Summary
Bu çalışmada nohut-Rhizoctonia bataticola etkileşiminin altında yatan patomorfolojik ve moleküler mekanizmaları incelemek için metodolojiler sunulmuştur. Blotting kağıt yöntemi hızla nohut genotip yanıtları çalışma için yararlıdır, hasta pot tabanlı yöntem aynı anda kuraklık ve R. bataticola enfeksiyon empoze etmek için kullanılabilir ve toleranslı genotipler için ekran.
Abstract
Kuru kök çürümesi (DRR) hastalığı, dünyada nohut yetiştiriciliği için ortaya çıkan biyotik stres tehdididir. Bir toprak kaynaklı mantar patojeni neden olur, Rhizoctonia bataticola. Literatürde hastalık tahlilleri ile ilgili kapsamlı ve ayrıntılı adım adım protokoller seyrektir. Bu makalede, DRR direnci için genotiplerin hızlı bir şekilde taranması için bir lekeleme kağıt tekniği kurma dahil adımlar hakkında tam ayrıntılar sağlar. Lekekağıt tekniği kolay ve daha az pahalıdır. Başka bir yöntem, hasta pot yaklaşımına dayalı, doğal enfeksiyon bir taklit ve etkileşen bileşenleri incelemek için uygulanabilir -bitki, patojen, ve çevre-hastalık üçgeninde yer.
Ayrıca, doğada, DRR çoğunlukla bitki büyüme ilerledikçe toprak nem çekilir yağmurla beslenen nohut yetiştirme alanlarında oluşur. Kuraklık stresi DRR hastalığına nohut bitkileri yatkınlık bilinmektedir. Kuraklık stresi altında bitki-patojen etkileşiminin patomorfolojik ve moleküler olarak anlaşılması, nohut mikroplu havuzdan drr dirençli elit çeşitlerin belirlenmesinin önünü açabilir. Bu makalede, bir hasta pot ve sonraki hastalık tsay hazırlanması için adım adımlı bir metodoloji sağlar. Genel olarak, burada sunulan bilgiler araştırmacılarR bataticola mantar inoculum hazırlamak, bu patojen korumak, leke kağıt tekniği kurmak, hasta kültür ve hasta pot hazırlamak ve nohut bitkilerde patojen enfeksiyonu değerlendirmek yardımcı olacaktır.
Introduction
Kuru kök çürümesi (DRR) nohut1,2ekonomik açıdan önemli hastalıklardan biridir. Rhizoctonia bataticola (teleomorf, Makroforin phaseolina)neden olduğu köke özgü bir hastalıktır. Enfekte bitkiler lateral kökleri eksikliği ve kırılgan taproots ve sarı yaprakları1,3sahip . Kuraklık stres altında DRR nohut ekimi için ortaya çıkan bir tehdit olduğu bildirilmiştir1,2,3. Ayrıca, DRR insidansı alan koşulları altında kuraklık stres altında ağırlaştırılmış olduğu bildirilmiştir1,2,3. DRR daha fazla sulu alanlarda daha yağmurla beslenen alanlarda yaygındır4. Dirençli çeşitlerin kullanımı hastalığın üstesinden gelmek ve fungisit kullanımı atlatmak için bir yoldur1,13. Nohut germplasm dünya çapında mevcut özelliği için genetik varyasyon barındıran çünkü5,tarama ve dirençli / duyarlı genotiplerin belirlenmesi ürün geliştirme için moleküler ıslahı için önemlidir.
Sağlam, kolay ve uygun maliyetli hastalık tahlilleri nohutta R. bataticola enfeksiyon modellerini araştırmak için gereklidir. Nohut genotiplerinin R. bataticola enfeksiyonuna tepkisini gözlemlemek için kullanılan birincil hastalık, lekeleme kağıt tekniği1,4'tür. Bu basit bir tekniktir ve sıvı mantar inoculum kullanılarak yürütülebilir, kökleri ile fideler, ve steril leke kağıt. Ancak literatürde adım adım protokol bulunmadığından bu teknik en üst düzeyde kullanılmamıştır.
Bu arada, hasta pot tekniği potansiyel bir hasta kültürünün hazırlanması ve kuraklık stres dayatılması içerir. Kuraklık stresi DRR hastalığı insidansını ağırlaştırdığı göz önüne alındığında3, bu kuraklık stres altında bitki-patojen etkileşimi çalışmak için gereklidir6,7. Hasta pot tekniği böyle bir eşzamanlı çalışma için platform sağlar, germplasm tarama için daha iyi olanaklar teşvik ve etkileşim mekanistik temelini anlamak. Kök uzunluğunun artması ve lateral kök sayısında azalma gibi patomorfolojik değişiklikler —DRR hastalığına bağlı olarak— hasta pot tekniği1,3,7kullanılarak ele alınabilir.
Burada, nohut ve R. bataticola ve ekran nohut germplasm arasındaki etkileşimi incelemek için kullanılabilecek kağıt ve hasta pot teknikleri, lekeleme için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Çalışmada kullanılan malzemelerin ayrıntıları Malzeme Tablosu'ndaverilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. R. bataticola ve depolama izolasyon
- Nohut genotip ve DRR semptomlarının ayrıntıları
- Nohut bitkileri kullanın (genotip, JG 62) genellikle tipik DRR belirtileri göstermek, kuru gibi, kabuğu altında hiçbir lateral kökleri ve mikrosclerotia ve pith içinde1,3.
- Toplama ve yıkama
- Epidermis tabakası altında mikrosclerotia ile kuru saman renkli foliar ve kırılgan birincil kök gibi belirtiler gösteren uproot bitkiler. Kök sökme sırasında, enfekte kökleri kırılgan olduğu gibi köklerin büyük bir kısmı toprak içinde kalacaktır. Köke bağlı kaba toprak enkaz kaldırın. Kökleri ayrı ayrı kesin ve uygun etiketle kağıt zarflarda (27,5 cm x 12 cm) toplayın ve bir numune toplama kutusuna yerleştirin.
- Numuneleri laboratuvara taşıdıktan sonra, kökleri 200 mL'lik bir kabın üzerine yerleştirin ve örgü (3 mm çapında gözenek boyutuna sahip naylon örgü) ile kaplayın ve yapışan toprak parçacıklarını çıkarmak için kökleri akan musluk suyuyla iyice yıkayın.
- Sonunda bir kez durulamak için ters ozmoz (RO) su kullanın.
- Yüzey sterilizasyonu
- Kökleri her biri neşter bıçakla 2 cm uzunluğunda dört parçaya bölün ve temiz bir 200 mL kabına koyun.
- Otoklavlı RO suyunu, %2 NaOCl,kavanozu atın ve otoklavlı blotasyon kağıdını (5 cm2)laminar akış odasının içinde birleştirin.
- Kökleri 50 mL otoklavlı RO suyu ile üç kez ve daha sonra 50 mL 2% 2 NaOCl ile 10 dakika yıkayın. NaOCl kaldırmak için tekrar üç kez RO su 50 mL ile kökleri yıkayın.
- Lekeler otoklavlı leke kağıdına kökleri yerleştirerek kökleri kurutun ve kökleri kuruyana kadar bırakın.
- Medya ve kuluçka
- Sterilize edilmiş bir neşter bıçağı ile köklerin kenarlarını çıkarın. Bıçak kullanarak kökleri bölün ve streptomisin sülfat (50 mg L-1) ve ampisilin (50 mg L-1)içeren bir patates dekstroz agar (PDA) medya Petri plaka üzerine yerleştirmek için sterilize forseps kullanın.
- Plakayı kapatın, parafilm ile kapatın ve karanlıkta iki gün boyunca 28 °C'de bir kuluçka makinesinde kuluçkaya yatın.
- Hipür ucu yöntemi
- İki günlük kuluçkadan sonra plakaları laminar akış odasına getirin. Bir stereomikroskop altında hyphal büyüme8 ucunu kesin (Leica EZ4 eğitim stereomikroskop) ve streptomisin sülfat ve ampisilin ile taze bir PDA plaka içine aktarın.
- 28 °C'de kuvözdeki plakaları karanlıkta on gün kuluçkaya yatırın.
- R. bataticola fungal inoculum'un depolanması ve bakımı
- Test tüpleri PDA eğimler olun ve alev sterilize aşılama döngü kullanarak on günlük kültür plaka bir mantar agar fiş transfer. Test tüpü kapağını parafilm ile kapatın.
- 28 °C'de 10 gün boyunca karanlıkta eğimleri kuluçkaya yatırın.
- Kapağı tekrar parafilm ile kapatın ve ileride kullanmak üzere buzdolabında 4 °C'de saklayın.
- Mantarı korumak için her altı ayda bir alt kültür.
- Virülans Bakımı
- Hasta pot tekniğinde belirtildiği gibi hazırlanan saf mantar inokül ile bitkilere bulaştırmak3. Enfekte bitkilerden aynı mantar izole (Koch's postülatlar)9 ve daha fazla deney için kullanın.
NOT: Bu çalışmada mantarın bir alan izole suşu kullanılmıştır (GenBank: MH509971.1 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MH509971)
- Hasta pot tekniğinde belirtildiği gibi hazırlanan saf mantar inokül ile bitkilere bulaştırmak3. Enfekte bitkilerden aynı mantar izole (Koch's postülatlar)9 ve daha fazla deney için kullanın.
2. Blotting kağıt tekniği
NOT: Lekeleme kağıdı tekniği sıvı mantar inokülhazırlanmasını, fide hazırlamayı ve hastalık değerlendirmesini gerektirir.
- Sıvı R. bataticola inoculum hazırlanması
NOT: Sıvı R. bataticola fungal inoculum hem misel hem de mikroskroti içerir. Bu yapıların her ikisi de birincil inokül görevi görededir.- 1.000 mL'lik bir şişede 500 mL PDB ortam hazırlayın ve 15 dakika boyunca 121 lbs'de otoklavlayın.
- Ortam soğuduktan sonra, mantar eğimli bir kültürden bir döngü dolusu mantar agar fişi ile suyu aşılayın ve karanlıkta 180 rpm'de bir çalkalayıcıda beş gün boyunca 28 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Otoklavlı cam veya plastik huni (10 cm), bir litrelik konik şişe ve iki kat örgü (10 cm2 ebat) (3 mm çapında gözenek boyutuna sahip naylon örgü) masada bir araya getirin. Örgükullanarak mantar miselve mikrosclerotifiltre. Otoklavlı blotlama kağıdında mantarı kurutun.
- % 50 inoculum için 100 g misel tartmak ve oda sıcaklığında tutmak.
- Nohut bitkisinin hazırlanması
- Seçin 50 sağlıklı tohum (Bu çalışmada, DRR duyarlı genotip JG 62 kullanılmıştır), 100 mL kabına yerleştirin ve bir örgü ile kaplayın.
- Toprak enkaz kaldırmak için ilk musluk suyu ile tohumları yıkayın.
- Laminar akış odasına tohumlu kabı alın ve yıkama başına 1 dakika boyunca steril 50 mL RO su ile üç kez yıkayın.
- Tohumları 50 mL %2 sulu NaOCl ile 2 dk boyunca sürekli sallayarak sterilize edin ve tohumları 50 mL steril su ile 1 dk'lık beş kez yıkayın.
- Bir polietilen torbayı (47,5 cm x 25 cm) Soilrite ile doldurun (bahçecilik sınıfı genişletilmiş perlitkarışımı, İrlanda turba yosunu ve aynı oranda eksfoliyon vermikülit yani, 1/3:1/3:1/3), yüzeysterilize 50 tohum iki cm derinliğinde ekmek ve 28 °C ± 2 °C sıcaklık, 16 saat fotoperiod 150 μmol m−2 s−1ışık yoğunluğu ve %70 bağıl nem ile bir büyüme odası / oda tutun. Ro su ile su ve ekim sekiz gün sonra bitkilerin kökünü.
- Soilrite parçacıkları kaldırmak için musluk suyunda kökleri yıkayın. Kökleri steril RO suyuyla durulayın ve 1000 mL'lik bir kabın içinde RO suyunda saklayın.
- Tepsilerde lekeleme kağıdı hazırlanması
- Bir leke kağıt alın ve çoğaltmaları karşılamak için yeterli sayıda parçalar (30 cm × 23 cm) onları kesti.
- Otoklavlanabilir polietilen torba içinde yaprak paketi ve 15 dakika boyunca 121 lbs onları otoklav ve kurutma için sıcak hava fırında tutun.
- Kat her lekeli kağıt levha yarısında.
- Kağıt, Şekil 2i-iv'tegösterildiği gibi temiz, ruhla silinmiş plastik tepsiye yerleştirin.
- Daldırma ile bitki aşılama
- %50 inoculum elde etmek için 200 mL otoklavlı RO suyunda 100 g mantar inoculumunu 200 mL'lik bir kabın içinde çözün.
- Mantar inokülünün tek tip bağlanmasını sağlamak için bitki köklerini aralıklı yukarı ve aşağı hareketlerle 1 dakika boyunca hazırlanan inoküle batırın.
- Bitkileri leke kağıdına yerleştirme
- Steril RO suyu ile tepsiye yerleştirilen leke kağıdının alt tarafını ıslatın. Bitkileri sadece köklerin kağıtla kaplandığı ve sürgünlerin dışarıda bırakıldığı bir şekilde kağıda yerleştirin.
- Blotlama kağıdının üst tarafını katlayarak kapatın ve bitki büyümesini sürdürmek için yeterli su sağlamak için tüm kağıdı ıslatın.
- Tepsiyi günde bir kez sulayın ve tepsileri 28 °C'de tutun. Nekroz, kök çürümesi ve günlük yaprak sararken sararma gibi belirtileri gözlemleyin.
3. Hasta pot tekniği
NOT: Hasta pot tekniği öldürücü inokül ve hasta bir tencere hazırlanması, nem seviyesinin korunması ve hastalık belirtilerinin değerlendirilmesi gerektirir.
- Substrat hazırlanması
- Herhangi bir ticari nohut tohumu bir kg alın. Enfekte tohumları çıkarın (mantar büyüme, enfeksiyon lekeleri ve böcek hasarı ile tohumlar). 5 L plastik kabıyerleştirin ve büyük enkaz kaldırmak için iyice 3-4 kez musluk suyu ile yıkayın.
- Tohumları 2 L RO suyu yla üç kez yıkayın ve 1 kg'lık tohumları 5 L'lik bir kabın içine beş saat boyunca üç kat daha fazla su ile ıslatın.
- Bir kez tohumlar su imbibed, tohum exudates kaldırmak için RO su üç kez onları yeniden yıkayın.
- Suyu tamamen çıkarın ve tohumları reçel şişelerine (300 mL, 12 cm yükseklik, 6 cm çapında ve 155 g ağırlık) yaklaşık1/4'lük kapasiteye (reçel şişesi başına 100 g) paketleyin ve şişeleri kapaklarla kapatın. Bir otoklavable plastik torba (48 cm x 30 cm) otoklav iki kez 15 dakika boyunca 15 dakika boyunca 121 lbs pack on reçel şişeleri.
- Şişeiçindeki su damlacıklarını çıkarmak için tohumları bir gecede fırında 40 °C'de kurulayın.
- Hasta kültürünün hazırlanması
- BSL-2 seviyesi laminar akış odasını açın. % 70 etanol ile zemin iyice silin ve 15 dakika UV açın. Sonra, laminar akış odası içinde tohumları tutun.
- 10 günlük taze izole R. bataticola kültürünü (bölüm 1) ele alalım. Daha sonra, steril bir pipet ucu veya mantar borer kullanarak üç mantar agar fişleri (4 mm çapında) almak ve aseptik reçel şişeleri içine koyun. Kapaklar ve parafilm ile mühür ile şişe kapağı.
- Mantar diskini nohut tohumlarıile eşit bir şekilde karıştırmak için şişeleri sallayın.
- Şişeleri 30 °C'de karanlıkta 15 gün kuluçkaya yatırın.
- Siyah mantar büyüme ile reçel şişeleri alın(Şekil 4iii)ve steril çömetler kullanarak bir cam Petri plaka reçel şişeleri hasta kültürü (mikrosclerotia ile tohum) aktarın. Bir cam Petri plaka iki gün boyunca oda sıcaklığında kurulayın.
- Mantar kütlesini bir harç ve havan topu kullanarak tozlayın ve tozu 4 °C'de saklayın.
- Autoclave Soilrite iki kez 15 dakika için 121 £ de.
- Otoklavlı Soilrite karışımını güneşlik altında kurutun.
- Mantar tozunu %50 w/w'de Soilrite ile karıştırın, tencereleri karışımla doldurun ve bir gün oda sıcaklığında tutun.
- Tencere başına yüzeye dayanıklı DRR duyarlı nohut tohumu (10 cm yuvarlak kaplar)(Malzeme Tablosu)ekin ve %80 alan kapasitesi (FC) nem seviyesini koruyun.
- Çimlenme sonrası bitkileri söküp nekroz ve kök çürümesi gibi belirtileri gözlemleyin.
- Hasta pot verimliliğinin değerlendirilmesi
NOT: Bitkiler kökleri tamamen çürümüş olduğunda sarı foliar belirtileri gösterir.- Lezyonun (nekrotik lekeler)(Ek Şekil 2C)sayılarını ve kök çürümesinin şiddetine göre bir hastalık skoru geliştirin. %90 bitki ölümünü gösteren hasta kaplar daha fazla kullanılabilir.
- Genotip taraması
- Büyük miktarlarda hasta kültürü hazırlamak ve 30 cm boyunda tencere sterilize Soilrite veya alan toprak (% 5 w / w) ile karıştırın. Yüzeyi ıslamak için tencereleri sulayın ve yedi gün boyunca bozulmadan bekletin.
- 10 cm yuvarlak tencere başına bir yüzeysterilize tohum ve 30 cm yuvarlak tencere başına üç tohum ekin ve yeterli su.
- Sarı foliar ve kök çürümesi belirtileri gözlemleyin.
- Kombine kuraklık ve R. bataticola enfeksiyonu
- Sinha ve ark.'da (2019) belirtilen protokolleri izleyerek kuraklık stresi uygulayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmada, kuraklık stresi altında bitki-patojen etkileşiminin patomorfolojik ve moleküler anlaşılmasını kolaylaştırmak için kağıt ve hasta saksı teknikleri gibi teknikler gösterilmiştir. Bunu başarmak için, DRR belirtileri sergileyen bitkiler1,3,4 bir nohut alanından toplandı ve mantar hiphal ucu yöntemi 8 kullanılarak izole edildi . R. bataticola mantar kültürü, kuluçkadan dört gün sonra PDA plakasında koyu gri ve(Şekil 1A & C)ve kuluçkadan beş gün sonra PDB ortamda gri renkte daha koyu görünür (Şekil 1B). R. bataticola septat misel vardır (Şekil 1D), ve mikrosclerotia üretir (Şekil 1E), toprakta birincil inokül olarak hareket10.
Şekil 2'de verilen adımlar, lekeleme kağıdı tekniğini uygulamak için takip edilebilmektedir. Sekiz günlük bitkiler sıvı inokül (%50) ile enfekte edildi ve enfeksiyon dan sekiz gün sonra, bitkiler belirtileri için gözlendi. Bitkiler, drr hastalığının tipik kök ve foliar semptomları olan yaprak sararma larının yanı sıra geniş nekroz nedeniyle kök çürümesi göstermiştir(Şekil 3B ve Ek Şekil 1A).
Hasta pot tekniği Şekil 4'tegösterilen adımlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Soilrite ve tarla toprağında mantar inokül konsantrasyonları sırasıyla %10 ve %5 idi. DRR duyarlı tohumlar kök çürümesi gibi tipik DRR belirtileri göstermek, lateral köklerin eksikliği, yaprak sarar, ve erken ölüm, kontrol bitkileri ile karşılaştırıldığında(Şekil 5A ve B). Soilrite ile yapılan hasta tencerede enfeksiyona maruz kalan bitkiler öldü ve ekimden yedi gün sonra kök çürümesi gösterdi (Şekil 5C ve Ek Şekil 2C). Bu arada, tarla toprağı ile yapılan hasta tencerede yetişen bitkiler tipik foliar belirtileri gösterdi, yani, saman renkli yeşillik ekim 48 gün sonra(Şekil 5E).
Kuraklığın DRR hastalığı üzerindeki etkisi de laboratuvar koşullarında hasta tencerede incelenmiştir. Kuraklık stressu3 stopaj tarafından empoze edildi. Kuraklık stresi altındaki bitkiler (%30 FC) patojen-sadece tedavi edilen (%90 FC) bitkilere göre ağırlaştırılmış hastalık insidansı göstermiştir(Şekil 6A ve B). Kontrol ve kuraklık la tedavi edilen bitkilerde herhangi bir belirti görülmedi(Şekil 6A ve B). Kombine stres altındaki kökler patojen bitkilere göre daha fazla nekrotik lekelere ve çürümeye sahipti(Şekil 6B).
Şekil 1: Rhizoctonia bataticolakarakteristik morfolojik özellikleri . Kuru kök çürümesinin nedensel maddesi(Rhizoctonia bataticola, ITCC 8635) sahadan izole edildi (Ulusal Bitki Genom Araştırma Enstitüsü, Yeni Delhi, 28.6139°N, 77.2090°E). Kültürlerden, mantar hiphal ucu yöntemi8kullanılarak izole edildi. Görüntüler bir Petri plaka(A)içinde patates dekstroz agar 4 günlük R. bataticola kültürü göstermek , 5 günlük sıvı kültür(B), ve 10 günlük eğimli kültür(C). Mantar miseli (D) ve mikrosclerotia (siyah oklar)(E)bir mikroskop slayt üzerinde alay edildi ve WGA-FITC ve anilin mavi ile lekeli, sırasıyla. Görüntüler(E, F,ölçek çubuğu, 20 ve 50 μm) epifloresan mikroskobun 20x ve 40x objektif lensi altında ele geçirildi. Beyaz oklar miseldeki çapraz duvarları gösteriyor. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Blotting kağıt tekniğinde R. bataticola aşısı ve DRR tahlillerinde yer alan adımlar. Yüzey, tohumları musluk suyundan geçirerek ve %2 sodyum hipoklorit ile yıkayarak sterilize eder ve ardından steril RO suyu ile 3-4 kez yıkanır (adım 1). Daha sonra, Soilrite (adım 2) içeren 15 cm yüksekliğindeki kaplarda 30 tohum ekin ve tohumların 28 °C ± 2 °C sıcaklık, 16 saat fotoperan 150 μmol m−2 s−1ışık yoğunluğu ve %70 bağıl nem (adım 3) ile bir büyüme odasında sekiz gün boyunca büyümesine izin verin. Bitkileri kökünden sökün ve sterilize edilmiş suyla yıkayın (adım 4). Mantar ile 500 mL PDB ortam aşılayarak mantar inokül hazırlayın (adım 5). Enfeksiyon için 5 günlük mantar suyu kültürünü kullanın. Daha sonra, 30 s için bir kabın içinde mantar inokül içine kökleri daldırma ve kabın iç yanak dokunarak aşırı inokül kaldırmak bitkiler aşılamak (adım 6). Enfeksiyondan sonra, farklı lekeleme kağıtlarına mantar aşılı ve mock-aşılanmış bitkileri ayrı temiz tepsilere yerleştirin (adım 7). Günlük yeterli steril su ile lekeleme kağıt nemlendirin ve belirtileri gözlemlemek, viz., lateral kökleri dökülme, sarar ve bitki yaprakları, çürük tohumlar solma, ve kök çürüme sekiz gün post-enfeksiyon (adım 8)(A). Görüntüler temel adımları temsil eder (adım 3-7)(B). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Nohutta DRR hastalığı belirtileri blotting kağıt tekniğine dayalı. Şekil 2'de gösterilen protokolütaki protokole göre, DRR duyarlı bitkiler (genotip, JG 62) bloting kağıt tekniği kullanılarak enfeksiyona maruz kaldı ve semptomlar enfeksiyondan sekiz gün sonra yakalandı. Görüntüler, temsili kontrol tesislerini (mock-inoulated) sağlıklı sürgünler (kırmızı ok) ve daha fazla yanal köke (sarı ok) sahip kökleri gösterir (A). Görüntüler, yapraklar (mavi oklar) ve daha az yanal kökleri (beyaz oklar) ile kurutulmuş / nekrotik kökleri solma, sarar ve kurutma gibi tipik belirtileri ile temsili enfekte bitkiler göstermektedir (B). Ölçek çubuğu 1 cm'dir. Deneyler en az beş kez tekrarlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: R. bataticola aşısı ve DRR hastalığı tahlilleri için hasta pot hazırlığına genel bakış. Aktif olarak büyüyen mantar kültürüne sahip 5 mm'lik mantar diski ile bir PDA plakası aşılayarak mantar inokülunu hazırlayın ve 10 gün boyunca 28 °C'de kuluçkaya yatırın. Daha sonra, substrat hazırlamak için, musluk suyu ile nohut tohumları yıkayın, bir gecede suda tohumları ıslatın ve 15 dakika boyunca 121 lbs otoklav. Daha sonra, 10 günlük kültürden üç agar fişi ile substrat 100 g aşılayın ve iyice karıştırın. Daha sonra, aşılanmış substrat 30 °C'de bir kuluçka makinesinde 15 gün kuluçkaya yatırın. Hasta kültürü (mantar yetiştirilen substrat), kuru ve toz ezmek ve 4 ° C'de saklayın. Daha sonra, iyice kuru Soilrite 100 g (hasta pot)(A)ile hasta kültür 50 g karıştırın. Sonra, yüzeysterilize duyarlı nohut tohumları ekmek ve belirtileri gözlemlemek, viz., musluk kök çürümesi, lateral kök nekroz, ve yaprak sarar. Aynı tencerede belirtiler gösteren bitkilera asimile edin. Daha fazla deney için, duyarlı genotip olarak% 90 enfeksiyon gösteren tencere kullanın. Görüntüler inokül (i), substrat (ii) ve kontrol ve aşılanmış hasta kültürünü (iii)(B)temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Hasta pot tekniğine dayalı nohutta DRR hastalığı belirtileri. Hasta bir tencere yapmak için Şekil 4'te gösterilen protokol kullanılmıştır. Daha sonra, yüzeysterilize DRR duyarlı nohut genotip (JG 62) tohumları kontrol ekildi (A) ve hasta pot(B). Saksıdaki her bitki bir kopyayı temsil eder ve hasta tencerede ölü veya bodur bitki büyümesi gözlenmiştir. Panelin sağ tarafındaki bitkiler(C)sırasıyla kontrol ve tedavide lateral köklerin (sarı ok) varlığını ve yokluğunu gösterir. Grafik kontrol(D)ile karşılaştırıldığında hasta pot tedavisinde ölü bitkilerin sayısını gösterir. Hasta tencere NIPGR tarlasından toplanan sterilize edilmiş tarla toprağında hazırlandı ve hasta kültürü karıştırıldı. Yüzeyde sterilize edilmiş tohumlar ekildi ve hastalık belirtileri ekimden 48 gün sonra yakalandı. Görüntü kontrol tesisleri gösterir(E), ve tipik DRR foliar belirtileri, yani, bitkilerin kurutma, gösterilir (beyaz oklar). Öğrencinin t-testikullanılarak istatistiksel anlamlılık belirlendi. Çubuk dokuz biyolojik çoğaltmanın SEM'ini temsil eder ve yıldız işareti P < 0,0001'de istatistiksel olarak anlamlı bir değeri gösterir. Sarı ok nekrotik / çürümüş, kurutulmuş birincil kök herhangi bir yanal kökleri olmadan gösterir. Deneyler en az on kez tekrarlandı ve benzer sonuçlar elde edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Hasta pot yöntemi bitki-patojen etkileşimi üzerinde kuraklık stresinin etkisini incelemek için yararlıdır. Kuraklığın R. bataticola enfeksiyonu üzerindeki etkisini incelemek için bir pot deneyi yapılmıştır. Deney kontrol, kuraklık sadece, patojen sadece(R. bataticola, patojen) ve kombine kuraklık ve R. bataticola stres (kombine stres) oluşuyordu. Bitkiler 28 °C ± 2 °C sıcaklık, 16 saat fotoperre 150 μmol m−2 s−1, ve %70 bağıl nem ile bir büyüme odasında yetiştirildi. Hasta kabı Şekil 4'te gösterilen protokole göre hazırlanmıştır. Daha sonra, yüzeysterilize DDR duyarlı nohut genotip (JG 62) tohumları kontrol ve hasta tencere ekildi. Deney boyunca kontrol ve patojen tedavileri sulandırıldı. Kuraklık ve kombine stres tedavisi altındaki bitkilere kuraklık stresi uygulandı. Su ekimden 18 gün sonra bekletildi ve ekimden 24 gün sonra istenilen kuraklık seviyesine ulaşıldı. Bitkiler ekimden 29 gün sonra semptomlar için gözlendi. Görüntü tedaviler altında foliar ve kök değişiklikleri gösterir(A). Görüntüler, bir SMZ25/SMZ18 araştırma stereomikroskobunun(B)0.5X objektif merceğinin altında gözlenen lekesiz bitki köklerini göstermektedir. Kırmızı ok enfekte olmayan lateral kökleri gösterir, ve siyah oklar enfekte lateral kökleri gösterir. Deneyler en az on kez tekrarlandı ve benzer sonuçlar elde edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil S1: Nohutta inokül boyutu ve lateral kök sayısında azalma. Şekil 2'de gösterilen protokolütaki protokole göre, DRR duyarlı bitkiler (genotip, JG 62) bloting kağıt tekniği kullanılarak çeşitli inokül boyutunda enfeksiyona maruz kaldı ve semptomlar enfeksiyondan sekiz gün sonra yakalandı. Bitkiler çeşitli inokül boyutu (0.1%, 1%, 10% ve% 20 w / v suda) Görüntüleri solma, sarar ve yaprakların ve kurutulmuş / nekrotik köklerin daha az lateral kökleri (B) ile tipik belirtiler ile temsili enfekte bitkiler göstermektedir aşılanmış edildi. Grafik inokül varyasyonu (B) ile enfeksiyon altındaki bitkilerde lateral köklerin sayısını gösterir. Ölçek çubuğu 1 cm. n=10'dur. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil S2: Soilrite nohut DRR foliar belirtileri. Şekil 4'te gösterilen protokole göre yüzeysterilize edilmiş tohumlar ekildi ve hastalık belirtileri ekimden 14 gün sonra yakalandı. Temsili görüntü kontrol tesisleri (A) gösterir ve resim tipik DRR foliar belirtileri, yani bitkilerin kurutma gösterir (beyaz oklar) (B). Hastalık skoru kökteki nekrotik lekelere göre geliştirilmiştir. Puanlama gün (C) arasında geliştirilmiştir. Fotoğraflar (A&B) aynı deneyden. Ölçek çubuğu= 3 cm. n= 10. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Blotting kağıt tekniği laboratuvar koşullarında nohut genotipleri ekrana basit bir yaklaşım sağlar. Dip aşılama, inokül yükü üzerinde kolay kontrol(Ek Şekil 1)ile etkileşimin zamansal olarak araştırılmasını sağlar ve in vitro taramayı kolaylaştırır. Ayrıca genç fideler bile kullanılabilir. Beş günlük mantar kültürü(Şekil 1B)bitkilere bulaştırmak için yeterli inoculum verebilir. Sıvı inokül hem misel hem de mikroskroti içerir (Şekil 1D & E). Kök çürümesi semptomları(Şekil 3B)hastalığı ortaya çıkarmak ve dirençli genotipleri belirlemek için kullanılabilir. DRR oluşumu büyük ölçüde kuraklık stres1,3,5etkilenir. Ancak, sadece bu teknik ile, kuraklık stres dayatma mümkün değildir ve bu teknik ile tarama doğal tepkiler yansıtmaz.
Hasta pot tekniği bitkiler, patojenler ve kuraklık stres arasındaki etkileşimlerin incelenmesini sağlar. Bu dirençli genotipleri belirlemek için kombine kuraklık ve patojen stres altında genotipleri taramak için bir yol sağlar. Hasta bir tencerede, kuraklık stres bitki ve ekran bitkilerin herhangi bir yaşta empoze edilebilir. Bitkiler hasta pot yönteminde tipik DRR semptomları(Şekil 5C & F ve Ek Şekil 2B & C)gösterir. Kombine kuraklık ve patojen enfeksiyonuna maruz kalan bitkiler, sadece patojen tedavisine kıyasla ciddi kök çürümesi gösterdiler. Bu mevcut nohut germplasm sadece patojen değil, aynı zamanda kombine patojen ve kuraklık stresdirençli bir genotip belirlemek için taranması gerektiği anlamına gelir. Çeşitli çalışmalar daha önce genotipleri taramak için denendi ama lekeleme kağıt tekniği kullanılarak11,12. Ayrıca, alan tarama da yapılmıştır ama kuraklık stres11empoze olmadan . Nohutun farklı aşamalarında kuraklık stresi uygulamak ve genotip yanıtını değerlendirmek çok önemlidir.
SORUN GIDERME
Lekekağıt tekniği için, kabın içinde inoculum hacmi tüm bitki kökü batırılır düzeyinde olmalıdır. Ayrıca, aşırı sulama bitki kökleriıslak çürümeye yol açacaktır. Kirlenmeye neden olabileceğinden bitkileri sulandırmak için musluk suyu kullanmayın.
Hasta pot tekniği için, Desi nohut çeşitleri tercih edilir. Tohum sayısı araştırmacıların ihtiyaçlarına bağlı olarak değişebilir. Tohumları ıslatmak için kullanılan su hacmi üç kat daha fazla olmalıdır çünkü tohumlar imbibe su. Yıkama doğru yapılmazsa bakteri büyümesi meydana gelecektir. Otoklavsız su tohumları ıslatmak için kullanılabilir. Otoklavlama dan sonra tohumların rengi yanlış otoklavlama gösterir kahverengi yerine siyah olmalıdır. Sıcak hava fırınında kurutma üzerinde tohum kurutma yol açar; bu tür tohumlar mantar aşısı için kullanılamaz. Laminar akış dışında şişe aşılama kontaminasyona neden olabilir. Aşılanmış nohut yemek beyaz mantar büyüme uygunsuz otoklavlama bir işaretidir. Kullanılan inokül, lekeleme kağıdı ve enfekte bitkilerin atılmasında biyogüvenlik önlemleri alınmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Açıklayacak bir şeyimiz yok.
Acknowledgments
M.S.K laboratuvarındaki projeler Ulusal Bitki Genom Araştırmaları Enstitüsü çekirdek finansmanı tarafından desteklenir. VI, DBT- JRF (DBT/2015/NIPGR/430) kabul eder. Kursiyer öğrencilere, Bayan Rishika'ya, Bay Jayachendrayan'a ve Bayan Durgadevi'ye video çekimi sırasında ki teknik yardımları için teşekkür ederiz ve Bay Sandeep Dixit, Bayan Anjali ve Dr. Avanish Rai ham verileri ve el yazması dosyaları eleştirel olarak değerlendirdiği için. Sayın Rahim H Tarafdar ve Bay Sunder Solanki'ye laboratuvardaki yardımları için teşekkür ederiz. Tesis büyüme desteği/alanı için e-kaynaklara ve NIPGR Tesis Büyüme Tesisine erişim sağlayan DBT-eLibrary Konsorsiyumu (DeLCON) ve NIPGR Kütüphanesi'ni kabul ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fungus- Rhizoctonia bataticola | Pathogen inoculum | Indian Type Culture Collection No. 8365 | GenBank: MH509971.1, ITCC 8635 (https://www.iari.res.in/index.php?option=com_content&view=article& id=1251&Itemid=1370) |
| Soilrite mix | Soil medium in the lab | Keltech Energies Limited, Bangalore, India | http://www.keltechenergies.com/ |
| Filter paper | Blotting paper to support the plant growth | Himedia | http://himedialabs.com/catalogue/chemical2017/index.html#374 |
| Pot | Growing plants | 10 and 30 cm size pots | Routinely used nursery pots, for example, https://dir.indiamart.com/impcat/nursery-pots.html |
| Potato dextrose agar/broth | Culture and maintain the fungus | Cat# 213400, DifcoTM, MD, USA | https://www.fishersci.com/shop/products/bd-difco-dehydrated-culture-media-potato-dextrose-agar-3/p-4901946 |
| Incubator | Culture the fungus | LOM-150-2, S/N AI13082601-38, MRC, incubator, and shaker | http://www.mrclab.com/productDetails.aspx?pid=91131 |
| Growth chamber | Growing plants in controlled condition | Model No. A1000, Conviron, Canada | https://www.conviron.com/products/gen1000-reach-in-plant-growth-chamber |
| Laminar airflow | Carrying out aseptic exercises | Telstar, Bio II advance, Class II cabinet, EN-12469-2000 | https://www.telstar.com/lab-hospitals-equipment/biological-safety-cabinets/bio-ii-advance-plus/, http://www.atlantisindia.co.in/laminar-air-flow.html |
| Mesh | Filtering the fungal mycelia | Nylon mosquito net | Mesh with 0.6-1 mm diameter pore size |
| Autoclave | Autoclaving media and chickpea seeds | Autoclave | http://www.scientificsystems.in/autoclave |
| Microscopes | Visualizing the infection ang fungal mycelia | SMZ25 / SMZ18, Research Stereomicroscopes, Leica EZ4 educational stereomicroscope | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/stereomicroscopes-macroscopes/smz25-smz18 https://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/p/leica-ez4/ https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-80i |
| Weighing balance | Weighing fungus and chemicals | Sartorius Electronic Weighing Balance, BSA 4202S-CW | https://www.sartorius.com/en/products/weighing/laboratory-balances |
| WGA-FITC | Fungus staining | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l4895?lang=en®ion=IN |
| Aniline blue | Fungus staining | Himedia | http://www.himedialabs.com/intl/en/products/Chemicals/Dyes-Indicators-and-Stains/Aniline-blue-Water-soluble-Practical-grade-GRM901 |
References
- Sharma, M., Ghosh, R., Pande, S. Dry root rot (Rhizoctonia bataticola (Taub.) Butler): an emerging disease of chickpea - where do we stand. Archives of Phytopathology and Plant Protection. 48 (13-16), 797-812 (2015).
- Srinivas, P. Studies on dry root rot of chickpea (Cicer arietinum L.). , Available from: http://krishikosh.egranth.ac.in/handle/1/93135 (2016).
- Sinha, R., Irulappan, V., Mohan-Raju, B., Suganthi, A., Senthil-Kumar, M. Impact of drought stress on simultaneously occurring pathogen infection in field-grown chickpea. Scientific Reports. 9 (1), (2019).
- Nene, Y., Haware, M., Reddy, M. Chickpea diseases: resistance screening techniques, information bulletins No. 10. Patancheru. Information Bulletin No. 10. Patancheru, A.P., India: International CroDS Research Institute for the Semi-Arid Tropics. , 1-10 (1981).
- Pande, S., Krishna Kishore, G., Upadhyaya, H. D., Narayana Rao, J. Identification of sources of multiple disease resistance in mini-core collection of chickpea. Plant Disease. , (2006).
- Pandey, P., Irulappan, V., Bagavathiannan, M. V., Senthil-Kumar, M. Impact of combined abiotic and biotic stresses on plant growth and avenues for crop improvement by exploiting physio-morphological traits. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
- Irulappan, V., Senthil-Kumar, M. Morpho-physiological traits and molecular intricacies associated with tolerance to combined drought and pathogen stress in plants. Biotechnologies of Crop Improvement, Volume 3: Genomic Approaches. , (2018).
- Jensen, A. B., et al. Standard methods for fungal brood disease research. Journal of Apicultural Research. 52 (1), 1-39 (2013).
- Agrios, G. Plant Pathology: Fifth Edition. , 9780080473 (2004).
- Coley-Smith, J. R., Cooke, R. C. Survival and germination of fungal sclerotia. Annual Review of Phytopathology. , (1971).
- Nagamma, G., Saifulla, M., Sab, J., Pavitra, S. Screening of chickpea genotypes against dry root rot caused by Macrophomina phaseolina (tassi) goid. 10 (4), 1795-1800 (2015).
- Infantino, A., et al. Screening techniques and sources of resistance to root diseases in cool season food legumes. Euphytica. 147 (1-2), 201-221 (2006).
- Khaliq, A., et al. Integrated control of dry root rot of chickpea caused by Rhizoctonia bataticola under the natural field condition. Biotechnology Reports. 25, 00423 (2020).
