Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

التنميط الأيضي لتحديد آثار البكتيريا أو Bacteriostatic للمنتجات الطبيعية الجديدة باستخدام القياس الدقيق متساوي الحرارة

doi: 10.3791/61703 Published: October 29, 2020
* These authors contributed equally

Summary

إن توضيح طريقة عمل المضادات الحيوية الجديدة مهمة صعبة في عملية اكتشاف الدواء. الهدف من الطريقة المذكورة هنا هو تطبيق القياسات الحرارية الحرارية باستخدام calScreener في التنميط المضاد للبكتيريا لتوفير نظرة إضافية على تفاعلات ميكروباء المخدرات.

Abstract

ونظراً للتهديد العالمي المتمثل في ارتفاع مقاومة مضادات الميكروبات، هناك حاجة ماسة إلى مضادات حيوية جديدة. نحن نتحرى عن المنتجات الطبيعية من Myxobacteria كمصدر مبتكر لهذه المركبات الجديدة. اختناق واحد في العملية هو عادة توضيح أسلوب العمل الخاصة بهم. لقد أنشأنا مؤخراً قياس حرارية حرارية مجهرية متساوي الاتسام كجزء من خط أنابيب تنميط روتيني. تسمح هذه التقنية بالتحقيق في تأثير التعرض للمضادات الحيوية على الاستجابة الأيضية البكتيرية الكلية، بما في ذلك العمليات التي يتم فصلها عن تكوين الكتلة الحيوية. الأهم من ذلك، آثار بكتيريا ومبيد للجراثيم يمكن تمييزها بسهولة دون أي تدخل المستخدم أثناء القياسات. ومع ذلك، فإن القياس الدقيق متساوي الاتسام هو نهج جديد إلى حد ما، وتطبيق هذه الطريقة على الأنواع البكتيرية المختلفة يتطلب عادة ما قبل التقييم لظروف القياس المناسبة. هناك بعض ثيرمجرامات مرجعية المتاحة من بعض البكتيريا، وتسهيل كبير تفسير النتائج. وبما أن مجموعة البيانات المرجعية تنمو باطراد، فإننا نتوقع أن يكون للمنهجية تأثير متزايد في المستقبل ونتوقع أن تسمح بإجراء تحليلات متعمقة لبصمات الأصابع تمكن من التمييز بين فئات المضادات الحيوية.

Introduction

والهدف من هذه الطريقة هو تطبيق القياسات الحرارية الأرضية الحرارية (IMC) كمقايسة متوسطة في وضع العمل (وزارة الشؤون الداخلية) تحديد ملامح المركبات المضادة للبكتيريا الجديدة. هذه الطريقة تكشف عن البيانات المتعلقة بنشاط المركبات على الأنواع البكتيرية، ويقدم معلومات عن طبيعة البكتيريا أو بكتيريا المركب نفسه.

إن ظهور المقاومة الناشئة المضادة للميكروبات (AMR) مشكلة عالمية وتؤدي إلى علاجات أقل فعالية للعدوى الشائعة بالمضادات الحيوية المعروفة1. ومع ذلك، فإن البحث عن مركبات وأدّاءات جديدة يمكن أن تحل محل أو تعمل بالاقتران مع المضادات الحيوية المعروفة مستمر، وهذا مبني على مقاربات متنوعة. المنتجات الطبيعية هي لاعب رئيسي في حملات اكتشاف المخدرات الحالية وخاصة في اكتشاف المخدرات المضادة للعدوى2. ومع ذلك ، فإن تحديد هياكل الرصاص الجديدة لتطوير المضادات الحيوية هو عملية طويلة ومطلبة ماليا3. وبالتالي، فإن الخطوات المبكرة من الاكتشاف هي في غاية الأهمية من أجل تصفية على السقالات الواعدة بالفعل في مرحلة مبكرة. وتشمل الخطوات الأولية في اكتشاف الأدوية الطبيعية المنتج الحصول على هيكل المركب، وتحديد النشاط في المختبر جنبا إلى جنب مع وزارة الداخلية وتحديد الهدف. وينبغي أن معظم المركبات الناجحة التي تكون مؤهلة لمزيد من التطوير عرض طيف إيجابي من النشاط (أي، نشاط واسع الطيف في حالة مضادات الجراثيم) ورواية وزارة الداخلية التي يمكن من خلالها التغلب على AMR الموجودة من قبل. ثم يتم فرز السقالات الواعدة عادة في المقايسات الثانوية، والتي تشمل في التوافر البيولوجي الجسماني، والسمية، والتمثيل الغذائي4. وإلى جانب المخاوف المالية، المنتج الطبيعي اكتشاف المخدرات يواجه المزيد من التحديات المتعلقة بالتكاليف والصعوبات التقنية المتعلقة العزلة المركبة وتنقيتها، والتي، بدورها، يمكن أن تجعل من الصعب الحصول على كميات متعددة مليغرام أو حتى غرام في المراحل المبكرة من عملية الاكتشاف5،6. لذلك، من الأهمية القصوى في بحوث المنتجات الطبيعية أن تكون قادرة على إجراء أحدث الفحوصات الأولية مع الحد الأدنى من الكميات المركبة من أجل اتخاذ قرار مستنير بشأن المزيد من الاستثمارات لجعل منتج طبيعي جديد في متناول التنمية قبل السريرية. مع استخدام IMC لتحديد مضادة للبكتيريا ، يتم تقليل كمية المركب المطلوبة بشكل كبير بالمقارنة مع الطرق القياسية. كما توفر هذه التقنية معلومات أكثر تعمقاً بشأن تفاعل الأدوية الجديدة مع المجتمع الميكروبي7.

12- إن اللجنة البحرية الدولية هي طريقة راسخة لقياس الطاقة الكلية نتيجة لجميع العمليات البيولوجية والفيزيائية والكيميائية الحيوية والتفاعلات في النظام البيولوجي. البكتيرية الطاقة الإفراج يتناسب مع مجموع ردود الفعل الأيضية8. داخل نظام مغلق، مثل مقياس الحرارية الدقيقة المستخدمة، يمكن قياس مستويات الحرارة في نطاق microwatt لدراسة الحركية الأيضية للبكتيريا9،10،11،12. وترتبط الحرارة (الطاقة) التي يتم الإفراج عنها من قبل البكتيريا إلى الوظائف الخلوية التي تكمن وراء عملية التمثيل الغذائي الخاصة بهم والتي ليست بالضرورة متناسبة مع الكتلة الحيوية الخلوية.

في البداية، كان تطبيق قياس السعرات الحرارية الأيزوحرارية للمقايسات الميكروبيولوجية محدوداً بسبب انخفاض الإنتاجية وأحجام الاختبار العالية. ومع ذلك ، فإن المقياس الدقيق المستخدم فريد من نوعه لأنه يجمع بين مزايا قياس السعرات الحرارية isothermal مع زيادة الإنتاجية ومتطلبات المركبات الأقل ، مما يجعله أداة قيمة لتطبيقات اكتشاف الأدوية10. وعلاوة على ذلك، يوفر الجهاز مزايا إضافية على الطرق البديلة لقياس حركية النمو البكتيرية، مثل طريقة التعكر القياسية، والتي تقوم على قياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD<600). ويستند قياس OD600 على افتراض أن زيادة الكثافة البصرية يساوي النمو الميكروبي، وبالتالي إهمال وجود خلايا غير قابلة للحياة. وقد انتقد هذا الأسلوب أيضا لأنه يستبعد متغيرات مستعمرة صغيرة والخلاياالمستمرة 11. في المقابل، يسمح IMC بالمراقبة في الوقت الحقيقي لأي نوع من الخلايا القابلة للحياة. إذا كانت الخلايا نائمة، فإنها لا تزال تظهر النشاط الأيضي، وبالتالي يمكن الكشف عنها من قبل IMC، في حين أن مثل هذه الظواهر لا يمكن الكشف عنها من قبل طريقة التعكر القياسية11. وتشمل المزايا الأخرى لـ IMC وقت اختبار الحساسية المضادة للميكروبات أقصر ، وقياس تفاعلات المخدرات في مجتمع معقد وطرق التحليل القياسية دون تدمير العينة7.

وقد تم تنفيذ تكنولوجيا IMC في مجموعة واسعة من الدراسات، بدءا من علم الأحياء الدقيقة إلى توليد الحرارة وعلم الأحياء السرطان13،14،15،16،17. وتشمل التطبيقات الميكروبية تحديد الحد الأدنى من التركيزات المثبطة (MIC) من المركبات ضد السلالات البكتيرية المختلفة. وقد أجريت عدة دراسات وقد تم التوصل إلى أن بيانات هيئة التصنيع العسكري من قياس السعرات الحرارية isotherry لغالبية الأنواع البكتيرية يمكن الحصول عليها بشكل أسرع والنتائج مماثلة لأساليب أخرى (قياسية) لتحديد MIC12،18،19. وتشمل تطبيقات أخرى من IMC مراقبة التفاعل بين المخدرات والجمع بين العلاجات الدوائية مع المجتمعات البكتيرية المعقدة مثل الأغشية الحيوية11. وأظهرت دراسة تركز على التنميط وزارة الشؤون المالية أن microcalorimeter يمكن الكشف عن الفرق في الجيل الأول والثاني من السيفالوسبورين، في حين أن المضادات الحيوية المختلفة مع وزارة الداخلية نفس المعرض منحنى تدفق الحرارة مماثلة مقارنة مع بعضها البعض18.

هنا، نحن وصف استخدام IMC لملامح وزارة الشؤون العامة للمنتجات الطبيعية الجديدة باستخدام أداة القياس الدقيق isothermal الجديدة. وتستخدم هذه الطريقة لتحديد تركيزات المضادات الحيوية الفعالة ووصف خصائص المضادات الحيوية من حيث آليات المبيد للجراثيم أو البكتيريا. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على نطاق واسع في تحديد ملامح وزارة الشؤون الداخلية للمركبات وقد تحل محل الطرق الميكروبيولوجية المعيارية أو تكملها على الأقل. وستشمل الدراسات المستقبلية تحليلات متعمقة لبصمات الأصابع من شأنها أن تمكن من التفريق بين فئات المضادات الحيوية على أساس الآليات المستهدفة.

Protocol

ملاحظة: يجب تعيين درجة حرارة الجهاز وفقا للبكتيريا المستخدمة قبل يوم على الأقل لضمان استقرار النظام. هنا، يتم تشغيل عينات Acinetobacter baumannii DSM30008 في 30 درجة مئوية.

1- الإعداد الثقافي

  1. خط خارج سلالة قيد التحقيق (هنا: A. baumannii)على لوحة آجار CASO واحتضان بين عشية وضحاها في حاضنة ثابتة في 30 درجة مئوية.
  2. إعداد ثقافة بين عشية وضحاها عن طريق تلقيح مستعمرة واحدة في MHB (مرق مولر هينتون) واحتضان على حاضنة تهتز في 180 دورة في الدقيقة في 30 درجة مئوية.

2. إعداد العينة

  1. استخدام 1.5 مل أنابيب لإعداد نطاق تركيز المخدرات أو مركب مختارة (على سبيل المثال، عن طريق إضافة 1.5 ميكرولتر من 100x حلول المخزون في DMSO؛ انظر الخطوة 2.3).
  2. تمييع ثقافة بين عشية وضحاها في MHB المتوسطة.
    1. قياس الكثافة البصرية للثقافة بين عشية وضحاها باستخدام مقياس الطيفي في طول موجة من 600 نانومتر.
    2. تمييع الثقافة للحصول على 5 × 105 مستعمرة تشكيل وحدات (CFU) / مل في المتوسط MHB الطازجة. A OD600 واحد يساوي تقريبا 5 × 108 CFU /مل (على سبيل المثال، Escherichia القولونية، المكورات العنقودية aureus، A. baumannii).
      ملاحظة: من المهم معايرة عامل التحويل OD600 إلى CFU/mL لكل سلالة بكتيرية فردية في ظل ظروف الاستزراع المطبقة.
  3. إضافة 150 μL من الخلايا إلى أنابيب الاختبار المعدة في الخطوة 2.1، وضمان التركيز النهائي الصحيح من المخدرات اختبار أو مركب والتركيز الصحيح الخلية النهائية.
  4. اخلط المركب مع الخلايا عن طريق الدوامة.
    ملاحظة: لوحة العينة (انظر جدول المواد)لديها ستة صفوف، يحتوي كل منها على ثمانية آبار، ما مجموعه 48 بئراً؛ الصف A و F هما المرجع الديناميكي الحراري. لذلك، لا يمكن تحميل أي عينات في تلك الآبار، يتم تحميل وسائل الإعلام المقابلة في تلك الآبار. ويمكن قياس 32 عينة اختبار لكل شوط، باستخدام الآبار في الصفوف B-E. يجب تشغيل عينة الاختبار الفردية على الأقل في التكرار (هنا: تم تشغيل كافة العينات على شكل ثلاث نسخ). وينبغي إدراج ضوابط للنمو.

3. إدراج إعداد

  1. نقل 120 μL من الخليط المعدة في الخطوة 2.4 إلى إدراج البلاستيك.
    ملاحظة: استخدم الأنابيب العكسية في الخطوة 3.1 لمنع السائل من الرش على جانبي الإدراجات البلاستيكية، مما قد يؤدي إلى تداخل مع قراءات الإشارة الصحيحة.
  2. ضع جميع قوارير التيتانيوم في أصحابها (انظر جدول المواد)مع ملاقط.
  3. نقل بلطف إدراج في قارورة التيتانيوم في لوحة حامل.
  4. ضع أغطية التيتانيوم على جميع قوارير التيتانيوم.

4. إدراج تحميل

  1. نقل حامل مع أكواب التيتانيوم على محطة العينة ومكان على منطقة معينة.
  2. استخدام وجع عزم الدوران، تعيين إلى قوة 40 cNm، لتشد من جميع الأغطية.

5. تشغيل العينات

  1. في برنامج calView ، ابدأ تجربة جديدة(الشكل التكميلي 1).
  2. اسحب ذراع الإدراج العينة من الأداة.
  3. ضع حامل الكأس على "الجسر"، العمود 8 الذي يواجه فتح العينة وإدخال ودفع بلطف حامل الكأس إلى الصك في "الموقف 1" المعين. انتظر 10 دقائق حتى يستقر النظام. تسمية الآبار التجريبية.
  4. دفع نموذج الإدراج الذراع حتى حامل الكأس هو في المعين "موقف 2". انتظر 20 دقيقة حتى يستقر النظام.
  5. دفع ذراع الإدراج عينة في "الموقف 3" والسحب من ذراع الإدراج عينة حتى يكون في "تشغيل الموقف". تسليط الضوء على جميع الآبار في البرنامج وحدد رد الفعل ابدأ (الشكل التكميلي 4).
  6. تشغيل التجربة حتى يقرأ الانبعاثات الحرارية هي بشكل ثابت مرة أخرى في الصفر.
    ملاحظة: تأكد من أن كافة الآبار تتصرف مماثلة ضمن هذه الخطوات. ويوضح الشكل التكميلي 5 ما ينبغي ملاحظته إذا تم تحميل الآبار بشكل صحيح. إذا تم تحميله بشكل غير صحيح، كرر الخطوات 5.2-5.4.

6. إزالة حامل الكأس

  1. في البرنامج، حدد إيقاف (الرقم التكميلي 6). البرنامج ثم يسأل إذا "كنت متأكدا" ، حدد نعم (الرقم التكميلي 7) وحفظ التجربة على محرك الأقراص أو سطح المكتب لتحليل البيانات(تكميلية الشكل 8).
  2. إدراج ذراع الإدراج عينة تماما في الصك وإشراك المغناطيس لاسترداد حامل الكأس.
  3. تخفيف الأغطية، وإزالة إدراج ووضع قوارير والأغطية في حاملي الزجاج ومكان لمدة 4 ساعات في 180 درجة مئوية متبوعا بوضع قوارير وأغطية في مجفف لضمان الأغطية وقوارير جافة.

7. تحليل البيانات

  1. فتح البرنامج (الشكل التكميلي 9)، حدد تجربة مفتوحة في الزاوية العليا اليسرى ( الشكلالتكميلي 10). في النافذة المنبثقة حدد تجربة الفائدة واضغط على فتح (الشكل التكميلي 11). التطبيق سوف تفتح التجربة في عرض الآبار الافتراضية(الشكل التكميلي 12).
  2. اضغط على تحديد الكل أو Ctrl+A (الشكل الإضافي 13).
  3. اضغط على تحديد الأساس، تقوم هذه المعلمة بتطبيع البيانات في كل موضع ( الشكل الإضافي14). في نافذة منبثقة حدد فترة زمنية من > 30 دقيقة تقع في مرحلة التأخر (تدفق الحرارة يجب أن تكون منخفضة، بين صفر وعشرة μW؛ الشكل التكميلي 15). بعد اختيار الفترة الزمنية لخط الأساس سيظهر خط الأساس المختار باللون الأخضر في الرسم الحراري. إغلاق إطار تعريف مقطع الأساس.
  4. اضغط حفظ أو Ctrl + S وإغلاق البرنامج ( الرقم التكميلي16).
  5. فتح على شبكة الإنترنت تطبيق تحليل قياس الحسابات الكالي (https://symcel.shinyapps.io/symcel_calorimetricgrowth/).
  6. لتحميل الملف إلى تطبيق تحليل Calorimetry، اضغط على استعراض (الشكل التكميلي 17)، حدد التجربة واضغط على فتح ( الشكلالتكميلي 18). سيتم حساب المعلمات الأيضية تلقائياً للعينات 32 في تطبيق الويب(الشكل التكميلي 19).
  7. من أجل احتواء البيانات تدفق الحرارة إلى Gompertz و / أو نماذج النمو ريتشارد انقر فوق وظيفة النمو. نماذج النمو تناسب سيتم عرض في قسم "تراكمي"، أيضا بالمقارنة مع البيانات الخام في قسم "تدفق"(الشكل التكميلي 20).
  8. لتنزيل جميع المعلمات المحسوبة، اضغط على "قياسات التنزيل". حدد موقع الملف واضغط على حفظ (الشكل التكميلي 21). سيتم تصدير الملف إلى جدول بيانات لإجراء المزيد من الحسابات.

Representative Results

وهناك حاجة إلى عدد كاف من البكتيريا المنتجة للحرارة للأداة لتسجيل إشارة الحرارة. إذا كان هناك تأخير في الوقت حتى تدفق الحرارة يمكن الكشف عنها فهذا يعني أن البكتيريا لا تنتج بعد إشارة الحرارة فوق حد الكشف. ولذلك فإن الكشف عن الحرارة المنبعثة من العينة البكتيرية يرتبط مباشرة بزيادة النشاط البكتيري، بما في ذلك نمو البكتيريا. ومن المعروف أن نمو البكتيريا وغيرها من الأنشطة الأيضية تتأثر بقوة بإضافة دواء مضاد للبكتيريا. لتحديد ما إذا كان منتج طبيعي جديد قيد التحقيق يمارس آثارًا مبيدة للجراثيم أو جراثيم أو مزيجًا من كلا MoAs ، اخترنا مجموعة صغيرة من الأدوية المرجعية وسجلنا صورًا حرارة قارنا البيانات من التجارب مع المنتج الطبيعي. استناداً إلى قوة المضادات الحيوية المختارة تم اختيار مجموعة من التركيزات التي تكون قريبة من الحد الأدنى للتركيز المثبط (MIC) كما يحددها تخفيف البروكيل.

يستهدف Ciprofloxacin جيراز الحمض النووي البكتيري وتوبواوميراز الرابع وبالتالي ، فإنه يعرض وزارة الشؤون الداخلية للبكتيريا. ومع ذلك، القتل البكتيري الناجم عن ciprofloxacin يعتمد على التركيز وعندما يتم الورطى بتركيزات غير كافية يمكن أن يكون لها تأثير البكتيريا21. التتراسيكلين والكلورافينيكول الهدف الريبوسوم في 30S و 50S الوحدة الفرعية, على التوالي, وأنها تعمل bacteriostatic بسبب تثبيط تخليق البروتين22,23. Rifampicin أعمال عن طريق تثبيط الحمض النووي الريبي البوليميراز والاعتماد على ذلك يمكن أن يكون لها على حد سواء, آثار بكتيريا والجرثومة, اعتمادا على الجرعة المستخدمة24. المنتج الطبيعي الذي نحقق هنا كان معزولاً عن البكتيريا الفطرية وأظهر نشاطاً قوياً ضد مسببات الأمراض البكتيرية السلبية والجرامية. أثناء التحقيق في وزارة الشؤون العامة والهدف الجزيئي ، كنا مهتمين في تحديد ما إذا كان المنتج الطبيعي الجديد يمارس آثار مبيد للجراثيم و / أو bacteriostatic وما إذا كانت الملامح الحرارية من Acinetobacter baumannii المعالجة مشابهة لجرامات الحرارة من البكتيريا التي تم علاجها مع الأدوية المرجعية المذكورة أعلاه.

يتم عرض الرسوم الحرارية التي تم الحصول عليها عن طريق تعريض A. baumannii DSM-30008 إلى ciprofloxacin في التخفيف التسلسلي في الشكل 1A. التركيزات بين 0.005 μM و 0.1 μM لها تأثير ضئيل على نمو والتمثيل الغذائي لـ A. baumannii. ومع ذلك، علاج الخلايا مع 0.5 μM سيبروفلوكساسين يؤدي إلى تحول كبير في مدة المرحلة الانتقالية وانخفاض الحد الأقصى لتدفق الحرارة. هذه التغييرات اثنين معا تؤثر على الوقت إلى الذروة(الشكل 1C)،والتي يتم زيادتها بنحو 6 ساعات. في الشكل 1B، يتم رسم الحرارة التراكمية الصادرة ضد الزمن. هنا، نرى تأثير التركيزات، والذي ينعكس من خلال منحدر الميل. Quantification من المنحدر في thermogram يعطينا معدل الأيض القصوى من A. baumannii في وجود ciprofloxacin كما هو معروض في الشكل 1D، حيث يمكننا أن نلاحظ انخفاض مصاحب لمعدل الأيض من الخلايا المعالجة مع 0.5 μM ciprofloxacin. تغيرات معدل الأيض من الخلايا المعالجة بتركيزات أقل هي الحد الأدنى. ويمكن زيادة تحسين هذه التجربة بإضافة تركيزات وسيطة تغطي نطاق 0.1-1 ميكرومتر لمراقبة تغير تدريجي أكثر وضوحا بين التركيزات التي ليس لها تأثير والتركيز الذي يؤدي إلى تأخير كبير في مرحلة التأخر ومعدل الأيض. ومع ذلك، فإن اتجاهات التغيير تدعم وزارة الشؤون الداخلية للجراثيم من سيبروفلوكساسين.

Figure 1A
الشكل 1A: يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 1B
الشكل 1ب: يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 1C
الشكل 1 ج: يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 1D
الشكل 1D: تأثير سيبروفلوكساسين على A. baumannii DSM-30008 النمو والتمثيل الغذائي. (أ)ثيرموجرامات تظهر كتدفق الحرارة (μW) مقابل الوقت (ح) للنوع البري (WT) A. baumannii DSM-30008، غير المعالجة والمعرضة للسيبروفلوكساسين. (B) الحرارة التراكمية (mJ) مقابل الوقت (ح). (C) الوقت إلى الذروة (ح) مع أشرطة الخطأ (الانحراف المعياري). (D) معدل الأيض (μW) مع أشرطة الخطأ (الانحراف المعياري). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

في حالة التتراسيكلين، لم نلاحظ تغيرات كبيرة في ثيرموجرامات لجميع التركيزات التي تم اختبارها حتى أواخر المرحلة الأسية التي تبدأ بعد 8 ساعات (انظر الشكل 2A). ومع ذلك، لوحظت تغيرات كبيرة في الانبعاثات الحرارية في المرحلة الثابتة، حيث يتم خفض الذروة الثانية لتدفق الحرارة بشكل كبير بالنسبة لـ A. baumannii المعالجة بـ 5 ميكرومتر و10 ميكرومتر تتراسيكلين. تلقّى تركيزات أقلّ تأثير أيضا, أيّ كان مهما أقلّ وضوحا. هذا التأثير أيضا يسبب إطالة في الوقت المناسب إلى الذروة كما هو معروض في الشكل 2C. تظهر منحنيات الحرارة المُطلقة التراكمية(الشكل 2B)أن الخلايا غير المعالجة والمعالجة لا تظهر اختلافات كبيرة في شكل المنحنى العام ولكن حسب الميل، ينخفض ميل المنحنيات عند تركيزات أعلى من التتراسيكلين. وهذا يترجم أيضا إلى معدلات التمثيل الغذائي كمي المعروضة في الشكل 2D، حيث لوحظ تأثير يعتمد على التركيز ، (أي، انخفاض معدل الأيض في زيادة تركيزات المضادات الحيوية). هذه النتائج تدعم حقيقة أن التتراسيكلين له تأثير بكتيريا.

Figure 2A
الشكل 2A: يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2B
الشكل 2B: يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2C
الشكل 2C: يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2D
الشكل 2D: تأثير التتراسيكلين على نمو واستقلاب A. baumannii DSM-30008. (أ)ثيرموجرامات تظهر كتدفق الحرارة (μW) مقابل الوقت (ح) للنوع البري (WT) A. baumannii DSM-30008، غير المعالجة والمعرضة للتتراسيكلين. (B) الحرارة التراكمية (mJ) مقابل الوقت (ح). (C) الوقت إلى الذروة (ح) مع أشرطة الخطأ (الانحراف المعياري). (D) معدل الأيض (μW) مع أشرطة الخطأ (الانحراف المعياري). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ويمكن ملاحظة آثار أكثر وضوحا عند علاج A. baumannii مع مثبطات تخليق البروتين الكلورامفينيكول الذي يستهدف الوحدة الفرعية الريبوسومية 50S. التعرض لتركيزات متزايدة من الكلورافينيكول يؤدي إلى إطالة مرحلة التأخر والتغيرات الكبيرة في النشاط الأيضي في المرحلة الثابتة(الشكل 3A والشكل 3B). لم يلاحظ أي تغير في معدل الأيض لأدنى تركيز تم اختباره، كما أن أعلى تركيز اختبار تم اختياره (50 ميكرومتر) يمنع معظم إطلاق الطاقة للعينة. وبالنظر إلى تركيزات الاختبار الوسيطة (5 ميكرومتر و10 ميكرومتر)، يزداد وقت الذروة زيادة كبيرة بنحو 8-9 ساعات(الشكل 3C). في الوقت نفسه ، ينخفض معدل التمثيل الغذائي للخلايا المعالجة بشكل كبير ، مع 50 ميكرومتر قاتلة(الشكل 3D). عموما، التغيرات التي لوحظت في تركيزات تصل إلى 10 μM الكلورامفينيكول تتفق مع تأثير بكتيريا لهذه الفئة من المضادات الحيوية.

Figure 3A
الشكل 3A: يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3B
الشكل 3B: يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3C
الشكل 3C: يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3D
الشكل 3D: تأثير الكلورامفينيكول على A. baumannii DSM-30008 النمو والتمثيل الغذائي. (أ)ثيرموجرامات تظهر كتدفق الحرارة (μW) مقابل الوقت (ح) للنوع البري (WT) A. baumannii DSM-30008، غير المعالجة والمعرضة للكلورامفينيكول. (B) الحرارة التراكمية (mJ) مقابل الوقت (ح). (C) الوقت إلى الذروة (ح) مع أشرطة الخطأ (الانحراف المعياري). (D) معدل الأيض (μW) مع أشرطة الخطأ (الانحراف المعياري). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

إن علاج ريفامبيسين في نطاق التركيز المختار له تأثير كبير على ثيرموجرامات A. baumannii DSM-30008 المتعلقة بمدة المرحلة المتأخرة والآثار على النمو حتى المرحلة الثابتة المتأخرة (الشكل 4A). ويمكن ملاحظة انخفاض كبير في انبعاثات الحرارة في الشكل 4B الذي يذهب جنبا إلى جنب مع انخفاض في النشاط الأيضي. ويوضح الشكل 4C والشكل 4D تأثير إطالة مرحلة التأخر والتغيرات في النشاط الأيضي في المرحلة الثابتة. ويبين الشكل 4C زيادة محددة في الوقت المحدد إلى ذروته بالنسبة لجميع التركيزات المستخدمة. ويوضح الشكل 4D الانخفاض في معدل الأيض الناتج عن انخفاض الميل لجميع التركيزات التي عادة ما تعزى إلى تأثير مبيد للجراثيم. بسبب قتل الخلايا البكتيرية الناجم عن المضادات الحيوية ، من المتوقع أن يكون النشاط الأيضي أقل بسبب وجود عدد أقل من البكتيريا النشطة. البيانات التي تم جمعها تتفق مع حقيقة أن ريفامبيسين يمكن أن تعمل بكتيريا والجرثومة، والبيانات المقدمة هنا تدعم أساسا آثار مبيد للجراثيم من التركيزات المختارة.

Figure 4A
الشكل 4A: يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4B
الشكل 4B: يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4C
الشكل 4C: يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4D
الشكل 4D: تأثير ريفامبيسين على A. baumannii DSM-30008 النمو والتمثيل الغذائي. (أ)ثيرموغرافية تظهر كتدفق الحرارة (μW) مقابل الوقت (ح) للنوع البري (WT) A. baumannii DSM-30008، غير المعالجة والمعرضة للريفامبيسين. (B) الحرارة التراكمية (mJ) مقابل الوقت (ح). (C) الوقت إلى الذروة (ح) مع أشرطة الخطأ (الانحراف المعياري). (D) معدل الأيض (μW) مع أشرطة الخطأ (الانحراف المعياري). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

إن أقل تركيز اختباري مختار للمضادات الحيوية للمنتج الطبيعي (0.25 ميكرومتر) له تأثيرات هامشية أو فقط على الرسم الحراري لـ A. baumannii DSM-30008. ومع ذلك، تظهر التركيزات الأخرى المختبرة بعض التأثير على مدة المرحلة الانتقالية، وتؤثر على النمو حتى المرحلة الثابتة المتأخرة(الشكل 5A). التأثير الأكثر وضوحا هو الانخفاض الكبير في انبعاثات الحرارة في المرحلة الثابتة. وتبين البيانات المعروضة في الشكل 5B بوضوح أن الطاقة المنبعثة تنخفض بشكل كبير بالنسبة لجميع التركيزات الفعالة وينخفض المنحدر أيضا. هذه الآثار تترجم إلى انخفاض الوقت إلى الذروة(الشكل 5C) والأهم من ذلك، لوحظ انخفاض كبير وبشكل واضح تعتمد على الجرعة في معدل الأيض(الشكل 5D). وكشف التحقيق في المنتج الطبيعي الميكسوباتكتيري الجديد تأثير مشترك للجراثيم والجراثيم.

Figure 5A
الشكل 5A: يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5B
الشكل 5B: يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5C
الشكل 5C: يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5D
الشكل 5D: تأثير منتج طبيعي مضاد للبكتيريا جديد على نمو واستقلاب A. baumannii DSM-30008. (أ)ثيرمجرامات تظهر كتدفق الحرارة (μW) مقابل الوقت (ح) للنوع البري (WT) A. baumannii DSM-30008، غير المعالجة والمعرضة للمنتج الطبيعي. (B) الحرارة التراكمية (mJ) مقابل الوقت (ح). (C) الوقت إلى الذروة (ح) مع أشرطة الخطأ (الانحراف المعياري). (D) معدل الأيض (μW) مع أشرطة الخطأ (الانحراف المعياري). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: اختيار تجربة جديدة في واجهة البرنامج. في مربع أحمر يتم تصوير الخطوة لتحديد تجربة جديدة. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 2: تسمية تجربة جديدة في واجهة البرنامج. في مربع أحمر يتم تصوير الخطوة إلى اسم وتأكيد التجربة الجديدة. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 3: بدء تجربة جديدة في واجهة البرنامج. في مربع أحمر يتم تصوير الخطوة لبدء تجربة جديدة. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 4: اختيار جيدا ورد الفعل تبدأ في واجهة البرنامج. يتم اختيار جميع آبار التفاعل (الآبار الملونة باللون الأزرق العميق ، الزر حدد جميعها في مربع أحمر) ويتم تحديد بدء التفاعل (يصور في مربع أحمر). الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الرقم التكميلي 5: التحميل الصحيح لحامل الكأس. يتم اختيار الآبار المرجعية (اللون الأزرق العميق، المربع الأحمر) ويتم عرض الرسوم الحرارية في نافذة منبثقة. عندما يتم تنفيذ التحميل بشكل صحيح، نلاحظ انخفاضا حادا في إشارة الانبعاثات الحرارية الكشف عن التي يجب أن تصل إلى مرحلة الهضبة وتبقى في هذه المرحلة لمدة 2-3 دقيقة تقريبا، بعد ذلك يعود إشارة إلى نقطة البداية. عندما لوحظ هذا التحميل من حامل الكأس هو الصحيح. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 6: نهاية التجربة. باللون الأحمر، يتم تصوير الزر إيقاف في التجربة. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 7: تأكيد نهاية التجربة. باللون الأحمر، يتم تصوير الزر نعم لتأكيد نهاية التجربة قيد التشغيل. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 8: حفظ ملف التجربة. يتم عرض نافذة منبثقة مع حفظ خيارات الملف و باللون الأحمر يتم تصوير الزر حفظ. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 9: واجهة البرامج. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل الإضافي 10: الوصول إلى التجارب المحفوظة. باللون الأحمر، يتم تصوير الزر "فتح التجربة" للوصول إلى التجارب المحفوظة. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 11: فتح ملف تجربة مختارة. باللون الأحمر يتم تصوير الزر فتح. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل الإضافي 12: عرض الآبار الافتراضي. جميع آبار تجريبية وحرارية مقابلة مرئية. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 13: اختيار الآبار للتحليل. باللون الأحمر، يُصوَّر الزر تحديد الكل. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 14: تعريف خط الأساس. باللون الأحمر، يتم تصوير الزر "تعريف الخط الأساسي". الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 15: اختيار إشارة الأساس. الحد الأدنى من 30 دقيقة من إشارة في مرحلة التأخر يتم تحديد (المربع الأحمر). الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 16: حفظ التغييرات على الملف التجريبي. باللون الأحمر يتم تصوير الزر حفظ. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 17: تطبيق تحليل قياس الحسابات الكاليوري القائم على الويب. يتم عرض واجهة البرنامج عبر الإنترنت ومسار تحميل الملف. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 18: تحميل ملف تجريبي مختار. باللون الأحمر يتم تصوير الزر فتح. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 19: تحليل الرسوم الحرارية. يتم تصوير معلمات التمثيل الغذائي المحسوبة لكل بئر تجريبي باللون الأحمر. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 20: تركيب البيانات التجريبية مع نماذج النمو النظرية. يتم تركيب بيانات تدفق الحرارة إما إلى Gompertz أو نموذج نمو ريتشارد. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 21: تصدير القياسات. باللون الأحمر يتم تصوير أزرار تدابير التحميل وحفظ. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

Discussion

يقيس القياس الدقيق للمقاييس الحرارية الطاقة المنبعثة من عينة على مر الزمن، وهذا الإطلاق للطاقة هو نتيجة لجميع العمليات الكيميائية البيولوجية والفيزيائية و(البيولوجية). يمكن استغلال تدفق الحرارة المقاس لتقييم أو تحديد الآثار المضادة للبكتيريا للمواد لأنها تمكن من الرصد المستمر في الوقت الحقيقي للنشاط الأيضي.

من أجل الحصول على بيانات موثوقة للتحليل، يجب تحديد وحدات تشكيل المستعمرة الصحيحة (CFU) بشكل فردي لكل نوع أو سلالة مستخدمة. في حالة أن عدد CFU منخفض جداً، وهذا يؤدي إلى مرحلة تأخر طويلة حيث يستغرق النظام وقتاً أطول للوصول إلى كمية حرجة من الكتلة الحيوية التي تنتج ما يكفي من الحرارة ليتم الكشف عنها. في حالة أن العد CFU عالية جداً فإن مرحلة التأخر تكون قصيرة جداً، وكمية الحرارة المنتجة يمكن أن يسبب نقل الحرارة إلى خلايا الاستشعار المجاورة (المرجعية والآبار التجريبية) وتسبب تشوهات في ثيرمجرامس. كما ستؤدي أعداد كبيرة من الـ CFU إلى استنفاد أسرع للأكسجين والتحول إلى الظروف اللاهوائية. كما يجب أن يؤخذ في الاعتبار أنه خلال الدقائق الثلاثين الأولى من التجربة، عندما يكون النظام اِهزَاً، لا يمكن جمع البيانات ويتأخر التسجيل الفعلي للآثار. بالإضافة إلى ذلك ، يؤدي تحديد CFU غير صحيحة إلى تحديد MIC زائف ، مما يؤثر في نهاية المطاف على التجربة والتغييراتالملاحظة 25. وثمة نقطة أخرى هامة هي التحديد الصحيح لخط الأساس. عادة، يتم تحديد إشارة خط الأساس خلال مرحلة التأخر عندما تكون إشارة تدفق الحرارة صفرًا، ومن الناحية المثالية، يكون النطاق الزمني لتعريف خط الأساس >30 دقيقة. ومع ذلك، هذا ليس ممكنا دائماً لأن الوقت الذي تتطلبه البكتيريا للوصول إلى حد الكشف عن الإشارة الحرارية يختلف بين السلالات والأنواع. تتطلب بعض الأنواع أو السلالات أكثر من 30 دقيقة للوصول إلى حد الكشف عن الإشارة الحرارية في حين أن سلالات أو أنواع أخرى تصل إليه في غضون الدقائق الثلاثين الأولى. في هذه الحالة، من الممكن تحديد إشارة خط الأساس في نهاية التجربة عندما تكون جميع إشارات الحرارة قد انخفضت مرة أخرى إلى الصفر وتظل مستقرة. بدلاً من ذلك، يمكن استخدام خطوط الأساس من تجارب أخرى مع نفس السلالة البكتيرية، والتي لا ينصح بها.

ويتيح النظام بعض المرونة من حيث التصميم والتحسين للتجارب واستكشاف الأخطاء وإصلاحها. وحدات التخزين المستخدمة هي في نطاق 100-300 ميكرولتر عند استخدام إدراج البلاستيك و 100-600 μL عند استخدام أكواب التيتانيوم دون إدراج البلاستيك. حجم العمل الموصى به من قبل الشركة المصنعة هو 120 μL. 10- إن استخدام أحجام مختلفة في إعداد سلسلة تجريبية جديدة، وفي الوقت الذي يجد فيه الظروف المثلى للقياسات، له تأثير رئيسي على المعلمات. باستخدام وحدات تخزين أقل، يمكن تقليل كمية مركب الاختبار المطلوب، وهو أمر مهم بشكل خاص للمركبات، التي لا تتوفر إلا بكميات صغيرة. وبالإضافة إلى ذلك، يؤثر حجم استخدام مباشرة على توافر الأكسجين أثناء القياس مع كميات أقل زيادة كمية الأكسجين المتاحة اللازمة لنمو البكتيريا. إن استنفاد الأكسجين هو أحد العوامل الرئيسية التي تسهم في الحد الأقصى للتجربة. الأهم من ذلك ، فمن الممكن استخدام وسائل الإعلام الصلبة ، وليس فقط وسائل الإعلام السائلة. وهذا مهم بشكل خاص بالنسبة للكائنات الدقيقة بطيئة النمو حيث أن النمو على الواجهة بين مرحلة الصلب والغاز يتيح الوصول إلى الأكسجين بشكل أفضل9.

IMC هو أداة تحليلية مفيدة لاكتشاف العمليات غير المعروفة مع تطبيقات في الفيزياء والكيمياء والبيولوجيا. الطريقة يقيس تبادل الحرارة داخل نظام مغلق وتحليل تبادل الحرارة المسجلة يوفر معلومات إضافية لا يمكن الحصول عليها دائما مع الأساليب القياسية. في أبحاث الميكروبيولوجيا والمضادات الحيوية ، واحدة من أكبر مزايا IMC هي قدرتها على التمييز بين الخلايا الحية والأموات والهادّدة أو الخاملة ، وهو أمر غير ممكن باستخدام طرق التعكر القياسية11. وبالإضافة إلى ذلك، IMC حساس للغاية ويمكن الكشف عن انبعاث الحرارة من عدد قليل من 104-105 الخلايا9. ميزة أخرى هي أن الإعداد التجريبي سريع وسهل ، ويسمح بالتتبع المستمر في الوقت الحقيقي مع الحد الأدنى إلى أي تدخل المستخدم. وعلاوة على ذلك، فإن اللجنة الطبية المشتركة غير مدمرة، مما يتيح إجراء مزيد من التحليل للعينات. يسمح تحليل البيانات بفصل تكوين الكتلة الحيوية حتى وقت متأخر من الطور الأسي أو المبكر والنشاط الأيضي في المرحلة الثابتة.

إلى جانب ميزات التطبيق الجديدة والمثيرة المذكورة أعلاه ، هناك أيضًا عيوب في هذا الأسلوب. والقيود الرئيسية هي أن أجهزة اللجنة تقيس الحرارة الكلية المنتجة والمطلقة داخل نظام محدد، والتي تشمل أيضا إشارات غير محددة. وهذا يسلط الضوء على أهمية التخطيط التجريبي مع الضوابط المناسبة لتكون قادرة على تقييم التغيرات إشارة الحرارة التي يتم قياسها عن طريق تسجيل تدفق الحرارة9،20.

في أيدينا، IMC هو أداة هامة لدراسة الآثار المضادة للبكتيريا من المنتجات الطبيعية الجديدة وتحديد نطاقات التركيز الفعالة. وبصرف النظر عن التمييز بين الآثار الجرثومية والمبيد للجراثيم، يمكن استخدامه في المستقبل كجزء من دراسات تحديد الهدف وتحديد وزارة الشؤون العامة. ويمكن القيام بذلك من خلال مقارنة ثيرموجرامات من مختلف فئات المضادات الحيوية إلى ثيرمجرامات المركبات النشطة الجديدة كما هو معروض هنا. ومع ذلك، لا يزال يتعين التحقق مما إذا كانت بعض البارامترات القابلة للقياس الكمي التي يمكن استخلاصها من البيانات المقاسة كافية لمثل هذه المقارنات أو إذا كان من الضروري العمل على خوارزميات تعطي بصمات الأصابع استناداً إلى حرارية كاملة. تطبيق آخر ممكن في مجال البحوث المضادات الحيوية هو مقارنة النمط البري إلى الحيوانات المستنسخة المقاومة، إلى جانب تسلسل الجينوم كله، والتي يمكن أن تساعد في توضيح طريقة المقاومة (MoR) من مضادات الجراثيم الجديدة. وبسبب الطبيعة الساكنة للطريقة، فإن التحقيق في فعالية العوامل الجديدة في تكوين البيو فيلم أو على الأغشية الحيوية المنشأة بالفعل يمكن أن يؤدي إلى فهم أفضل للعملية البيولوجية وتأثير عوامل مختارة على الميكروبات في مراحل مختلفة من السكون. IMC سجلات الطاقة الإجمالية التي أطلقت في شكل الحرارة مما يجعلها وسيلة مناسبة للتحقيق أيضا دون مثبطة الآثار من المواد الفعالة التي قد تكون مقترنة transcriptomics. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة في البيئات السريرية للكشف عن تلوث العينات أو لتحديد مضادات الحيوية مما يساعد على اتخاذ قرار سريع بشأن العلاج المحدد للمرضى11.

Disclosures

تم تنفيذ المشروع بالتعاون مع سيمسيل، مطور تقنية كالسكريفير. ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

ويود المؤلفان أن يشكرا فريق سيمسيل على المناقشات المثمرة ونود أن نعرب عن تقديرنا للدعم الكبير الذي تقدمه كل من جوانا أوليينيك وفيلهلم بولاندر. ونود أيضا أن نشكر دانيال Kohnhäuser لتوفير المنتج الطبيعي وستيفاني شميدت للدعم الفني ماهرا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acinetobacter baumannii DSMZ DSM-30008 reference strain used in this study
calPlate Symcel 1220093 48-well plate for titanium cups to be inserted
calScreener Symcel 1200001 isothermal microcalorimetry instrument
calView software Symcel collection and analysis software
calWell Symcel 1901004 micro-bio grade (non-active) 48-well plate with plastic inserts which are inserted into the titanium cups
CASO agar Carl Roth X937.1 isolation and cultivation of microorganisms
Chloroamphenicol Sigma-Aldrich C0378 antibiotic
Ciprofloxacin Sigma-Aldrich 17850 antibiotic
Cuvettes Brand 759015 1.5 mL cuvettes
Disposable inoculation loops Sarsted 86.1562.050 10 µL inoculation loops
Dimethylsulfoxid (DMSO) Thermo Fisher Scientific 85190
Eppendorf tubes Eppendorf 30120086 1.5 mL eppendorf safe-lock tubes
Ethanol Thermo Fisher Scientific 10428671
Falcon Tubes Sarsted 62.554.502 15 mL falcon tubes
Hydrochloride (HCL) Thermo Fisher Scientific 10316380
Methanol Thermo Fisher Scientific A412-500
Mueller Hinton Broth Sigma-Aldrich 70192 liquid medium for antibiotic susceptibility studies
Mueller Hinton Broth II cation adjusted media Sigma-Aldrich 90922 Mueller Hinton Broth cation-adjusted to 1.25 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2
Petri dishes LABSOLUTE 7696404
Pipette 100 - 1000 µL Brand 705880
Pipette 2 - 20 µL Brand 705872
Pipette 20 - 200 µL Brand 705878
Pipette tips 100 - 1000 L Brand 732032
Pipette tips 2 - 200 µL Brand 732028
Polymyxin B sulfate Sigma-Aldrich P0972 antibiotic
Rifampicin Sigma-Aldrich R3501 antibiotic
Serological pipette Thermo Fisher Scientific 170356N 10 mL Nunc serological pipette
Spectrophotometer Eppendorf AG 6135 000.017
Sterile filters Minisart 16534----------K 0.2 µm pore size sterile filters
Syringe 50 mL NORM-JECT 22778
Tetracycline Sigma-Aldrich 87128 antibiotic
Titanium cups Symcel 1220089 inserted in 48-well titanium calPlate
Titanium lids Symcel 1220091 screwed and tightend to the titanium cups
Trimethroprim Sigma-Aldrich T7883 antibiotic
Tweezers Symcel 1900602

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization (WHO). Antibiotic resistance. World Health Organization (WHO). Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antibiotic-resistance (2018).
  2. Herrmann, J., Abou Fayad, A., Müller, R. Natural products from myxobacteria: novel metabolites and bioactivities. Natural Product Reports. 34, (2), 135-160 (2017).
  3. Cassar, S., et al. Use of Zebrafish in Drug Discovery Toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33, (1), 95-118 (2020).
  4. Bhusnure, O. G., et al. Drug Target Screening and its Validation by Zebrafish as a Novel Tool. Pharmaceutica Analytica Acta. 6, (10), 426 (2015).
  5. Kraus, J., Tobin, G., Development, Discovery, Deveopment, and Regulation of Natural Products. Using Old Solutions to New Problems - Natural Drug Discovery in the 21st Century. Kulka, M. InTech. Rijeka, HR. 4-36 (2013).
  6. Tabassum, N., Tai, H., Jung, D., Williams, D. R. Fishing for Nature's Hits: Establishment of the Zebrafish as a Model for Screening Antidiabetic Natural Products. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015, (1), 287847 (2015).
  7. Antimicrobial Development. Symcel. Available from: https://symcel.com/applications/microbiology/antimicrobials-development (2019).
  8. Robador, A., LaRowe, D. E., Finkel, S. E., Amend, J. P., Nealson, K. H. Changes in Microbial Energy Metabolism Measured by Nanocalorimetry during Growth Phase Transitions. Frontiers in Microbiology. 2018, (9), 109 (2018).
  9. Braissant, O., Wirz, D., Göpfert, B., Daniels, A. U. Use of isothermal microcalorimetry to monitor microbial activities. FEMS Microbiology Letter. 303, (1), 1-8 (2010).
  10. Braissant, O., et al. Isothermal microcalorimetry accurately detects bacteria, tumorous microtissues, and parasitic worms in a label-free well-plate assay. Biotechnology Journal. 10, (3), 460-468 (2015).
  11. Butini, M. E., Abbandonato, G., Di Rienzo, C., Trampuz, J., Di Luca, M. Isothermal microcalorimetry detects the presence of persister cells in a Staphylococcus aureus biofilm after vancomycin treatment. Frontiers in Microbiology. 25, (10), 332 (2019).
  12. Tellapragda, C., et al. Isothermal microcalorimetry minimal inhibitory concentration testing in extensively drug resistant Gram-negative bacilli - A multicenter study. Clinical Microbiology and Infection. (2020).
  13. Abdillahi, S., et al. Collagen VI Contains Multiple Host Defense Peptides with Potent In Vivo Activity. The Journal of Immunology. 201, (3), 1007-1020 (2018).
  14. Astasov-Frauenhoffer, M., et al. Exopolysaccharides regulate calcium flow in cariogenic biofilms. PLoS ONE. 12, (10), 1-14 (2017).
  15. Gros, S., et al. Personalized Treatment Response Assessment for Rare Childhood Tumors Using Microcalorimetry-Exemplified by Use of Carbonic Anhydrase IX and Aquaporin 1 Inhibitors. International Journal of Molecular Sciences. 20, (20), 4984 (2019).
  16. Kriszt, R., et al. Optical visualisation of thermogenesis in stimulated single-cell brown adipocytes. Scientific Reports. 7, (1), 1-14 (2017).
  17. Wadsö, I., et al. A well-plate format isothermal multi-channel microcalorimeter for monitoring the activity of living cells and tissues. Thermochimica Acta. 652, (1), 141-149 (2017).
  18. von Ah, U., Wirz, D., Daniels, A. U. Isothermal micro calorimetry - a new method for MIC determinations: results for 12 antibiotics and reference strains of E. coli and S. aureus. BMC Microbiology. 9, (106), (2009).
  19. Howell, M., Wirz, D., Daniels, A. U., Braissant, O. Application of a Microcalorimetric Method for Determining Drug Susceptibility in Mycobacterium Species. Journal of Clinical Microbiology. 50, (1), (2012).
  20. Wadsö, I. Isothermal Microcalorimetry: Current problems and prospects. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 64, (2001), 75-84 (2001).
  21. LeBel, M. Ciprofloxacin: chemistry, mechanism of action, resistance, antimicrobial spectrum, pharmacokinetics, clinical trials, and adverse reactions. Pharmacotherapy. 8, (1), 3-33 (1988).
  22. Chopra, I., Roberts, M. Tetracycline antibiotics: mode of action, applications, molecular biology, and epidemiology of bacterial resistance. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 65, (2), 232-260 (2001).
  23. Allison, J. L., et al. Mode of action of chloramphenicol. VII. Growth and multiplication of Escherichia coli in the presence of chloramphenicol. Journal of Bacteriology. 83, (3), 609-615 (1962).
  24. Wehrli, W. Rifampin: mechanisms of action and resistance. Reviews of Infectious Diseases. 5, Suppl 3 407-411 (1983).
  25. Hancock, R. E. W., et al. Agar and broth methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nature Protocols. 3, (2), 163-175 (2008).
التنميط الأيضي لتحديد آثار البكتيريا أو Bacteriostatic للمنتجات الطبيعية الجديدة باستخدام القياس الدقيق متساوي الحرارة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cirnski, K., Coetzee, J., Herrmann, J., Müller, R. Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry. J. Vis. Exp. (164), e61703, doi:10.3791/61703 (2020).More

Cirnski, K., Coetzee, J., Herrmann, J., Müller, R. Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry. J. Vis. Exp. (164), e61703, doi:10.3791/61703 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter