Summary
Ylerifieringen av ett nytt antibiotikums verkningssätt är en utmanande uppgift i läkemedelsupptäcktsprocessen. Målet med metoden som beskrivs här är tillämpningen av isotermiska mikrokalorimetry med hjälp av calScreener i antibakteriella profilering för att ge ytterligare insikt i läkemedels-mikrob interaktioner.
Abstract
På grund av det globala hotet om ökande antimikrobiell resistens behövs det ett akut behov av nya antibiotika. Vi undersöker naturliga produkter från Myxobakterier som en innovativ källa till sådana nya föreningar. En flaskhals i processen är vanligtvis klarläggande av deras verkningssätt. Vi etablerade nyligen isotermiska mikrokalorimetry som en del av en rutinmässig profilering pipeline. Denna teknik möjliggör för undersökning av effekten av antibiotikaexponering på den totala bakteriell metaboliska responsen, inklusive processer som är frikopplade från biomassabildning. Viktigt, bakteriostatiska och bakteriedödande effekter är lätt urskiljbara utan någon användare ingripande under mätningarna. Isotermisk mikrokalorimetry är dock ett ganska nytt tillvägagångssätt och att tillämpa denna metod på olika bakteriearter kräver vanligtvis förvärdering av lämpliga mätförhållanden. Det finns några referens termogram tillgängliga av vissa bakterier, kraftigt underlätta tolkning av resultat. Eftersom poolen av referensdata stadigt växer förväntar vi oss att metoden kommer att få allt större effekt i framtiden och förväntar oss att den möjliggör djupgående fingeravtrycksanalyser som möjliggör en differentiering av antibiotikaklasser.
Introduction
Syftet med denna metod är att tillämpa isotermisk mikrokalorimetry (IMC) som en medelhög genomströmningsanalys i mode-of-action (MoA) profilering av nya antibakteriella föreningar. Denna metod avslöjar data angående aktiviteten hos föreningar på bakteriearter och ger information om den bakteriedödande eller bakteriostatiska karaktären hos själva föreningen.
Ökningen av framväxande antimikrobiell resistens (ANTIR) är ett globalt problem och det leder till mindre effektiva behandlingar av vanliga infektioner med kända antibiotika1. Men sökandet efter nya föreningar och läkemedel som kan ersätta eller arbeta i kombination med kända antibiotika pågår och detta bygger på olika metoder. Naturliga produkter är en viktig aktör i nuvarande kampanjer drog upptäckt och särskilt i anti-infective drug discovery2. Att identifiera nya blystrukturer för antibiotikautveckling är dock en lång och finansiellt krävande process3. Således är de tidiga upptäcktsstegen oerhört viktiga för att kunna filtrera på de flesta lovande byggnadsställningar redan i ett tidigt skede. Inledande steg i naturliga produkt läkemedel upptäckt inkluderar att få en förening struktur, bestämma aktiviteten in vitro tillsammans med MoA och mål identifiering. Mest framgångsrika föreningar är berättigade till ytterligare utveckling bör visa ett gynnsamt spektrum av verksamhet (dvs. bredspektrum aktivitet i fråga om antibakteriella medel) och en ny MoA genom vilken redan existerande AMR kan övervinnas. Lovande byggnadsställningar sedan typiskt screenas i sekundära analyser, som inkluderar in vivo biotillgänglighet, toxicitet, och metabolism4. Förutom de ekonomiska oro, naturliga produkt läkemedel upptäckt står inför ytterligare utmaningar rörande kostnader och tekniska svårigheter i samband med sammansatt isolering och rening, som i sin tur kan göra det svårt att få flera milligram eller ens gram belopp i ett tidigt skede av upptäckten processen5,6. Därför är det av yttersta vikt inom naturproduktforskningen att kunna utföra toppmodern primärscreening med minimala sammansatta mängder för att kunna fatta ett välgrundat beslut om ytterligare investeringar för att göra en ny naturlig produkt tillgänglig för preklinisk utveckling. Med användning av IMC för antibakteriell profilering, mängden av föreningen som behövs minskas avsevärt i jämförelse med standardmetoder. Tekniken ger också mer ingående information om samspelet mellan nya läkemedel med det mikrobiella samhället7.
IMC är en väletablerad metod för att mäta total energi som ett resultat av alla biologiska, fysikaliska och biokemiska processer och reaktioner i ett biologiskt system. Bakteriell energi release är proportionell mot den totala metaboliska reaktioner8. Inom ett slutet system, såsom den använda mikrokalorimetern, kan värmenivåerna mätas i mikrowattområdet för att studera den metaboliska kinetiken hos bakterier9,10,11,12. Den värme (energi) som frigörs av bakterier är kopplad till cellulära funktioner som ligger bakom deras ämnesomsättning och som inte nödvändigtvis är proportionell mot cellulära biomassa.
Inledningsvis har tillämpligheten av isotermisk kalorimetri för mikrobiologiska analyser varit begränsad på grund av dess låga genomströmning och höga testvolymer. Den använda mikrokalorimetern är dock unik eftersom den kombinerar fördelarna med isotermisk kalorimetri med ökad genomströmning och lägre sammansatta krav, vilket gör den till ett värdefullt verktyg förläkemedelsupptäcktsapplikationer 10. Vidare ger instrumentet ytterligare fördelar jämfört med alternativa metoder för mätning av bakterietillväxtkinetik, såsom standardturbiditetsmetoden, som bygger på mätning av optisk densitet vid 600 nm (OD<600). Mätning OD600 bygger på antagandet att ökad optisk densitet är lika med mikrobiell tillväxt, och därigenom försumma förekomsten av icke-livskraftiga celler. Denna metod har också kritiserats eftersom det utesluter små kolonivarianter och persisterceller11. I motsats till detta tillåter IMC realtidsobservation av någon typ av livskraftiga celler. Om celler är vilande uppvisar de fortfarande metabolisk aktivitet och de kan därmed upptäckas av IMC, medan sådana fenomen inte kan upptäckas med hjälp av standard grumlighetsmetod11. Andra fördelar med IMC inkluderar en kortare antimikrobiell resistenstesttid, mätning av läkemedelsinteraktioner i ett komplext samhälle och standardanalysmetoder utan att förstöra provet7.
IMC-tekniken har implementats i ett brett spektrum av studier, allt från mikrobiologi till termogenes och cancerbiologi13,14,15,16,17. De mikrobiella tillämpningarna omfattar bestämning av minsta hämmande koncentrationer (MIC) av föreningar mot olika bakteriestammar. Flera studier har gjorts och man har kommit fram till att MIC-data från isotermisk kalorimetri för majoriteten av bakteriearter kan fås snabbare och resultat är liknande jämfört med andra (standard) metoder för MIC-bestämning12,18,19. Ytterligare tillämpningar av IMC inkluderar observera interaktion av läkemedel och kombination av läkemedelsbehandlingar med komplexa bakteriella samhällen såsom biofilmer11. En studie med fokus på MoA profilering visade att mikrokalorimetern kan upptäcka en skillnad i första och andra generationens cefalosporiner, medan olika antibiotika med samma MoA uppvisar en liknande värmeflödeskurva jämfört med varandra18.
Här beskriver vi användningen av IMC för MoA-profilering av nya naturliga produkter med hjälp av det nya isotermiska mikrokalorimetriinstrumentet. Metoden används för att bestämma effektiva antibiotikakoncentrationer och för att beskriva egenskaper hos antibiotika vad gäller bakteriedödande eller bakteriostatiska mekanismer. Metoden kan i stort sett genomföras i MoA-profilering av föreningar och den kan ersätta eller åtminstone komplettera standardmikrobbiologiska metoder. Framtida studier kommer att omfatta djupgående fingeravtrycksanalyser som möjliggör differentiering av antibiotikaklasser baserat på målmekanismer.
Protocol
OBS: Instrumenttemperaturen måste ställas in enligt den bakterie som används minst en dag i förväg för att säkerställa systemets stabilitet. Här körs Acinetobacter baumannii DSM30008 prover vid 30 °C.
1. Kulturberedning
- Strimm ut anstränga under utredning (här: A. baumannii) på en CASO-agar pläterar och inkubera över natten i en statisk elektricitetinkubator på °C 30.
- Förbered en över natten kultur genom att inokupa en enda koloni i MHB (Mueller-Hinton buljong) och inkubera på en skakande inkubator på 180 rpm vid 30 °C.
2. Provberedning
- Använd 1,5 mL rör för att förbereda koncentrationsområdet för utvalda läkemedel eller föreningar (t.ex., genom att lägga till 1,5 μL av 100x lagerlösningar i DMSO; se steg 2.3).
- Späd över natten kulturen i MHB medium.
- Mät den optiska densiteten i övernattningskulturen med hjälp av en spektrofotometer vid en våglängd på 600 nm.
- Späd kulturen för att erhålla 5 x 105 kolonibildande enheter (CFU)/mL i färskt MHB-medium. En OD600 av en motsvarar ungefärligt 5 x 108 CFU/mL (e.g., Escherichia coli, Staphylococcus aureus, A. baumannii).
OBS: Det är viktigt att kalibrera konverteringsfaktorn OD600 till CFU/mL för varje enskild bakteriestam under de tillämpade odlingsförhållandena.
- Tillsätt 150 μL av cellerna till de provrör som bereds i steg 2.1, vilket garanterar korrekt slutkoncentration av testat läkemedel eller förening och korrekt slutcellskoncentration.
- Blanda föreningen med cellerna genom att virvel.
OBS: Provplattan (se Tabell över material) har sex rader, som var och en innehåller åtta brunnar, totalt 48-brunnar; Rad A och rad F är den termodynamiska referensen. Därför kan inga prover laddas i dessa brunnar, motsvarande media laddas i dessa brunnar. 32 testprover kan mätas per körning, med hjälp av brunnar i rad B-E. Individuellt provprov bör köras på minimum i två exemplar (här: alla prover har körts som tre exemplar). Tillväxtkontroller bör ingå.
3. Sätt beredning
- Överför 120 μL från blandningen som bereds i steg 2.4 till plastinläggen.
OBS: Använd omvänd pipettering i steg 3.1 för att förhindra att vätska sprutar på sidorna av plastinläggen, vilket kan leda till störningar vid korrekta signalutläsningar. - Placera alla titanalar i hållarna (se Tabell över material) med pincett.
- Överför försiktigt inlägg i titan-injektionsflaskan i hållarplattan.
- Placera löst titanlock på alla titanflaska.
4. Inläsning
- Överför hållaren med titankoppar till provstationen och placera på anvisat område.
- Använd momentnyckeln, inställd på 40 cNm kraft, för att dra åt alla locken.
5. Körning av prover
- I calView programvara, starta ett nytt experiment( Supplemental Figur 1).
- Dra tillbaka provinsättningsarmen från instrumentet.
- Placera mugghållaren på "bryggan", kolumn 8 vänd mot provinfogningsöppningen och tryck försiktigt in mugghållaren i instrumentet vid anvisad "Position 1". Vänta 10 minuter för att systemet ska stabiliseras. Märk de experimentella brunnarna.
- Skjut provinsättningsarmen tills mugghållaren är vid anvisad "Position 2". Vänta 20 minuter tills systemet stabiliseras.
- Tryck in provinsättningsarmen i "Position 3" och dra tillbaka provinfogningsarmen tills den är vid "Löpläge". Markera alla brunnarna i programvaran och välj Reaktionsstart (Supplemental Figure 4).
- Kör experimentet tills värmeutsläppet avläsningar är stabilt tillbaka på noll.
OBS: Var säker på att alla brunnar beter sig liknande inom dessa steg. Kompletterande figur 5 illustrerar vad som bör observeras om brunnarna laddas korrekt. Om den läses in felaktigt, upprepa steg 5.2-5.4.
6. Ta bort mugghållaren
- I programvaran väljer du Stop (Supplemental Figure 6). Programvaran kommer då att fråga om "du är säker", välj Ja (Supplemental Figur 7) och spara experimentet på en enhet eller ett skrivbord för dataanalys (Supplemental Figure 8).
- Sätt i provinfogningsarmen helt i instrumentet och koppla in magneterna för att hämta upp mugghållaren.
- Lossa locken, ta bort inläggen och placera injektionsflaskor och lock i glashållare och lägg i 4 timmar vid 180 °C följt av att placera injektionsflaskorna och locken i en exsiccator för att säkerställa att lock och injektionsflaskor är torra.
7. Analysera data
- Öppna programvaran (Supplemental Figure 9), välj Öppna experiment i det vänstra övre hörnet (Supplemental Figure 10). I popup-fönstret välj experimentet av intresse och tryck på Öppna ( KompletterandeBild 11). Ansökan kommer att öppna experimentet i standard brunnar visa (Kompletterande Figur 12).
- Tryck på Markera alla eller Ctrl+A ( Kompletterande bild 13).
- Tryck på Definierabaslinje , denna parameter normaliserar data i varje position (Supplemental Figure 14). I popup fönstret välj en tidsperiod på >30 min som ligger i lagfasen (värmeflödet måste vara lågt, mellan noll och tio μW; Kompletterande figur 15). Efter val av baslinje tidsperiod den valda baslinjen kommer att visas i grönt i termogrammet. Stäng fönstret Definiera originalavsnitt för original.
- Tryck på Spara eller Ctrl+S och stäng programvaran ( Kompletterande bild16).
- Öppna webbaserade Symcel Calorimetry analys ansökan (https://symcel.shinyapps.io/symcel_calorimetricgrowth/).
- Om du vill ladda upp filen till analysprogrammet För kalorimetri trycker du på Bläddra (Supplemental Figure 17), väljer du experimentet och trycker på Öppna (Supplemental Figure 18). De metaboliska parametrarna kommer att beräknas automatiskt för de 32 proverna i webbapplikationen (Supplemental Figure 19).
- För att kunna passa in värmeflödesdata till Gompertz och/eller Richards tillväxtmodeller klickar på Tillväxtfunktion. Tillväxtmodeller passar kommer att visas i avsnittet "Kumulativ", även jämfört med rådata i avsnittet "Flow" (Supplemental Figur 20).
- Om du vill hämta alla beräknade parametrar trycker du på Hämta åtgärder. Välj filens plats och tryck på Spara ( Kompletterandebild 21). Filen kommer att exporteras till ett kalkylblad för ytterligare beräkningar.
Representative Results
Ett tillräckligt antal bakterier som producerar värme behövs för att instrumentet ska kunna registrera en värmesignal. Om det finns en fördröjning i tid tills ett värmeflöde är detekterbart det innebär att bakterierna ännu inte producerar en värmesignal över detektionsgränsen. Detektion av frisläppt värme från bakterieprovet är därför direkt relaterad till ökande bakterieaktivitet, inklusive bakterietillväxt. Bakterietillväxt och andra metaboliska aktiviteter är kända för att vara starkt påverkad av tillsats av ett antibakteriellt läkemedel. För att avgöra om en ny naturprodukt under utredning utövar bakteriedödande eller bakteriestatiska effekter eller en kombination av båda MoAs, har vi valt en liten uppsättning referensläkemedel och vi spelade in termogram som vi jämfört data från experiment med den naturliga produkten. Baserat på styrkan av utvalda antibiotika en rad koncentrationer valdes att stänga den minsta hämmande koncentration (MIC) som bestäms av mikrobroth utspädning.
Ciprofloxacin mål bakteriell DNA-gyras och topoisomeras IV och följaktligen uppvisar det en bakteriedödande MoA. Bakteriedödandet som induceras av ciprofloxacin är dock koncentrationsberoende och när det görs i otillräckligt antal koncentrationer kan den också ha en bakteriostatisk effekt21. Tetracyklin och kloramfenikol mål ribosomen vid 30S och 50S subunit, respektive, och de verkar bakteriostatisk på grund av hämning avproteinsyntes 22,23. Rifampicin verkar genom att hämma DNA-beroende RNA-polymeras och det kan ha båda, bakteriedödande och bakteriostatiska effekter, beroende på vilken dos somanvänds 24. Den naturliga produkt som vi undersöker här var isolerade från Myxobakterier och det visade potent aktivitet mot Gram-negativa och Gram-positiva bakteriella patogener. Samtidigt som man undersöker dess MoA och molekylära mål, var vi intresserade av att fastställa om den nya naturliga produkten utövar bakteriedödande och/eller bakteriestatiska effekter och om värmeprofilerna för behandlade Acinetobacter baumannii liknar termogram från bakterier som behandlades med referensläkemedel som nämns ovan.
De termogram som erhålls genom att exponera A. baumannii DSM-30008 för ciprofloxacin i serieutspädning visas i figur 1A. Koncentrationer mellan 0,005 μM och 0,1 μM har en minimal effekt på tillväxt och metabolism av A. baumannii. Behandling av cellerna med 0,5 μM ciprofloxacin leder dock till en betydande förskjutning av eftersläpningfasens varaktighet och lägre maximalt värmeflöde. Dessa två förändringar påverkar tillsammans tiden till topp (Bild 1C), som ökas med cirka 6 timmar. I figur 1Britas den kumulativa utgivna värmen mot tiden. Här ser vi effekten av koncentrationer, vilket återspeglas av en sluttning. Kvantifiering av termogrammets lutning ger oss den maximala ämnesomsättningen av A. baumannii i närvaro av ciprofloxacin som visas i figur 1D, där vi kan observera en samtidig minskning av ämnesomsättningshastigheten hos celler som behandlats med 0,5 μM ciprofloxacin. Förändringar av ämnesomsättningshastigheten hos celler som behandlas med lägre koncentrationer är minimala. Detta experiment skulle kunna förbättras ytterligare genom tillsats av mellanliggande koncentrationer som täcker 0,1-1 μM-området för att observera en mer uttalad gradvis förändring mellan de koncentrationer som inte har någon effekt och en koncentration som resulterar i en betydande fördröjning av lagfasen och metabolisk hastighet. Men, trenderna för förändring stödja en bakteriedödande MoA av ciprofloxacin.
Bild 1A: Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 1B: Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 1C: Klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 1D: Ciprofloxacins effekt på A. baumannii DSM-30008 tillväxt och metabolism. (A) Termogram som visas som värmeflöde (μW) jämfört med tid (h) för vildtyp (WT) A. baumannii DSM-30008, icke-behandlad och exponerad för ciprofloxacin. (B) Kumulativ värme (mJ) jämfört med tiden (h). (C) Dags att topp (h) med felstaplar (standardavvikelse). (D) Ämnesomsättningshastighet (μW) med felstaplar (standardavvikelse). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
När det gäller tetracyklin observerade vi inte signifikanta förändringar i termogrammen för alla koncentrationer som testades förrän sent exponentiell fas med början efter 8 timmar (se figur 2A). Trots detta observeras större förändringar i uppvärmningsfasens värmeutsläpp, där värmeflödets andra topp sänks betydligt för A. baumannii som behandlats med 5 μM och 10 μM-tetracyklin. Lägre koncentrationer hade en verkställa som väl, som emellertid var mindre uttalad. Denna effekt medför också en förlängning i tiden till topp som visas i figur 2C. De kumulativa frisläppta värmekurvorna (figur 2B) visar att icke-behandlade och behandlade celler inte uppvisar signifikanta skillnader i den övergripande kurvformen utan genom tendens, lutningen på kurvorna avtar vid högre koncentrationer av tetracyklin. Detta leder också till kvantifierade ämnesomsättningsfrekvenser som visas i figur 2D, där en koncentrationsberoende effekt, (dvs. minskning av ämnesomsättningen vid ökande antibiotikakoncentrationer) observeras. Dessa fynd stöder det faktum att tetracyklin har en bakteriostatisk effekt.
Bild 2A: Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2B: Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 2C: Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2D: Tetracyklineffekt på A. baumannii DSM-30008 tillväxt och metabolism. (A) Termogram som visas som värmeflöde (μW) jämfört med tid (h) för vildtyp (WT) A. baumannii DSM-30008, icke-behandlade och exponerade för tetracyklin. (B) Kumulativ värme (mJ) jämfört med tiden (h). (C) Dags att topp (h) med felstaplar (standardavvikelse). (D) Ämnesomsättningshastighet (μW) med felstaplar (standardavvikelse). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Ännu mer uttalade effekter kan observeras vid behandling av A. baumannii med proteinsynteshämmaren kloramfenikol som riktar sig mot subenheten 50S-ribosomal. Exponering för ökande koncentrationer av kloramfenikol leder till förlängning av lagfasen och betydande förändringar av den metaboliska aktiviteten i den stationära fasen (figur 3A och figur 3B). Ingen förändring i ämnesomsättningen observeras för den lägsta testade koncentrationen och den högsta testkoncentration som valts (50 μM) förhindrar att större delen av energisläppet av provet. Om man tittar på de mellanliggande testkoncentrationerna (5 μM och 10 μM) ökas tiden till topp betydligt med cirka 8-9 timmar (figur 3C). Samtidigt minskas ämnesomsättningen hos behandlade celler signifikant, med 50 μM som dödligt (Figur 3D). Sammantaget överensstämmer de förändringar som observerats vid koncentrationer upp till 10 μM kloramfenikol med en bakteriostatisk effekt av denna antibiotikaklass.
Bild 3A: Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3B: Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3C: Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3D: Effekten av kloramfenikol på A. baumannii DSM-30008 tillväxt och metabolism. (A) Termogram som visas som värmeflöde (μW) jämfört med tid (h) för vildtyp (WT) A. baumannii DSM-30008, icke-behandlad och exponerad för kloramfenikol. (B) Kumulativ värme (mJ) jämfört med tiden (h). (C) Dags att topp (h) med felstaplar (standardavvikelse). (D) Ämnesomsättningshastighet (μW) med felstaplar (standardavvikelse). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Rifampicinbehandling i det valda koncentrationsområdet har en dramatisk effekt på termogrammen av A. baumannii DSM-30008 som hänför sig till fördröjningsfasens varaktighet och effekter på tillväxten fram till den sena stationära fasen (figur 4A). En betydande minskning av värmeutsläpp kan ses i figur 4B som går längs med en minskning av metabolisk aktivitet. Figur 4C och figur 4D illustrerar påverkan av förlängningen av lagfasen och förändringar av den metaboliska aktiviteten i den stationära fasen. Bild 4C visar en bestämd ökning i tiden till topp för alla koncentrationer som används. Figur 4D illustrerar minskningen av den metaboliska hastigheten som orsakas av minskningen av lutningen för alla koncentrationer som vanligtvis tillskrivs en bakteriedödande effekt. På grund av antibiotika-inducerad avlivning av bakterieceller, den metaboliska aktiviteten förväntas vara lägre på grund av ett mindre antal aktiva bakterier närvarande. De uppgifter som samlas in är överens med det faktum att rifampicin kan agera bakteriedödande och bakteriostatiskt, och de uppgifter som presenteras här stöder främst bakteriedödande effekter av de valda koncentrationerna.
Bild 4A: Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 4B: Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 4C: Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4D: Effekten av rifampicin på A. baumannii DSM-30008 tillväxt och metabolism. (A) Termogram som visas som värmeflöde (μW) jämfört med tid (h) för vildtyp (WT) A. baumannii DSM-30008, icke-behandlad och utsatt för rifampicin. (B) Kumulativ värme (mJ) jämfört med tiden (h). (C) Dags att topp (h) med felstaplar (standardavvikelse). (D) Ämnesomsättningshastighet (μW) med felstaplar (standardavvikelse). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Den lägsta valda testkoncentrationen av den naturliga produkten antibiotikum (0,25 μM) har inga eller endast marginella effekter på termogrammet av A. baumannii DSM-30008. Andra testade koncentrationer uppvisar dock viss effekt på fördröjningsfasens varaktighet, och påverkar tillväxten fram till den sena stationära fasen (figur 5A). Den mest uppenbara effekten är den betydande minskningen av värmeutsläpp i den stationära fasen. Data som visas i figur 5B visar tydligt att frisläppt energi minskar betydligt för alla effektiva koncentrationer och lutningen också minskar. Dessa effekter översätts till en minskning av tiden till topp (Figur 5C) och ännu viktigare, en signifikant och klart dosberoende minskning av ämnesomsättningen observeras (Figur 5D). Undersökningen av den nya myxobacterial naturprodukten visade en kombinerad bakteriostatisk och bakteriedödande effekt.
Bild 5A: Klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 5B: Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 5C: Klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 5D: Effekt av en ny antibakteriell naturprodukt på A. baumannii DSM-30008 tillväxt och metabolism. (A) Termogram som visas som värmeflöde (μW) jämfört med tid (h) för vildtyp (WT) A. baumannii DSM-30008, icke-behandlad och exponerad för den naturliga produkten. (B) Kumulativ värme (mJ) jämfört med tiden (h). (C) Dags att topp (h) med felstaplar (standardavvikelse). (D) Ämnesomsättningshastighet (μW) med felstaplar (standardavvikelse). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Kompletterande figur 1: Välja ett nytt experiment i programvarugränssnittet. I en röd fyrkant steget för att välja ett nytt experiment avbildas. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 2: Namnge ett nytt experiment i programvarugränssnittet. I en röd fyrkant steget för att namnge och bekräfta det nya experimentet avbildas. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 3: Att starta ett nytt experiment i programvarugränssnittet. I en röd fyrkant steget för att starta ett nytt experiment avbildas. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Supplemental Figur 4: Väl val och reaktion start i programvara gränssnitt. Alla reaktionsväldarna är valda (brunnar färgade i djupblå färg, knapp Välj alla avbildade i en röd fyrkant) och reaktionsstart är vald (avbildad i en röd fyrkant). Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 5: Korrekt lastning av mugghållare. Referens brunnar är markerade (djup blå färg, röd fyrkant) och termogram visas i en popup fönster. När lastningen utförs korrekt observerar vi en brant nedgång i värmeutsläppssignalen som detekteras och som måste nå en platåfas och kvarstå i denna fas i ungefär 2-3 min, efteråt återgår signalen till startpunkten. När detta observeras lastningen av mugghållaren är korrekt. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 6: Slutet av försöket. I rött avbildas knappen Stopp i experimentet. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 7: Bekräftelse av slutet av försöket. I rött avbildas ja-knappen för att bekräfta slutet av det löpande experimentet. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 8: Spara experimentfilen. Ett popup-fönster med alternativ för sparfilen visas och i rött visas knappen Spara. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 9: Programvarugränssnitt. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 10: Åtkomst till sparade experiment. I rött avbildas knappen Öppna experiment för att komma åt sparade experiment. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 11: Öppnande av vald experimentfil. I rött avbildas knappen Open. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 12: Standard brunnar visa. Alla experimentella brunn och motsvarande termogram syns. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 13: Val av brunnar för analys. I rött visas knappen Markera alla. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 14: Definition av utgångsvärdet. I rött avbildas knappen Definiera baslinjen. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 15: Välja baslinjesignal. Minimum av 30 min signal i lagfasen är vald (röd ruta). Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 16: Spara ändringar i den experimentella filen. I rött visas knappen Spara. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 17: Webbaserad Calorimetry analys ansökan. Online-programvarugränssnittet och filuppladdningsvägen visas. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Supplemental Figur 18: Uppladdning av vald experimentell fil. I rött avbildas knappen Open. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 19: Analys av termogrammen. Metaboliska parametrar som beräknas för varje experimentell brunn avbildas i rött. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Supplemental Figur 20: Montering av försöksdata till teoretiska tillväxtmodeller. Värmeflödesdata är monterade antingen på en Gompertz eller en Richards tillväxtmodell. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 21: Exportera mätningarna. I rött visas knapparna Hämta åtgärder och Spara. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Discussion
Isotermiska mikrokalorimetry mäter energi som släpps ut från ett exemplar över tiden och denna energi release är ett resultat av alla biologiska, fysiska och (bio-)kemiska processer. Det uppmätta värmeflödet kan utnyttjas för att utvärdera eller bestämma antibakteriella effekter av ämnen eftersom det möjliggör kontinuerlig realtidsövervakning av metabolisk aktivitet.
För att erhålla tillförlitliga uppgifter för analys behöver korrekta startkolonibildande enheter (CFU) fastställas individuellt för varje art eller stam som används. I fall CFU räkna är för låg, Detta leder till en långvarig lagfas som det tar längre tid för systemet att nå en kritisk mängd biomassa producerar tillräckligt med värme för att upptäckas. I fall CFU räkna är för hög lagfasen kommer att vara mycket kort, och mängden värme som produceras kan orsaka värmeöverföring till angränsande sensorceller (referens och experimentella brunnar) och orsaka snedvridningar av termogram. Höga antal CFU kommer också att leda till en snabbare syreutarmning och byta till anaeroba förhållanden. Man måste också ta hänsyn till att under de första 30 minuterna av försöket, när systemet är jämvikt, är insamling av uppgifter inte möjlig och den faktiska registreringen av effekter försenas. Dessutom leder felaktig CFU-bestämning till falsk MIC-bestämning, vilket i slutändan påverkar försöket och de förändringar som observerats25. En annan kritisk punkt är den korrekta bestämningen av baslinjen. Vanligtvis väljs baslinjesignalen under lagfasen när värmeflödessignalen är noll och helst är tidsintervallet för baslinjedefinitionen >30 min. Detta är dock inte alltid möjligt eftersom den tid som bakterierna kräver för att nå värmesignaldetektionsgränsen skiljer sig mellan stammar och arter. Vissa arter eller stammar kräver mer än 30 minuter för att nå värmesignaldetektionsgränsen medan andra stammar eller arter når den inom de första 30 minuterna. I så fall är det möjligt att välja baslinjesignalen i slutet av experimentet när alla värmesignaler har sjunkit tillbaka till noll och förblir stabil. Alternativt kan baslinjer från andra experiment med samma bakteriestam användas, vilket dock inte rekommenderas.
Systemet möjliggör viss flexibilitet vad gäller konstruktion och optimering av experiment och felsökning. Volymer som används ligger i intervallet 100-300 μL vid användning av plastinlägg och 100-600 μL vid användning av titankoppar utan plastinläggen. Tillverkarens rekommenderade arbetsvolym är 120 μL. Användningen av olika volymer vid inrättandet av en ny experimentell serie, och samtidigt som man hittar optimala förhållanden för mätningar, har en inverkan främst på två parametrar. Genom att använda lägre volymer kan mängden erforderligt test sammansatt minskas, vilket är särskilt viktigt för föreningar, som endast finns i små mängder. Dessutom påverkar den använda volymen direkt syretillgängligheten under mätningen med lägre volymer som ökar mängden tillgängligt syre som krävs för bakterietillväxt. Syreutarmning är en av de viktigaste faktorerna som bidrar till den maximala möjliga varaktigheten av experimentet. Viktigt är det möjligt att använda fasta medier, inte bara flytande media. Detta är särskilt viktigt för långsamt växande mikroorganismer som tillväxt på gränssnittet mellan fasta och gas fas möjliggör bättre syre tillgång9.
IMC är ett användbart analytiskt verktyg för att upptäcka okända processer med tillämpningar inom fysik, kemi och biologi. Metoden mäter värmeväxlingen inom ett slutet system och analys av det registrerade värmeutbytet ger ytterligare information som inte alltid kan erhållas med standardmetoder. Inom mikrobiologi och antibiotika forskning, en av de största fördelarna med IMC är dess förmåga att skilja mellan levande, döda och persister eller vilande celler, vilket inte är möjligt med hjälp av standard grumlighet metoder11. Dessutom är IMC mycket känslig och det kan upptäcka värmeutsläpp från så få som 104-105 celler9. En annan fördel är att den experimentella setup är snabb och enkel, och det möjliggör kontinuerlig, realtid spårning med minimal till ingen användarstörning. Vidare är IMC icke-förstörande, vilket möjliggör ytterligare analys av prover. Dataanalys möjliggör frikoppling av biomassabildning tills sen exponentiell eller tidig stationär fas och metabolisk aktivitet i stationär fas.
Förutom romanen och spännande programfunktioner som nämns ovan, finns det också nackdelar med denna metod. Den stora begränsningen är att IMC-instrument mäter den totala värme som produceras och frigörs inom ett specifikt system, som även omfattar icke-specifika signaler. Detta belyser vikten av experimentell planering med lämpliga kontroller för att kunna bedöma de värmesignalförändringar som mäts genom registrering avvärmeflöde 9,20.
I våra händer är IMC ett viktigt verktyg för att studera antibakteriella effekter av nya naturliga produkter och för att bestämma effektiva koncentrationsintervall. Bortsett från att skilja bakteriostatiska och bakteriedödande effekter, det skulle kunna användas i framtiden som en del av mål identifiering studier och MoA bestämning. Detta kan göras genom att jämföra termogram av olika antibiotiska klasser till termogram av nya aktiva föreningar som visas här. Det måste dock fortfarande undersökas om vissa kvantifierbara parametrar som kan extraheras från de uppmätta uppgifterna är tillräckliga för sådana jämförelser eller om det kommer att bli nödvändigt att arbeta med algoritmer som ger fingeravtryck baserade på fullständiga termogram. En annan möjlig tillämpning inom antibiotikaforskning är jämförelsen av vildtyp mot resistenta kloner, tillsammans med hela genomsekvensering, vilket kan bidra till att belysa mode-of-resistance (MoR) av nya antibakteriella medel. På grund av metodens statiska karaktär skulle utredning av effekten av nya agenser på antingen biofilmsbildning eller på redan etablerade biofilmer kunna leda till bättre förståelse av den biologiska processen och effekten av utvalda agenser på mikrober i olika stadier av dvala. IMC registrerar total energi som frigörs i form av värme vilket gör det till en lämplig metod för att undersöka även subhämmande effekter av aktiva substanser som kan kopplas till transkriptomik. Denna metod kan också användas i kliniska inställningar för att upptäcka kontaminering av prover eller för bestämning av antibiogram som hjälper till att snabbt besluta om bestämd behandling av patienterna11.
Disclosures
Projektet utfördes i samarbete med Symcel, utvecklare av calScreener-tekniken. Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka teamet av Symcel för givande diskussioner och vi vill erkänna det stora stödet från Ganna Oliynyk och Wilhelm Paulander. Vi vill också tacka Daniel Kohnhäuser för att ha tillhandahållit den naturliga produkten och Stefanie Schmidt för skicklig teknisk support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acinetobacter baumannii | DSMZ | DSM-30008 | reference strain used in this study |
| calPlate | Symcel | 1220093 | 48-well plate for titanium cups to be inserted |
| calScreener | Symcel | 1200001 | isothermal microcalorimetry instrument |
| calView software | Symcel | collection and analysis software | |
| calWell | Symcel | 1901004 | micro-bio grade (non-active) 48-well plate with plastic inserts which are inserted into the titanium cups |
| CASO agar | Carl Roth | X937.1 | isolation and cultivation of microorganisms |
| Chloroamphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | antibiotic |
| Ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | antibiotic |
| Cuvettes | Brand | 759015 | 1.5 mL cuvettes |
| Disposable inoculation loops | Sarsted | 86.1562.050 | 10 µL inoculation loops |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Thermo Fisher Scientific | 85190 | |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL eppendorf safe-lock tubes |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | 10428671 | |
| Falcon Tubes | Sarsted | 62.554.502 | 15 mL falcon tubes |
| Hydrochloride (HCL) | Thermo Fisher Scientific | 10316380 | |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific | A412-500 | |
| Mueller Hinton Broth | Sigma-Aldrich | 70192 | liquid medium for antibiotic susceptibility studies |
| Mueller Hinton Broth II cation adjusted media | Sigma-Aldrich | 90922 | Mueller Hinton Broth cation-adjusted to 1.25 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2 |
| Petri dishes | LABSOLUTE | 7696404 | |
| Pipette 100 - 1000 µL | Brand | 705880 | |
| Pipette 2 - 20 µL | Brand | 705872 | |
| Pipette 20 - 200 µL | Brand | 705878 | |
| Pipette tips 100 - 1000 L | Brand | 732032 | |
| Pipette tips 2 - 200 µL | Brand | 732028 | |
| Polymyxin B sulfate | Sigma-Aldrich | P0972 | antibiotic |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
| Serological pipette | Thermo Fisher Scientific | 170356N | 10 mL Nunc serological pipette |
| Spectrophotometer | Eppendorf AG | 6135 000.017 | |
| Sterile filters | Minisart | 16534----------K | 0.2 µm pore size sterile filters |
| Syringe 50 mL | NORM-JECT | 22778 | |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | 87128 | antibiotic |
| Titanium cups | Symcel | 1220089 | inserted in 48-well titanium calPlate |
| Titanium lids | Symcel | 1220091 | screwed and tightend to the titanium cups |
| Trimethroprim | Sigma-Aldrich | T7883 | antibiotic |
| Tweezers | Symcel | 1900602 |
References
- World Health Organization (WHO). Antibiotic resistance. World Health Organization (WHO). , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antibiotic-resistance (2018).
- Herrmann, J., Abou Fayad, A., Müller, R. Natural products from myxobacteria: novel metabolites and bioactivities. Natural Product Reports. 34 (2), 135-160 (2017).
- Cassar, S., et al. Use of Zebrafish in Drug Discovery Toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).
- Bhusnure, O. G., et al. Drug Target Screening and its Validation by Zebrafish as a Novel Tool. Pharmaceutica Analytica Acta. 6 (10), 426 (2015).
- Kraus, J., Tobin, G., Development, Discovery, Deveopment, and Regulation of Natural Products. Using Old Solutions to New Problems - Natural Drug Discovery in the 21st Century. Kulka, M. , InTech. Rijeka, HR. 4-36 (2013).
- Tabassum, N., Tai, H., Jung, D., Williams, D. R. Fishing for Nature's Hits: Establishment of the Zebrafish as a Model for Screening Antidiabetic Natural Products. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015 (1), 287847 (2015).
- Antimicrobial Development. Symcel. , Available from: https://symcel.com/applications/microbiology/antimicrobials-development (2019).
- Robador, A., LaRowe, D. E., Finkel, S. E., Amend, J. P., Nealson, K. H. Changes in Microbial Energy Metabolism Measured by Nanocalorimetry during Growth Phase Transitions. Frontiers in Microbiology. 2018 (9), 109 (2018).
- Braissant, O., Wirz, D., Göpfert, B., Daniels, A. U. Use of isothermal microcalorimetry to monitor microbial activities. FEMS Microbiology Letter. 303 (1), 1-8 (2010).
- Braissant, O., et al. Isothermal microcalorimetry accurately detects bacteria, tumorous microtissues, and parasitic worms in a label-free well-plate assay. Biotechnology Journal. 10 (3), 460-468 (2015).
- Butini, M. E., Abbandonato, G., Di Rienzo, C., Trampuz, J., Di Luca, M. Isothermal microcalorimetry detects the presence of persister cells in a Staphylococcus aureus biofilm after vancomycin treatment. Frontiers in Microbiology. 25 (10), 332 (2019).
- Tellapragda, C., et al. Isothermal microcalorimetry minimal inhibitory concentration testing in extensively drug resistant Gram-negative bacilli - A multicenter study. Clinical Microbiology and Infection. , (2020).
- Abdillahi, S., et al. Collagen VI Contains Multiple Host Defense Peptides with Potent In Vivo Activity. The Journal of Immunology. 201 (3), 1007-1020 (2018).
- Astasov-Frauenhoffer, M., et al. Exopolysaccharides regulate calcium flow in cariogenic biofilms. PLoS ONE. 12 (10), 1-14 (2017).
- Gros, S., et al. Personalized Treatment Response Assessment for Rare Childhood Tumors Using Microcalorimetry-Exemplified by Use of Carbonic Anhydrase IX and Aquaporin 1 Inhibitors. International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 4984 (2019).
- Kriszt, R., et al. Optical visualisation of thermogenesis in stimulated single-cell brown adipocytes. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Wadsö, I., et al. A well-plate format isothermal multi-channel microcalorimeter for monitoring the activity of living cells and tissues. Thermochimica Acta. 652 (1), 141-149 (2017).
- von Ah, U., Wirz, D., Daniels, A. U. Isothermal micro calorimetry - a new method for MIC determinations: results for 12 antibiotics and reference strains of E. coli and S. aureus. BMC Microbiology. 9 (106), (2009).
- Howell, M., Wirz, D., Daniels, A. U., Braissant, O. Application of a Microcalorimetric Method for Determining Drug Susceptibility in Mycobacterium Species. Journal of Clinical Microbiology. 50 (1), (2012).
- Wadsö, I. Isothermal Microcalorimetry: Current problems and prospects. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 64 (2001), 75-84 (2001).
- LeBel, M. Ciprofloxacin: chemistry, mechanism of action, resistance, antimicrobial spectrum, pharmacokinetics, clinical trials, and adverse reactions. Pharmacotherapy. 8 (1), 3-33 (1988).
- Chopra, I., Roberts, M. Tetracycline antibiotics: mode of action, applications, molecular biology, and epidemiology of bacterial resistance. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 65 (2), 232-260 (2001).
- Allison, J. L., et al. Mode of action of chloramphenicol. VII. Growth and multiplication of Escherichia coli in the presence of chloramphenicol. Journal of Bacteriology. 83 (3), 609-615 (1962).
- Wehrli, W. Rifampin: mechanisms of action and resistance. Reviews of Infectious Diseases. 5, Suppl 3 407-411 (1983).
- Hancock, R. E. W., et al. Agar and broth methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nature Protocols. 3 (2), 163-175 (2008).
