Summary
이 연구는 병아리콩의 근간을 연구하는 방법론과 분자 메커니즘을 제시합니다–Rhizoctonia 바타티콜라 상호 작용. 상기 블로팅 종이 방법은 병아리콩 유전자형 반응을 빠르게 연구하는 데 유용하며, 아픈 냄비 기반 방법은 가뭄과 R. 바타티콜라 감염 및 내성 유전자형을 위한 화면을 동시에 부과하는 데 사용될 수 있다.
Abstract
건조 루트 부패 (DRR) 질병은 전 세계 병아리콩 재배에 대한 새로운 생물학적 스트레스 위협입니다. 토양에 의한 곰팡이 병원체인 리조토니아 바타티콜라에의한 것이다. 문헌에서는 질병 분석에 대한 포괄적이고 상세한 단계별 프로토콜은 희소합니다. 이 문서에서는 DRR에 대한 저항성을 위해 유전자형을 신속하게 선별하기 위한 블로팅 용지 기술을 설정하는 데 관련된 단계에 대한 자세한 내용을 제공합니다. 블로팅 페이퍼 기법은 쉽고 저렴합니다. 아픈 냄비 접근법에 근거한 또 다른 방법은 자연 감염의 모방이며 질병 삼각형에 관여하는 식물, 병원균 및 환경과 같은 상호 작용하는 구성 요소를 연구하기 위해 적용 될 수 있습니다.
또한, 자연에서 DRR은 주로 작물 성장이 진행됨에 따라 토양 수분이 후퇴하는 비가 내린 병아리콩 재배 지역에서 발생합니다. 가뭄 스트레스는 DRR 질병에 병아리콩 식물을 걸리기 쉬운 것으로 알려져 있습니다. 가뭄 스트레스하에서 식물 병원체 상호 작용의 병리학 및 분자 이해는 병아리콩 세균성 수영장에서 엘리트 DRR 내성 품종의 식별을위한 길을 열 수 있습니다. 이 문서는 아픈 냄비와 후속 질병 분석의 준비를위한 단계별 방법론을 제공합니다. 전반적으로, 본 원에 제시된 정보는 연구원이 R. bataticola 곰팡이 무분큐럼을 준비하고, 이 병원체를 유지하고, 블로팅 종이 기술을 설정하고, 아픈 문화와 아픈 냄비를 준비하고, 병아리콩 식물에 있는 병원균 감염을 평가하는 것을 도울 것입니다.
Introduction
건조 루트 부패 (DRR)는 병아리콩1,2에서경제적으로 중요한 질병 중 하나입니다. 그것은 Rhizoctonia 바타티콜라에 의해 발생 하는 루트 특이 적인 질병 (텔레모프, 거시 포 미나 phaseolina). 감염된 식물은 측면 뿌리가 부족하고 부서지기 쉬운 타뿌리와 노란색 단풍1,3을가지고 있습니다. 가뭄 스트레스하에서 DRR은 병아리콩재배1,2,3에대한 새로운 위협으로 보고되었습니다. 더욱이, DRR발생률은1, 2,3의현장조건하에서 가뭄 스트레스하에서 악화되는 것으로 보고된다. DRR은 관개 필드4보다비가 많이 내리는 지역에서 더 널리 퍼져 있습니다. 내성 품종의 활용은 질병을 극복하고 살균제 사용1,13을우회하는 방법입니다. 전 세계적으로 사용할 수있는 병아리 콩 세균은 특성5에대한 유전 적 변이를 항구하기 때문에, 내성 / 깨지기 쉬운 유전자형의 선별 및 식별은 작물 개선을위한 분자 번식에 매우 중요합니다.
견고하고 쉽고 비용 효율적인 질병 애약은 병아리콩의 R. 바타티콜라 감염 패턴을 조사하는 데 필수적입니다. R. 바타티콜라 감염에 대한 병아리콩 유전자형의 반응을 관찰하는 데 사용되는 1차 질환 분석법은 블로팅 종이 기술1,4이다. 그것은 간단한 기술이며 액체 곰팡이 접종, 뿌리가있는 모종 및 멸균 얼룩지를 사용하여 실행할 수 있습니다. 그러나 이 기술은 문헌에서 단계별 프로토콜을 사용할 수 없기 때문에 최대한 활용되지 않았습니다.
한편, 아픈 냄비 기술은 잠재적 인 아픈 문화의 준비와 가뭄 스트레스의 부과를 포함한다. 가뭄 스트레스가 DRR 질환 발생률 을 악화시키는 것을 감안할 때3,가뭄 스트레스6,7하에서식물 병원체 상호 작용을 연구하는 것이 필수적이다. 아픈 냄비 기술은 이러한 동시 연구를위한 플랫폼을 제공, 세균 검사를위한 더 나은 가능성을 촉진하고 상호 작용의 기계론적 기초를 이해. DRR 질병에 내재된 루트 길이의 증가 및 측면 루트 수의 감소와 같은 병리학적 변화는 아픈 냄비 기술1,3,7을사용하여 해결할 수 있다.
본명, 병아리콩과 R. 바타티콜라 와 스크린 병아리콩 세균질 사이의 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있는 종이와 아픈 냄비 기술을 부팅하기 위한 상세한 프로토콜이 제시된다. 연구에 사용된 재료의 세부 사항은 재료 표에부여됩니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. R. 바타티콜라 의 격리 및 저장
- 병아리콩 유전자형 및 DRR 증상의 세부 사항
- 일반적으로 건조, 취성 1 차 뿌리와 같은 전형적인 DRR 증상을 보이는 병아리콩 식물 (유전자형, JG 62)을 사용하여 껍질 아래 와 pith1,3내부의 측면 뿌리및 미세 경화증이 없는경우.
- 수거 및 세척
- 표피 층 아래 미세경화증을 가진 마른 짚 색 의 엽및 취성 1 차 뿌리와 같은 현상을 보여주는 뿌리 식물. 뿌리 뽑는 동안, 뿌리의 주요 부분은 감염된 뿌리가 취성이기 때문에 토양 내부에 남아있을 것입니다. 뿌리에 부착된 거친 토양 파편을 제거합니다. 뿌리를 따로 자르고 적절한 라벨로 종이 봉투(27.5cm x 12cm)로 수집하여 샘플 수집 상자에 넣습니다.
- 샘플을 실험실로 운반한 후 뿌리를 200mL 비커에 놓고 메쉬(직경 3mm 크기의 나일론 메쉬)로 덮어, 흐르는 수돗물로 뿌리를 철저히 씻어 토양 입자를 제거합니다.
- 역삼투압(RO) 물을 사용하여 마지막에 한 번 헹구세요.
- 표면 살균
- 메스 블레이드로 각각 2cm 길이로 뿌리를 4개로 부수고 깨끗한 200mL 비커에 넣습니다.
- 라미나르 플로우 챔버 내부에 오토클레이브 RO 물, 2% NaOCl, 폐기 항아리 및 자동 블로팅 용지(5cm2)를조립합니다.
- 50mL의 오토클레이브 RO 워터로 뿌리를 세 번 씻은 다음 50mL의 2% NaOCl으로 10분 간 세척합니다. 뿌리를 RO 물 50mL로 세 번 다시 씻어 NaOCl을 제거합니다.
- 블롯은 뿌리를 오토클레이브 블로팅 용지에 놓고 뿌리가 건조될 때까지 그대로 둡니다.
- 미디어 및 인큐베이션
- 멸균 된 메스 블레이드로 뿌리의 가장자리를 제거합니다. 블레이드를 이용하여 뿌리를 분할하고 멸균 된 집게를 사용하여 감자 덱스트로스 천 (PDA) 미디어 페트리 플레이트에 연쇄상 구균 황산염 (50 mg L-1)및 암피실린 (50 mg L-1)을함유한다.
- 판을 닫고 파라필름으로 밀봉하고 어둠 속에서 이틀 동안 28 °C의 인큐베이터에서 배양하십시오.
- 최면 팁 방법
- 잠복 2 일 후, 라미나르 흐름 챔버에 플레이트를 가져. 스테레오현미경(라이카 EZ4 교육 스테레오현미경)에서 최면 성장8의 끝을 잘라내고 연쇄상 구균 황산염및 암피실린을 갖춘 신선한 PDA 플레이트로 옮는다.
- 어둠 속에서 10 일 동안 28 °C에서 인큐베이터에서 플레이트를 배양합니다.
- R. 바타티콜라 곰팡이 무접종의 보관 및 유지 보수
- 시험관에서 PDA 경사를 만들고 화염 살균 접종 루프를 사용하여 10 일 된 배양 판에서 곰팡이 천마 플러그를 전송합니다. 파라필름으로 테스트 튜브 캡을 밀봉합니다.
- 어둠 속에서 10 일 동안 28 °C에서 경사를 배양하십시오.
- 파라필름으로 캡을 다시 밀봉하고 냉장고에 4°C로 보관하여 향후 사용하십시오.
- 곰팡이를 유지하기 위해 6 개월마다 하위 문화.
- 독성 유지 보수
- 아픈 냄비 기술3에서언급 한 대로 준비 된 순수한 곰팡이 무분비로 식물을 감염하십시오. 감염된 식물 (코흐의 추정)9에서 동일한 곰팡이를 분리하고 추가 실험에 사용합니다.
참고 : 이 연구에서, 곰팡이의 필드 고립 된 변형이 사용되었다 (GenBank: MH509971.1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH509971)
- 아픈 냄비 기술3에서언급 한 대로 준비 된 순수한 곰팡이 무분비로 식물을 감염하십시오. 감염된 식물 (코흐의 추정)9에서 동일한 곰팡이를 분리하고 추가 실험에 사용합니다.
2. 종이 기술을 블로팅
참고: 얼룩진 종이 기술은 액체 곰팡이 접종, 모종 준비 및 질병 평가의 준비를 수반합니다.
- 액체 R. 바타티콜라 접종 준비
참고: 액체 R. 바타티콜라 곰팡이 접종에는 균증과 미세성 내분이 모두 포함되어 있습니다. 이 두 구조는 기본 무분비로 작용합니다.- 1,000mL 플라스크로 500mL의 PDB 미디어를 준비하고 15분 동안 121파운드에서 오토클레이브를 준비한다.
- 미디어가 냉각된 후, 곰팡이 경사 배양에서 곰팡이 가루 플러그로 국물을 접종하고 어둠 속에서 180 rpm에서 셰이커에서 5 일 동안 28 °C에서 배양하십시오.
- 테이블에 오토클레이브 유리 또는 플라스틱 깔때기 (10cm), 1 리터 원뿔 플라스크 및 두 층의 메쉬 (10cm2 크기) (직경 3mm의 모공 크기가있는 나일론 메쉬)를 조립합니다. 메쉬를 사용하여 곰팡이 균증과 미세 경화증을 걸러내세요. 블로는 오토클레이브 블로팅 페이퍼로 곰팡이를 말리십시오.
- 50% 비수근에 100g 의 mycelia의 무게와 실온에서 유지.
- 병아리콩 식물의 준비
- 50개의 건강한 씨앗을 선택합니다(이 연구에서 DRR에 취약한 유전자형 JG 62가 사용됨), 100mL 비커에 배치하고 메쉬로 덮습니다.
- 먼저 수돗물로 씨앗을 씻어 토양 이물질을 제거합니다.
- 씨앗이 있는 비커를 라미나르 유량 챔버에 넣고 세척당 1분 동안 50mL의 RO 물로 세척할 수 있습니다.
- 50mL의 2% 수성 NaOCl으로 씨앗을 2분 동안 연속 흔들림으로 살균하고 50mL의 멸균수로 씨앗을 1분 동안 5회 세척합니다.
- 폴리에틸린 백(47.5cm x 25cm)을 토양라이트(원예 등급의 혼합물)로 채우고, 아이리쉬 피트 이끼, 그리고 동등한 비율로 각질 제거 버미쿨라이트, 1/3:1/3:1/3), 표면 살균 50 씨앗 2cm 깊이를 뿌리고, 28 °C ± 2 °C 온도, 16 h 광기간을 150mol μ m-2,1 %의 빛 강도로 성장 챔버 / 방에 보관하십시오. RO 물로 물을 뿌리고 파종 후 8 일 동안 식물을 뿌리 뽑습니다.
- 수돗물에 뿌리를 씻어 토양당 입자를 제거합니다. 멸균 된 RO 물로 뿌리를 헹구고 1000 mL 비커로 RO 물에 보관하십시오.
- 트레이에 용지를 얼룩질 준비
- 얼룩진 종이를 가져 와서 복제를 충족하기에 충분한 숫자로 조각 (30cm × 23cm)로 잘라냅니다.
- 자동 분해성 폴리에틸렌 백에 시트를 포장하고 121 파운드로 15 분 동안 오토 클레이브하고 건조를위한 뜨거운 공기 오븐에 보관하십시오.
- 각 얼룩진 용지 시트를 반으로 접습니다.
- 그림 2i-iv에표시된 것처럼 깨끗하고 정신이 닦은 플라스틱 트레이에 종이를 놓습니다.
- 담그면 식물 접종
- 200mL 비커에 200mL 오토클레이브 RO 물에 곰팡이 이노쿨럼 100g을 녹여 50% 접종을 합니다.
- 간헐적인 상하 운동으로 제조된 접종에 식물 뿌리를 담그고 곰팡이 무분비의 균일한 부착을 보장합니다.
- 식물을 얼룩진 종이에 넣습니다.
- 멸균 된 RO 물로 트레이에 놓인 블로팅 용지의 하단을 적시. 뿌리만 종이로 덮여 있고 싹이 남지 않는 방식으로 종이에 식물을 놓습니다.
- 얼룩지는 종이의 상단을 접고 전체 종이를 적시어 식물 성장을 유지하기에 충분한 물을 공급하십시오.
- 트레이를 하루에 한 번 물에 담고 트레이를 28°C로 유지합니다. 매일 괴사, 뿌리 부패 및 잎 황색과 같은 증상을 관찰하십시오.
3. 아픈 냄비 기술
참고 : 아픈 냄비 기술은 악성 접종과 아픈 냄비의 준비, 수분 수준의 유지 보수 및 질병 증상의 평가를 수반한다.
- 기판 준비
- 시판되는 병아리콩 씨앗 1kg을 섭취하십시오. 감염된 씨앗을 제거하십시오 (곰팡이 성장, 감염 반점 및 곤충 손상이있는 씨앗). 5 L 플라스틱 비커에 놓고 수돗물로 3-4번 철저히 씻어 주요 이물질을 제거합니다.
- 2L의 RO 물로 씨앗을 세 번 씻고 5 L 비커에 1kg 씨앗을 담그고 5 h의 물을 3 배 더 넣습니다.
- 씨앗이 물을 뿌리면, 세 번 RO 물로 다시 씻어 씨앗을 제거합니다.
- 물을 완전히 제거하고 씨앗을 잼 병(높이 300mL, 높이 12cm, 직경 6cm, 무게 155g)에 약1/4번째 용량(잼 병 당 100g)으로 포장하고 캡으로 병을 닫습니다. 자동 복제 가능한 비닐 봉지(48cm x 30cm)에 10개의 잼 병을 121파운드로 두 번 포장하여 15분 동안 계속 포장합니다.
- 하룻밤 동안 오븐에서 40°C에서 씨앗을 건조하여 병 내부의 물방울을 제거합니다.
- 아픈 문화의 준비
- BSL-2 레벨 라미나르 유량 챔버를 켭니다. 70% 에탄올로 바닥을 철저히 닦고 15분 동안 UV를 켭니다. 그런 다음, 라미나르 흐름 챔버 내부에 씨앗을 유지합니다.
- 10일 된 갓 고립 된 R. 바타티콜라 문화 (1 부)를 가져 가라. 그런 다음 멸균 파이펫 팁이나 코르크 보어를 사용하여 3 개의 곰팡이 천 플러그 (직경 4mm)를 가져 가서 무균 잼 병에 넣습니다. 캡으로 병을 덮고 파라필름으로 밀봉합니다.
- 병아리콩 씨앗과 곰팡이 디스크를 균일하게 혼합하기 위해 병을 흔들어.
- 어둠 속에서 15 일 동안 30 °C에서 병을 배양하십시오.
- 검은 곰팡이 성장(그림 4iii)과잼 병을 가지고 멸균 집게를 사용하여 유리 페트리 플레이트에 잼 병에서 아픈 문화 (미세 경화증씨앗)를 전송합니다. 유리 페트리 접시에 이틀 동안 실온에서 그들을 건조.
- 모르타르와 유봉을 사용하여 곰팡이 덩어리를 분말화하고 분말을 4 °C에 저장합니다.
- 오토클레이브 토양은 15 분 동안 121 파운드에서 두 번.
- 자동 음영 으로 자동 토양 을 건조.
- 곰팡이 분말을 토양과 50 % w /w로 섞고 냄비를 혼합물로 채우고 하루 동안 실온에서 유지하십시오.
- 냄비당 표면 멸균 된 DRR -깨지기 쉬운 병아리콩 씨앗 (10cm 둥근 냄비)(재료 표)을 뿌리고 80%의필드 용량 (FC)의 수분 수준을 유지합니다.
- 발아 후 식물을 뿌리 뽑아 괴사 및 뿌리 부패와 같은 증상을 관찰하십시오.
- 아픈 냄비 효율 평가
참고: 뿌리가 완전히 썩으면 식물은 노란 잎 증상을 보여줍니다.- 병변(괴사 반점)(보충도2C)및 루트 부패의 중증도에 기초한 질병 점수를 개발한다. 90%의 식물 죽음을 보여주는 아픈 냄비는 더 이상 사용될 수 있습니다.
- 유전자형 스크리닝
- 아픈 문화를 대량으로 준비하고 30cm 높이의 냄비에 멸균 된 토양 또는 필드 토양 (5 % w /w)과 혼합하십시오. 냄비에 물을 주어 표면에 젖어 7 일 동안 방해받지 않고 둡니다.
- 둥근 냄비 10cm당 표면 멸균 시드 1개를 뿌리고 30cm 둥근 냄비당 3개의 씨앗을 뿌리고 물을 적절히 뿌릴 수 있습니다.
- 노란색 엽서 및 루트 부패 증상을 관찰하십시오.
- 결합 된 가뭄과 R. 바타티콜라 감염
- 신하 등에서 언급 된 프로토콜을 따라 가뭄 스트레스를 부과합니다.(2019).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
이 연구는 가뭄 스트레스하에서 식물 병원체 상호 작용의 병리학 및 분자 이해를 촉진하기 위해 종이와 아픈 냄비 기술을 블로팅과 같은 기술을 입증하는 것을 목표로했습니다. 이를 위해 DRR 증상을 보이는 식물1,3,4는 병아리콩 밭에서 수집되었고, 곰팡이는 최면 팁 방법8을사용하여 분리되었다. R. bataticola 곰팡이 문화는 PDA 플레이트에 어두운 회색으로 나타나고 인큐베이션 후 4 일 동안 기울어진(도 1A & C)및 인큐베이션 후 5 일 동안 PDB 배지에서 회색 색으로 어둡게 나타난다(도 1B). R. 바타티콜라는 미셀리아(도1D)를정화하고,토양(10)에서1차 접종으로 작용하는 미세경화증(도1E)을생성한다.
그림 2에 주어진 단계는 블로팅 용지 기술을 실행하기 위해 따랐다. 8일 된 식물은 액체 접종(50%)에 감염되었고, 감염 후 8일 후, 식물은 증상을 관찰했다. 식물은 광범위한 괴사뿐만 아니라 잎 황색으로 인해 뿌리 부패를 보였으며, 이는 DRR 질환의 전형적인 뿌리 및 엽 증상입니다(도 3B 및 보충 도 1A).
아픈 냄비 기술은 도 4에표시된 단계를 사용하여 수행되었다. 토양염 및 필드 토양에서 곰팡이 무분비의 농도는 각각 10 %와 5 %였다. DRR-영향을 받기 쉬운 종자는 대조식물(도5A및 B)에 비해 뿌리 부패, 측면 뿌리 부족, 잎 황색 및 조기사망과같은 전형적인 DRR 증상을 나타내고 있다. 토양으로 만든 아픈 냄비에 감염을 입은 식물은 파종 후 7 일 동안 뿌리 부패를 보였습니다(도 5C 및 보충 도 2C). 한편, 식물은 식물토양으로 만든 아픈 냄비에서 자라는 전형적인 엽기 증상, 즉 파종 후 48일(그림5E)을보였다.
DRR 질병에 가뭄의 영향은 또한 실험실 조건 하에서 아픈 냄비에서 공부했습니다. 가뭄 스트레스는 물3을원천 징수하여 부과되었습니다. 가뭄 스트레스(30% FC)를 받고 있는 식물은 병원균 전용 치료(90% FC)식물(도 6A 및 B)과비교하여 악화된 질환 발생률을 보였다. 제어 및 가뭄 처리 식물은 증상을 나타내지 않았다(그림 6A 및 B). 결합 된 스트레스 아래 뿌리는 병원체 전용 식물(도 6B)에비해 더 많은 괴사 반점과 부패를 했다.
그림 1: 리조토니아 바타티콜라의특징적인 형태학적 특징. 건조 뿌리 부패의 인과 제인(Rhizoctonia bataticola,ITCC 8635) 분야에서 격리되었다 (식물 게놈 연구의 국립 연구소, 뉴 델리, 28.6139 °N, 77.2090 ° E). 배양으로부터, 곰팡이는 최면 팁 방법8을사용하여 분리되었다. 이미지는 페트리 플레이트(A),5 일 된 액체 문화(B),10 일 된 경사 문화(C)에감자 덱스트로스 천에 4 일 된 R. 바타티콜라 문화를 보여줍니다. 곰팡이 균증체(D)및 현미경 (검은 화살)(E)는현미경 슬라이드에 조롱하고 각각 WGA-FITC 및 애니라인 블루로 염색되었다. 이미지(E, F,스케일 바, 20 및 50 μm)는 상피 형광 현미경의 20배 및 40x 객관적렌즈 하에서 포착되었다. 흰색 화살표는 신비의 교차 벽을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 블로팅 페이퍼 기법에서 R. 바타티콜라 접종 및 DRR 저서와 관련된 단계. 표면은 흐르는 수돗물을 통과하고 2 % 나트륨 hypochlorite로 세척하여 씨앗을 살균하고 멸균 RO 물로 3-4 번 세척합니다 (1 단계). 이어서, 토양리(2단계)를 함유한 15cm 높이의 냄비에 30개의 씨앗을 뿌리고 28°C ± 2°C 온도, 16h 광도가 150 μmolm-2-s-1, 상대 습도 70%(단계 3)를 함유한 성장실에서 8일 동안 자랄 수 있도록 한다. 식물을 뿌리 뽑고 멸균 된 물 (4 단계)으로 씻으세요. 곰팡이 (5 단계)로 500 mL PDB 미디어를 접종하여 곰팡이 접종을 준비합니다. 감염의 경우 5 일 된 곰팡이 국물 문화를 사용하십시오. 이어서, 30초 동안 비커로 곰팡이 무분리에 뿌리를 담그고 비커의 내부 사이드월을 만져 과도한 접종을 제거하여 식물을 접종한다(6단계). 감염 후, 곰팡이 접종 및 모의 접종 식물을 별도의 깨끗한 트레이 (7 단계)에 다른 얼룩진 종이에 놓습니다. 매일 적절한 멸균물로 얼룩진 종이를 적감시키고 증상을 관찰하고, viz., 측면 뿌리에서 흘리고, 식물 잎의 황변과 시스팅, 썩은 씨앗, 그리고 8일 후 감염후(8단계) (A)에서뿌리 부패를 한다. 이미지는 필수 단계(3-7단계)(B)를나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 병아리콩의 DRR 질환 증상은 블로팅 페이퍼 기술을 기반으로 합니다. 도 2에 묘사된 프로토콜에 따라 DRR-취약한 식물(유전자형, JG 62)은 블로팅 페이퍼 기술을 사용하여 감염을 겪었으며, 감염 후 8일 후에 증상이 포착되었다. 이미지는 건강한 싹 (빨간 화살표)과 더 많은 측면 뿌리 (노란색 화살표)(노란색 화살표)와 뿌리를가진 대표적인 제어 식물 (모의 접종)을 보여줍니다. 이미지는 잎 (파란색 화살표) 및 말기 / 괴사 뿌리의 시스팅, 황색 및 건조와 같은 전형적인 증상을 가진 대표적인 감염된식물을 나타내며 측면 뿌리 (흰색 화살표)(B)가 적습니다. 스케일 바는 1cm입니다. 실험은 적어도 5회 반복되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: R. 바타티콜라 접종 및 DRR 질병 저약에 대한 아픈 냄비 준비에 대한 개요. 적극적으로 성장하는 곰팡이 배양의 5mm 곰팡이 디스크로 PDA 플레이트를 접종하여 곰팡이 접종을 준비하고 10 일 동안 28 °C에서 배양하십시오. 그런 다음 기판을 준비하기 위해 병아리콩 씨앗을 수돗물로 씻고, 하룻밤 동안 물에 씨앗을 담그고, 121 파운드에서 15 분 동안 오토 클레이브하십시오. 그런 다음, 10일 된 문화로부터 3개의 한천 플러그로 기판 100g을 접종하고 잘 섞어주십시오. 이어서, 인큐베이터에서 15일 동안 30°C에서 접종된 기판을 배양한다. 아픈 배양 (곰팡이 재배 기판),건조 하고 분말을 분쇄하고 4 °C에 보관하십시오. 그런 다음 아픈 배양 50g을 마른 토양리트 100g과 철저히 섞는다(아픈 냄비)(A). 이어서, 표면 살균에 취약한 병아리콩 씨앗을 뿌리고 증상, viz., 탭 루트 부패, 측면 루트 괴사 및 잎 황색을 관찰한다. 같은 냄비에 증상을 보여주는 식물을 동화. 추가 실험을 위해, 영향을 받기 쉬운 유전자형으로 90% 감염을 보여주는 냄비를 사용하십시오. 이미지는 접종 (i), 기판 (ii), 및 제어 및 접종 된 아픈 배양 (iii)(B)를나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 병아리콩에서 DRR 질환 증상은 아픈 냄비 기술에 기초한다. 아픈 냄비를 만들기 위해 그림 4에 묘사 된 프로토콜이 사용되었습니다. 이어서, 표면멸DRR-용해성 병아리콩 유전자형(JG 62) 종자는대조군(A)및 아픈냄비(B)에파종하였다. 냄비에 있는 각 식물은 하나의 복제를 나타내며, 아픈 냄비에서 죽거나 기절한 식물의 성장이 관찰되었다. 패널(C)의오른쪽에 있는 식물은 각각 대조군 및 치료에 측면 뿌리(yellow arrow)의 존재 와 부재를 나타낸다. 그래프는 대조군(D)에 비해 아픈 냄비 치료에 죽은식물의 수를 나타낸다. 아픈 냄비는 NIPGR 필드에서 수집 된 살균 된 필드 토양에 제조되었고, 아픈 배양은 혼합되었다. 표면 살균 된 씨앗은 파종 후 48 일 동안 파종되었고 질병 증상이 포착되었습니다. 이미지는대조식물(E)을나타내며, 전형적인 DRR Foliar 증상, 즉 식물의 건조가 표시된다(흰색 화살표). 통계적 유의성은 학생의 t-test를사용하여 결정되었습니다. 바는 9개의 생물학적 복제물의 SEM을 나타내며, 별표는 P< 0.0001에서 통계적으로 유의한 값을 나타냅니다. 노란색 화살표는 측면 뿌리없이 괴사 / 썩은, 건조 된 기본 뿌리를 나타냅니다. 실험은 유사한 결과로 적어도 10번 반복되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 아픈 냄비 방법은 식물 병원체 상호 작용에 가뭄 스트레스의 영향을 연구하는 데 유용합니다. 냄비 실험은 R. 바타티콜라 감염에 가뭄의 효과를 연구하기 위해 실시되었다. 실험은 대조군, 가뭄 전용, 병원균전용(R. bataticola,병원균), 결합된 가뭄 및 R. 바타티콜라 스트레스(결합된 응력)를 구성했습니다. 식물은 28 °C ± 2 °C 온도, 16 h 광막150 μmol m-2 s-1,및 70 % 상대 습도가있는 성장실에서 재배되었다. 아픈 냄비는 그림 4에 묘사 된 프로토콜에 따라 준비되었다. 이어서, 표면멸DDR-용해성 병아리콩 유전자형(JG 62) 종자들은 제어및 아픈 냄비에 파종하였다. 대조군 및 병원균 치료는 실험 내내 관개되었다. 가뭄 스트레스는 가뭄과 결합 된 스트레스 치료하에 식물에 부과되었다. 파종 후 18일 간 물이 보류되었고, 파종 후 24일 만에 원하는 가뭄 수준에 도달했습니다. 식물은 파종 후 29 일 동안 증상을 관찰했다. 이미지는치료(A)에서Foliar 및 루트 변경 사항을 보여 주습니다. 이미지는 SMZ25/SMZ18 연구 스테레오현미경(B)의 0.5X 객관적렌즈 하에서 관찰된 스테인이드 식물 뿌리를 보여준다. 적색 화살표는 감염되지 않은 측면 뿌리를 나타내고 검은 화살표는 감염된 측면 뿌리를 나타냅니다. 실험은 유사한 결과로 적어도 10번 반복되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 서 S1: 병아리콩의 측면 뿌리 수의 접종 크기와 감소. 도 2에 묘사된 프로토콜에 따라 DRR 취약 식물(유전자형, JG 62)은 블로팅 페이퍼 기술을 사용하여 다양한 크기의 접종으로 감염을 겪었으며, 감염 후 8일 후에 증상이 포착되었다. 식물은 다양한 접종 크기 (0.1%, 1%, 10 % 및 물에서 20 % w/v)로 접종하였다.이미지는 잎의 시스팅, 황변 및 건조및 건조 / 말기 뿌리와 같은 전형적인 증상을 가진 대표적인 감염된 식물을 나타내며 측면 뿌리 (B)가 적습니다. 그래프는 접종 변동(B)을 감염한 식물의 측면 뿌리 수를 나타낸다. 스케일 표시줄은 1cm. n=10입니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도서 S2: 토양에 병아리콩에서 DRR의 폴리아 증상. 그림 4에 묘사된 프로토콜에 따라 표면 살균 씨앗이 파종되었고, 파종 후 14일 동안 질병 증상이 포착되었다. 대표적인 이미지는 대조식물(A)을 나타내며, 사진은 식물(흰색 화살표)(B)의 건조와 같은 전형적인 DRR Foliar 증상을 나타낸다. 질병 점수는 뿌리에 괴사 반점을 기반으로 개발되었다. 점수는 일 (C)에 걸쳐 개발되었다. 사진(A&B)은 동일한 실험에서 나온 것입니다. 배율 막대 = 3cm. n= 10. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
얼룩지는 종이 기술은 실험실 조건 하에서 병아리콩 유전자형을 검사하는 간단한 접근 방식을 제공합니다. 딥 접종을 통해 접종부하(보충 도 1)를쉽게 제어하여 현세적 기초에 대한 상호 작용의 조사를 가능하게 하고 체외 검사를 용이하게 합니다. 또한, 심지어 젊은 묘목을 사용할 수 있습니다. 5일 된 곰팡이 배양(도 1B)은식물을 감염시킬 만큼 충분한 접종을 할 수 있습니다. 액체 접종은 균골과 미세 경화증(도 1D & E)을모두 함유하고 있습니다. 루트 부패증상(도 3B)은질병을 점수매기고 내성 유전자형을 식별하는 데 사용될 수 있다. DRR 발생은 주로 가뭄 스트레스1,3,5에의해 영향을 받습니다. 그러나 이 기술만으로는 가뭄 스트레스 부과가 불가능하며 이 기술로 선별하는 것은 자연스러운 반응을 반영하지 않습니다.
아픈 냄비 기술은 식물, 병원체 및 가뭄 스트레스 사이의 상호 작용에 대한 연구를 허용합니다. 그것은 결합된 가뭄과 병원체 스트레스의 밑에 유전자형을 검사하는 방법을 제공하여 저항하는 유전자형을 식별합니다. 아픈 냄비에서, 가뭄 스트레스는 식물의 모든 나이에 부과하고 식물을 검사 할 수 있습니다. 식물은 아픈 냄비 방법으로 전형적인 DRR 증상(도 5C & F 및 보충 도 2B & C)을보여줍니다. 결합된 가뭄과 병원균 감염을 겪은 식물은 병원체 전용 치료에 비해 심각한 뿌리 부패를 보였다. 이것은 유효한 병아리콩 세균질이 병원체 뿐 아니라 또한 결합한 병원체 및 가뭄 긴장에 저항하는 유전자형을 확인하기 위하여 가려져야 한다는 것을 의미합니다. 여러 연구는 유전자형을 검사하기 위해 이전에 시도되었지만 블로팅 용지기술(11,12)을사용하여 시도되었습니다. 게다가, 현장 검열도 실시되었지만 가뭄 스트레스를 부과하지 않고(11). 병아리콩의 다른 단계 도중 가뭄 스트레스를 부과하고 유전자형 반응을 평가하는 것이 중요합니다.
문제 촬영
블로팅 용지 기술의 경우 비커의 접종부피가 전체 식물 뿌리가 담근 수준에 있어야 합니다. 또한 과도한 급수는 식물 뿌리의 젖은 부패로 이어질 것입니다. 오염을 일으킬 수 있기 때문에 식물에 물을 수돗물을 사용하지 마십시오.
아픈 냄비 기술의 경우, 데시 병아리콩 품종은 바람직하다. 씨앗의 수는 연구원의 필요에 따라 달라질 수 있습니다. 씨앗을 흡수하는 데 사용되는 물의 양은 씨앗이 물을 imbibe 때문에 세 배 더해야합니다. 세탁이 제대로 이루어지지 않으면 세균 성장이 발생합니다. 비 자동 용해 물은 씨앗을 흡수하는 데 사용할 수 있습니다. 오토클레이브 후 씨앗의 색상은 부적절한 오토클레이브를 나타내는 갈색 대신 검은색이어야 합니다. 뜨거운 공기 오븐에서 건조 과잉 씨앗의 건조에 이르게; 이러한 씨앗은 곰팡이 예방 접종에 사용할 수 없습니다. 라미나르 흐름 외부의 병을 접종하면 오염이 발생할 수 있습니다. 접종 된 병아리 콩 식사에서 백색 곰팡이 성장은 부적절한 오토클레이브의 표시입니다. 생체 안전 예방 조치는 사용되는 접종, 얼룩진 종이 및 감염된 식물을 폐기하는 데 따라야합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
우리는 공개 할 것이 없다
Acknowledgments
M.S.K 연구소의 프로젝트는 국립 식물 게놈 연구 핵심 자금 조달에 의해 지원됩니다. VI는 DBT-JRF(DBT/2015/NIPGR/430)를 인정합니다. 우리는 비디오 촬영 중 기술 적 도움을 준 훈련생 리시카 양, 자야첸 씨, 두르가데비 양에게 원시 데이터와 원고 파일을 비판적으로 평가해 준 것에 대해 감사드립니다. 라힘 H 타라프다르 씨와 선더 솔란키 씨가 실험실에서 도움을 주신 것에 감사드립니다. 우리는 DBT-eLibrary 컨소시엄 (DeLCON) 및 NIPGR 도서관이 공장 성장 지원 / 공간을위한 e 자원 및 NIPGR 플랜트 성장 시설에 대한 액세스를 제공하는 것을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fungus- Rhizoctonia bataticola | Pathogen inoculum | Indian Type Culture Collection No. 8365 | GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article& id=1251&Itemid=1370) |
| Soilrite mix | Soil medium in the lab | Keltech Energies Limited, Bangalore, India | http://www.keltechenergies.com/ |
| Filter paper | Blotting paper to support the plant growth | Himedia | http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374 |
| Pot | Growing plants | 10 and 30 cm size pots | Routinely used nursery pots, for example, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html |
| Potato dextrose agar/broth | Culture and maintain the fungus | Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA | https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946 |
| Incubator | Culture the fungus | LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator, and shaker | http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131 |
| Growth chamber | Growing plants in controlled condition | Model No. A1000, Conviron, Canada | https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber |
| Laminar airflow | Carrying out aseptic exercises | Telstar, Bio II advance, Class II cabinet, EN-12469-2000 | https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html |
| Mesh | Filtering the fungal mycelia | Nylon mosquito net | Mesh with 0.6-1 mm diameter pore size |
| Autoclave | Autoclaving media and chickpea seeds | Autoclave | http://www.scientificsystems.in/autoclave |
| Microscopes | Visualizing the infection ang fungal mycelia | SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopes, Leica EZ4 educational stereomicroscope | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i |
| Weighing balance | Weighing fungus and chemicals | Sartorius Electronic Weighing Balance, BSA 4202S-CW | https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances |
| WGA-FITC | Fungus staining | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en®ion=IN |
| Aniline blue | Fungus staining | Himedia | http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901 |
References
- Sharma, M., Ghosh, R., Pande, S. Dry root rot (Rhizoctonia bataticola (Taub.) Butler): an emerging disease of chickpea - where do we stand. Archives of Phytopathology and Plant Protection. 48 (13-16), 797-812 (2015).
- Srinivas, P. Studies on dry root rot of chickpea (Cicer arietinum L.). , Available from: http://krishikosh.egranth.ac.in/handle/1/93135 (2016).
- Sinha, R., Irulappan, V., Mohan-Raju, B., Suganthi, A., Senthil-Kumar, M. Impact of drought stress on simultaneously occurring pathogen infection in field-grown chickpea. Scientific Reports. 9 (1), (2019).
- Nene, Y., Haware, M., Reddy, M. Chickpea diseases: resistance screening techniques, information bulletins No. 10. Patancheru. Information Bulletin No. 10. Patancheru, A.P., India: International CroDS Research Institute for the Semi-Arid Tropics. , 1-10 (1981).
- Pande, S., Krishna Kishore, G., Upadhyaya, H. D., Narayana Rao, J. Identification of sources of multiple disease resistance in mini-core collection of chickpea. Plant Disease. , (2006).
- Pandey, P., Irulappan, V., Bagavathiannan, M. V., Senthil-Kumar, M. Impact of combined abiotic and biotic stresses on plant growth and avenues for crop improvement by exploiting physio-morphological traits. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
- Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. Morpho-physiological traits and molecular intricacies associated with tolerance to combined drought and pathogen stress in plants. Biotechnologies of Crop Improvement, Volume 3: Genomic Approaches. , (2018).
- Jensen, A. B., et al. Standard methods for fungal brood disease research. Journal of Apicultural Research. 52 (1), 1-39 (2013).
- Agrios, G. Plant Pathology: Fifth Edition. , 9780080473 (2004).
- Coley-Smith, J. R., Cooke, R. C. Survival and germination of fungal sclerotia. Annual Review of Phytopathology. , (1971).
- Nagamma, G., Saifulla, M., Sab, J., Pavitra, S. Screening of chickpea genotypes against dry root rot caused by Macrophomina phaseolina (tassi) goid. 10 (4), 1795-1800 (2015).
- Infantino, A., et al. Screening techniques and sources of resistance to root diseases in cool season food legumes. Euphytica. 147 (1-2), 201-221 (2006).
- Khaliq, A., et al. Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition. Biotechnology Reports. 25, 00423 (2020).
