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Biology

ひよこ豆の乾燥した根腐れ病アッセイ:詳細な方法論

Published: January 17, 2021 doi: 10.3791/61702

Summary

本研究では、ひよこ豆-根支バタチコラ 相互作用の根底にある病態分子メカニズムを研究する方法論を提示する。ブロッティングペーパー法は、ひよこ豆遺伝子型応答を迅速に研究するのに有用であり、病気のポットベースの方法は、同時に干ばつと R.バタチコラ 感染を課し、寛容な遺伝子型のスクリーニングに使用することができます。

Abstract

乾燥した根腐れ(DRR)病は、世界中のひよこ豆栽培に対する新たな生物ストレスの脅威です。これは、土壌媒介性真菌病原体、 根支バタチコラによって引き起こされます。文献では、疾患アッセイに関する包括的かつ詳細なステップバイステップのプロトコルはまばらである。この記事では、DRRに対する耐性の遺伝子型をすばやくスクリーニングするためのブロッティングペーパー技術の設定に関する手順の詳細を提供します。ブロッティング紙の技術は簡単で安価です。病気のポットアプローチに基づくもう 1 つの方法は、自然感染の模倣であり、疾患の三角形に関与する相互作用コンポーネント(植物、病原体、および環境)を研究するために適用することができます。

さらに、自然界では、DRRは主に雨が降ったひよこ豆栽培地域で発生し、作物の成長が進むにつれて土壌水分が後退します。干ばつストレスは、DRR病にひよこ豆植物を素因とすることが知られています。干ばつストレス下での植物と病原体の相互作用の病態および分子的理解は、ひよこ豆の生殖器プールからのエリートDRR耐性品種の同定のための道を開くことができる。本稿では、病的なポットの調製とその後の疾患アッセイのための段階的な方法論を提供する。全体として、本明細書に提示された情報は、研究者が R.バタチコラ 真菌接種を準備し、この病原体を維持し、ブロッティングペーパー技術を設定し、病気の培養および病気のポットを準備し、ひよこ豆植物における病原体感染を評価するのに役立ちます。

Introduction

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乾燥した根腐れ(DRR)は、ひよこ豆1、2の経済的に重要な疾患の一つである。これは、根性バタチコーラ(テレオモーフ、マクロフォミナフェイショウチリーナ)によって引き起こされる根特異的疾患である。感染した植物は横根を欠き、脆いタップルートと黄色の葉1、3を所有しています。干ばつストレス下のDRRは、ひよこ豆栽培1、2、3に対する新たな脅威であると報告されている。さらに、DRRの発生率は、フィールド条件1、2、3の下で干ばつストレス下で悪化すると報告されている。DRRは、灌漑されたフィールド4よりも雨の多い地域で一般的です。耐性品種の利用は、病気を克服し、殺菌剤の使用を回避する方法です1,13.世界中で利用可能なひよこ豆の生殖器は、形質5の遺伝的変異を抱えているため、作物改善のための分子繁殖には耐性/感受性遺伝子型のスクリーニングおよび同定が重要である。

ひよこ豆のR.バタチコラ感染パターンを調査するには、堅牢で簡単で費用対効果の高い疾患アッセイが不可欠です。R.バタチコラ感染症に対するひよこ豆遺伝子型の応答を観察するために使用される主要な疾患アッセイは、ブロッティングペーパー技術1,4である。それは簡単な技術であり、液体真菌の接種、根を持つ苗、および無菌ブロッティング紙を使用して実行することができる。しかし、この技術は、文献で利用できるステップバイステッププロトコルがないため、最大限に活用されていません。

一方、シックポット技術は、潜在的な病気の文化の準備と干ばつストレスの賦課を含みます。干ばつストレスがDRR病の発生率を悪化させることを考えると、干ばつストレス6、7の下で植物病原体の相互作用を研究することが不可欠である。シックポット技術は、このような同時研究のためのプラットフォームを提供し、胚芽スクリーニングのためのより良い可能性を促進し、相互作用の機械主義的基礎を理解する。DRR病に固有の根長の増加や横根数の減少などの病態変化は、シックポット手法1、3、7を使用して対処することができる。

本明細書において、ひよこ豆と R.バタチコラ とスクリーンひよこ豆の細菌との相互作用を研究するために使用することができる紙およびシックポット技術をブロッティングするための詳細なプロトコルが提示される。研究で使用される材料の詳細は、材料表に示されています。

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Protocol

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1. R. バタチコラ とストレージの分離

  1. ひよこ豆遺伝子型とDRR症状の詳細
    1. 一般的に典型的なDRR症状を示すひよこ豆植物(遺伝子型、JG62)を用いて、樹皮の下およびピス1、3の下に横根と微小動脈を持たない乾燥した脆い原根のような一般的なDRR症状を示す。
  2. 収集と洗浄
    1. 乾燥したわら色の葉膜や表皮層の下に微小動脈を持つ脆い原根などの症状を示す根根植物。根こそぎにしている間、感染した根が脆くなるにつれて、根の大部分は土壌の中に残ります。根に付けられた粗い土の破片を取り除きます。根を別々に切り取り、適切なラベルを貼った紙の封筒(27.5 cm x 12 cm)に集め、サンプルの採取ボックスに入れます。
    2. サンプルを実験室に運んだ後、根を200 mLビーカーに入れ、メッシュ(直径3mmの細孔サイズのナイロンメッシュ)で覆い、根を水道水で十分に洗い流して土壌粒子を除去します。
    3. 逆浸透(RO)水を使用して、最後に一度すすきます。
  3. 表面滅菌
    1. 根を2cmの長さの4つに分割し、メスの刃を持ち、清潔な200 mLビーカーに入れます。
    2. オートクレーブRO水、2%NaOCl、廃棄瓶、およびオートクレーブブロッティングペーパー(5cm2)を層流チャンバー内に組み立てます。
    3. 50 mLのオートクレーブRO水で根を洗い、その後50 mLの2%NaOClで10分間洗浄します。50mLのRO水で根を3回洗い、NaOClを取り除きます。
    4. ブロットは、オートクレーブブロッティング紙の上に根を置くことによって根を乾燥させ、根が乾燥するまで放置します。
  4. メディアとインキュベーション
    1. 滅菌メスの刃で根の端を取り除きます。ブレードを使用して根を分割し、滅菌された鉗子を使用して、ストレプトマイシン硫酸塩(50mgL-1)およびアンピシリン(50mgL-1)を含むペトリプレートをポテトデキストロース寒天(PDA)培地に置く。
    2. プレートを閉じ、パラフィルムで密封し、暗闇の中で28°Cのインキュベーターで2日間インキュベートします。
  5. ヒファール先端法
    1. 2日間のインキュベーションの後、プレートを層流チャンバーに持ち込みます。ヒファル成長8 の先端を実体顕微鏡(ライカEZ4教育用実体顕微鏡)で切り、スルフェートとアンピシリンを含む新鮮なPDAプレートに移します。
    2. 28°Cのインキュベーターで、暗闇の中で10日間インキュベーターにプレートをインキュベートします。
  6. R.バタチコラ菌接種の保管とメンテナンス
    1. 試験管でPDAスラントを作り、炎殺菌接種ループを使用して10日前の培養プレートから真菌寒天プラグを移します。パラフィルムで試験管キャップを密封します。
    2. 暗闇の中で10日間、28°Cでスラントをインキュベートします。
    3. キャップをパラフィルムでシールし、4°Cで冷蔵庫に保管して、今後の使用に備えます。
    4. 真菌を維持するために6ヶ月ごとにサブカルチャー。
  7. 毒性の維持
    1. 病気のポット技術3で述べたように調製純粋な真菌接種で植物に感染する。感染した植物(コッホの後述)9 から同じ真菌を分離し、さらなる実験に使用する。
      注:本研究では、真菌の単離株を用いた(GenBank: MH509971.1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH509971)

2. ブロッティング紙の技術

注:ブロッティングペーパー技術は、液体真菌接種、苗の調製、および疾患評価の調製を伴う。

  1. 液体 R.バタチコラ 接種の調製
    注:液体 R.バタチコラ 真菌接種は、ミセリアとミクロクレローティアの両方が含まれています。これらの構造は両方とも一次接種として機能する。
    1. 1,000 mL フラスコに500 mLのPDB培地を用意し、121ポンドでオートクレーブして15分間準備します。
    2. メディアが冷却された後、真菌の斜めの培養から真菌類寒天プラグのループでスープを接種し、暗闇の中で180 rpmのシェーカーで28°Cで5日間インキュベートします。
    3. オートクレーブガラスまたはプラスチック漏斗(10cm)、1リットルの円錐形フラスコ、および2層のメッシュ(10 cm2 サイズ)(直径3mmの細孔サイズのナイロンメッシュ)をテーブルに組み立てます。メッシュを使用して真菌菌叢とミクロクレローティアを除外します。ブロットは、オートクレーブブロッティングペーパーで真菌を乾燥させます。
    4. 50%の接種のための100グラムの菌体の重量を量り、室温で保ちます。
  2. ひよこ豆植物の準備
    1. 50種の健康な種子(本研究では、DRR感受性遺伝子型JG 62を使用)、100 mLビーカーに入れ、メッシュで覆います。
    2. まず水道水で種を洗い、土壌の破片を取り除きます。
    3. 種子を付けて層流チャンバーにシーズを取り込み、洗浄ごとに1分間、50mLのRO水を殺菌して洗浄します。
    4. 2%水性NaOClの50 mLで2分間連続的に振るとともに種子を殺菌し、50mLの滅菌水を5回5回1分間洗浄します。
    5. ポリテーンバッグ(47.5 cm x 25 cm)に土壌(園芸グレード拡張パーライトの混合物) アイリッシュ泥炭苔、剥離したバーミクーライトを等比で1/3:1/3:1/3)、表面滅菌した50種を2cm深くまき、28°Cの2°C±2°Cの成長室/部屋に保管し、光強度150 μmol m2 -1 s-1、相対湿度70%の湿度を有する。RO水でそれらを水にし、播種の8日後に植物を根こそぎにします。
    6. 土壌の粒子を除去するために水道水で根を洗います。根を殺菌したRO水ですすい、RO水に1000 mLビーカーで入れておきます。
  3. トレイ内のブロッティング紙の準備
    1. ブロッティング紙を取り、複製を満たすのに十分な数(30cm×23cm)に切ります。
    2. シートをオートクレーブ可能なポリテーン袋に詰め、121ポンドで15分間オートクレーブし、乾燥のための熱風オーブンに保管してください。
    3. 各ブロッティング用紙を半分に折ります。
    4. 図 2i-ivに示すように、紙を清潔で精神で拭いたプラスチックトレイの上に置きます。
  4. 浸漬による植物接種
    1. 200 mL のオートクレーブ RO 水に 100 gの真菌接種液を 200 mL で溶解し、50% の接種を得る。
    2. 調製した接種物に植物の根を1分間浸し、断続的な上下運動を行い、真菌内の一様な付着を確実にします。
  5. ブロッティング紙に植物を配置する
    1. トレイに置かれたブロッティングペーパーの底面を滅菌RO水で濡らします。根だけが紙で覆われ、芽が取り残される方法で、植物を紙の上に置きます。
    2. ブロッティングペーパーの上面を折りたたんで閉じ、植物の成長を維持するのに十分な水を提供するために紙全体を濡らします。
    3. 1日1回トレイに水をやり、トレイを28°Cに保ちます。 壊死、根腐れ、葉の黄変などの症状を毎日観察してください。

3. シックポットテクニック

注:病気のポット技術は、有害な接種と病気のポットの調製、水分レベルの維持、および病気の症状の評価を伴います。

  1. 基板の作製
    1. 市販のひよこ豆の種子を1kg摂取してください。感染した種子(真菌の増殖、感染スポット、昆虫の損傷を伴う種子)を除去する。5 Lプラスチックビーカーに入れ、水道水で3~4回徹底的に洗い、大きな破片を取り除きます。
    2. 2 LのRO水で種を洗い、5Lビーカーに1kgの種子を5倍の水で浸します。
    3. 種子が水を浸透したら、RO水で再洗浄して種子が滲出します。
    4. 水を完全に取り除き、ジャムボトル(300mL、高さ12cm、直径6cm、体重155g)で約1/4 の容量(ジャムボトルあたり100g)に種子を詰め、キャップでボトルを閉じます。10個のジャムボトルをオートクレーブ可能なビニール袋(48 cm x 30 cm)のオートクレーブに121ポンドで2回パックし、15分間連続してパックします。
    5. オーブンで40°Cの種子を一晩乾燥させ、ボトル内の水滴を取り除きます。
  2. 病気文化の準備
    1. BSL-2レベルの層流れチャンバーをオンにします。70%エタノールで床を十分に拭き、15分間紫外線をオンにします。次に、ラミナーフローチャンバー内に種子を保管します。
    2. 10日齢の孤立した R.バタチコラ 文化を取る(パート1)。次に、滅菌ピペットチップまたはコルクボーラーを使用して3本の真菌寒天プラグ(直径4mm)を取り、無菌でジャムボトルに入れます。ボトルをキャップで覆い、パラフィルムでシールします。
    3. ボトルを振って、真菌ディスクとひよこ豆の種を均一に混ぜます。
    4. 30°Cで、暗闇の中で15日間インキュベートします。
    5. 黒い真菌の成長を持つジャムボトル(図4iii)を取り、殺菌鉗子を使用してジャムボトルからガラスペトリプレートに病気の文化(マイクロクレローティアの種子)を移します。ガラスペトリプレートで2日間室温で乾燥させます。
    6. 乳鉢と害虫を用いて菌塊を粉末化し、4°Cで保存します。
    7. 121ポンドで15分間オートクレーブソイルライトを2回行います。
    8. オートクレーブドソイルライトミックスを日よけで乾かします。
    9. 50%w/wでソイライトと真菌粉末を混合し、混合物で鍋を満たし、一日室温でそれらを維持します。
    10. 表面滅菌されたDRR感受性のひよこ豆の種子をポット(10cm丸ポット)(材料表)にまき、80%のフィールド容量(FC)の水分レベルを維持します。
    11. 発芽後に植物を根こそぎにして壊死や根腐れなどの症状を観察する。
  3. 病気のポット効率の評価
    注:植物は根が完全に腐っているとき黄色の葉面症状を示します。
    1. 病変(壊死性斑点)(補足図2C)の数と根腐敗の重症度に基づいて疾患スコアを開発する。90%の植物死を示すシックポットはさらに使用することができます。
  4. 遺伝子型スクリーニング
    1. 病気の文化を大量に準備し、30cmの高さの鍋で殺菌された土壌または畑の土壌(5%w/w)と混ぜます。水に水をやって表面を濡らし、7日間邪魔されずに放置します。
    2. 10 cmの丸い鍋ごとに1つの表面滅菌種子を播種し、30cmの丸い鍋ごとに3つの種子を播種し、それらを十分に水にする。
    3. 黄色の葉前葉と根腐りの症状を観察してください。
  5. 干ばつと R.バタチコラ 感染症を組み合わせた
    1. Sinhaら(2019)で言及されているプロトコルに従って干ばつストレスを課す。

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Representative Results

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本研究は、干ばつストレス下での植物と病原体の相互作用の病態形態および分子理解を促進するための、ブロッティング紙やシックポット技術などの技術を実証することを目的とした。これを達成するために、DRR症状1、3、4を呈する植物をひよこ豆場から採取し、真菌を催眠先端法8を用いて単離した。R. バタチコラ菌培養は、インキュベーション後4日間にPDAプレートに濃い灰色で表示され、傾斜(図1A&C)、インキュベーション後5日間にPDB培地では灰色色で暗くなります(図1B)。R.バタチコラはミセプテミシア(図1D)を有し、土壌10中の一次接種として作用する微小動脈(図1E)を産生する。

図2に示す手順は、ブロッティングペーパー技術を実行するために従った。8日前の植物は液体接種(50%)に感染し、感染後8日後に症状について植物が観察された。植物は、広範な壊死のために根腐を示しただけでなく、葉黄変、これはDRR疾患の典型的な根および葉面症状である(図3Bおよび補足図1A)。

シックポット技術は、図4に示す手順を用いて行った。土壌中の真菌接種物の濃度は、それぞれ10%および5%であった。DRR感受性種子は、対照植物と比較して、根腐れ、横根の欠如、葉黄化、早期死亡などの典型的なDRR症状を示す(図5AおよびB)。ソイルテライトで作られた病気の鉢で感染した植物は死亡し、播種の7日後に根腐を示した(5Cおよび補足図2C)。一方、畑土で作られた病原性鉢で育つ植物は、播種後48日後に典型的な葉前葉症状、すなわちわら色の葉を示した(図5E)。

DRR病に対する干ばつの影響は、実験室の条件下で病気のポットでも研究されました。干ばつストレスは、水を源泉徴収することによって課された 3.干ばつストレス下の植物(30%FC)は、病原体のみ治療(FC)植物と比較して悪化した疾患発生率を示した(図6AおよびB)。制御および干ばつ処理された植物は、何の症状も示さなかった(図6AおよびB)。複合ストレス下の根は、病原体のみの植物と比較して、より多くの壊死的な斑点および腐敗を持っていた(図6B)。

Figure 1
図1:根支座バタチコラの特徴的な形態学的特徴.乾燥根腐敗の因果剤(リゾクトニアバタチコラ、ITCC 8635)は、フィールドから分離されました(国立植物ゲノム研究所、ニューデリー、28.6139°N、77.2090°E)。培養物から、真菌は、催眠先端法8を用いて単離した。画像は、ペトリプレート(A)、5日前の液体培養物(B)、および10日前の斜め文化(C)のジャガイモデキストロース寒天の4日前のR.バタチコラ文化を示しています。真菌菌(D)とマイクロスクレローティア(黒矢印)(E)を顕微鏡スライドでからかわれ、WGA-FITCとアニリンブルーでそれぞれ染色された。画像(E、F、スケールバー、20、および50μm)を、蛍光顕微鏡の20xおよび40x対物レンズの下で撮影しました。白い矢印は、ミセリアの十字壁を示しています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:ブロッティング紙技術におけるR.バタチコラ接種およびDRRアッセイに関与するステップ。表面は、水道水を流し、2%次亜塩素酸ナトリウムで洗浄し、滅菌RO水を3〜4回洗浄することによって種子を殺菌します(ステップ1)。次に、土壌を含む高さ15cmのポットに30種をまき、2°C±2°Cの温度で成長室で8日間、光強度150μmol m-2 s−1の16時間、相対湿度70%(ステップ3)で種子を8日間成長させます。植物を根こそぎにし、殺菌水で洗います(ステップ4)。真菌を500 mL PDB培地に接種して真菌接種を準備する(ステップ5)。感染のために、5日齢の真菌スープ培養を使用してください。次に、30sのビーカーに根を真菌接種液に浸して植物を接種し、ビーカーの内側壁に触れることで余分な接種を除去する(ステップ6)。感染後、真菌を接種し、模擬接種植物を別々のきれいなトレイに別々のブロット紙に入れる(ステップ7)。毎日十分な無菌水でブロッティング紙を湿らせ、症状を観察し、viz.、横根の脱落、植物の葉の黄変としおれ、腐った種子、および感染後8日間の根腐れ(ステップ8)(A)画像は、重要なステップ (ステップ 3 ~ 7) (B) を表します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:ブロット紙技術に基づくひよこ豆におけるDRR疾患症状。図2に示したプロトコルに従って、DRR感受性植物(遺伝子型、JG62)をブロッティングペーパー技術を用いて感染させ、感染後8日後に症状を捕捉した。画像は、健康な芽(赤い矢印)とより横方向の根(黄色の矢印)を持つ根を持つ代表的な対照植物(模擬接種)を示しています(A)。画像は、葉のしおれ、黄変、乾燥(青い矢印)や乾燥/壊死根の少ない側根(白い矢印)(B)などの典型的な症状を有する代表的な感染植物を示している。スケールバーは1cmです。実験は少なくとも5回繰り返した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
4:R.バタチコラ接種およびDRR疾患アッセイのための病的なポット調製の概要。積極的に成長する真菌培養の5mmの真菌ディスクをPDAプレートに接種して真菌接種を準備し、28°Cで10日間インキュベートします。次に、基板を準備するために、ひよこ豆の種子を水道水で洗い、種子を一晩水に浸し、121ポンドでオートクレーブで15分間オートクレーブします。次いで、10日前培養から3つの寒天プラグで基板100gを接種し、よく混合する。次いで、インキュベーターで15日間、30°Cで接種した基材をインキュベートする。病気の培養物(菌体成長基質)を潰し、乾燥して粉末化し、4°Cで保存します。 その後、50gの病気文化を乾燥した土壌100g(シックポット)を徹底的に混ぜ合わせる(A)。次に、表面殺菌された感受性のひよこ豆の種子をまき、症状を観察し、viz.、根腐れ、側面根壊死、および葉黄変を観察する。同じ鉢に症状を示す植物を同化します。さらなる実験のために、90%の感染を示すポットを感受性遺伝子型として使用する。画像は、接種(i)、基板(ii)、及びコントロール及び接種病培養(iii)(B)を表す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:シックポット技術に基づくひよこ豆のDRR疾患症状。シックポットを作る場合、図4に示すプロトコルを使用しました。次いで、表面殺菌されたDRR感受性のひよこ豆遺伝子型(JG 62)種子をコントロール(A)および病鍋(B)に播種した。ポット内の各植物は1つの複製を表し、死んでいるか、または発育されなかった植物の成長は、病気の鉢で観察された。パネルの右側にある植物(C)は、それぞれコントロールと治療における横根(黄色の矢印)の有無を示す。グラフは、コントロール(D)と比較して、病気のポット治療における死んだ植物の数を示しています。病気のポットを、NIPGRフィールドから採取した殺菌されたフィールド土壌に調製し、病気培養を混合した。表面滅菌種子を播種し、播種後48日後に病気の症状を捉えた。画像は、コントロール植物(E)および典型的なDRRの葉面症状、すなわち植物の乾燥が示されている(白い矢印)。統計的有意性は、スチューデントの t-testを用いて決定された。棒は9つの生物学的複製のSEMを表し、アスタリスクはP<0.0001で統計的に有意な値を示す。黄色の矢印は、横根のない壊死/腐った乾燥した原根を示します。実験は少なくとも10回繰り返され、同様の結果が得られた。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:病弱ポット法は、植物と病原体の相互作用に対する干ばつストレスの影響を研究するのに有用である。植えの感染に対する干ばつの影響を調べるためのポット実験を行った。実験は、対照、干ばつのみ、病原体のみ(R.バタチコラ、病原体)、および干ばつとR.バタチコラストレス(複合ストレス)を組み合わせた。植物は28°C±2°Cの温度、16時間の光周期で150 μmolm−2 s-1、相対湿度70%の光強度で成長室で成長させた。病弱ポットは図4に示すプロトコルに従って準備した。次いで、表面殺菌されたDDR感受性のひよこ豆遺伝子型(JG 62)種子をコントロールおよび病気の鉢に播種した。試験を通してコントロールと病原体の治療が灌漑された。干ばつストレスは干ばつと複合ストレス治療の下で植物に課されました。水は播種の18日後に源泉徴収され、所望の干ばつレベルは播種後24日に達した。植物は播種後29日後に症状について観察された。画像は、治療の下での前頭面と根の変化を示しています(A)。画像は、SMZ25/SMZ18研究用実体顕微鏡の0.5X対物レンズの下で観察された未染色の植物根を示す(B)。赤い矢印は感染していない横方向の根を示し、黒い矢印は感染した横根を示します。実験は少なくとも10回繰り返され、同様の結果が得られた。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

補助図S1:ひよこ豆における接種のサイズおよび横根の減少。 図2に示すプロトコルに従って、DRR感受性植物(遺伝子型、JG62)は、ブロッティングペーパー技術を用いて様々な量の接種量で感染し、感染の8日後に症状を捕捉した。植物は、様々な接種接種された(水中の0.1%、1%、10%および20%w/v)画像は、葉のしおれ、黄変、乾燥などの典型的な症状を有する代表的な感染植物を示し、乾燥/壊死した根を少なくする側根(B)。。グラフは、接種原発変動(B)に感染している植物の横根の数を示す。スケールバーは1cmn=10です。 こちらをダウンロードしてください。

補助図S2:土壌中のひよこ豆におけるDRRの葉面症状。 図4に示すプロトコルに従って、表面滅菌種子を播種し、播種後14日に病気の症状を捉えた。代表的な画像は対照植物(A)を示し、画像は典型的なDRRの葉面症状、すなわち植物の乾燥(白い矢印)(B)を示す。疾患スコアは根の壊死性スポットに基づいて開発された。得点は日を越えて開発されました (C).写真(A&B)は同じ実験の写真です。スケールバー= 3 cm. n = 10. こちらをダウンロードしてください。

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Discussion

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ブロッティングペーパー技術は、実験室の条件下でひよこ豆遺伝子型をスクリーニングするための簡単なアプローチを提供します。浸出接種は、接種負荷を容易に制御して時間ベースで相互作用を調査し、インビトロスクリーニングを容易にする。さらに、若い苗も使用できます。5日前の真菌培養(図1B)は、植物に感染するのに十分な接種を生じることができる。液体接種には、ミセリアとミクロクレローティアの両方が含まれています(図1D&E)。根腐れ症状(図3B)は、疾患をスコア付けし、耐性遺伝子型を同定するために使用することができる。DRRの発生は、主に干ばつストレス1、3、5によって影響される。しかし、この技術だけでは干ばつストレス面付けは不可能であり、この技術によるスクリーニングは自然な反応を反映しません。

病気のポット技術は植物、病原体、および干ばつストレス間の相互作用の研究を可能にする。これは、耐性遺伝子型を識別するために、複合干ばつと病原体ストレスの下で遺伝子型をスクリーニングする方法を提供します。病気のポットでは、植物のどの年齢でも干ばつストレスを課し、植物をスクリーニングすることができます。植物は、シックポット法で典型的なDRR症状(図5C&Fおよび補助図2B及びC)を示す。干ばつと病原体感染を組み合わせた植物は、病原体のみの治療と比較して重度の根腐を示した。これは、利用可能なひよこ豆の細菌をスクリーニングして、病原体だけでなく、病原体と干ばつストレスを組み合わせた耐性遺伝子型を同定する必要があることを意味する。いくつかの研究は、遺伝子型をスクリーニングするために先に試みたが、ブロッティング紙の技術11、12を使用して。また、フィールドスクリーニングも行われていますが、干ばつストレス11を課すことなく行われています。ひよこ豆の異なる段階で干ばつストレスを課し、遺伝子型応答を評価することが重要です。

トラブルシューティング

ブロッティング紙の技術では、ビーカー内の接種液の体積は、植物の根全体が浸漬されるレベルでなければなりません。さらに、余分な水を入れると、植物の根の湿った腐敗につながります。汚染の原因となる可能性があるため、水道水を使用して植物に水をやらないでください。

シックポットの技術のために、デジひよこ豆の品種が好ましいです。種子の数は、研究者のニーズによって異なる場合があります。種子は水を浸すので、種子を浸すために使用される水の量は、より3倍にする必要があります。洗浄が正しく行われないと細菌の増殖が起こります。非オートクレーブ水は、種子を浸すために使用することができます。オートクレーブ処理後の種子の色は、不適切なオートクレーブを示す茶色の代わりに黒でなければなりません。熱い空気オーブンで乾燥を過ぎ、種子の乾燥につながります。そのような種子は真菌の接種に使用することはできません。ラミナーフローの外側にボトルを接種すると、汚染を引き起こす可能性があります。接種されたひよこ豆の食事における白い真菌の成長は、不適切なオートクレーブの兆候である。生体安全に関する注意は、使用された接種、ブロッティングペーパー、および感染した植物を廃棄する際に従う必要があります。

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Disclosures

開示するものは何もない

Acknowledgments

M.S.Kラボのプロジェクトは、国立植物ゲノム研究所のコア資金によって支援されています。VI は、DBT- JRF (DBT/2015/NIPGR/430) を確認します。研修生のリシカさん、ジャヤチェンドラヤンさん、ドゥルガデヴィさんはビデオ撮影中の技術的な助け、サンディープ・ディクシット氏、アンジャリさん、アヴァニシュ・ライ博士が生データと原稿ファイルを批判的に評価してくれたことに感謝します。ラヒム・H・タラフダル氏とサンダー・ソランキ氏の研究室での支援に感謝します。我々は、プラント成長支援/スペースのためのe資源およびNIPGR植物成長施設へのアクセスを提供するDBT-eLibraryコンソーシアム(DeLCON)およびNIPGRライブラリを認める。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fungus- Rhizoctonia bataticola Pathogen inoculum Indian Type Culture Collection No. 8365 GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article&
id=1251&Itemid=1370)
Soilrite mix Soil medium in the lab Keltech Energies Limited, Bangalore, India http://www.keltechenergies.com/
Filter paper Blotting paper to support the plant growth Himedia http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374
Pot Growing plants 10 and 30 cm size pots Routinely used nursery pots, for example, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html
Potato dextrose agar/broth Culture and maintain the fungus Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946
Incubator Culture the fungus LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator, and shaker http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131
Growth chamber Growing plants in controlled condition Model No. A1000, Conviron, Canada https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber
Laminar airflow Carrying out aseptic exercises Telstar, Bio II advance, Class II cabinet, EN-12469-2000 https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html
Mesh Filtering the fungal mycelia Nylon mosquito net Mesh with 0.6-1 mm diameter pore size
Autoclave Autoclaving media and chickpea seeds Autoclave http://www.scientificsystems.in/autoclave
Microscopes Visualizing the infection ang fungal mycelia SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopes, Leica EZ4 educational stereomicroscope https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18

https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/

https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i
Weighing balance Weighing fungus and chemicals Sartorius Electronic Weighing Balance, BSA 4202S-CW https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances
WGA-FITC Fungus staining Sigma https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en&region=IN
Aniline blue Fungus staining Himedia http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901

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References

  1. Sharma, M., Ghosh, R., Pande, S. Dry root rot (Rhizoctonia bataticola (Taub.) Butler): an emerging disease of chickpea - where do we stand. Archives of Phytopathology and Plant Protection. 48, (13-16), 797-812 (2015).
  2. Srinivas, P. Studies on dry root rot of chickpea (Cicer arietinum L.). Available from: http://krishikosh.egranth.ac.in/handle/1/93135 (2016).
  3. Sinha, R., Irulappan, V., Mohan-Raju, B., Suganthi, A., Senthil-Kumar, M. Impact of drought stress on simultaneously occurring pathogen infection in field-grown chickpea. Scientific Reports. 9, (1), (2019).
  4. Nene, Y., Haware, M., Reddy, M. Chickpea diseases: resistance screening techniques, information bulletins No. 10. Patancheru. Information Bulletin No. 10. Patancheru, A.P., India: International CroDS Research Institute for the Semi-Arid Tropics. 1-10 (1981).
  5. Pande, S., Krishna Kishore, G., Upadhyaya, H. D., Narayana Rao, J. Identification of sources of multiple disease resistance in mini-core collection of chickpea. Plant Disease. (2006).
  6. Pandey, P., Irulappan, V., Bagavathiannan, M. V., Senthil-Kumar, M. Impact of combined abiotic and biotic stresses on plant growth and avenues for crop improvement by exploiting physio-morphological traits. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
  7. Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. Morpho-physiological traits and molecular intricacies associated with tolerance to combined drought and pathogen stress in plants. Biotechnologies of Crop Improvement, Volume 3: Genomic Approaches. (2018).
  8. Jensen, A. B., et al. Standard methods for fungal brood disease research. Journal of Apicultural Research. 52, (1), 1-39 (2013).
  9. Agrios, G. Plant Pathology: Fifth Edition. 9780080473 (2004).
  10. Coley-Smith, J. R., Cooke, R. C. Survival and germination of fungal sclerotia. Annual Review of Phytopathology. (1971).
  11. Nagamma, G., Saifulla, M., Sab, J., Pavitra, S. Screening of chickpea genotypes against dry root rot caused by Macrophomina phaseolina (tassi) goid. 10, (4), 1795-1800 (2015).
  12. Infantino, A., et al. Screening techniques and sources of resistance to root diseases in cool season food legumes. Euphytica. 147, (1-2), 201-221 (2006).
  13. Khaliq, A., et al. Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition. Biotechnology Reports. 25, 00423 (2020).
ひよこ豆の乾燥した根腐れ病アッセイ:詳細な方法論
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Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: a Detailed Methodology. J. Vis. Exp. (167), e61702, doi:10.3791/61702 (2021).More

Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. Dry Root Rot Disease Assays in Chickpea: a Detailed Methodology. J. Vis. Exp. (167), e61702, doi:10.3791/61702 (2021).

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