Summary
Oppklaringen av handlingsmåten til et nytt antibiotika er en utfordrende oppgave i narkotikaoppdagelsesprosessen. Målet med metoden som er beskrevet her er anvendelsen av isotermisk mikrocalorimetry ved hjelp av calScreener i antibakteriell profilering for å gi ytterligere innsikt i interaksjoner mellom stoff og mikrobe.
Abstract
På grunn av den globale trusselen om økende antimikrobiell resistens, er det presserende behov for nye antibiotika. Vi undersøker naturlige produkter fra Myxobacteria som en innovativ kilde til slike nye forbindelser. En flaskehals i prosessen er vanligvis belysningen av deres handlingsmodus. Vi har nylig etablert isotermisk mikroberegning som en del av en rutinemessig profileringsrørledning. Denne teknologien gjør det mulig å undersøke effekten av antibiotikaeksponering på den totale bakterielle metabolske responsen, inkludert prosesser som er koblet fra biomassedannelse. Viktigere, bakteriostatiske og bakteriedrepende effekter er lett å skilles uten brukermedvirkning under målingene. Imidlertid er isotermisk mikrocalorimetry en ganske ny tilnærming, og bruk av denne metoden på forskjellige bakterielle arter krever vanligvis forhåndsevaluering av egnede måleforhold. Det er noen referanse termogrammer tilgjengelig for visse bakterier, sterkt tilrettelegge tolkning av resultater. Etter hvert som utvalget av referansedata vokser jevnt og trutt, forventer vi at metodikken vil ha økende innvirkning i fremtiden og forventer at den tillater grundige fingeravtrykksanalyser som muliggjør differensiering av antibiotikaklasser.
Introduction
Målet med denne metoden er å bruke isotermisk mikrokalorimetri (IMC) som en middels gjennomstrømningsanalyse i handlingsmodus (MoA) profilering av nye antibakterielle forbindelser. Denne metoden avslører data om aktiviteten til forbindelser på bakterielle arter og gir informasjon om den bakteriedrepende eller bakteriostatiske naturen til selve forbindelsen.
Fremveksten av fremvoksende antimikrobiell resistens (AMR) er et globalt problem, og det fører til mindre effektive behandlinger av vanlige infeksjoner med kjente antibiotika1. Imidlertid er søket etter nye forbindelser og legemidler som kan erstatte eller fungere i kombinasjon med kjente antibiotika pågående, og dette er bygget på ulike tilnærminger. Naturlige produkter er en sentral aktør i dagens narkotikaoppdagelseskampanjer og spesielt i anti-infeksiøs narkotikaoppdagelse2. Å identifisere nye blystrukturer for antibiotikautvikling er imidlertid en lang og økonomisk krevende prosess3. Dermed er de tidlige trinnene i oppdagelsen ekstremt viktig for å filtrere på de mest lovende stillasene allerede på et tidlig stadium. Innledende trinn i naturlig produkt narkotika funn inkluderer å skaffe en sammensatt struktur, bestemme aktiviteten in vitro sammen med MoA og mål identifikasjon. De fleste vellykkede forbindelser som er kvalifisert for videre utvikling bør vise et gunstig spekter av aktivitet (det vil si bredspektret aktivitet i tilfelle av antibakterielle) og en roman MoA som eksisterende AMR kan overvinnes. Lovende stillas blir deretter vanligvis screenet i sekundære analyser, som inkluderer in vivo biotilgjengelighet, toksisitet, og metabolisme4. Foruten de økonomiske bekymringene står naturlig produktstofffunn overfor ytterligere utfordringer om kostnadene og tekniske vanskeligheter knyttet til sammensatt isolasjon og rensing, noe som igjen kan gjøre det vanskelig å få flere milligram eller gram mengder i de tidlige stadiene avoppdagelsesprosessen 5,,6. Derfor er det av største betydning i naturlig produktforskning å kunne utføre toppmoderne primærscreening med minimale sammensatte mengder for å ta en godt informert beslutning om ytterligere investeringer for å gjøre et nytt naturlig produkt tilgjengelig for preklinisk utvikling. Ved bruk av IMC for antibakteriell profilering reduseres mengden sammensatt som trengs betydelig i forhold til standardmetoder. Teknikken gir også mer detaljert informasjon om samspillet mellom nye legemidler med mikrobiell samfunn7.
IMC er en veletablert metode for måling av total energi som følge av alle biologiske, fysiske og biokjemiske prosesser og reaksjoner i et biologisk system. Bakteriell energiutløsning er proporsjonal med de totale metabolske reaksjonene8. Innenfor et lukket system, for eksempel det brukte mikrokalorimeteret, kan varmenivåene måles i mikrowattområdet for å studere metabolsk kinetikk av bakterier9,,10,,11,,12. Varmen (energien) som frigjøres av bakterier er knyttet til cellulære funksjoner som ligger til grunn for stoffskiftet, og som ikke nødvendigvis er proporsjonal med cellulær biomasse.
I utgangspunktet har anvendeligheten av isotermisk kalorimetri for mikrobiologiske analyser vært begrenset på grunn av lav gjennomstrømning og høye testvolumer. Det brukte mikrokalorimeteret er imidlertid unikt da det kombinerer fordelene med isotermisk kalorimetri med økt gjennomstrømning og lavere sammensatte krav, noe som gjør det til et verdifullt verktøy for narkotikaoppdagelsesapplikasjoner10. Videre gir instrumentet ytterligere fordeler fremfor alternative metoder for måling av bakteriell vekstkinetikk, for eksempel standard turbiditetsmetode, som er basert på måling av optisk tetthet ved 600 nm (OD<600). Måling av OD600 er basert på antagelsen om at økt optisk tetthet er lik mikrobiell vekst, og dermed forsømmer tilstedeværelsen av ikke-levedyktige celler. Denne metoden har også blitt kritisert da den utelukker små kolonivarianter og persisterceller11. I motsetning tillater IMC sanntidsobservasjon av alle typer levedyktige celler. Hvis cellene er sovende, viser de fortsatt metabolsk aktivitet, og de kan dermed oppdages av IMC, mens slike fenomener ikke kan oppdages ved standard turbiditetsmetode11. Andre fordeler med IMC inkluderer en kortere antimikrobiell følsomhetstesttid, måling av legemiddelinteraksjoner i et komplekst fellesskap og standard analysemetoder uten å ødeleggeprøven 7.
IMC-teknologien er implementert i et bredt spekter av studier, alt fra mikrobiologi til termotilblivelsen og kreftbiologi13,,14,,15,,16,,17. De mikrobielle applikasjonene inkluderer bestemmelse av minimum hemmende konsentrasjoner (MIC) av forbindelser mot ulike bakterielle stammer. Flere studier er gjort, og det har blitt konkludert med at MIC-data fra isotermisk kalorimetri for de fleste bakterielle arter kan oppnås raskere og resultatene er like sammenlignet med andre (standard) metoder for MIC bestemmelse12,18,19. Videre anvendelser av IMC inkluderer å observere samspillet mellom narkotika og kombinasjon av narkotikabehandlinger med komplekse bakterielle samfunn som biofilmer11. En studie med fokus på MoA profilering viste at mikrocalorimeter kan oppdage en forskjell i første- og andregenerasjons cefalosporiner, mens forskjellige antibiotika med samme MoA viser en lignende varmestrømningskurve sammenlignet med hverandre18.
Her beskriver vi bruken av IMC for MoA profilering av nye naturlige produkter ved hjelp av det nye isotermiske mikrokalorimetriinstrumentet. Metoden brukes til å bestemme effektive antibiotikakonsentrasjoner og for å beskrive egenskapene til antibiotika når det gjelder bakteriedrepende eller bakteriostatiske mekanismer. Metoden kan implementeres bredt i MoA profilering av forbindelser, og det kan erstatte eller i det minste utfylle standard mikrobiologiske metoder. Fremtidige studier vil omfatte grundige fingeravtrykksanalyser som vil muliggjøre differensiering av antibiotikaklasser basert på målmekanismer.
Protocol
MERK: Instrumenttemperaturen må stilles inn i henhold til bakterien som brukes minst en dag i forveien for å sikre stabiliteten i systemet. Her kjøres Acinetobacter baumannii DSM30008 prøver ved 30 °C.
1. Kulturforberedelse
- Strek ut belastningen som er under etterforskning (her: A. baumannii) på en CASO agar plate og inkuber over natten i en statisk inkubator ved 30 ° C.
- Forbered en kultur over natten ved å vaksinere en enkelt koloni i MHB (Mueller-Hinton buljong) og inkubere på en ristende inkubator ved 180 rpm ved 30 ° C.
2. Prøve forberedelse
- Bruk 1,5 ml rør for å forberede konsentrasjonsområdet til valgt legemiddel eller forbindelse (f.eks. ved å legge til 1,5 μL μL 100x lagerløsninger i DMSO; se trinn 2.3).
- Fortynn nattkulturen i MHB medium.
- Mål den optiske tettheten av overnattingskulturen ved hjelp av et spektrofotometer ved en bølgelengde på 600 nm.
- Fortynn kulturen for å få 5 x 105 kolonidannende enheter (CFU)/ml i friskt MHB-medium. En OD600 av en tilsvarer ca. 5 x 108 CFU/ml (f.eks. Escherichia coli, Staphylococcus aureus, A. baumannii).
MERK: Det er viktig å kalibrere konverteringsfaktoren OD600 til CFU/ml for hver enkelt bakteriestamme under de påførte kulteringsforholdene.
- Tilsett 150 μL av cellene til testrørene som er utarbeidet i trinn 2.1, noe som sikrer riktig endelig konsentrasjon av testet legemiddel eller forbindelse og riktig endelig cellekonsentrasjon.
- Bland forbindelsen med cellene ved å virvle.
MERK: Prøveplaten (se Materialtabell)har seks rader, hver med åtte brønner, totalt 48 brønner; Rad A og Rad F er den termodynamiske referansen. Derfor kan ingen prøver lastes inn i disse brønnene, tilsvarende medier lastes inn i disse brønnene. 32 testprøver kan måles per kjøring, ved hjelp av brønner i rad B-E. Individuell testprøve bør kjøres minst i duplikat (her: alle prøver ble kjørt som triplicates). Vekstkontroller bør inkluderes.
3. Sett inn forberedelse
- Overfør 120 μL fra blandingen tilberedt i trinn 2.4 til plastinnsatsene.
MERK: Bruk omvendt pipettering i trinn 3.1 for å hindre at væske sprøyter på sidene av plastinnsatsene, noe som kan føre til interferens med korrekte signalavlesninger. - Plasser alle hetteglass med titan i holderne (se Materialtabell) med pinsett.
- Overfør innsatser forsiktig inn i titanhettelene i holderplaten.
- Legg titanlokkene løst på alle hetteglass med titan.
4. Sett inn lasting
- Overfør holderen med titankopper til prøvestasjonen og plasser på angitt område.
- Bruk momentnøkkelen, sett til 40 cNm kraft, for å stramme alle lokkene.
5. Kjøring av prøver
- I calView-programvaren starter du et nytt eksperiment (Tilleggsfigur 1).
- Trekk prøveinnsettingsarmen tilbake fra instrumentet.
- Plasser koppholderen på "broen", kolonne 8 vendt mot prøveinnsettingsåpningen og skyv forsiktig koppholderen inn i instrumentet ved den angitte "Posisjon 1". Vent i 10 minutter til systemet stabiliserer seg. Merk de eksperimentelle brønnene.
- Skyv prøveinnsettingsarmen til koppholderen er på den angitte "Posisjon 2". Vent i 20 minutter til systemet stabiliserer seg.
- Skyv prøveinnsettingsarmen inn i "Posisjon 3" og trekk inn prøveinnsettingsarmen til den er i "Løpsposisjon". Fremhev alle brønnene i programvaren, og velg Reaksjonsstart (Tilleggstall 4).
- Kjør eksperimentet til varmeutslippene leses er stabilt tilbake på null.
MERK: Pass på at alle brønner oppfører seg likt innenfor disse trinnene. Supplerende figur 5 illustrerer hva som bør observeres hvis brønnene lastes riktig. Hvis lastet feil, gjentar du trinn 5.2-5.4.
6. Fjern koppholderen
- Velg Stopp ( Tilleggsfigur 6) i programvaren. Programvaren vil da spørre om "du er sikker", velg Ja (Supplerende figur 7) og lagre eksperimentet på en stasjon eller stasjonær pc for dataanalyse (Tilleggs figur 8).
- Sett prøveinnsettingsarmen helt inn i instrumentet og sett magnetene inn for å hente koppholderen.
- Løsne lokkene, fjern innsatsene og legg hetteglassene og lokkene i glassholdere og plasser i 4 timer ved 180 °C etterfulgt av å plassere hetteglassene og lokkene i en desiccator for å sikre at lokk og hetteglass er tørre.
7. Analysere data
- Åpne programvaren (Tilleggsfigur 9), velg Åpent eksperiment i venstre øvre hjørne (Tilleggstall 10). I popup-vinduet velger du eksperimentet av interesse og trykk Åpne (Tilleggsfigur 11). Søknaden vil åpne eksperimentet i standard brønnvisning (Supplerende figur 12).
- Trykk Merk alle eller Ctrl+A (Tilleggsfigur 13).
- Trykk Defineropprinnelig plan , denne parameteren normaliserer dataene i hver posisjon( Tilleggstall 14). I popup-vinduet velger du en tidsperiode på > 30 min plassert i forsinkelsesfasen (varmestrømmen må være lav, mellom null og ti μW; Tilleggstall 15). Etter valg av basislinjetidsperiode vises den valgte grunnlinjen i grønt i termogrammet. Lukk vinduet Definer opprinnelig inndeling.
- Trykk Lagre eller Ctrl+S og lukk programvaren (Tilleggsfigur 16).
- Åpne nettbasert Symcel Calorimetry analyse søknad (https://symcel.shinyapps.io/symcel_calorimetricgrowth/).
- Hvis du vil laste opp filen til calorimetry analyseprogrammet, trykker du Bla gjennom (tilleggsfigur 17), velger eksperimentet og trykker Åpne (tilleggsfigur 18). De metabolske parametrene vil bli beregnet automatisk for de 32 prøvene i webapplikasjonen( Supplerende figur 19).
- For å passe varmeflytdataene til Gompertz og/eller Richards vekstmodeller klikker du Vekstfunksjon. Vekstmodeller som passer vil bli vist i avsnittet "Kumulativ", også sammenlignet med rådata i avsnittet "Flow" (Tilleggstall 20).
- Hvis du vil laste ned alle beregnede parametere, trykker du Last ned tiltak. Velg filplasseringen, og trykk Lagre ( Tilleggstall 21). Filen eksporteres til et regneark for ytterligere beregninger.
Representative Results
Et tilstrekkelig antall bakterier som produserer varme er nødvendig for at instrumentet skal registrere et varmesignal. Hvis det er en forsinkelse i tid til en varmestrøm er påviselig, betyr det at bakteriene ennå ikke produserer et varmesignal over registreringsgrensen. Påvisning av frigjort varme fra bakterieprøven er derfor direkte relatert til økende bakteriell aktivitet, inkludert bakteriell vekst. Bakteriell vekst og andre metabolske aktiviteter er kjent for å være sterkt påvirket av tilsetning av et antibakterielt stoff. For å finne ut om et nytt naturlig produkt under undersøkelse utøver bakteriedrepende eller bakteriostatiske effekter eller en kombinasjon av begge MoAs, har vi valgt et lite sett med referansemedisiner og vi registrerte termogrammer som vi sammenlignet data fra eksperimenter med det naturlige produktet. Basert på styrken av utvalgte antibiotika ble det valgt en rekke konsentrasjoner som var nær den minste hemmende konsentrasjonen (MIC) som bestemmes av mikrobroth fortynning.
Ciprofloxacin retter seg mot bakteriell DNA-gyrase og topoisomerase IV, og viser derfor en bakteriedrepende MoA. Imidlertid er bakteriell drap indusert av ciprofloksacin konsentrasjonsavhengig, og når det er doses ved utilstrekkelige konsentrasjoner, kan det også ha en bakteriostatisk effekt21. Tetracyklin og kloramfenikol retter seg mot ribosomet ved 30S- og 50S-underenheten, og de virker bakteriostatiske på grunn av hemming av proteinsyntese22,,23. Rifampicin virker ved å hemme DNA-avhengige RNA polymerase og det kan ha både, bakteriedrepende og bakteriostatiske effekter, avhengig av dosen som brukes24. Det naturlige produktet som vi undersøker her ble isolert fra Myxobacteria, og det viste potent aktivitet mot Gram-negative og Gram-positive bakterielle patogener. Mens vi undersøkte sitt MoA og molekylære mål, var vi interessert i å avgjøre om det nye naturlige produktet utøver bakteriedrepende og/ eller bakteriostatiske effekter, og om varmeprofilene til behandlet Acinetobacter baumannii ligner termogrammer fra bakterier som ble behandlet med referansemedisinene nevnt ovenfor.
Termogrammene oppnådd ved å utsette A. baumannii DSM-30008 til ciprofloxacin i seriell fortynning vises i figur 1A. Konsentrasjoner mellom 0,005 μM og 0,1 μM har minimal effekt på veksten og metabolismen av A. baumannii. Behandling av cellene med 0,5 μM ciprofloxacin fører imidlertid til et betydelig skifte i etterslepfavarig og lavere maksimal varmestrøm. Disse to endringene sammen påvirker tiden til toppen (figur 1C), som økes med ca. 6 timer. I figur 1B plottesden kumulative frigitte varmen mot tiden. Her ser vi effekten av konsentrasjoner, noe som gjenspeiles av en skråning. Kvantifisering av termogramets helling gir oss maksimal metabolsk hastighet på A. baumannii i nærvær av ciprofloxacin som vist i figur 1D, hvor vi kan observere en samtidig reduksjon av metabolske frekvensen av celler behandlet med 0,5 μM ciprofloksacin. Endringer av metabolske rate av celler behandlet med lavere konsentrasjoner er minimal. Dette eksperimentet kan forbedres ytterligere ved tilsetning av mellomliggende konsentrasjoner som dekker 0,1-1 μM-området for å observere en mer uttalt gradvis endring mellom konsentrasjonene som ikke har noen effekt og en konsentrasjon som resulterer i en betydelig forsinkelse av forsinkelser i forsinkelsesfase og metabolsk hastighet. Men endringstrendene støtter en bakteriedrepende MoA av ciprofloxacin.
Figur 1A: Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 1B: Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 1C: Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 1D: Effekt av ciprofloxacin på A. baumannii DSM-30008 vekst og metabolisme. (A) Termogrammer vist som varmestrøm (μW) vs. tid (h) for vill type (WT) A. baumannii DSM-30008, ikke-behandlet og eksponert for ciprofloksacin. (B) Kumulativ varme (mJ) vs. tid (h). (C) Tid til topp (h) med feilfelt (standardavvik). (D) Metabolsk hastighet (μW) med feilfelt (standardavvik). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Ved tetracyklin observerte vi ikke signifikante endringer i termogrammene for alle konsentrasjoner som ble testet før sen eksponentiell fase starter etter 8 timer (se figur 2A). Likevel observeres store endringer i stasjonære fasevarmeutslipp, hvor den andre toppen av varmestrømmen reduseres betydelig for A. baumannii behandlet med 5 μM og 10 μM tetracyklin. Lavere konsentrasjoner hadde også en effekt, noe som imidlertid var mindre uttalt. Denne effekten fører også til en forlengelse i tide til å toppe som vist i figur 2C. De kumulative oppgitte varmekurvene (figur 2B) viser at ikke-behandlede og behandlede celler ikke viser signifikante forskjeller i den generelle kurveformen, men ved tendens av avtar skråningen av kurvene ved høyere konsentrasjoner av tetracyklin. Dette oversettes også til kvantifiserte metabolske priser som vises i figur 2D, hvor en konsentrasjonsavhengig effekt (det vil si reduksjon av metabolsk hastighet ved økende antibiotikakonsentrasjoner) observeres. Disse funnene støtter det faktum at tetracyklin har en bakteriostatisk effekt.
Figur 2A: Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2B: Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2C: Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2D: Effekt av tetracyklin på A. baumannii DSM-30008 vekst og metabolisme. (A) Termogrammer vist som varmestrøm (μW) vs. tid (h) for vill type (WT) A. baumannii DSM-30008, ikke-behandlet og utsatt for tetracyklin. (B) Kumulativ varme (mJ) vs. tid (h). (C) Tid til topp (h) med feilfelt (standardavvik). (D) Metabolsk hastighet (μW) med feilfelt (standardavvik). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Enda mer uttalt effekter kan observeres ved behandling av A. baumannii med proteinsyntesehemmerkloramfenikol som retter seg mot 50S ribosomal subunit. Eksponering for økende konsentrasjoner av kloramfenikol fører til forlengelse av etterslepfasen og betydelige endringer av metabolsk aktivitet i den stasjonære fasen (figur 3A og figur 3B). Ingen endring i metabolsk hastighet observeres for den laveste testede konsentrasjonen, og den høyeste testkonsentrasjonen valgt (50 μM) forhindrer de fleste energiutgivelser av prøven. Når man ser på de mellomliggende testkonsentrasjonene (5 μM og 10 μM), økes tiden til toppen betydelig med ca. 8-9 timer (figur 3C). Samtidig reduseres metabolske frekvensen av behandlede celler betydelig, med 50 μM dødelig (figur 3D). Samlet sett er endringene observert ved konsentrasjoner opp til 10 μM kloramfenikol konsistent med en bakteriostatisk effekt av denne antibiotikaklassen.
Figur 3A: Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3B: Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3C: Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3D: Effekt av kloramfenikol på A. baumannii DSM-30008 vekst og metabolisme. (A) Termogrammer vist som varmestrøm (μW) vs. tid (h) for vill type (WT) A. baumannii DSM-30008, ikke-behandlet og utsatt for kloramfenikol. (B) Kumulativ varme (mJ) vs. tid (h). (C) Tid til topp (h) med feilfelt (standardavvik). (D) Metabolsk hastighet (μW) med feilfelt (standardavvik). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Rifampicinbehandling i det valgte konsentrasjonsområdet har en dramatisk effekt på termogrammene til A. baumannii DSM-30008 relatert til etterslepfavarigheten og effekter på vekst til sen stasjonær fase (figur 4A). En betydelig reduksjon av varmeutslipp kan sees i figur 4B som går sammen med en reduksjon i metabolsk aktivitet. Figur 4C og figur 4D illustrerer påvirkningen av forlengelsen av forsinkelsesfasen og endringer av metabolsk aktivitet i den stasjonære fasen. Figur 4C viser en klar økning i tid til topp for alle konsentrasjoner som brukes. Figur 4D illustrerer nedgangen i metabolsk hastighet forårsaket av reduksjon i helling for alle konsentrasjoner som vanligvis tilskrives en bakteriedrepende effekt. På grunn av antibiotika-indusert drap på bakterielle celler, er metabolsk aktivitet forventet å være lavere på grunn av et mindre antall aktive bakterier tilstede. Dataene som samles inn er i samsvar med det faktum at rifampicin kan virke bakteriedrepende og bakteriostatisk, og dataene som presenteres her støtter hovedsakelig bakteriedrepende effekter av de valgte konsentrasjonene.
Figur 4A: Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4B: Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4C: Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4D: Effekten av rifampicin på A. baumannii DSM-30008 vekst og metabolisme. (A) Termogrammer vist som varmestrøm (μW) vs. tid (h) for vill type (WT) A. baumannii DSM-30008, ikke-behandlet og utsatt for rifampicin. (B) Kumulativ varme (mJ) vs. tid (h). (C) Tid til topp (h) med feilfelt (standardavvik). (D) Metabolsk hastighet (μW) med feilfelt (standardavvik). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Den laveste valgte testkonsentrasjonen av det naturlige produktantibiotikumet (0,25 μM) har ingen eller bare marginale effekter på termogrammet til A. baumannii DSM-30008. Andre testede konsentrasjoner har imidlertid en viss effekt på etterslepfavarigheten, og påvirker veksten til sen stasjonær fase (figur 5A). Den mest åpenbare effekten er den betydelige reduksjonen av varmeutslipp i den stasjonære fasen. Data som vises i figur 5B viser tydelig at frigjort energi reduseres betydelig for alle effektive konsentrasjoner og hellingen reduseres også. Disse effektene oversettes til en reduksjon av tid til topp (figur 5C) og enda viktigere, en betydelig og klart doseavhengig reduksjon i metabolsk hastighet observeres (figur 5D). Undersøkelsen av det nye myxobakterielle naturlige produktet viste en kombinert bakteriostatisk og bakteriedrepende effekt.
Figur 5A: Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5B: Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5C: Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5D: Effekten av et nytt antibakterielt naturprodukt på A. baumannii DSM-30008 vekst og metabolisme. (A) Termogrammer vist som varmestrøm (μW) vs. tid (h) for vill type (WT) A. baumannii DSM-30008, ikke-behandlet og eksponert for det naturlige produktet. (B) Kumulativ varme (mJ) vs. tid (h). (C) Tid til topp (h) med feilfelt (standardavvik). (D) Metabolsk hastighet (μW) med feilfelt (standardavvik). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur 1: Velge et nytt eksperiment i programvaregrensesnittet. I en rød firkant er trinnet for å velge et nytt eksperiment avbildet. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Tilleggsfigur 2: Navngi et nytt eksperiment i programvaregrensesnittet. I en rød firkant trinnet for å navngi og bekrefte det nye eksperimentet er avbildet. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Tilleggsfigur 3: Starte et nytt eksperiment i programvaregrensesnittet. I en rød firkant er trinnet for å starte et nytt eksperiment avbildet. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Supplerende figur 4: Godt utvalg og reaksjon starter i programvaregrensesnittet. Alle reaksjonsbrønner er valgt (brønner farget i dypblå farge, knapp Velg alt avbildet i en rød firkant) og reaksjonsstart er valgt (avbildet i en rød firkant). Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Tilleggs figur 5: Riktig lasting av koppholderen. Referansebrønner velges (dypblå farge, rød firkant) og termogrammer vises i et popup-vindu. Når lasting utføres riktig, observerer vi en bratt nedgang i varmeutslippssignalet som må nå en platåfase og forbli i denne fasen i ca. 2-3 min, etterpå går signalet tilbake til utgangspunktet. Når dette observeres, er lasting av koppholderen riktig. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Tilleggsfigur 6: Slutten av eksperimentet. I rødt er Stopp-knappen i eksperimentet avbildet. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Tilleggstall 7: Bekreftelse på slutten av eksperimentet. I rødt er Ja-knappen for å bekrefte slutten av det løpende eksperimentet avbildet. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Tilleggsfigur 8: Lagre eksperimentfilen. Et popup-vindu med alternativer for lagringsfil vises, og i rødt vises knappen Lagre. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Tilleggsfigur 9: Programvaregrensesnitt. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Tilleggstall 10: Få tilgang til lagrede eksperimenter. I rødt knappen Åpne eksperiment for å få tilgang til lagrede eksperimenter er avbildet. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Tilleggsfigur 11: Åpning av valgt eksperimentfil. I rødt knappen Åpne er avbildet. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Tilleggstall 12: Standard brønnvisning. Alle eksperimentelle brønner og tilsvarende termogrammer er synlige. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Tilleggstall 13: Velge brønner for analyse. I rødt knappen Velg alt er avbildet. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Tilleggstall 14: Definere baseline. I rødt knappen Definer grunnlinje er avbildet. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Tilleggstall 15: Velge grunnlinjesignalet. Minimum 30 min signal i lagfasen er valgt (rød boks). Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Tilleggsfigur 16: Lagre endringer i den eksperimentelle filen. I rødt knappen Lagre er avbildet. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Tilleggstall 17: Webbasert applikasjon for calorimetryanalyse. Det elektroniske programvaregrensesnittet og filopplastingsveien vises. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Tilleggsfigur 18: Opplasting av valgt eksperimentell fil. I rødt knappen Åpne er avbildet. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Tilleggs figur 19: Analyse av termogrammene. Metabolske parametere beregnet for hver eksperimentelle brønn er avbildet i rødt. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Tilleggstall 20: Montering av eksperimentelle data til teoretiske vekstmodeller. Varmestrømdata er montert enten på en Gompertz eller en Richards vekstmodell. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Tilleggstall 21: Eksportere målingene. I rødt knappene Last ned tiltak og Lagre er avbildet. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.
Discussion
Isotermisk mikrokalorimetri måler energi som slippes ut fra en prøve over tid, og denne energiutgivelsen er et resultat av alle biologiske, fysiske og (bio-)kjemiske prosesser. Den målte varmestrømmen kan utnyttes til å evaluere eller bestemme antibakterielle effekter av stoffer som det muliggjør kontinuerlig sanntidsovervåking av metabolsk aktivitet.
For å få pålitelige data for analyse, må korrekte startkolonidannende enheter (CFU) bestemmes individuelt for hver art eller belastning som brukes. Hvis CFU-tellingen er for lav, fører dette til en lengre forsinkelsesfase, da det tar lengre tid før systemet når en kritisk mengde biomasse som produserer nok varme til å bli oppdaget. Hvis CFU-tellingen er for høy, vil forsinkelsesfasen være svært kort, og mengden varme som produseres kan føre til varmeoverføring til nærliggende sensorceller (referanse og eksperimentelle brønner) og forårsake forvrengninger av termogrammene. Høyt antall CFU vil også føre til en raskere oksygenuttømming og bytte til anaerobe forhold. Det må også tas hensyn til at i løpet av de første 30 minuttene av eksperimentet, når systemet er likevekt, er datainnsamling ikke mulig og selve opptaket av effekter er forsinket. I tillegg fører feil CFU-bestemmelse til falsk MIC-bestemmelse, som til slutt påvirker eksperimentet og endringene observert25. Et annet kritisk punkt er riktig bestemmelse av grunnlinjen. Vanligvis velges grunnlinjesignalet under forsinkelsesfasen når varmestrømssignalet er null, og ideelt sett er tidsintervallet for baselinedefinisjon > 30 min. Dette er imidlertid ikke alltid mulig da tiden bakteriene krever for å nå varmesignaldeteksjonsgrensen varierer mellom stammer og arter. Noen arter eller stammer krever mer enn 30 minutter for å nå varmesignaldeteksjonsgrensen, mens andre stammer eller arter når den i løpet av de første 30 minuttene. I så fall er det mulig å velge grunnlinjesignalet på slutten av eksperimentet når alle varmesignalene har falt tilbake til null og forblir stabile. Alternativt kan baselines fra andre eksperimenter med samme bakterielle belastning brukes, noe som imidlertid ikke anbefales.
Systemet gir en viss fleksibilitet når det gjelder design og optimalisering av eksperimenter og feilsøking. Volumer som brukes er i området 100-300 μL ved bruk av plastinnsatser og 100-600 μL ved bruk av titankopper uten plastinnsatsene. Det anbefalte arbeidsvolumet fra produsenten er 120 μL. Bruken av ulike volumer i å sette opp en ny eksperimentell serie, og samtidig som de finner optimale forhold for målinger, har det hovedsakelig innvirkning på to parametere. Ved hjelp av lavere volumer, mengden av nødvendig test sammensatte kan reduseres, noe som er spesielt viktig for forbindelser, som er tilgjengelig bare i små mengder. I tillegg påvirker det brukte volumet direkte oksygentilgjengeligheten under målingen med lavere volumer som øker mengden tilgjengelig oksygen som kreves for bakteriell vekst. Oksygenuttømming er en av de viktigste faktorene som bidrar til maksimal mulig varighet av eksperimentet. Viktigere er det mulig å bruke faste medier, ikke bare flytende medier. Dette er spesielt viktig for sakte voksende mikroorganismer som vekst på grensesnittet mellom fast og gass fase gir bedre oksygen tilgang9.
IMC er et nyttig analytisk verktøy for å oppdage ukjente prosesser med applikasjoner i fysikk, kjemi og biologi. Metoden måler varmeutvekslingen i et lukket system, og analyse av den registrerte varmeutvekslingen gir ytterligere informasjon som ikke alltid kan oppnås med standardmetoder. I mikrobiologi og antibiotika forskning, en av de største fordelene med IMC er dens evne til å skille mellom levende, døde og persister eller sovende celler, som ikke er mulig ved hjelp av standard turbiditet metoder11. I tillegg er IMC svært følsom, og det kan oppdage varmeutslipp fra så få som 104-105 celler9. En annen fordel er at det eksperimentelle oppsettet er raskt og enkelt, og det gir mulighet for kontinuerlig sanntidssporing med minimal eller ingen brukerforstyrrelser. Videre er IMC ikke-destruktiv, noe som muliggjør videre analyse av prøver. Dataanalyse gjør det mulig å koble fra biomassedannelse til sen eksponentiell eller tidlig stasjonær fase og metabolsk aktivitet i stillefasen.
Foruten romanen og spennende applikasjonsfunksjoner nevnt ovenfor, er det også ulemper med denne metoden. Den store begrensningen er at IMC-instrumenter måler den totale varmen som produseres og frigjøres i et bestemt system, som også inkluderer ikke-spesifikke signaler. Dette understreker viktigheten av eksperimentell planlegging med egnede kontroller for å kunne vurdere varmesignalendringene som måles ved å registrere varmestrøm9,20.
I våre hender er IMC et viktig verktøy for å studere antibakterielle effekter av nye naturlige produkter og for å bestemme effektive konsentrasjonsområder. Bortsett fra differensiering bakteriostatiske og bakteriedrepende effekter, kan den brukes i fremtiden som en del av målidentifikasjonsstudier og MoA-bestemmelse. Dette kan gjøres ved å sammenligne termogrammer av ulike antibiotikaklasser med termogrammer av nye aktive forbindelser som vises her. Det må imidlertid fortsatt undersøkes om visse kvantifiserbare parametere som kan hentes ut fra de målte dataene, er tilstrekkelige for slike sammenligninger, eller om det vil være nødvendig å jobbe med algoritmer som gir fingeravtrykk basert på fulle termogrammer. En annen mulig anvendelse innen antibiotikaforskning er sammenligningen av wildtype til resistente kloner, kombinert med hele genomsekvensering, som kan bidra til å belyse resistensmodus (MoR) av nye antibakterielle. På grunn av metodens statiske natur kan undersøkelse av effekt av nye midler på enten biofilmdannelse eller på allerede etablerte biofilmer føre til bedre forståelse av den biologiske prosessen og effekten av utvalgte midler på mikrober i forskjellige stadier av dvalen. IMC registrerer total energi utgitt i form av varme, noe som gjør det til en passende metode for å undersøke også sub-hemmende effekter av aktive stoffer som kan være koplet til transkripsjonsmikromer. Denne metoden kan også brukes i kliniske omgivelser for å oppdage forurensning av prøver eller for bestemmelse av antibiogrammer som bidrar til å raskt bestemme bestemt behandling av pasientene11.
Disclosures
Prosjektet ble utført i samarbeid med Symcel, utvikler av calScreener-teknologien. Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke symcelteamet for fruktbare diskusjoner, og vi vil gjerne anerkjenne den store støtten fra Ganna Oliynyk og Wilhelm Paulander. Vi vil også takke Daniel Kohnhäuser for å ha gitt det naturlige produktet og Stefanie Schmidt for dyktig teknisk støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acinetobacter baumannii | DSMZ | DSM-30008 | reference strain used in this study |
| calPlate | Symcel | 1220093 | 48-well plate for titanium cups to be inserted |
| calScreener | Symcel | 1200001 | isothermal microcalorimetry instrument |
| calView software | Symcel | collection and analysis software | |
| calWell | Symcel | 1901004 | micro-bio grade (non-active) 48-well plate with plastic inserts which are inserted into the titanium cups |
| CASO agar | Carl Roth | X937.1 | isolation and cultivation of microorganisms |
| Chloroamphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | antibiotic |
| Ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | antibiotic |
| Cuvettes | Brand | 759015 | 1.5 mL cuvettes |
| Disposable inoculation loops | Sarsted | 86.1562.050 | 10 µL inoculation loops |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Thermo Fisher Scientific | 85190 | |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL eppendorf safe-lock tubes |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | 10428671 | |
| Falcon Tubes | Sarsted | 62.554.502 | 15 mL falcon tubes |
| Hydrochloride (HCL) | Thermo Fisher Scientific | 10316380 | |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific | A412-500 | |
| Mueller Hinton Broth | Sigma-Aldrich | 70192 | liquid medium for antibiotic susceptibility studies |
| Mueller Hinton Broth II cation adjusted media | Sigma-Aldrich | 90922 | Mueller Hinton Broth cation-adjusted to 1.25 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2 |
| Petri dishes | LABSOLUTE | 7696404 | |
| Pipette 100 - 1000 µL | Brand | 705880 | |
| Pipette 2 - 20 µL | Brand | 705872 | |
| Pipette 20 - 200 µL | Brand | 705878 | |
| Pipette tips 100 - 1000 L | Brand | 732032 | |
| Pipette tips 2 - 200 µL | Brand | 732028 | |
| Polymyxin B sulfate | Sigma-Aldrich | P0972 | antibiotic |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
| Serological pipette | Thermo Fisher Scientific | 170356N | 10 mL Nunc serological pipette |
| Spectrophotometer | Eppendorf AG | 6135 000.017 | |
| Sterile filters | Minisart | 16534----------K | 0.2 µm pore size sterile filters |
| Syringe 50 mL | NORM-JECT | 22778 | |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | 87128 | antibiotic |
| Titanium cups | Symcel | 1220089 | inserted in 48-well titanium calPlate |
| Titanium lids | Symcel | 1220091 | screwed and tightend to the titanium cups |
| Trimethroprim | Sigma-Aldrich | T7883 | antibiotic |
| Tweezers | Symcel | 1900602 |
References
- World Health Organization (WHO). Antibiotic resistance. World Health Organization (WHO). , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antibiotic-resistance (2018).
- Herrmann, J., Abou Fayad, A., Müller, R. Natural products from myxobacteria: novel metabolites and bioactivities. Natural Product Reports. 34 (2), 135-160 (2017).
- Cassar, S., et al. Use of Zebrafish in Drug Discovery Toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).
- Bhusnure, O. G., et al. Drug Target Screening and its Validation by Zebrafish as a Novel Tool. Pharmaceutica Analytica Acta. 6 (10), 426 (2015).
- Kraus, J., Tobin, G., Development, Discovery, Deveopment, and Regulation of Natural Products. Using Old Solutions to New Problems - Natural Drug Discovery in the 21st Century. Kulka, M. , InTech. Rijeka, HR. 4-36 (2013).
- Tabassum, N., Tai, H., Jung, D., Williams, D. R. Fishing for Nature's Hits: Establishment of the Zebrafish as a Model for Screening Antidiabetic Natural Products. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015 (1), 287847 (2015).
- Antimicrobial Development. Symcel. , Available from: https://symcel.com/applications/microbiology/antimicrobials-development (2019).
- Robador, A., LaRowe, D. E., Finkel, S. E., Amend, J. P., Nealson, K. H. Changes in Microbial Energy Metabolism Measured by Nanocalorimetry during Growth Phase Transitions. Frontiers in Microbiology. 2018 (9), 109 (2018).
- Braissant, O., Wirz, D., Göpfert, B., Daniels, A. U. Use of isothermal microcalorimetry to monitor microbial activities. FEMS Microbiology Letter. 303 (1), 1-8 (2010).
- Braissant, O., et al. Isothermal microcalorimetry accurately detects bacteria, tumorous microtissues, and parasitic worms in a label-free well-plate assay. Biotechnology Journal. 10 (3), 460-468 (2015).
- Butini, M. E., Abbandonato, G., Di Rienzo, C., Trampuz, J., Di Luca, M. Isothermal microcalorimetry detects the presence of persister cells in a Staphylococcus aureus biofilm after vancomycin treatment. Frontiers in Microbiology. 25 (10), 332 (2019).
- Tellapragda, C., et al. Isothermal microcalorimetry minimal inhibitory concentration testing in extensively drug resistant Gram-negative bacilli - A multicenter study. Clinical Microbiology and Infection. , (2020).
- Abdillahi, S., et al. Collagen VI Contains Multiple Host Defense Peptides with Potent In Vivo Activity. The Journal of Immunology. 201 (3), 1007-1020 (2018).
- Astasov-Frauenhoffer, M., et al. Exopolysaccharides regulate calcium flow in cariogenic biofilms. PLoS ONE. 12 (10), 1-14 (2017).
- Gros, S., et al. Personalized Treatment Response Assessment for Rare Childhood Tumors Using Microcalorimetry-Exemplified by Use of Carbonic Anhydrase IX and Aquaporin 1 Inhibitors. International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 4984 (2019).
- Kriszt, R., et al. Optical visualisation of thermogenesis in stimulated single-cell brown adipocytes. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Wadsö, I., et al. A well-plate format isothermal multi-channel microcalorimeter for monitoring the activity of living cells and tissues. Thermochimica Acta. 652 (1), 141-149 (2017).
- von Ah, U., Wirz, D., Daniels, A. U. Isothermal micro calorimetry - a new method for MIC determinations: results for 12 antibiotics and reference strains of E. coli and S. aureus. BMC Microbiology. 9 (106), (2009).
- Howell, M., Wirz, D., Daniels, A. U., Braissant, O. Application of a Microcalorimetric Method for Determining Drug Susceptibility in Mycobacterium Species. Journal of Clinical Microbiology. 50 (1), (2012).
- Wadsö, I. Isothermal Microcalorimetry: Current problems and prospects. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 64 (2001), 75-84 (2001).
- LeBel, M. Ciprofloxacin: chemistry, mechanism of action, resistance, antimicrobial spectrum, pharmacokinetics, clinical trials, and adverse reactions. Pharmacotherapy. 8 (1), 3-33 (1988).
- Chopra, I., Roberts, M. Tetracycline antibiotics: mode of action, applications, molecular biology, and epidemiology of bacterial resistance. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 65 (2), 232-260 (2001).
- Allison, J. L., et al. Mode of action of chloramphenicol. VII. Growth and multiplication of Escherichia coli in the presence of chloramphenicol. Journal of Bacteriology. 83 (3), 609-615 (1962).
- Wehrli, W. Rifampin: mechanisms of action and resistance. Reviews of Infectious Diseases. 5, Suppl 3 407-411 (1983).
- Hancock, R. E. W., et al. Agar and broth methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nature Protocols. 3 (2), 163-175 (2008).
