Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

שורש יבש רוט רוט מחלה אומר חומוס: מתודולוגיה מפורטת

Published: January 17, 2021 doi: 10.3791/61702
Automatic Translation
1, 1
1National Institute of Plant Genome Research

Summary

מחקר זה מציג מתודולוגיות כדי ללמוד את המנגנונים הפתומורפולוגיים והמולקולריים הבסיסיים חומוס –אינטראקציה בטיקולה Rhizoctonia. שיטת נייר הכתמים שימושית כדי ללמוד במהירות תגובות גנוטיפ חומוס, בעוד השיטה מבוססת סיר חולה יכול לשמש בו זמנית לכפות בצורת וזיהום R. bataticola ומסנן עבור גנוטיפים סובלניים.

Abstract

מחלת ריקבון שורש יבש (DRR) היא איום לחץ ביוטי המתעוררים על גידול חומוס ברחבי העולם. היא נגרמת על ידי פתוגן פטרייתי הנישא בקרקע, ריזוקוניה באטיקולה. בספרות, פרוטוקולים מקיפים ומפורטים שלב אחר שלב על מחלות הם דלים. מאמר זה מספק פרטים מלאים על השלבים המעורבים בהגדרת טכניקת נייר משתקת להקרנה מהירה של גנוטיפים להתנגדות ל-DRR. טכניקת הנייר הנוהקת קלה ופחות יקרה. שיטה נוספת, המבוססת על גישת החשיש החולה, היא חיקוי של זיהום טבעי וניתן ליישם אותה כדי ללמוד את הרכיבים המקיימים אינטראקציה – צמח, פתוגן וסביבה – המעורבים במשולש המחלה.

יתר על כן, בטבע, DRR מתרחשת בעיקר באזורי גידול חומוס ים, שם לחות הקרקע נסוגה ככל שצמיחת היבול מתקדמת. לחץ בצורת ידוע נטייה צמחי חומוס למחלת DRR. הבנה פתומורפולוגית ומולקולרית של אינטראקציה בין צמחים לפתוגן תחת לחץ בצורת יכולה לסלול את הדרך לזיהוי זנים עמידים בפני DRR מבריכת החיידקים של גרגירי החומוס. מאמר זה מספק מתודולוגיה צעד קדימה להכנת סיר חולה ואסה מחלה לאחר מכן. בסך הכל, המידע המוצג בזאת יסייע לחוקרים להכין את האנוקולום פטרייתי R. bataticola, לשמור על פתוגן זה, להגדיר את טכניקת נייר הכתמים, להכין תרבות חולה וסיר חולה, ולהעריך זיהום פתוגן בצמחי חומוס.

Introduction

ריקבון שורש יבש (DRR) היא אחת המחלות המשמעותיות מבחינה כלכלית חומוס1,2. זוהי מחלה ספציפית שורש הנגרמת על ידי רזוקטוניה bataticola (טלומורפ, Phaseomina). צמחים נגועים חסר שורשים לחוץ ויש להם טפירים שבירים ועלווה צהובה1,3. DRR תחת לחץ בצורת דווח להיות איום המתעוררים על גידולחומוס 1,2,3. יתר על כן, שכיחות DRR מדווח להיות מחמיר תחת לחץ בצורת בתנאי שדה1,2,3. DRR נפוץ יותר באזורי גשם מאשר בשדות שוריים4. ניצול זנים עמידים היא הדרך להתגבר על המחלה ולעוקף את השימוש בקוטל פטריות1,13. מכיוון שחיידקי חומוס הזמינים ברחבי העולם מטמינים וריאציהגנטית עבור התכונה 5, ההקרנה והזיהוי של גנוטיפים עמידים/רגישים הם קריטיים לרבייה מולקולרית לשיפור היבול.

תבניות מחלה חזקות, קלות וחסכונית חיוניות כדי לחקור את דפוסי הזיהום של ר. באטיקולה בגוזל. המחלה העיקרית assay משמש כדי לצפות בתגובה של גנוטיפים חומוס לזיהום R. bataticola היא טכניקת ניירכתמים 1,4. זוהי טכניקה פשוטה, ניתן לבצע באמצעות אינוקולום פטרייתי נוזלי, שתילים עם שורשים, ונייר כתם סטרילי. עם זאת, טכניקה זו לא נוצלה למקסימום שלה מכיוון שאין פרוטוקול שלב אחר שלב זמין בספרות.

בינתיים, טכניקת החשיש החולה כרוכה בהכנת תרבות חולה פוטנציאלית והטלת לחץ בצורת. בהתחשב בכך שלחץ בצורת מחמיר אתשכיחותמחלת DRR 3 , זה חיוני כדי ללמוד את האינטראקציה צמח-פתוגן תחתלחץ בצורת 6,7. טכניקת סיר חולה מספקת את הפלטפורמה למחקר כזה בו זמנית, קידום אפשרויות טובות יותר עבור הקרנת חיידקים והבנת הבסיס המכני של האינטראקציה. ניתן לטפל בשינויים פתומורפיים כגון עלייה באורך השורש וצמצום מספר השורשים הניגבים – הטבועים במחלת DRR – באמצעות טכניקתסיר חולה 1,3,7.

בזאת, פרוטוקול מפורט עבור נייר כתמים וטכניקות סיר חולה, אשר ניתן להשתמש כדי ללמוד את האינטראקציה בין חומוס ו R. bataticola ו germplasm חומוס מסך, מוצג. פרטי החומרים המשמשים במחקר ניתנים בטבלת החומרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. בידוד ר. באטיקולה ואחסון

  1. פרטים על הגנוטיפ של גרגירי החומוס ותסמיני DRR
    1. השתמש בצמחי חומוס (גנוטיפ, JG 62) כי בדרך כלל להראות סימפטומים DRR טיפוסי, כגון יבש, שורש ראשי שביר ללא שורשים לחוץ microsclerotia מתחת לקליפה ובתוך pith1,3.
  2. איסוף ושטיפה
    1. צמחי עקורים המציגים תסמינים כגון בוליאר בצבע קש יבש ושורש ראשי שביר עם מיקרוקלרוטיה מתחת לשכבת האפידרמיס. בעוד העקרוץ, חלק גדול של השורשים יישאר בתוך האדמה כמו השורשים הנגועים הם שבירים. הסר את פסולת האדמה גסה המחוברת לשורש. חותכים את השורשים בנפרד ואספים אותם במעטפות נייר (27.5 ס"מ על 12 ס"מ) עם התווית המתאימה והיכו אותם בתיבת איסוף לדוגמה.
    2. לאחר העברת דגימות למעבדה, מניחים את השורשים בשקית של 200 מ"ל ומכסים ברשת (רשת ניילון עם גודל נקבוביות בקוטר 3 מ"מ), ושטפו את השורשים ביסודיות עם מי ברז זורמים כדי להסיר חלקיקי קרקע דבקים.
    3. השתמשו במים הפוכים של אוסמוזה (RO) כדי לשטוף פעם אחת בסוף.
  3. עיקור פני השטח
    1. לשבור את השורשים לארבע חתיכות עם 2 ס"מ אורך כל אחד עם להב אזמל ולשים אותם ב 200 מ"ל נקי במקום.
    2. להרכיב מי RO autoclaved, 2% NaOCl, צנצנת השלכה, ונייר כתמים autoclaved (5ס"מ 2)בתוך תא זרימת למינאר.
    3. לשטוף את השורשים עם 50 מ"ל של מי RO autoclaved שלוש פעמים ולאחר מכן עם 50 מ"ל של 2% NaOCl במשך 10 דקות. לשטוף את השורשים עם 50 מ"ל של מים RO שלוש פעמים שוב כדי להסיר את NaOCl.
    4. כתם לייבש את השורשים על ידי הנחת השורשים על נייר כתמים autoclaved ולהשאיר עד השורשים מיובשים.
  4. מדיה ותרירה
    1. הסר את קצות השורשים עם להב אזמל מחטא. לפצל את השורשים באמצעות הלהב ולהשתמש מפלצות מעוטא למקם אותם על תפוח אדמה דקסטרוז אגר (PDA) צלחת פטרי מדיה המכיל סטרפטומיצין סולפט (50 מ"ג L-1) ואמפוצילין (50 מ"ג L-1).
    2. סוגרים את הצלחת, אוטמים עם פרפילם, ותדגירה באינקובטור ב-28 מעלות צלזיוס למשך יומיים בחושך.
  5. שיטת קצה מיף
    1. לאחר יומיים של דגירה, להביא את הצלחות לתוך תא זרימת למינאר. לחתוך את קצה הצמיחה hyphal8 תחת stereomicroscope (Leica EZ4 סטריאומיקרוסקופ חינוכי) ולהעביר אותו לתוך צלחת מחשב כף יד טרי עם סטרפטומיצין סולפט ואאמפצילין.
    2. דגירה את הצלחות באינקובטור ב 28 מעלות צלזיוס במשך עשרה ימים בחושך.
  6. אחסון ותחזוקה של לאוקולום פטרייתי של ר. באטיקולה
    1. הפוך את מחשב כף יד במבחנות ולהעביר תקע אגר פטרייתי מצלחת תרבות בת עשרה ימים באמצעות לולאת חיסון עיקור להבה. אטמו את מכסה הבדיקה עם פרפילם.
    2. דגירה את המשקעים ב 28 ° C במשך עשרה ימים בחושך.
    3. אטמו שוב את המכסה עם פרפילם ואחסן אותו ב-4 מעלות צלזיוס במקרר לשימוש עתידי.
    4. תת-תרבות כל שישה חודשים כדי לשמור על הפטרייה.
  7. תחזוקת הוויראליות
    1. להדביק את הצמחים עם inoculum פטרייתי טהור הוכן כאמור בטכניקה סיר חולה3. בודדו את אותה פטריה מהצמחים הנגועים (הקוך מפרסם)9 והשתמשו בהם לניסויים נוספים.
      הערה: במחקר זה, זן מבודד שדה של הפטריה שימש (GenBank: MH509971.1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH509971)

2. טכניקת נייר כתמים

הערה: טכניקת נייר הכתמים כרוכה בהכנת inoculum פטרייתי נוזלי, הכנת שתילים, והערכת מחלות.

  1. הכנת נוזל R. באטיקולה
    הערה: אינוקולום פטרייתי נוזלי R. bataticola מכיל הן mycelia ו microsclerotia. שני המבנים האלה פועלים כאונוקולום ראשי.
    1. הכן 500 מ"ל של מדיה PDB בקבוקון 1,000 מ"ל autoclave אותו ב 121 ק ג במשך 15 דקות.
    2. לאחר שהתקשורת מתקררת, לחסן את המרק עם לולאה של תקע אגר פטרייתי מתרבות שיפוע פטרייתי דגירה ב 28 מעלות צלזיוס במשך חמישה ימים בשייקר ב 180 סל"ד בחושך.
    3. להרכיב זכוכית autoclaved או משפך פלסטיק (10 ס"מ), בקבוקון חרסי ליטר אחד, ושתי שכבות של רשת (10ס"מ 2 גודל) (ניילון רשת עם גודל הנקבוביות של 3 מ"מ קוטר) על השולחן. לסנן את המיליה פטרייתית ומיקרוקלרוטיה באמצעות הרשת. כתם לייבש את הפטרייה בנייר כתמים autoclaved.
    4. לשקול 100 גרם mycelia עבור 50% אינקולום ולשמור על טמפרטורת החדר.
  2. הכנת צמח חומוס
    1. בחר 50 זרעים בריאים (במחקר זה, הגנוטיפ JG 62 רגיש DRR היה בשימוש), למקם אותם ב100 מ"ל בפיק, ולכסות עם רשת.
    2. לשטוף את הזרעים עם מי ברז הראשון כדי להסיר פסולת אדמה.
    3. קח את הבקת עם זרעים לתוך תא זרימת למינאר ולשטוף אותם עם 50 מ"ל עיקור של מים RO שלוש פעמים במשך 1 דקות לכל שטיפה.
    4. לחטא את הזרעים עם 50 מ"ל של 2% NaOCl מים במשך 2 דקות עם רעד מתמשך לשטוף את הזרעים עם 50 מ"ל של מים מחטאים חמש פעמים עבור 1 דקות כל אחד.
    5. מלאו שקית פוליאתילן (47.5 ס"מ על 25 ס"מ) ב-Soilrite (תערובת של גננות מדורגות מורחבות פרלייט, אזוב כבול אירי, ורמיקוליטיס פילינג ביחס שווה כלומר, 1/3:1/3:1/3), לזרוע את פני השטח מעוטר 50 זרעים שני ס"מ עמוק, ולשמור בתא צמיחה / חדר עם 28 °C ± 2 ° C טמפרטורה, 16 שעות photoperiod בעוצמה קלה של 150 μmol-2 s-1, ולחות יחסית של 70%. להשקות אותם עם מי RO ולערוק את הצמחים שמונה ימים לאחר הזורע.
    6. לשטוף את השורשים במים ברז כדי להסיר את חלקיקי Soilrite. לשטוף את השורשים עם מי RO מחטאים, ולשמור אותם במים RO ב1000 מ"ל במקום.
  3. הכנת נייר כתמים במגשים
    1. קח נייר כתמים וחתוך אותם לחתיכות (30 ס"מ × 23 ס"מ) במספרים מספיקים כדי לעמוד בשכפולים.
    2. אורזים את הסדינים בשקית פוליאתילן הניתנת לעבודה אוטומטית ומקלעים אותם ב-50 ק"ג למשך 15 דקות ולשמור אותם בתנור אוויר חם לייבוש.
    3. מקפלים כל גיליון נייר מנפח לשניים.
    4. מניחים את הנייר על מגש פלסטיק נקי ומרוח, כפי המוצג באות 2i-iv.
  4. חסון צמחים על ידי טבילה
    1. להמיס 100 גרם של inoculum פטרייתי ב 200 מ"ל autoclaved RO מים ב 200 מ"ל בספל כדי להשיג 50% אינקולום.
    2. טובלים את שורשי הצמח באינוקולום המוכן למשך דקה אחת עם תנועה לסירוגין למעלה למטה כדי להבטיח חיבור אחיד של אינוקולום פטרייתי.
  5. הנחת הצמחים בנייר הכתמים
    1. הרטיבו את הצד התחתון של נייר הכתמים המוצבים על המגש עם מי RO סטריליים. מניחים את הצמחים על הנייר באופן שבו רק השורשים מכוסים על ידי הנייר, ויורה נשאר בחוץ.
    2. סגור אותו על ידי קיפול הצד העליון של נייר הכתמים ולהרטיב את הנייר כולו כדי לספק מספיק מים כדי לקיים את צמיחת הצמח.
    3. להשקות את המגש פעם ביום ולשמור את המגשים ב 28 מעלות צלזיוס. שים לב לתסמינים כגון נמק, ריקבון שורש, ועלה צהבהב מדי יום.

3. טכניקת סיר חולה

הערה: טכניקת סיר חולה כרוכה בהכנת inoculum ארסי סיר חולה, תחזוקה של רמת לחות, והערכה של תסמיני המחלה.

  1. הכנת תכשיר
    1. קח ק"ג אחד מכל זרעי חומוס זמינים מבחינה מסחרית. הסר זרעים נגועים (זרעים עם צמיחה פטרייתית, כתמי זיהום, ונזק חרקים). מניחים אותם בשקית פלסטיק של 5 L ושטפו עם מי ברז ביסודיות 3-4 פעמים כדי להסיר פסולת גדולה.
    2. לשטוף את הזרעים עם 2 L של מים RO שלוש פעמים ולהשרות את הזרעים 1 ק"ג ב 5 L ב 11 עם שלוש יותר מים במשך חמש שעות.
    3. ברגע שהזרעים זלעו את המים, רחו אותם מחדש במי RO שלוש פעמים כדי להסיר את הזרע מפריך.
    4. מסירים את המים לחלוטין וארזים את הזרעים בבקבוקי ריבה (300 מ"ל, גובה 12 ס"מ, קוטר 6 ס"מ ו-155 גרם משקל) לקיבולת של חצי ליטר (100 גרם לבקבוקריבה) וסוגרים את הבקבוקים עם פקקים. ארוז עשרה בקבוקי ריבה בשקית פלסטיק הניתנת לשיעבוד אוטומטי (48 ס"מ על 30 ס"מ) אוטוקלב פעמיים ב-121 ק"ג למשך 15 דקות ברציפות.
    5. מייבשים את הזרעים ב-40 מעלות צלזיוס בתנור למשך הלילה כדי להסיר את טיפות המים בתוך הבקבוק.
  2. הכנת תרבות חולה
    1. הפעל את תא זרימת ה למינאר ברמה BSL-2. מנגבים את הרצפה ביסודיות עם 70% אתנול, ומפעילים UV למשך 15 דקות. לאחר מכן, לשמור את הזרעים בתוך תא זרימת למינאר.
    2. קחו את תרבות ר. באטיקולה בת 10 ימים מבודדת (חלק 1). לאחר מכן, יש לקחת שלושה תקעי אגר פטרייתיים (קוטר 4 מ"מ) באמצעות קצה פיפטה סטרילי או בור שעם, ולשים אותם בבקבוקי ריבה באופן באותה פריסה. מכסים את הבקבוקים בפקקים וחותמים בפילם.
    3. לנער את הבקבוקים כדי לערבב את הדיסק פטרייתי עם זרעי חומוס באופן אחיד.
    4. דגירה את הבקבוקים ב 30 מעלות צלזיוס במשך 15 ימים בחושך.
    5. קח בקבוקי ריבה עם צמיחה פטריית שחורה (איור 4iii) ולהעביר את התרבות החולה (זרעים עם microsclerotia) מבקבוקי ריבה לצלחת פטרי זכוכית באמצעות מלקות סטריליות. לייבש אותם בטמפרטורת החדר במשך יומיים בצלחת פטרי זכוכית.
    6. אבקת מסה פטרייתית באמצעות מרגמה ועלי, ולאחסן את האבקה ב 4 מעלות צלזיוס.
    7. Autoclave Soilrite פעמיים ב 121 ק"ג במשך 15 דקות.
    8. ייבשו את תערובת האדמה המשובכת תחת שמש.
    9. מערבבים את האבקה הפטריתית עם Soilrite ב-50% w/w, ממלאים את הסירים בתערובת, ולשמור אותם בטמפרטורת החדר למשך יום.
    10. לזרוע זרעי חומוס רגישים ל-DRR לכל סיר (10 ס"מסיריםעגולים) ולשמור על רמת לחות של 80% קיבולת שדה (FC).
    11. צפה בסימפטומים כגון נמק ודהיב שורש על ידי עקרו את הצמחים לאחר נביטה.
  3. הערכת יעילות סיר חולה
    הערה: צמחים מראים תסמיני פליאר צהוב כאשר השורשים רקובים לחלוטין.
    1. לפתח ציון מחלה המבוסס על הנגע (נקודות נמק) (דמות משלימה 2C) מספרים וחומרת ריקבון שורש. סירים חולים מראה 90% מוות צמח יכול לשמש עוד יותר.
  4. הקרנת גנוטיפ
    1. הכינו את התרבות החולה בכמויות גדולות ומערבבו אותה עם Soilrite מעוטר או אדמת שדה (5% w/w) בסירים בגובה 30 ס"מ. להשקות את הסירים כדי להרטיב את פני השטח ולהשאיר אותם ללא הפרעה במשך שבעה ימים.
    2. לזרוע זרע אחד מעוטר פני השטח לכל סיר עגול 10 ס"מ ושלושה זרעים לכל סירים עגולים 30 ס"מ להשקות אותם כראוי.
    3. שימו לב לתסמיני הפוליאר הצהובים והריקבון של השורש.
  5. בצורת משולבת וזיהום ר. באטיקולה
    1. לכפות לחץ בצורת על ידי ביצוע הפרוטוקולים המוזכרים בSineha ואח '. (2019).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מחקר זה נועד להפגין טכניקות כגון נייר כתמים וטכניקות סיר חולה כדי להקל על הבנה פתומורפולוגית ומולקולרית של אינטראקציה צמח-פתוגן תחת לחץ בצורת. כדי להשיג זאת, צמחים המציגים תסמיני DRR1,3,4 נאספומתוך שדה חומוס, והפטרייה הייתה מבודדת באמצעות שיטת קצה hyphal8. תרבות פטרייתית באטיקולה מופיעה אפור כהה על צלחת מחשב כף יד ושיפוע על ארבעה ימים לאחר הדגירה (איור 1A & C) וכהה יותר בצבע אפור במדיום PDB על חמישה ימים לאחר הדגירה ( איור1B). ר. באטיקולה יש ספיגה mycelia (איור 1D), והוא מייצר microsclerotia (איור 1E), אשר פועלים כאינוקולום העיקריבאדמה 10.

השלבים שניתנו באות 2 בוצעו כדי לבצע את טכניקת הנייר ההתנפחות. צמחים בני שמונה ימים נדבקו ב-inoculum נוזלי (50%), ושמונה ימים לאחר הזיהום, צמחים נצפו לתסמינים. צמחים הראו ריקבון שורש בגלל נמק נרחב, כמו גם צהבהב עלה, שהוא הסימפטומים האופייניים שורש וfoliar של מחלת DRR (איור 3B ו דמות משלימה 1A).

טכניקת סיר חולה בוצעה באמצעות השלבים המוצגים איור 4. ריכוזי אינוקולום פטרייתי בSal and Soilrite וקרקע שדה היה 10% ו 5%, בהתאמה. זרעים רגישים DRR להראות את הסימפטומים DRR טיפוסי כגון ריקבון שורש, חוסר שורשים לחוץ, צהבהב עלה, ומוות בטרם עת, בהשוואה לצמחיבקרה (איור 5A ו- B). צמחים נתון לזיהום בסיר חולה עשה עם Soilrite מת והראה ריקבון שורש שבעה ימים לאחר זורע(איור 5C ו דמות משלימה 2C). בינתיים, צמחים הגדלים בסיר החולה עשוי אדמת שדה הראו תסמינים עלווה טיפוסית, כלומר, עלווה בצבע קש 48 ימים לאחר זורע(איור 5E).

השפעת הבצורת על מחלת DRR נחקרה גם בסיר החולה בתנאי מעבדה. הלחץ בצורת הוטל על ידי מניעת מים3. הצמחים תחת לחץ בצורת (30% FC) הראו שכיחות מחלה בנסיבות מחמירות בהשוואה לצמחים שטופלו בפתוגן בלבד (90% FC)(איור 6A ו-B). בקרה ובצורת שטופלו צמחים לא הראו כל סימפטומים(איור 6A ו-B). שורשים תחת לחץ משולב היו יותר כתמים נמק ונרקב לעומת צמחים פתוגן בלבד (איור 6B).

Figure 1
איור 1: תכונות מורפולוגיות אופייניות של ראיזוקטוניה באטיקולה. הסוכן סיבתי של ריקבון שורש יבש(Rhizoctonia bataticola, ITCC 8635) היה מבודד מהשדה (המכון הלאומי לחקר הגנום צמח, ניו דלהי, 28.6139 ° N, 77.2090 מעלות E). מהתרבויות בודדה הפטרייה בשיטת קצה ההייפ8. התמונות מראות את תרבות ר' באטיקולה בת 4 ימים בתפוחי אדמה בצלחת פטרי (A), תרבות נוזלית בת חמישה ימים (B), ותרבות שיפוע בת 10 ימים (ג). מיקליה פטרייתית(D)ומיקרוסקופי (חצים שחורים) (E) הקניטו על שקופית מיקרוסקופ מוכתמת WGA-FITC וכחול אנילין, בהתאמה. תמונות (E, F, סרגל קנה מידה, 20, ו 50 μm) נתפסו תחת עדשת האובייקטיבית 20x ו 40x של מיקרוסקופ epifluorescent. חצים לבנים מראים את הקירות הצולבים במיליה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: שלבים המעורבים בחיסון R. bataticola ו- DRR בטכניקה נייר מחיקה. משטח לחטא את הזרעים על ידי העברתם דרך מי ברז זורמים ושטיפה עם 2% נתרן hypochlorite, ואחריו כביסה עם מי RO סטריליים 3-4 פעמים (שלב 1). לאחר מכן, לזרוע 30 זרעים בסירים 15 ס"מ גבוה המכיל Soilrite (שלב 2) ולאפשר את הזרעים לגדול במשך שמונה ימים בחדר צמיחה עם 28 °C ± 2 ° C טמפרטורה, 16 h photoperiod בעוצמה קלה של 150 μmol m-2 s1, ולחותיחסית של 70% (שלב 3). לעקרו את הצמחים ולשטוף אותם במים עיקור (שלב 4). הכן את אינוקולום פטרייתי על ידי לחסן 500 mL PDB מדיה עם פטרייה (שלב 5). לזיהום, השתמשו בתרבות מרק פטריות בת 5 ימים. לאחר מכן, לחסן את הצמחים על ידי טבילה השורשים לתוך inoculum פטרייתי בבקת במשך 30 s ולהסיר עודף inoculum על ידי נגיעה הקיר הצדדי הפנימי של הבקת (שלב 6). לאחר הזיהום, מניחים צמחים מחוסנים פטרייתיים ומחוסנים מדומה בניירות כתמים שונים במגשים נקיים נפרדים (שלב 7). להניח את נייר הכתמים עם מים סטריליים נאותה מדי יום ולהתבונן בסימפטומים, viz., שפיכה של שורשים לחוץ, צהבהב ונבול של עלי צמח, זרעים רקובים, ודהיב שורש בשמונה ימים לאחר הזיהום (שלב 8) (א). תמונות מייצגות שלבים חיוניים (שלבים 3-7) (ב). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: תסמיני מחלת DRR בחומוס המבוסס על טכניקת נייר הכתמים. בעקבות הפרוטוקול המתואר בדמות 2, צמחים רגישים DRR (גנוטיפ, JG 62) היו נתונים לזיהום באמצעות טכניקת נייר כתמים, ותסמינים נתפסו שמונה ימים לאחר הזיהום. תמונות מראות את צמחי הבקרה המייצגים (מחוסנים מדומה) עם צילומים בריאים (חץ אדום) ושורשים עם שורשים לחוץ יותר (חץ צהוב) (A). תמונות מראות את הצמחים הנגועים הנציג עם תסמינים אופייניים, כגון נבול, צהבהב, וייבוש של עלים (חצים כחולים) ושורשים מיובשים / נמקים עם פחות שורשים לחוץ (חציםלבנים)( B ). סרגל קנה המידה הוא 1 ס"מ. הניסויים חזרו על עצמם לפחות חמש פעמים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: סקירה של הכנת סיר חולה עבור R. bataticola חיסונים ומחלת DRR אומר. הכינו את האינוקולום הפטריתי על ידי חסון צלחת מחשב כף יד עם דיסק פטרייתי של 5 מ"מ של תרבות פטרייתית הגדלה באופן פעיל ותדגירה ב-28°C למשך עשרה ימים. לאחר מכן, להכנת המקום, שטפו את זרעי החומוס עם מי ברז, השרו את הזרעים במים למשך הלילה, והובלו ב-50 ק"ג למשך 15 דקות. לאחר מכן, לחסן 100 גרם של הצוללת עם שלושה אטמי אגר מתרבות 10-יום ולערבב היטב. לאחר מכן, דגירה את החתמה מחוסנת ב 30 מעלות צלזיוס במשך 15 ימים באינקובטור. לרסק את התרבות החולה (החתמת פטריות גדל), לייבש ולאבק אותו, ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לערבב 50 גרם של תרבות חולה עם 100 גרם של Soilrite יבש ביסודיות (סיר חולה) (א). לאחר מכן, לזרוע את זרעי חומוס רגישים פני השטח ולהתבונן בסימפטומים, viz., רוט ברז ריקבון שורש, נמק שורש רוחב, וצהבהב עלה. להטמיע את הצמחים מראה סימפטומים באותו סיר. לניסויים נוספים, השתמשו בסירים המציגים 90% זיהום כגנוטיפ רגיש. התמונות מייצגות את האנוקולום (i), את המקום (ii), ואת השליטה ואת תרבות החולים המחוסנת (iii) (B). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: תסמיני מחלת DRR בחומוס המבוסס על טכניקת סיר חולה. להכנת סיר חולה, נעשה שימוש בפרוטוקול המתואר בדמות 4. לאחר מכן, זרעי חומוס רגישים ל-DRR (JG 62) נזרעו בפקד(A)וסיר חולה(B). כל צמח בסיר מייצג שכפול אחד, וצמיחת צמחים מתים או מעוכלים נצפתה בסיר החולה. צמחים בצד ימין של הפאנל(C) מצביעיםעל נוכחות והיעדר שורשים לעיבר (חץ צהוב) בשליטה ובטיפול, בהתאמה. הגרף מציג את מספר הצמחים המתים בטיפול בחשיש החולה בהשוואה לבקרה (D). סיר החולים הוכן על אדמת שדה עיקור שנאספו שדה NIPGR, ותרבות חולה היה מעורב. זרעים מחטאים נזרעו, ותסמיני המחלה נתפסו 48 ימים לאחר הזריע. התמונה מציגה את צמחי הבקרה(E),ואת הסימפטומים טיפוסיים של ה-DRR, כלומר, ייבוש הצמחים( חצים לבנים). משמעות סטטיסטית נקבעה באמצעות מבחן tשל סטודנט. מייצג את ה- SEM של תשעה משכפלים ביולוגיים, והסטרית מציינת ערך משמעותי סטטיסטית ב- P < 0.0001. החץ הצהוב מצביע על שורש ראשי נמק/רקוב ומיובש ללא שורשים לרוחביים. ניסויים חזרו על עצמם לפחות עשר פעמים, עם תוצאות דומות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: שיטת סיר חולה שימושית כדי ללמוד את ההשפעה של מתח בצורת על אינטראקציה צמח-פתוגן. ניסוי סיר נערך כדי לחקור את ההשפעה של בצורת על זיהום R. bataticola. הניסוי כלל שליטה, בצורת בלבד, פתוגן בלבד(ר. באטיקולה,פתוגן), ובצורת משולבת ומתח באטיקולה (מתח משולב). צמחים גדלו בחדר צמיחה עם 28 °C ± 2 מעלות צלזיוס טמפרטורה, 16 שעות photoperiod בעוצמה קלה של 150 μmolm -2 s-1, ו 70% לחות יחסית. סיר החולים הוכן כך דרך הפרוטוקול המתואר בדמות 4. לאחר מכן, גנוטיפ חומוס רגישים DDR משטחית (JG 62) זרעו בשליטה סירים חולים. טיפולים בקרה ופתוגן הופשטו לאורך כל הניסוי. לחץ בצורת הוטל על צמחים תחת בצורת וטיפול לחץ משולב. המים הוסתרו 18 ימים לאחר הזורע, ומפלס הבצורת הרצוי הושג 24 ימים לאחר הזורע. צמחים נצפו לתסמינים 29 ימים לאחר הזורע. התמונה מציגה את שינויי הפוליאר והשורש תחת טיפולים (A). תמונות מראות שורשי צמחים לא מוכתמים שנצפו תחת עדשת האובייקטיבית 0.5X של סטריאומיקרוסקופ מחקר SMZ25/SMZ18 (B). החץ האדום מציין את השורשים הניציים הלא נגועים, והחיצים השחורים מצביעים על השורשים הנגועים לצימק. ניסויים חזרו על עצמם לפחות עשר פעמים, עם תוצאות דומות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

איור משלים S1: גודל Inoculum וצמצום מספר שורש רוחבי בחומוס. בעקבות הפרוטוקול המתואר בדמות 2, צמחים רגישים DRR (גנוטיפ, JG 62) היו נתונים לזיהום עם גודל מגוון של אינוקולום באמצעות טכניקת נייר כתמים, ותסמינים נתפסו שמונה ימים לאחר הזיהום. צמחים היו מחוסנים עם גודל inoculum מגוון (0.1%, 1%, 10% ו 20% w / v במים)תמונות להראות את הצמחים הנגועים נציג עם תסמינים אופייניים כגון נבול, צהבהב, וייבוש של עלים ושורשים מיובשים / נמק עם שורשים לרוחב פחות (B). גרף מראה את מספר השורשים לסוף בצמחים תחת זיהום עם וריאציה inoculum (B). סרגל קנה המידה הוא 1 ס"מ. n = 10. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.

דמות משלימה S2: תסמיני בוליאר של DRR בחומוס ב soilrite. בעקבות הפרוטוקול המתואר בדמות 4, זרעים מחטאים נזרעו, ותסמיני המחלה נתפסו ב-14 ימים לאחר הזריעתם. התמונה המייצגת מציגה את צמחי הבקרה (A), והתמונה מציגה את הסימפטומים האופייניים של ה-DRR, כלומר ייבוש צמחים (חצים לבנים) (B). ציון המחלה פותח בהתבסס על נקודות נמק על השורשים. הניקוד פותח במהלך הימים (ג'). התמונות (A&B) הן מאותו ניסוי. סרגל קנה מידה = 3 ס"מ. n = 10. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

טכניקת הנייר הנוהקת מספקת גישה פשוטה לגנוטיפים של חומוס על המסך בתנאי מעבדה. מחיסון מטבל מאפשר חקירה של אינטראקציה על בסיס זמני עם שליטה קלה על עומס inoculum (דמות משלימה 1) ומאפשר בהקרנה חוץית. יתר על כן, אפילו שתילים צעירים יכולים לשמש. תרבות פטרייתית בת חמישה ימים(איור 1B)יכולה להניב מספיק לאנוקולום כדי להדביק את הצמחים. אינוקולום נוזלי מכיל הן מיקליה והן מיקרוסקלרוטציה (איור 1D & E). תסמיני ריקבוןשורש (איור 3B)יכול לשמש כדי להבקיע את המחלה ולזהות גנוטיפים עמידים. מופע DRR מושפע במידה רבה מלחץ בצורת1,3,5. עם זאת, עם טכניקה זו בלבד, הטלת מתח בצורת היא בלתי אפשרית, והקרנה עם טכניקה זו לא תשקף תגובות טבעיות.

טכניקת סיר חולה מאפשרת את המחקר של האינטראקציות בין צמחים, פתוגנים, ומתח בצורת. הוא מספק דרך לסנן את הגנוטיפים תחת בצורת משולבת ומתח פתוגן כדי לזהות גנוטיפים עמידים. בסיר חולה, לחץ בצורת ניתן להטיל בכל גיל של הצמח ולסנן את הצמחים. צמחים מראים סימפטומים DRR טיפוסי(איור 5C & F ו דמות משלימה 2B & C) בשיטת סיר חולה. צמחים נתון בצורת משולבת וזיהום פתוגן הראה ריקבון שורש חמור בהשוואה לטיפול פתוגן בלבד. זה מרמז על כך שחיידקי חומוס זמינים צריך להיות מוקרן כדי לזהות גנוטיפ עמיד לא רק פתוגן אלא גם פתוגן משולב ומתח בצורת. מספר מחקרים נוסו קודם לכן כדי לסנן את הגנוטיפים אבל באמצעות טכניקת ניירכתמים 11,12. חוץ מזה, סינון שדה נערך גם כן, אבל בלי הטלתמתח בצורת 11. זה חיוני כדי לכפות מתח בצורת בשלבים שונים של חומוס ולהעריך את התגובה הגנוטיפ.

צרות בירי

עבור טכניקת נייר הכתמים, נפח אינוקולום בבקת צריך להיות ברמה שבה כל שורש הצמח טבול. בנוסף, השקיה עודפת תוביל לריקבון רטוב של שורשי הצמח. אין להשתמש מי ברז להשקות את הצמחים כי זה יכול לגרום לזיהום.

עבור טכניקת סיר חולה, זני חומוס דסי עדיפים. מספר הזרעים עשוי להשתנות בהתאם לצרכי החוקרים. נפח המים המשמשים להשריה זרעים צריך להיות פי שלושה יותר כי הזרעים לטבול מים. צמיחה חיידקית תתרחש אם הכביסה לא נעשית כראוי. מים שאינם משועבדים אוטומטית יכולים לשמש להשרת הזרעים. צבע הזרעים לאחר autoclaving צריך להיות שחור במקום חום, אשר מציין autoclaving לא תקין. מעל ייבוש בתנור אוויר חם מוביל לייבוש הזרעים; זרעים כאלה לא יכולים לשמש עבור חסון פטרייתי. לחסן את הבקבוקים מחוץ לזרימת למינאר עלול לגרום לזיהום. גידול פטרייתי לבן בארוחה חומוס מחוסן הוא סימן של autoclaving לא תקין. יש לנקוט באמצעי זהירות בטיחות ביולוגית בהשלכת ה-inoculum המשמש, נייר ההשחתה והצמחים הנגועים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין לנו מה לחשוף.

Acknowledgments

פרויקטים במעבדת M.S.K נתמכים על ידי המכון הלאומי למימון הליבה של מחקר הגנום של הצמח. VI מאשרת DBT-JRF (DBT/2015/NIPGR/430). אנו מודים לסטודנטים מתאמנים, מיס רישיקה, מר ג'ייאכנדריאן ומיס דורגדבי על עזרה טכנית במהלך צילומי וידאו ומר סנדיפ דיקסיט, מיס אנג'אלי וד"ר אווניש ראי על הערכה ביקורתית של נתונים גולמיים וקבצי כתב היד. אנו מודים למר רחים ה. טראפדר ולמר סונדר סולנקי על עזרתם במעבדה. אנו מכירים DBT-eLibrary קונסורציום (DeLCON) ו ספריית NIPGR למתן גישה למשאבים אלקטרוניים ומתקן צמיחה צמח NIPGR עבור תמיכה צמח צמיחה / שטח.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fungus- Rhizoctonia bataticola Pathogen inoculum Indian Type Culture Collection No. 8365 GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article&
id=1251&Itemid=1370)
Soilrite mix Soil medium in the lab Keltech Energies Limited, Bangalore, India http://www.keltechenergies.com/
Filter paper Blotting paper to support the plant growth Himedia http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374
Pot Growing plants 10 and 30 cm size pots Routinely used nursery pots, for example, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html
Potato dextrose agar/broth Culture and maintain the fungus Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946
Incubator Culture the fungus LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator, and shaker http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131
Growth chamber Growing plants in controlled condition Model No. A1000, Conviron, Canada https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber
Laminar airflow Carrying out aseptic exercises Telstar, Bio II advance, Class II cabinet, EN-12469-2000 https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html
Mesh Filtering the fungal mycelia Nylon mosquito net Mesh with 0.6-1 mm diameter pore size
Autoclave Autoclaving media and chickpea seeds Autoclave http://www.scientificsystems.in/autoclave
Microscopes Visualizing the infection ang fungal mycelia SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopes, Leica EZ4 educational stereomicroscope https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18

https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/

https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i
Weighing balance Weighing fungus and chemicals Sartorius Electronic Weighing Balance, BSA 4202S-CW https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances
WGA-FITC Fungus staining Sigma https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en&region=IN
Aniline blue Fungus staining Himedia http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sharma, M., Ghosh, R., Pande, S. Dry root rot (Rhizoctonia bataticola (Taub.) Butler): an emerging disease of chickpea - where do we stand. Archives of Phytopathology and Plant Protection. 48 (13-16), 797-812 (2015).
  2. Srinivas, P. Studies on dry root rot of chickpea (Cicer arietinum L.). , Available from: http://krishikosh.egranth.ac.in/handle/1/93135 (2016).
  3. Sinha, R., Irulappan, V., Mohan-Raju, B., Suganthi, A., Senthil-Kumar, M. Impact of drought stress on simultaneously occurring pathogen infection in field-grown chickpea. Scientific Reports. 9 (1), (2019).
  4. Nene, Y., Haware, M., Reddy, M. Chickpea diseases: resistance screening techniques, information bulletins No. 10. Patancheru. Information Bulletin No. 10. Patancheru, A.P., India: International CroDS Research Institute for the Semi-Arid Tropics. , 1-10 (1981).
  5. Pande, S., Krishna Kishore, G., Upadhyaya, H. D., Narayana Rao, J. Identification of sources of multiple disease resistance in mini-core collection of chickpea. Plant Disease. , (2006).
  6. Pandey, P., Irulappan, V., Bagavathiannan, M. V., Senthil-Kumar, M. Impact of combined abiotic and biotic stresses on plant growth and avenues for crop improvement by exploiting physio-morphological traits. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
  7. Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. Morpho-physiological traits and molecular intricacies associated with tolerance to combined drought and pathogen stress in plants. Biotechnologies of Crop Improvement, Volume 3: Genomic Approaches. , (2018).
  8. Jensen, A. B., et al. Standard methods for fungal brood disease research. Journal of Apicultural Research. 52 (1), 1-39 (2013).
  9. Agrios, G. Plant Pathology: Fifth Edition. , 9780080473 (2004).
  10. Coley-Smith, J. R., Cooke, R. C. Survival and germination of fungal sclerotia. Annual Review of Phytopathology. , (1971).
  11. Nagamma, G., Saifulla, M., Sab, J., Pavitra, S. Screening of chickpea genotypes against dry root rot caused by Macrophomina phaseolina (tassi) goid. 10 (4), 1795-1800 (2015).
  12. Infantino, A., et al. Screening techniques and sources of resistance to root diseases in cool season food legumes. Euphytica. 147 (1-2), 201-221 (2006).
  13. Khaliq, A., et al. Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition. Biotechnology Reports. 25, 00423 (2020).

Tags

ביולוגיה גיליון 167 Cicer arietinum ריזוטוניה בטיקולה סיר חולה נייר מבעבע מתח בצורת מיקלולוגיה ביולוגיה צמחית זיהום פטרייתי פרוטוקול הקרנה ביולוגיה מולקולרית פתולוגיה עמידות למחלות
שורש יבש רוט רוט מחלה אומר חומוס: מתודולוגיה מפורטת
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. Dry … More

Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: a Detailed Methodology. J. Vis. Exp. (167), e61702, doi:10.3791/61702 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter