Tør Root Rot Disease Assays i kikært: en detaljeret metode

Summary

Denne undersøgelse præsenterer metoder til at studere patomorfologiske og molekylære mekanismer, der ligger til grundfor kikært – Rhizoctonia bataticola interaktion. Den blotting papir metode er nyttig til hurtigt at studere kikært genotype svar, mens den syge pot-baserede metode kan bruges til samtidig at pålægge tørke og R. bataticola infektion og skærm for tolerante genotyper.

Abstract

Tør rod rådne (DRR) sygdom er en spirende biotisk stress trussel mod kikært dyrkning rundt om i verden. Det er forårsaget af en jordbåren svampepatogen, Rhizoctonia bataticola. I litteraturen er omfattende og detaljerede trinvise protokoller om sygdomsanalyser sparsomme. Denne artikel indeholder fuldstændige oplysninger om de trin, der er involveret i opsætningen af en blotting papir teknik til hurtigt at screene genotyper for resistens over for DRR. Den blotting papir teknik er let og billigere. En anden metode, baseret på den syge pot tilgang, er en efterligne af naturlig infektion og kan anvendes til at studere de interagerende komponenter-plante, patogen, og miljø-involveret i sygdommen trekant.

Desuden i naturen, DRR forekommer for det meste i rainfed kikært dyrkningsområder, hvor jordens fugtighed aftager som afgrødevækst fremskridt. Tørke stress er kendt for at disponere kikært planter til DRR sygdom. Patomorfologiske og molekylære forståelse af plantepatogen interaktion under tørke stress kan bane vejen for identifikation af elite DRR-resistente sorter fra kikært kimkimplasm pool. Denne artikel indeholder en trinvis metode til fremstilling af en syg gryde og efterfølgende sygdomsanalyse. Samlet set vil de oplysninger, der præsenteres heri hjælpe forskere forberede R. bataticola svampeinokuculum, vedligeholde dette patogen, oprette blotting papir teknik, forberede syge kultur og syge pot, og vurdere patogen infektion i kikærte planter.

Introduction

Tør rodråd (DRR) er en af de økonomisk signifikante sygdomme hos^{kikært 1,2}. Det er en rodspecifik sygdom forårsaget af Rhizoctonia bataticola (teleomorph, Macrophomina phaseolina). Inficerede planter mangler laterale rødder og besidder sprøde taproots og gule blade^1,3. DRR under tørke stress er blevet rapporteret at være en spirende trussel mod kikært^{dyrkning 1,2,3}. Desuden rapporteres forekomsten af drr , der forværres under tørkestress under^{feltbetingelserne 1,2,3}. DRR er mere udbredt i regnvedte områder end i vandede marker⁴. Udnyttelsen af resistente sorter er den måde at overvinde sygdommen og omgå fungicid brug^1,13. Fordi kikært kimmplasme til rådighed over hele kloden havne genetisk variation for træk⁵, screening og identifikation af resistente / modtagelige genotyper er afgørende for molekylær avl for afgrøde forbedring.

Robuste, nemme og omkostningseffektive sygdomsanalyser er afgørende for at undersøge R. bataticola infektion mønstre i kikært. Den primære sygdomsanalyse, der anvendes til at observere reaktionen af kikært genotyper til R. bataticola infektion er blotting papir teknik^1,4. Det er en simpel teknik og kan udføres ved hjælp af flydende svampeinoculum, planter med rødder og sterilt blotting papir. Men, denne teknik er ikke blevet udnyttet til sit maksimum, fordi ingen trin-for-trin-protokol er tilgængelig i litteraturen.

I mellemtiden, den syge pot teknik indebærer forberedelse af en potentiel syg kultur og indførelse af tørke stress. Da tørkestress forværrer forekomsten af DRR-sygdomme³, er det vigtigt at undersøge samspillet mellem plantepatogener under tørkebelastning^6,7. Den syge pot teknik giver platformen for en sådan samtidig undersøgelse, fremme bedre muligheder for kimlasma screening og forståelse af det mekanistiske grundlag for samspillet. Patomorfologiske ændringer såsom en stigning i rodlængde og reduktion i lateral rodtal- iboende drr sygdom-kan løses ved hjælp af syge pot^{teknik 1,3,7}.

Heri præsenteres en detaljeret protokol for blotting papir og syge pot teknikker, som kan bruges til at studere samspillet mellem kikært og R. bataticola og skærm kikært kimkimplasm, præsenteret. Oplysningerne om de materialer, der anvendes i undersøgelsen, findes i materialetabellen.

Protocol

1. Isolering af R. bataticola og opbevaring

1. Nærmere oplysninger om kikært genotype og DRR symptomer
   1. Brug kikært planter (genotype, JG 62), der generelt viser typiske DRR symptomer, såsom tør, skør primær rod uden laterale rødder og mikrosklerrotia under barken og inde i marv^1,3.
2. Indsamling og vask
   1. Uproot planter viser symptomer som tør halm-farvet blad og sprød primær rod med mikrosklerrotia under epidermis lag. Mens rodløshed, en stor del af rødderne vil forblive inde i jorden som de inficerede rødder er sprøde. Fjern det grove jordrester, der er fastgjort til roden. Skær rødderne separat og opsaml dem i papirkonvolutetter (27,5 cm x 12 cm) med den korrekte etiket, og læg dem i en prøveopsamlingskasse.
   2. Efter transport af prøver til laboratoriet, placere rødderne i en 200 ml bægerglas og dække med mesh (Nylon mesh med pore størrelse på 3 mm diameter), og vask rødderne grundigt med rindende vand fra hanen for at fjerne klæbende jordpartikler.
   3. Brug omvendt osmose (RO) vand til at skylle én gang i slutningen.
3. Overfladesterilisering
   1. Bryd rødderne i fire stykker med 2 cm længde hver med en skalpelkling og læg dem i et rent 200 ml bægerglas.
   2. Saml autoklaveret RO-vand, 2% NaOCl, kasseringsglas og autoklaveret blottingspapir (5 cm²⁾inde i laminarflowkammeret.
   3. Vask rødderne med 50 ml autoklaveret RO vand tre gange og derefter med 50 ml 2% NaOCl i 10 min. Vask rødderne med 50 ml RO-vand tre gange igen for at fjerne NaOCl.
   4. Tør rødderne ved at placere rødderne på autoklaveret blotting papir og lad indtil rødderne er tørret.
4. Medier og inkubation
   1. Fjern kanterne af rødderne med en steriliseret skalpel klinge. Opdel rødderne ved hjælp af klingen og brug de steriliserede kraftbelininger til at placere dem på en kartoffeldextrosealgar (PDA) med petriplade indeholdende streptomycinsulfat (50 mg L^-1) og ampicillin (50 mg L^-1).
   2. Pladen lukkes, forsegles med parafilm, og inkuberes i en inkubator ved 28 °C i to dage i mørke.
5. Hyphal tip metode
   1. Efter to dages inkubation, bringe pladerne ind i laminar flow kammer. Skær spidsen af hyphal vækst⁸ under et stereomikroskop (Leica EZ4 pædagogiske stereomikroskop) og overføre det til en frisk PDA plade med streptomycin sulfat og ampicillin.
   2. Inkuber pladerne i inkubatoren ved 28 °C i ti dage i mørke.
6. Opbevaring og vedligeholdelse af R. bataticola svampeinokuculum
   1. Lav PDA-skrå i reagensglas og overfør et svampegarstik fra en ti dage gammel dyrkeplade ved hjælp af den steriliserede inokuleringssløjfe. Reagensglashætten forsegles med parafilm.
   2. Hæld skråtstillet ved 28 °C i ti dage i mørke.
   3. Hætten forsegles igen med parafilm, og den opbevares ved 4 °C i køleskabet til fremtidig brug.
   4. Subkultur hvert halve år for at opretholde svampen.
7. Vedligeholdelse af virulens
   1. Inficere planterne med ren svampeinoculum udarbejdet som nævnt i den syge pot teknik³. Isoler den samme svamp fra de inficerede planter (Kochs postulater)⁹ og brug til yderligere eksperimenter.
      BEMÆRK: I denne undersøgelse blev der anvendt en markisoleret stamme af svampen (GenBank: MH509971,1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH509971)

2. Blotting papir teknik

BEMÆRK: Den blotting papir teknik indebærer forberedelse af flydende svampe inokulum, kimplante forberedelse, og sygdomsvurdering.

1. Fremstilling af flydende R. bataticola inoculum
   BEMÆRK: Flydende R. bataticola svampeinokuculum indeholder både mykelia og mikrosklerroti. Begge disse strukturer fungerer som primær inoculum.
   1. Forbered 500 ml PDB-medier i en 1.000 ml kolbe og autoklave det ved 121 lbs i 15 min.
   2. Når mediet er afkølet, inokuler bouillon med en loopful af svampe agar stik fra en svampestplante kultur og inkuberes ved 28 °C i fem dage i en shaker ved 180 rpm i mørke.
   3. Monter en autoklaveret glas eller plasttragt (10 cm), en-liters konisk kolbe og to lag mesh (10 cm² størrelse) (Nylon mesh med porestørrelsen på 3 mm diameter) på bordet. Bortfiltrere svampen mykelia og mikrosklerrotia ved hjælp af masken. Tør svampen i autoklaveret blotting papir.
   4. Afveje 100 g mycelia for 50% inoculum og holde ved stuetemperatur.
2. Fremstilling af kikærteplante
   1. Vælg 50 sunde frø (i denne undersøgelse blev drr-modtagelige genotype JG 62 anvendt), læg dem i et 100 ml bægerglas og dæk med et net.
   2. Vask frøene med postevand først for at fjerne snavs.
   3. Tag bægerglasset med frø ind i laminar flowkammeret og vask dem med steriliseret 50 ml RO-vand tre gange i 1 min.
   4. Steriliser frøene med 50 ml 2% vandig NaOCl i 2 min. med kontinuerlig omrystning og vask frøene med 50 ml steriliseret vand fem gange i 1 min. hver.
   5. Fyld en polyethylenpose (47,5 cm x 25 cm) med Soilrite (en blanding af gartnerikvalitet udvidet perlit, irsk tørvemos og eksfolieret vermiculit i samme forhold, dvs. 1/3:1/3:1/3), så de overfladesteriliserede 50 frø to cm dyb, og opbevares i et vækstkammer/rum med 28 °C ± 2 °C temperatur, 16 h fotoperiod med en lysintensitet på 150 μmol m⁻² s⁻¹og relativ luftfugtighed på 70%. Vand dem med RO vand og udrydde planterne otte dage efter såning.
   6. Vask rødderne i postevand for at fjerne Soilrite partikler. Skyl rødderne med steriliseret RO-vand, og opbevar dem i RO-vandet i et 1000 ml bægerglas.
3. Fremstilling af blotting papir i bakker
   1. Tag en blotting papir og skær dem i stykker (30 cm × 23 cm) i tilstrækkeligt antal til at opfylde replikationerne.
   2. Pak arkene i autoclavable polyethylen taske og autoklave dem på 121 lbs i 15 minutter og holde det i en varm luft ovn til tørring.
   3. Fold hver blotting papirark i halve.
   4. Papiret sættes på en ren, spiritustørret plastbakke som vist i figur 2i-iv.
4. Plante vaccination ved dypning
   1. 100 g svampeinokuculum opløses i 200 ml autoklaveret RO-vand i et 200 ml bægerglas for at opnå 50% inokulum.
   2. Dyp planterødderne i det forberedte inokulum i 1 min. med intermitterende op-og-ned bevægelse for at sikre ensartet fastgørelse af svampeinokulum.
5. Placering af planterne i det blotting papir
   1. Våd den nederste side af det blottingspapir, der er placeret på bakken, med sterilt RO-vand. Placer planterne på papiret på en måde, hvor kun rødderne er dækket af papiret, og skud er udeladt.
   2. Luk den ved at folde den øverste side af blotting papir og våd hele papiret til at give nok vand til at opretholde plantevækst.
   3. Vand bakken én gang dagligt, og hold bakkerne ved 28 °C. Overhold symptomerne såsom nekrose, rod råd, og blad gulfarvning dagligt.

3. Syg pot teknik

BEMÆRK: Den syge pot teknik indebærer forberedelse af virulent inoculum og en syg gryde, vedligeholdelse af fugt niveau, og vurdering af sygdomssymptomer.

1. Fremstilling af substrat
   1. Tag et kg af alle kommercielt tilgængelige kikærtfrø. Fjern inficerede frø (frø med svampevækst, infektion pletter, og insektskader). Placer dem i 5 L plast bæger og vask med vand fra hanen grundigt 3-4 gange for at fjerne større snavs.
   2. Vask frøene med 2 L RO vand tre gange og sættetid 1 kg frø i en 5 L bægerglas med trefold mere vand i fem timer.
   3. Når frøene imbibed vandet, rewash dem med RO vand tre gange for at fjerne frøet eksudater.
   4. Fjern vandet helt og pak frøene i syltetøjsflasker (300 ml, 12 cm højde, 6 cm i diameter og 155 g vægt) til ca. 1/4^th kapacitet (100 g pr. marmeladeflaske) og luk flaskerne med hætter. Pak ti marmeladeflasker i en autoclavable plastikpose (48 cm x 30 cm) autoklave to gange ved 121 lbs i 15 min kontinuerligt.
   5. Tør frøene ved 40 °C i en ovn natten over for at fjerne vanddråberne inde i flasken.
2. Forberedelse af sygekultur
   1. Tænd for BSL-2 niveau laminar flow kammer. Tør gulvet grundigt med 70% ethanol, og tænd UV i 15 min. Derefter holde frøene inde i laminar flow kammer.
   2. Tag 10-dages gamle frisk isolerede R. bataticola kultur (del 1). Derefter tage tre svampe agar stik (4 mm diameter) ved hjælp af en steril pipette spids eller kork borer, og læg dem i marmelade flasker aseptisk. Dæk flaskerne med hætter og forsegling med parafilm.
   3. Ryst flaskerne for at blande svampeskiven med kikærtfrøene ensartet.
   4. Flaskerne inkuberes ved 30 °C i 15 dage i mørke.
   5. Tag marmeladeflasker med sort svampevækst (Figur 4iii) og overfør den syge kultur (frø med mikrosklerrotia) fra syltetøjsflasker til en glas petriplade ved hjælp af sterile fortriver. Tør dem ved stuetemperatur i to dage i en glas petriplade.
   6. Svampemassen pulverudsles ved hjælp af mørtel og støder, og pulveret opbevares ved 4 °C.
   7. Autoklave Soilrite to gange ved 121 lbs i 15 min.
   8. Tør den autoklaveret Soilrite-blanding under en solskærm.
   9. Bland svampepulveret med Soilrite ved 50% w/w, fyld gryderne med blandingen, og hold dem ved stuetemperatur i en dag.
   10. Så en overflade-steriliseret DRR-modtagelige kikært frø pr pot (10 cm runde potter) (Tabel af materialer) og opretholde en fugt niveau på 80% felt kapacitet (FC).
   11. Overhold symptomerne såsom nekrose og rodråd ved at udrydde planterne efter spiring.
3. Vurdering af effektiviteten af sygepotte
   BEMÆRK: Planter viser gule blade symptomer, når rødderne er helt rådne.
   1. Udvikle en sygdom score baseret på læsion (nekrotiske pletter) (supplerende figur 2C) numre og sværhedsgraden af rodråd. Syge potter viser 90% plantedød kan bruges yderligere.
4. Screening af Genotype
   1. Forbered sygekultur i store mængder og bland det enten med steriliseret Soilrite eller feltjord (5% w / w) i 30 cm høje potter. Vand gryderne til at våd overfladen og lad dem uforstyrret i syv dage.
   2. Så en overflade-steriliseret frø pr 10 cm rund gryde og tre frø pr 30 cm runde potter og vand dem tilstrækkeligt.
   3. Overhold de gule blad- og rodrådssymptomer.
5. Kombineret tørke og R. bataticola infektion
   1. Pålægge tørke stress ved at følge de protokoller, der er nævnt i Sinha et al. (2019).

Representative Results

Denne undersøgelse havde til formål at demonstrere teknikker såsom blotting papir og syge pot teknikker til at lette patomorfologiske og molekylære forståelse af plante-patogen interaktion under tørke stress. For at opnå dette, planter udviser DRR symptomer^1,3,4 blev indsamlet fra en kikært felt, og svampen blev isoleret ved hjælp af hyphal tip metode⁸. R. bataticola svampekultur fremstår mørkegrå på PDA-pladen og skrå fire dage efter inkubation (figur 1A & C) og mørkere i grå farve i PDB-mediet fem dage efter inkubation ( Figur1B). R. bataticola har septate mycelia (Figur 1D), og det producerer mikrosklerrotia (Figur 1E), der fungerer som primær inoculum i jorden¹⁰.

Trinene i figur 2 blev fulgt for at udføre blotting papir teknik. Otte dage gamle planter blev inficeret med flydende inokulum (50%), og otte dage efter infektion, planter blev observeret for symptomer. Planter viste rodråd på grund af omfattende nekrose, samt blad gulfarvning, som er den typiske rod og blad symptomer på DRR sygdom (Figur 3B og supplerende figur 1A).

Den syge pot teknik blev udført ved hjælp af trinene i figur 4. Koncentrationerne af svampeinokuculum i jordbund og markjord var henholdsvis 10 % og 5 %. DRR-modtagelige frø viser de typiske DRR symptomer såsom rod rådne, mangel på laterale rødder, blad gulfarvning, og for tidlig død, i forhold til kontrol planter (Figur 5A og B). Planter, der er blevet udsat for infektion i den sygegræske, og som er fremstillet med Soilrite, er døde og udviste rodråd syv dage efter såningen (figur 5C og supplerende figur 2C). I mellemtiden, planter vokser i den syge pot lavet med markjord viste typiske blad symptomer, dvs halm-farvet løv 48 dage efter såning (Figur 5E).

Påvirkningen af tørke på DRR-sygdom blev også undersøgt i sygepotten under laboratorieforhold. Tørke stress blev pålagt ved tilbageholdelse af vand³. De planter under tørke stress (30% FC) viste forværret sygdom forekomst i forhold til patogen-only-behandlede (90% FC) planter(figur 6A og B). Kontrol- og tørkebehandlede planter viste ingen symptomer (Figur 6A og B). Rødder under kombineret stress havde flere nekrotiske pletter og rådne i forhold til patogene-planter (Figur 6B).

Figur 1: Karakteristiske morfologiske træk ved Rhizoctonia bataticola. Den kausale agent af tør rod rådne(Rhizoctonia bataticola, ITCC 8635) blev isoleret fra feltet (National Institute of Plant Genome Research, New Delhi, 28.6139 ° N, 77.2090 ° E). Fra kulturerne blev svampen isoleret ved hjælp af hyphal tip metode⁸. Billeder viser den 4 dage gamle R. bataticola kultur i kartoffel dextrose agar i en petriplade (A),5 dage gamle flydende kultur (B), og 10 dage gamle skrå kultur (C). Svampe mycelia(D)og microsclerotia (sorte pile)(E)blev drillet på et mikroskop dias og farves med WGA-FITC og anilin blå, henholdsvis. Billeder (E, F, skala bar, 20 og 50 μm) blev fanget under 20x og 40x objektivet linse af en epifluorescerende mikroskop. Hvide pile viser korsvæggene i mycelia. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Trin, der er involveret i R. bataticola-inokulering og DRR-analyser i den blotting papirteknik. Overflade sterilisere frøene ved at passere dem gennem rindende vand fra hanen og vask med 2% natriumhypochlorit, efterfulgt af vask med sterilt RO vand 3-4 gange (trin 1). Derefter så 30 frø i 15 cm høje potter, der indeholder Soilrite (trin 2), og lad frøene vokse i otte dage i et vækstrum med 28 °C ± 2 °C temperatur, 16 h fotoperiod med en lysintensitet på 150 μmol m⁻² s⁻¹og relativ luftfugtighed på 70% (trin 3). Udrydde planterne og vaske dem med steriliseret vand (trin 4). Svampeinokulumet klargøres ved podning af 500 ml PDB-medier med svamp (trin 5). For infektionen, bruge 5-dages gamle svampe bouillon kultur. Derefter pode planterne ved at dyppe rødderne i svampeinokulum i et bægerglas i 30 s og fjern overskydende inokulum ved at røre ved bigbenets indre sidevæg (trin 6). Efter infektion skal svampeinkulerede og mock-podede planter sættes i forskellige blottingpapirer i separate rene bakker (trin 7). Fugt blotting papir med tilstrækkelig sterilt vand dagligt og observere symptomerne, dvs., udgydelse af laterale rødder, gulfarvning og visnende af planteblade, rådne frø, og rod rådne på otte dage efter infektion (trin 8) (A). Billeder repræsenterer vigtige trin (trin 3-7) (B). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: DRR sygdom symptomer i kikært-baseret på blotting papir teknik. Efter den protokol, der er afbildet i figur 2, blev DRR-modtagelige planter (genotype, JG 62) udsat for infektion ved hjælp af den blotting papirteknik, og symptomerne blev taget otte dage efter infektionen. Billeder viser de repræsentative kontrol planter (mock-podet) med sunde skud (rød pil) og rødder med mere laterale rødder (gul pil) (A). Billeder viser de repræsentative inficerede planter med typiske symptomer, såsom visne, gulfarvning og tørring af blade (blå pile) og tørrede / nekrotiske rødder med færre laterale rødder (hvide pile) (B). Skalabjælken er 1 cm. Eksperimenter blev gentaget mindst fem gange. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Oversigt over syge pot forberedelse til R. bataticola inokulering og DRR sygdom assays. Forbered svampeinokulum ved at vaccinere en PDA plade med en 5 mm svampeskive med aktivt voksende svampekultur og inkuberes ved 28 °C i ti dage. Derefter, for at forberede substrat, vaske kikært frø med vand fra hanen, suge frøene i vand natten over, og autoklave på 121 lbs i 15 min. Derefter inokuler 100 g af substratet med tre agar propper fra 10-dages-gamle kultur og bland godt. Derefter inkuberes det podede substrat ved 30 °C i 15 dage i en inkubator. Knus den syge kultur (svampe dyrket substrat), tør og pulver det, og opbevares ved 4 °C. Derefter blandes 50 g syg kultur med 100 g tør Soilrite grundigt (syg pot) (A). Derefter så overfladen steriliserede modtagelige kikært frø og observere symptomerne, dvs., tryk rod rådne, lateral rod nekrose, og blad gulfarvning. Assimilere planterne viser symptomer i samme gryde. For yderligere eksperimenter, bruge potter viser 90% infektion som modtagelige genotype. Billeder repræsenterer inoculum (i), substratet (ii) og kontrol og podet syg kultur (iii) (B). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: DRR sygdom symptomer i kikært-baseret på syge pot teknik. For at lave en syg gryde blev den protokol, der er afbildet i figur 4, anvendt. Derefter blev overfladesteriliserede DRR-modtagelige kikærtgenotypefrø (JG 62) sået i kontrol (A) og syg pot (B). Hver plante i potten repræsenterer en replika, og døde eller forkrøblede plantevækst blev observeret i den syge pot. Planter på højre side af panelet (C) angiver tilstedeværelsen og fraværet af laterale rødder (gul pil) i henholdsvis kontrol og behandling. Grafen viser antallet af døde planter i syge pot behandling i forhold til kontrol (D). Den syge pot blev udarbejdet på steriliseret markjord indsamlet fra NIPGR feltet, og syge kultur var blandet. Overflade-steriliserede frø blev sået, og sygdomssymptomer blev fanget 48 dage efter såning. Billedet viser kontrolplanter (E), og de typiske DRR bladsymptomer, nemlig tørring af planter, er angivet (hvide pile). Statistisk signifikans blev bestemt ved hjælp af Student's t-test. Baren repræsenterer SEM af ni biologiske replikater, og stjernen betegner en statistisk signifikant værdi på P < 0,0001. Den gule pil angiver nekrotisk/rådden, tørret primærrod uden laterale rødder. Eksperimenter blev gentaget mindst ti gange, med lignende resultater. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6: Den syge pot metode er nyttig til at studere indflydelsen af tørke stress på plante-patogen interaktion. En pot eksperiment blev udført for at undersøge effekten af tørke på R. bataticola infektion. Forsøget omfattede kontrol, tørke-only, patogen-only(R. bataticola, patogen), og kombineret tørke og R. bataticola stress (kombineret stress). Planter blev dyrket i et vækstrum med 28 °C ± 2 °C temperatur, 16 h fotoperiod med en lysintensitet på 150 μmol m⁻² s⁻¹og 70% relativ luftfugtighed. Den syge pot blev udarbejdet efter protokollen afbildet i figur 4. Derefter, overflade-steriliseret DDR-modtagelige kikært genotype (JG 62) frø blev sået i kontrol og syge potter. Kontrol og patogen behandlinger blev vandede under hele forsøget. Tørke stress blev pålagt planter under tørke og kombineret stressbehandling. Vandet blev tilbageholdt 18 dage efter såningen, og det ønskede tørkeniveau blev nået 24 dage efter såningen. Planter blev observeret for symptomer 29 dage efter såning. Billedet viser blad- og rodændringer under behandlinger (A). Billeder viser uindgroede planterødder observeret under 0,5X objektivet af en SMZ25/SMZ18 forskning stereomikroskop (B). Den røde pil angiver de uintrerede laterale rødder, og de sorte pile angiver de inficerede laterale rødder. Eksperimenter blev gentaget mindst ti gange, med lignende resultater. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur S1: Inoculum-størrelse og reduktion i lateral rodtal i kikært. Efter protokollen i figur 2 blev DRR-modtagelige planter (genotype, JG 62) udsat for infektion med varieret størrelse af inokulum ved hjælp af blotting papirteknik, og symptomerne blev fanget otte dage efter infektionen. Planter blev podet med varieret inoculum størrelse (0,1%, 1%, 10% og 20% w / v i vand)Billeder viser de repræsentative inficerede planter med typiske symptomer såsom visne, gulfarvning, og tørring af blade og tørrede / nekrotiske rødder med mindre laterale rødder (B). Graf viser antallet af laterale rødder i planter under infektion med inokulumvariation (B). Skalabjælken er 1 cm. n=10. Klik her for at downloade dette tal.

Supplerende figur S2: Bladsymptomer på DRR i kikært i jordbund. Efter protokollen afbildet i figur 4, overflade steriliserede frø blev sået, og sygdomssymptomer blev fanget på 14 dage efter såning. Det repræsentative billede viser kontrolplanterne (A), og billedet viser de typiske DRR-bladsymptomer, nemlig tørring af planter (hvide pile) (B). Sygdomsscore blev udviklet baseret på nekrotiske pletter på rødderne. Scoringen blev udviklet i løbet af dagene (C). Fotografierne (A&B) er fra det samme eksperiment. Skalabar= 3 cm. n= 10. Klik her for at downloade dette tal.

Discussion

Den blotting papir teknik giver en enkel tilgang til skærmen kikært genotyper under laboratorieforhold. Dipinokulering muliggør undersøgelse af interaktion på tidsbasis med nem kontrol over inokulumbelastningen (supplerende figur 1) og letter in vitro-screening. Desuden kan selv unge planter bruges. Fem dage gamle svampekultur ( Figur1B) kan give nok inoculum til at inficere planterne. Flydende inoculum indeholder både mycelia og mikrosklerroti (Figur 1D & E). Rodrådssymptomer ( Figur 3B) kan bruges til at score sygdommen og identificere resistente genotyper. DRR-forekomsten påvirkes i høj grad af tørkestress^1,3,5. Men med denne teknik alene, tørke stress pålæggelse er umuligt, og screening med denne teknik vil ikke afspejle naturlige reaktioner.

Den syge pot teknik giver mulighed for undersøgelse af samspillet mellem planter, patogener, og tørke stress. Det giver en måde at screene genotyper under kombineret tørke og patogen stress til at identificere resistente genotyper. I en syg gryde, kan tørke stress pålægges i alle aldre af planten og screene planterne. Planter viser typiske DRR symptomer (Figur 5C & F og supplerende figur 2B & C) i syge pot metode. Planter udsat for kombineret tørke og patogen infektion viste svær rod rådne i forhold til patogen-only behandling. Dette indebærer, at tilgængelige kikært kimmplasm skal screenes for at identificere en resistent genotype til ikke kun patogen, men også kombineret patogen og tørke stress. Flere undersøgelser blev forsøgt tidligere at screene genotyper, men ved hjælp af blotting papir teknik^11,12. Desuden er der også foretaget en feltscreening, men uden at pålægge tørkestress¹¹. Det er afgørende at indføre tørkestress i forskellige stadier af kikært og vurdere genotyperesponsen.

PROBLEMER MED AT SKYDE

For blotting papir teknik, bør mængden af inokulum i bægerglasset være på det niveau, hvor hele planten roden er dyppet. Derudover vil overskydende vanding føre til vådråd af planterødderne. Brug ikke vand fra hanen til vanding af planterne, da det kan forårsage forurening.

For de syge pot teknik, Desi kikært sorter er at foretrække. Antallet af frø kan variere afhængigt af forskernes behov. Mængden af vand, der anvendes til at suge frø bør være trefoldige mere, fordi frøene imbibe vand. Bakterievækst vil forekomme, hvis vasken ikke udføres korrekt. Ikke-autoklaveret vand kan bruges til at suge frøene. Farven på frøene efter autoclaving skal være sort i stedet for brun, hvilket indikerer forkert autoclaving. Overtørring i en varm luft ovn fører til tørring af frø; frø kan ikke anvendes til svampeookulering. Podning af flasker uden for laminar-strømmen kan forårsage kontaminering. Hvid svampevækst i podet kikært måltid er et tegn på forkert autoclaving. Biosikkerhedsforanstaltninger skal følges ved udsmid af det anvendte inokulum, blotting papir og inficerede planter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fungus- Rhizoctonia bataticola	Pathogen inoculum	Indian Type Culture Collection No. 8365	GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article& id=1251&Itemid=1370)
Soilrite mix	Soil medium in the lab	Keltech Energies Limited, Bangalore, India	http://www.keltechenergies.com/
Filter paper	Blotting paper to support the plant growth	Himedia	http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374
Pot	Growing plants	10 and 30 cm size pots	Routinely used nursery pots, for example, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html
Potato dextrose agar/broth	Culture and maintain the fungus	Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA	https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946
Incubator	Culture the fungus	LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator, and shaker	http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131
Growth chamber	Growing plants in controlled condition	Model No. A1000, Conviron, Canada	https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber
Laminar airflow	Carrying out aseptic exercises	Telstar, Bio II advance, Class II cabinet, EN-12469-2000	https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html
Mesh	Filtering the fungal mycelia	Nylon mosquito net	Mesh with 0.6-1 mm diameter pore size
Autoclave	Autoclaving media and chickpea seeds	Autoclave	http://www.scientificsystems.in/autoclave
Microscopes	Visualizing the infection ang fungal mycelia	SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopes, Leica EZ4 educational stereomicroscope	https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i
Weighing balance	Weighing fungus and chemicals	Sartorius Electronic Weighing Balance, BSA 4202S-CW	https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances
WGA-FITC	Fungus staining	Sigma	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en&region=IN
Aniline blue	Fungus staining	Himedia	http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901