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Bioengineering

使用等温微计算法确定新天然产物的杀菌或杀菌作用的代谢分析

doi: 10.3791/61703 Published: October 29, 2020
* These authors contributed equally

Summary

阐明新型抗生素的用法是药物发现过程中一项具有挑战性的任务。此处描述的方法的目标是在抗菌分析中应用等温微计算法,以提供对药物-微生物相互作用的更深入的了解。

Abstract

由于抗微生物药物耐药性上升的全球威胁,迫切需要新型抗生素。我们调查来自美索菌的天然产品,作为这种新化合物的创新来源。这一进程中的一个瓶颈通常是阐明其行动模式。我们最近建立了等温微计算法,作为常规分析管道的一部分。该技术允许研究抗生素暴露对细菌代谢反应总的影响,包括与生物量形成分离的过程。重要的是,在测量过程中,无需任何用户干预,即可轻松区分杀菌和杀菌效果。然而,等温微计算是一种相当新的方法,将这种方法应用于不同的细菌物种通常需要对合适的测量条件进行预先评估。有一些参考热图可用于某些细菌,大大方便了对结果的解释。随着参考数据库的稳步增长,我们预计该方法在未来将产生越来越大的影响,并期望它能够进行深入的指纹分析,从而实现抗生素类别的差异化。

Introduction

该方法的目的是将等温微计算(IMC)作为介质通量测定,用于新型抗菌化合物的活性模式(MoA)分析。该方法揭示了有关化合物在细菌物种上活性的数据,并提供了化合物本身的杀菌或杀菌性质的信息。

新出现的抗微生物药物耐药性(AMR)的兴起是一个全球性问题,它导致对已知抗生素1的常见感染治疗效果较低。然而,寻找新的化合物和药物,可以取代或与已知的抗生素结合工作正在进行中,这是基于不同的方法。天然产品是当前药物发现运动,特别是抗感染药物发现2的关键参与者。然而,为抗生素开发确定新的铅结构是一个漫长而财政要求高的过程3。因此,发现的早期阶段对于过滤已经处于早期阶段的最有前途的脚手架极为重要。天然产品药物发现的初始步骤包括获取化合物的结构,确定体外活动以及MoA和目标识别。大多数符合进一步开发条件的成功化合物应表现出有利的活性范围(即抗菌剂中的广谱活性)和可以克服预先存在的 AMR 的新 MOA。然后,有希望的脚手架通常通过二次检测进行筛选,包括体内生物利用度、毒性和代谢4。除了财务问题外,天然产品药物的发现也面临着与化合物分离和纯化相关的成本和技术难题的进一步挑战,这反过来又可能使其难以在发现过程5、6,的早期阶段获得多毫克甚至克的量。因此,在天然产品研究中,能够以最少的化合物量进行最先进的初级筛选,以便就进一步投资做出明智的决定,使一种新的天然产品可用于临床前开发,这一点至关重要。与标准方法相比,随着 IMC 用于抗菌分析,所需的化合物量显著减少。该技术还提供了关于新药与微生物群落7相互作用的更深入的信息

IMC 是测量生物系统中所有生物、物理和生化过程和反应的总能量的成熟方法。细菌能量释放与总代谢反应成正比 8。在封闭的系统中,如使用的微钙计,热量水平可以在微瓦范围内测量,以研究细菌的代谢动力学9,10,11,12。,10,11,12细菌释放的热量(能量)与细胞功能有关,这些细胞功能是细胞代谢的基元,不一定与细胞生物量成正比。

最初,由于其低吞吐量和高测试量,等温热法对微生物测定的适用性受到限制。然而,使用的微热量计是独一无二的,因为它结合了等温热量测定的优点,增加了产量和较低的化合物要求,这使得它成为药物发现应用10的宝贵工具。此外,该仪器还具有测量细菌生长动力学的替代方法(如基于 600 nm 光学密度测量的标准浊度方法)的替代方案。测量OD600 的假设是,增加的光密度等于微生物的生长,从而忽略了不可行的细胞的存在。这种方法也受到批评,因为它排除了小群体变种和持久细胞11。相比之下,IMC允许实时观察任何类型的可行细胞。如果细胞处于休眠状态,它们仍然表现出代谢活性,因此它们可以被 IMC 检测到,而标准浊度方法11无法检测到这种现象。IMC 的其他优点包括较短的抗菌易感性测试时间、测量复杂社区中的药物相互作用以及标准分析方法,而不破坏样本 7

IMC技术已应用在广泛的研究,从微生物学到热发生和癌症生物学13,14,15,16,17。13,14,15,16,17微生物的应用包括确定化合物对各种细菌菌株的最低抑制浓度(MIC)。已经做了几项研究,并得出结论,MIC数据从等温热量测定的大多数细菌物种可以更快地获得,结果类似于其他(标准)方法的MIC测定12,18,19。12,18,19IMC的进一步应用包括观察药物的相互作用和药物治疗与复杂的细菌群落(如生物膜11)的组合。一项以MOA分析为重点的研究表明,微钙计可以检测出第一代和第二代头孢菌素的差异,而同一MOA的不同抗生素则表现出与18种相似的热流曲线。

在这里,我们描述了使用新的等温微计算仪使用 IMC 分析新的天然产品的 MOA 分析。该方法用于确定有效的抗生素浓度,并描述抗生素的杀菌或杀菌机制的特征。该方法可以在化合物的农业部分析中广泛实施,可以取代或至少补充标准的微生物方法。今后的研究将包括深入的指纹分析,使抗生素类别能够基于目标机制进行分化。

Protocol

注:仪器温度必须至少提前一天根据使用的细菌进行设置,以确保系统的稳定性。在这里, 阿辛托菌鲍曼尼 DSM30008 样品运行在 30 °C。

1. 文化准备

  1. 将正在调查的菌株(这里 :A.鲍曼尼)划掉在CASO果糖板上,并在30°C的静态培养箱中孵育过夜。
  2. 在 MHB(穆勒-欣顿汤)中接种单个菌落,并在 30°C 的 180 rpm 转速下孵化孵化器,准备过夜培养。

2. 样品制备

  1. 使用 1.5 mL 管准备选定药物或化合物的浓度范围(例如,在 DMSO 中加入 1.5 μL 100 倍库存溶液;参见步骤 2.3)。
  2. 稀释 MHB 介质中的隔夜文化。
    1. 使用波长为 600 nm 的分光光度计测量过夜培养的光学密度。
    2. 稀释培养,在新鲜的MHB介质中获得5 x10 5菌落形成单位(CFU)/mL。一个OD600等于大约5 x 108 CFU/mL(例如,大肠杆菌金黄色葡萄球菌,A.鲍曼尼)。
      注:在应用培养条件下,将每种细菌菌株的转化因子 OD600 校准为 CFU/mL 非常重要。
  3. 将150μL的细胞加入步骤2.1中制备的试管中,确保测试药物或化合物的最终浓度正确,并正确最终细胞浓度。
  4. 通过涡旋将化合物与细胞混合。
    注:样品板(见 材料表)有六行,每行包含八孔,共48孔;行 A 行和行 F 是热力学参考。因此,不能将样品加载到这些井中,相应的介质加载到这些井中。使用 B-E 行中的油井,可以测量 32 个测试样本。单个测试示例应至少重复运行(此处:所有示例都作为三倍运行)。应包括增长控制。

3. 插入准备

  1. 将步骤 2.4 中制备的混合物中 120 μL 转移到塑料刀片。
    注:在步骤 3.1 中使用反向移液,以防止液体喷洒在塑料刀片的两侧,这可能导致干扰正确的信号读数。
  2. 将所有钛小瓶放入支架 中(参见材料表),并放入钳子中。
  3. 轻轻将刀片转移到支架板中的钛瓶中。
  4. 将钛盖松散地放在所有钛瓶上。

4. 插入加载

  1. 将带钛杯的支架转移到样品站上,并放在指定区域。
  2. 使用扭矩扳手(设置为 40 cNm 力)拧紧所有盖子。

5. 样品运行

  1. 在 calView 软件中,开始新的实验(补充图 1)。
  2. 从仪器中收回样品插入臂。
  3. 将杯架放在"桥"上,第 8 列朝向样品插入开口,轻轻将杯架推入指定"位置 1"处的仪器中。等待 10 分钟,让系统稳定下来。给实验井贴上标签。
  4. 推动样品插入臂,直到杯架位于指定的"位置 2"。等待 20 分钟,系统稳定。
  5. 将样品插入臂推入"位置 3",并缩回样品插入臂,直到其处于"运行位置"。突出显示软件中的所有孔并选择"反应开始"(补充图 4)。
  6. 运行实验,直到热发射读取稳定地回到零。
    注意:请确保所有油井在这些步骤中的行为类似。 补充图 5 说明了如果井装正确,应遵守哪些情况。如果加载不正确,请重复步骤 5.2-5.4。

6. 拆下杯架

  1. 在软件中,选择"停止"(补充图 6)。然后,软件将询问"您是否确定",选择"是"(补充图7),并将实验保存在驱动器或桌面上进行数据分析(补充图 8)。
  2. 将样品插入臂完全插入仪器,并接合磁铁以取回杯架。
  3. 松开盖子,取出盖子,将小瓶和盖子放入玻璃支架中,在 180°C 下放置 4 小时,然后将小瓶和盖子放入干燥器中,以确保盖子和小瓶干燥。

7. 分析数据

  1. 打开软件(补充图9),选择左上角的"打开实验"(补充图10)。在弹出窗口中选择感兴趣的实验,然后按"打开"(补充图11)。应用程序将在默认井视图中打开实验(补充图 12)。
  2. "选择全部"或"Ctrl+A"(补充图13)。
  3. 定义基线,此参数规范化每个位置的数据(补充图 14)。在弹出窗口中选择位于滞后相的 >30 分钟的时间段(热流量必须低,介于零和十 μW 之间); 补充图 15.选择基线时间段后,所选基线将在热图中显示为绿色。关闭" 定义基线剖面" 窗口。
  4. "保存"或"Ctrl+S"并关闭软件(补充图 16)。
  5. 打开基于 Web 的 Symcel 测热分析应用程序 (https://symcel.shinyapps.io/symcel_calorimetricgrowth/)。
  6. 要将文件上传到计算分析应用程序,请按Browse(补充图 17),选择实验并按"打开"(补充图 18)。代谢参数将自动计算在web应用程序中的32个样本(补充图19)。
  7. 为了适应热流数据到戈姆珀茨和/或理查德的增长模型点击 增长函数。生长模型拟合将显示在"累积"部分,也与"Flow"部分(补充图20) 中的原始数据进行比较
  8. 要下载所有计算的参数,请按下载措施。选择文件位置,然后按"保存"(补充图 21)。该文件将导出到电子表格中进行进一步计算。

Representative Results

仪器需要足够数量的产生热量的细菌来记录热信号。如果延迟时间,直到热流是可检测到的,这意味着细菌尚未产生超过检测限值的热信号。因此,从细菌样本中释放的热量与细菌活性的增加直接相关,包括细菌生长。细菌生长和其他代谢活动已知受到抗菌药物添加的严重影响。为了确定正在调查的新天然产品是否具有杀菌或杀菌作用,或者两种 MoAs 的组合,我们选择了一组小参考药物,并记录了热图,我们将实验中的数据与天然产品进行比较。根据所选抗生素的功效,选择一系列浓度接近微布罗特稀释所确定的最低抑制浓度(MIC)。

Ciprofloxacin 以细菌 DNA 陀螺和托托索默酶 IV 为目标,因此,它表现出杀菌性 MoA。然而,由丙沙星引起的细菌杀菌是浓度依赖的,当它在浓度不足时,它也可以有一个细菌作用21。四环素和氯霉素分别瞄准30S和50S亚基的核糖体,由于蛋白质合成22、23的抑制,它们具有杀菌作用。利福平通过抑制DNA依赖的RNA聚合酶而作用,它可以同时具有杀菌和杀菌作用,取决于24使用的剂量。我们在这里调查的自然产品从美索菌中分离出,它显示出对革兰阴性细菌和革兰阳性细菌病原体的有力活性。在调查其MOA和分子靶点时,我们有兴趣确定新的天然产品是否具有杀菌和/或杀菌作用,以及经过治疗的Acineto细菌鲍曼尼的热剖面是否与使用上述参考药物治疗的细菌的热图相似。

图1A中显示通过向星丙沙星进行序列稀释时暴露 A. 鲍曼尼DSM-30008获得的 热图。0.005 μM 和 0.1 μM 之间的浓度对 A. baumannii 的生长和新陈代谢影响最小。 然而,用0.5 μM的果黄沙星处理细胞会导致滞后相长持续时间的显著变化和最大热流量的降低。这两个变化一起影响峰值时间(图1C),增加了大约6小时。在 图1B中,累积释放的热量是根据时间绘制的。在这里,我们看到浓度的影响,这反映在坡度的倾斜。热电图倾斜的量化为我们提供了 A.baumannii 在存在ciprofloxacin时的最大代谢率, 如图1D所示,在那里我们可以观察到与0.5 μM ciprofloxacin治疗的细胞代谢率的伴随降低。用较低浓度治疗的细胞的代谢率变化极小。通过增加覆盖0.1-1μM范围的中间浓度,可以进一步改进这一实验,以观察无效果的浓度和浓度之间的更明显逐渐变化,从而导致滞后阶段和代谢率的显著延迟。然而,变化的趋势支持了丙丙沙酸的杀菌莫A。

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图1A:请单击此处查看此图的较大版本。

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图1D:丙丙沙星对 A.鲍曼尼 DSM-30008生长和代谢的影响。A) 野生类型 (WT) A. baumannii DSM-30008 的热血球显示为热流 (μW) 与时间 (h), 未经处理并暴露于 ciprofloxacin.(B) 累积热量 (mJ) 与时间 (h).(C) 带误差条(标准偏差)的峰值时间(h)。(D) 代谢率 (μW) 与误差杆 (标准偏差). 请单击此处查看此图的较大版本。

就四环素而言,直到8小时后开始,我们才观察到所有测试浓度的热图发生显著变化(参见图 2A)。然而,在固定相热发射中观察到重大变化,其中,使用 5 μM 和 10 μM 四环素处理的 A. baumannii 的热流量第二峰显著降低。较低的浓度也有影响,但效果不太明显。此效果还会导致时间延长峰值,如图 2C 所示。累积释放的热曲线(图2B)显示,未处理和经过处理的细胞在整体曲线形状上没有显著差异,但根据趋势,曲线的斜率在四环素浓度较高时下降。这也转化为图 2D中显示的量化代谢率,其中观察到浓度依赖效应(即增加抗生素浓度时代谢率的降低)。这些发现支持四环素具有杀菌作用的事实。

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图2D:四环素对 A. 鲍曼尼 DSM-30008 生长和代谢的影响。A) 野生类型 (WT) A. baumannii DSM-30008 的热血球显示为热流 (μW) 与时间 (h), 未处理并暴露于四环素中。(B) 累积热量 (mJ) 与时间 (h).(C) 带误差条(标准偏差)的峰值时间(h)。(D) 代谢率 (μW) 与误差杆 (标准偏差). 请单击此处查看此图的较大版本。

在用针对50S核糖体亚基的蛋白质合成抑制剂氯霉素治疗A. baumannii时,可以观察到更明显的效果。暴露在氯霉素浓度增加中会导致滞后阶段的延长和固定相代谢活性的显著变化(图3A和图3B)。最低测试浓度的代谢率没有变化,选择的最高测试浓度(50 μM)可防止样品释放大部分能量。从中间测试浓度(5 μM 和 10 μM)看,达到峰值的时间显著增加约 8-9 小时(图 3C)。同时,治疗细胞的代谢率显著降低,50μM是致命的(图3D)。总体而言,在浓度高达10μM氯霉素时观察到的变化与该抗生素类的杀菌作用一致。

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图 3A:请单击此处查看此图的较大版本。

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图3D:氯霉素对 A. 鲍曼尼 DSM-30008 生长和代谢的影响。A) 野生类型 (WT) A. baumannii DSM-30008 的热血球显示为热流 (μW) 与时间 (h), 未处理并暴露于氯霉素中。(B) 累积热量 (mJ) 与时间 (h).(C) 带误差条(标准偏差)的峰值时间(h)。(D) 代谢率 (μW) 与误差杆 (标准偏差). 请单击此处查看此图的较大版本。

在选定的浓度范围内处理利福平素对A.baumannii DSM-30008的热图有显著的影响,与滞后相持续时间和生长的影响,直到后期固定阶段(图4A)。在图 4B 中可以看到热量排放的显著减少,同时代谢活性也减少了。图4C和图4D说明了滞后阶段延长的影响和固定阶段代谢活动的变化。图4C显示所有浓度的高峰期明显增加。图 4D显示了通常归因于杀菌效果的所有浓度的斜率下降导致的代谢率下降。由于抗生素引起的细菌细胞的杀戮,由于活性细菌的数量较少,代谢活性预计会降低。所收集的数据符合利福平能起到杀菌和杀菌作用这一事实,这里提供的数据主要支持所选浓度的杀菌作用。

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图4D:利福平对 A. 鲍曼尼 DSM-30008 生长和代谢的影响。A) 野生类型 (WT) A. baumannii DSM-30008 的热图显示为热流 (μW) 与时间 (h), 未处理并暴露在利福平。(B) 累积热量 (mJ) 与时间 (h).(C) 带误差条(标准偏差)的峰值时间(h)。(D) 代谢率 (μW) 与误差杆 (标准偏差). 请单击此处查看此图的较大版本。

天然产品抗生素(0.25 μM)的最低选择测试浓度对 A. baumannii DSM-30008 的热图没有或只有边际影响。然而,其他测试浓度对滞后相长持续时间有一定影响,并影响生长,直到后期固定阶段(图5A)。最明显的效果是固定阶段热量排放的显著减少。图 5B 中显示的 数据清楚地表明,所有有效浓度释放的能量显著减少,斜率也降低。这些影响转化为峰值时间的减少(图5C),更重要的是,观察到代谢率显著和明显依赖剂量的下降(图5D)。对新型菌杆菌天然产品的调查表明,其抗菌效果与杀菌效果相结合。

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图5D:新型抗菌天然产物对 A. baumannii DSM-30008 生长和代谢的影响。A) 野生类型 (WT) A. baumannii DSM-30008 的热图显示为热流 (μW) 与时间 (h), 未经过处理并暴露在天然产品中。(B) 累积热量 (mJ) 与时间 (h).(C) 带误差条(标准偏差)的峰值时间(h)。(D) 代谢率 (μW) 与误差杆 (标准偏差). 请单击此处查看此图的较大版本。

补充图 1:在软件界面中选择新实验。 在红色方块中,将描绘选择新实验的步骤。 请点击这里下载此图。

补充图 2:在软件界面中命名新实验。 在红色方块中,将命名并确认新实验的命名步骤。 请点击这里下载此图。

补充图 3:在软件界面中启动新实验。 在红色方块中,将描绘开始新实验的步骤。 请点击这里下载此图。

补充图4:软件界面中的选好和反应开始。 选择所有反应井(以深蓝色着色的井,按钮 选择 所有以红色方块表示的井),并选择反应开始(以红色方块表示)。 请点击这里下载此图。

补充图 5:正确装载杯架。 选择参考井(深蓝色、红色正方形),热图显示在弹出窗口中。当负载执行正确时,我们观察到检测到的热发射信号急剧下降,这些信号必须达到高原相,并在此相位中保持大约 2-3 分钟,之后信号返回起点。当观察到此情况时,杯架的装载是正确的。 请点击这里下载此图。

补充图6:实验结束。 以红色表示 实验中 的"停止"按钮。 请点击这里下载此图。

补充图7:实验结束的确认。 在红色中, 描述用于确认运行实验结束的"是"按钮。 请点击这里下载此图。

补充图 8:保存实验文件。 将显示包含保存文件选项的弹出窗口,并在红色 显示"保存 "按钮。 请点击这里下载此图。

补充图9:软件接口。请点击这里下载此图。

补充图10:访问保存的实验。 在红色按钮 打开实验 访问保存的实验被描述。 请点击这里下载此图。

补充图11:打开选定的实验文件。 在红色中, 将描绘 "打开"按钮。 请点击这里下载此图。

补充图 12:默认井视图。 所有实验井和相应的热图都是可见的。 请点击这里下载此图。

补充图13:选择油井进行分析。在红色按钮 选择全部 被描绘。 请点击这里下载此图。

补充图14:定义基线。 在红色按钮 定义基线 被描绘。 请点击这里下载此图。

补充图15:选择基线信号。 选择滞后阶段中至少 30 分钟的信号(红色框)。 请点击这里下载此图。

补充图 16:保存对实验文件的更改。 在红色中, 将描绘 "保存"按钮。 请点击这里下载此图。

补充图17:基于Web的测热量分析应用程序。 显示在线软件界面和文件上传路径。 请点击这里下载此图。

补充图18:上传选定的实验文件。 在红色中, 将描绘 "打开"按钮。 请点击这里下载此图。

补充图19:热图分析。 每个实验井计算的代谢参数以红色表示。 请点击这里下载此图。

补充图20:将实验数据拟合理论生长模型。 热流数据要么适合 Gompertz,要么适合理查德的生长模型。 请点击这里下载此图。

补充图 21:导出测量值。在红色按钮下载措施和保存被描绘。请点击这里下载此图。

Discussion

等温微计算测量样品在一段时间内释放的能量,这种能量释放是所有生物、物理和(生物)化学过程的结果。测量的热流可用于评估或确定物质的抗菌效应,因为它能够持续实时监测代谢活动。

为了获得可靠的分析数据,需要根据每个物种或菌株分别确定正确的起始菌落形成单位 (CFU)。如果 CFU 计数过低,则会导致长时间的滞后阶段,因为系统需要更长的时间才能达到产生足够热量的临界量,从而检测出热量。如果 CFU 计数过高,滞后相位将非常短,产生的热量量会导致传热到相邻的传感器单元(参考和实验井),并导致热图失真。大量的CFU也会导致更快的氧气消耗,并切换到厌氧条件。还必须考虑到,在实验前30分钟,当系统平衡时,无法收集数据,并延迟实际记录效果。此外,不正确的CFU确定导致错误的MIC测定,最终影响实验和观察的变化25。另一个关键点是正确确定基线。通常,当热流信号为零时,在滞后阶段选择基线信号,理想情况下,基线定义的时间范围为 >30 分钟。然而,这并不总是可能的,因为细菌达到热信号检测极限的时间因菌株和物种的不同而不同。某些物种或菌株需要超过 30 分钟才能达到热信号检测极限,而其他菌株或菌株需要 30 分钟以上才能达到热信号检测极限。在这种情况下,当所有热信号都回退到零并保持稳定时,可以选择实验结束时的基线信号。或者,可以使用来自相同细菌菌株的其他实验的基线,但是不建议这样做。

该系统允许在设计和优化实验和故障排除方面具有一定的灵活性。使用塑料刀片时,使用的体积在 100-300 μL 范围内,使用无塑料刀片的钛杯时为 100-600 μL。制造商推荐的工作体积为 120 μL。使用不同的卷来建立一个新的实验系列,在找到测量的最佳条件的同时,主要对两个参数产生影响。通过使用较低的体积,所需的测试化合物的量可以减少,这对于化合物尤其重要,因为化合物只有少量可用。此外,在测量过程中,使用体积直接影响氧气的可用性,而较低的体积增加了细菌生长所需的可用氧气量。氧气消耗是导致实验最长可能持续时间的主要因素之一。重要的是,可以使用固体介质,不仅仅是液体介质。这对生长缓慢的微生物尤其重要,因为固体和气相之间的界面上的生长可以更好地获得氧气。

IMC 是一个有用的分析工具,用于发现物理、化学和生物学应用中的未知过程。该方法测量封闭系统中的热交换,对记录的热交换进行分析,提供了不能始终通过标准方法获得的额外信息。在微生物学和抗生素研究中,IMC最大的优点之一是能够区分活细胞、死细胞和持续细胞或休眠细胞,这是不可能使用标准浊度方法11。此外,IMC是高度敏感的,它可以检测热量发射从只有104-105细胞9。另一个优点是,实验设置是快速和容易的,它允许连续,实时跟踪,最小的或没有用户干扰。此外,IMC 是无损的,可以进一步分析样品。数据分析允许生物量形成分离,直到后期指数或早期固定阶段和固定阶段的代谢活性。

除了上述新颖而令人兴奋的应用功能外,这种方法也有缺点。主要限制是,IMC 仪器测量特定系统内产生和释放的总热量,其中还包括非特定信号。这突出了实验规划的重要性,适当的控制,以便能够评估热信号的变化,通过记录热流9,20,测量

在我们手中,IMC是研究新天然产品的抗菌效果和确定有效浓度范围的重要工具。除了区分杀菌和杀菌效果外,它将来还可用于目标鉴定研究和农业部测定。这可以通过比较不同抗生素类别的热图和此处显示的新活性化合物的热图来完成。然而,仍要调查从测量数据中提取的某些可量化参数是否足以进行此类比较,或者是否需要研究基于完整热图提供指纹的算法。抗生素研究领域的另一个可能应用是比较野生型对耐药克隆,加上全基因组测序,这可以帮助阐明新的抗菌剂的耐药模式(MoR)。由于该方法的静态性质,研究新制剂对生物膜形成或已经建立的生物膜的疗效,可导致更好地了解生物过程和选定制剂在休眠不同阶段的微生物的影响。IMC 记录以热的形式释放的总能量,因此它成为研究可能与转录组学相耦合的活性物质的亚抑制作用的合适方法。这种方法也可用于临床设置,以检测样品的污染或确定抗生物图有助于迅速决定确定治疗病人的11。

Disclosures

该项目是与calScreener技术的开发人员Symcel合作执行的。作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

作者要感谢Sycel团队进行了富有成果的讨论,我们感谢甘娜·奥利尼克和威廉·保兰德的大力支持。我们还要感谢丹尼尔·科恩海瑟提供天然产品,斯特凡妮·施密特提供娴熟的技术支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acinetobacter baumannii DSMZ DSM-30008 reference strain used in this study
calPlate Symcel 1220093 48-well plate for titanium cups to be inserted
calScreener Symcel 1200001 isothermal microcalorimetry instrument
calView software Symcel collection and analysis software
calWell Symcel 1901004 micro-bio grade (non-active) 48-well plate with plastic inserts which are inserted into the titanium cups
CASO agar Carl Roth X937.1 isolation and cultivation of microorganisms
Chloroamphenicol Sigma-Aldrich C0378 antibiotic
Ciprofloxacin Sigma-Aldrich 17850 antibiotic
Cuvettes Brand 759015 1.5 mL cuvettes
Disposable inoculation loops Sarsted 86.1562.050 10 µL inoculation loops
Dimethylsulfoxid (DMSO) Thermo Fisher Scientific 85190
Eppendorf tubes Eppendorf 30120086 1.5 mL eppendorf safe-lock tubes
Ethanol Thermo Fisher Scientific 10428671
Falcon Tubes Sarsted 62.554.502 15 mL falcon tubes
Hydrochloride (HCL) Thermo Fisher Scientific 10316380
Methanol Thermo Fisher Scientific A412-500
Mueller Hinton Broth Sigma-Aldrich 70192 liquid medium for antibiotic susceptibility studies
Mueller Hinton Broth II cation adjusted media Sigma-Aldrich 90922 Mueller Hinton Broth cation-adjusted to 1.25 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2
Petri dishes LABSOLUTE 7696404
Pipette 100 - 1000 µL Brand 705880
Pipette 2 - 20 µL Brand 705872
Pipette 20 - 200 µL Brand 705878
Pipette tips 100 - 1000 L Brand 732032
Pipette tips 2 - 200 µL Brand 732028
Polymyxin B sulfate Sigma-Aldrich P0972 antibiotic
Rifampicin Sigma-Aldrich R3501 antibiotic
Serological pipette Thermo Fisher Scientific 170356N 10 mL Nunc serological pipette
Spectrophotometer Eppendorf AG 6135 000.017
Sterile filters Minisart 16534----------K 0.2 µm pore size sterile filters
Syringe 50 mL NORM-JECT 22778
Tetracycline Sigma-Aldrich 87128 antibiotic
Titanium cups Symcel 1220089 inserted in 48-well titanium calPlate
Titanium lids Symcel 1220091 screwed and tightend to the titanium cups
Trimethroprim Sigma-Aldrich T7883 antibiotic
Tweezers Symcel 1900602

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References

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使用等温微计算法确定新天然产物的杀菌或杀菌作用的代谢分析
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Cirnski, K., Coetzee, J., Herrmann, J., Müller, R. Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry. J. Vis. Exp. (164), e61703, doi:10.3791/61703 (2020).More

Cirnski, K., Coetzee, J., Herrmann, J., Müller, R. Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry. J. Vis. Exp. (164), e61703, doi:10.3791/61703 (2020).

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