Summary
Belysningen af virkningsmåden for et nyt antibiotikum er en udfordrende opgave i lægemiddelopdagelsesprocessen. Målet med den metode, der er beskrevet her, er anvendelsen af isotermisk mikrocalortri ved hjælp af calScreener i antibakterielle profilering for at give yderligere indsigt i lægemiddel-mikrobe interaktioner.
Abstract
På grund af den globale trussel om stigende antimikrobiel resistens er der et presserende behov for nye antibiotika. Vi undersøger naturlige produkter fra Myxobacteria som en innovativ kilde til sådanne nye forbindelser. En flaskehals i processen er typisk belysning af deres virkningsmåde. Vi har for nylig etableret isotermisk mikrocalortri som en del af en rutinemæssig profilering rørledning. Denne teknologi gør det muligt at undersøge effekten af antibiotika eksponering på den samlede bakterielle metaboliske respons, herunder processer, der er afkoblet fra biomasse dannelse. Det er vigtigt, at bakterostatiske og bakteriidseffekter let kan skelnes uden brugerindgriben under målingerne. Isotermisk mikrocalortri er imidlertid en ret ny tilgang, og anvendelsen af denne metode på forskellige bakteriearter kræver normalt forudgående vurdering af passende målebetingelser. Der er nogle reference termogrammer til rådighed for visse bakterier, i høj grad lette fortolkningen af resultaterne. Da puljen af referencedata vokser støt, forventer vi, at metoden vil have stigende virkning i fremtiden, og forventer, at den giver mulighed for dybdegående fingeraftryksanalyser, der gør det muligt at differentiere antibiotikaklasser.
Introduction
Formålet med denne metode er at anvende isotermisk mikrocalortri (IMC) som en medium gennemløbsanalyse i virkningsform (MoA) profilering af nye antibakterielle forbindelser. Denne metode afslører data om aktiviteten af forbindelser på bakteriearter og giver oplysninger om den bakteriedræbende eller bakteriostatiske karakter af selve forbindelsen.
Fremkomsten af nye antimikrobiel resistens (AMR) er et globalt problem, og det fører til mindre effektive behandlinger af almindelige infektioner med kendte antibiotika1. Men, søgen efter nye forbindelser og lægemidler, der kan erstatte eller arbejde i kombination med kendte antibiotika er i gang, og dette er bygget på forskellige tilgange. Naturlige produkter er en central aktør i de nuværende drug discovery kampagner og især i anti-infektiøs lægemiddel opdagelse2. Det er imidlertid en langvarig og økonomisk krævende proces at identificere nye blystrukturer for udvikling afantibiotika. Således er de tidlige opdagelsestrin ekstremt vigtige for at filtrere på de fleste lovende stilladser allerede på et tidligt tidspunkt. Indledende trin i naturlige produkt stof opdagelse omfatter opnåelse af en forbindelse struktur, bestemmelse af aktiviteten in vitro sammen med MoA og mål identifikation. De fleste vellykkede forbindelser er berettiget til yderligere udvikling bør vise et gunstigt spektrum af aktivitet (dvs. bredspektret aktivitet i tilfælde af antibakterielle stoffer) og en roman MoA, som allerede eksisterende AMR kan overvindes. Lovende stilladser screenes derefter typisk i sekundære analyser, som omfatter in vivo biotilgængelighed, toksicitet og stofskifte4. Ud over de finansielle bekymringer, naturlige produkt stof opdagelse står over for yderligere udfordringer med hensyn til omkostninger og tekniske vanskeligheder i forbindelse med sammensatte isolation og rensning, som igen kan gøre det vanskeligt at opnå multi-milligram eller endda gram beløb i de tidlige stadier af opdagelsenproces 5,6. Derfor er det af største betydning i forskning i naturlige produkter at kunne udføre state-of-the-art primær screening med minimale sammensatte mængder for at træffe en velinformeret beslutning om yderligere investeringer for at gøre et nyt naturprodukt tilgængeligt for præklinisk udvikling. Med brugen af IMC til antibakteriel profilering reduceres mængden af den nødvendige mængde forbindelse betydeligt i forhold til standardmetoder. Teknikken giver også mere dybdegående information om samspillet mellem nye lægemidler med det mikrobielle samfund7.
IMC er en veletableret metode til måling af den samlede energi som følge af alle biologiske, fysiske og biokemiske processer og reaktioner i et biologisk system. Bakteriel energi frigivelse er proportional med den samlede metaboliske reaktioner8. Inden for et lukket system, såsom det anvendte mikrokalatormeter, kan varmeniveauerne måles i mikrowatt-området for at studere de metaboliske kinetikafbakterier9,10,,11,12. Den varme (energi), der frigives af bakterier er knyttet til cellulære funktioner, der ligger til grund for deres stofskifte, og som ikke nødvendigvis er proportional med den cellulære biomasse.
I første omgang har anvendeligheden af isotermisk kalorimetri for mikrobiologiske analyser været begrænset på grund af dens lave gennemløb og høje testmængder. Men det anvendte mikrokalorimeter er unikt, da det kombinerer fordelene ved isotermisk kalorimetri med øget gennemløb og lavere sammensatte krav, hvilket gør det til et værdifuldt værktøj til drug discovery applikationer10. Endvidere giver instrumentet yderligere fordele i forhold til alternative metoder til måling af bakterievækstkinetik, såsom standard turbiditetsmetoden, som er baseret på måling af optisk tæthed ved 600 nm (OD<600). Måling af OD600 er baseret på den antagelse, at øget optisk tæthed er lig med mikrobiel vækst, hvorved tilstedeværelsen af ikke-levedygtige celler forsømmes. Denne metode er også blevet kritiseret, da den udelukker små kolonivarianter og persisterceller11. I modsætning hertil giver IMC mulighed for real-time observation af enhver form for levedygtige celler. Hvis cellerne er i dvale, udviser de stadig metabolisk aktivitet, og de kan således detekteres af IMC, mens sådanne fænomener ikke kan påvises ved standard turbiditetsmetoden11. Andre fordele ved IMC omfatter en kortere antimikrobiel følsomhed testtid, måling af lægemiddelinteraktioner i et komplekst samfund og standard analysemetoder uden at ødelæggeprøven 7.
IMC-teknologien er blevet implementeret i en lang række undersøgelser, lige fra mikrobiologi til termogenese og kræftbiologi13,14,15,16,17. De mikrobielle anvendelser omfatter bestemmelse af minimale hæmmende koncentrationer (MIC) af forbindelser mod forskellige bakteriestammer. Der er udført flere undersøgelser, og det er blevet konkluderet, at MIC-data fra isotermisk kalorimetri for størstedelen af bakteriearterne hurtigere kan opnås , og resultaterne svarer til andre (standard) metoder tilMIC-bestemmelse 12,18,19. Yderligere anvendelser af IMC omfatter observere samspillet mellem narkotika og kombination af narkotika behandlinger med komplekse bakterielle samfund såsom biofilm11. En undersøgelse med fokus på MoA profilering viste, at mikrokalorimet kan påvise en forskel i første- og andengeneration cephalosporiner, mens forskellige antibiotika med samme MoA udviser en lignende varmestrømskurve sammenlignet medhinanden 18.
Her beskriver vi brugen af IMC til MoA profilering af nye naturlige produkter ved hjælp af det nye isotermiske mikrokalorimetriinstrument. Metoden anvendes til at bestemme effektive antibiotikakoncentrationer og til at beskrive antibiotikas karakteristika i form af baktericid eller bakterostatiske mekanismer. Metoden kan gennemføres bredt i MoA profilering af forbindelser, og den kan erstatte eller i det mindste supplere standardmikrobiologiske metoder. Fremtidige undersøgelser vil omfatte dybdegående fingeraftryksanalyser, der vil gøre det muligt at differentiere antibiotikaklasser baseret på målmekanismer.
Protocol
BEMÆRK: Instrumenttemperaturen skal indstilles i henhold til den bakterie, der anvendes mindst en dag i forvejen for at sikre systemets stabilitet. Her køres Acinetobacter baumannii DSM30008 prøver ved 30 °C.
1. Kulturforberedelse
- Streak ud stammen under efterforskning (her: A. baumannii) på en CASO agar plade og inkubere natten over i en statisk inkubator ved 30 °C.
- Forbered en overnatning kultur ved at vaccinere en enkelt koloni i MHB (Mueller-Hinton bouillon) og inkubere på en rystende inkubator ved 180 rpm ved 30 °C.
2. Prøveforberedelse
- Brug 1,5 ml rør til at forberede koncentrationsområdet for udvalgte lægemidler eller forbindelser (f.eks. ved at tilsætte 1,5 μL 100x stockopløsninger i DMSO; se trin 2.3).
- Fortynd natten kultur i MHB medium.
- Nattens optiske tæthed måles ved hjælp af et spektrofotometer ved en bølgelængde på 600 nm.
- Fortynd kulturen for at opnå 5 x 105 kolonidannende enheder (CFU)/ml i frisk MHB-medium. En OD600 påen svarer til ca. 5 x 108 CFU/ml Staphylococcus aureus(f.eks. A. baumannii
BEMÆRK: Det er vigtigt at kalibrere omregningsfaktoren OD600 til CFU/ml for hver enkelt bakteriestamme under de anvendte dyrkningsforhold.
- Der tilsættes 150 μL af cellerne til de reagensglas, der er fremstillet i trin 2.1, hvilket sikrer korrekt endelig koncentration af det testede lægemiddel eller den testede forbindelse og korrigerer den endelige cellekoncentration.
- Bland forbindelsen med cellerne ved at hvirvle.
BEMÆRK: Prøvepladen (se Materialetabel)har seks rækker, der hver indeholder otte brønde, i alt 48 brønde; Række A og række F er den termodynamiske reference. Derfor kan ingen prøver indlæses i disse brønde, tilsvarende medier er indlæst i disse brønde. 32 testprøver kan måles pr. kørsel ved hjælp af brønde i række B-E. Den individuelle prøve skal mindst køres i to eksemplarer (her: alle prøver blev kørt som tre eksemplarer). Vækstkontrol bør medtages.
3. Indsæt forberedelse
- Overfør 120 μL fra den blanding, der er fremstillet i trin 2.4, til plastindsatserne.
BEMÆRK: Brug omvendt pipettering i trin 3.1 for at forhindre væske i at sprøjte på siderne af plastindsatserne, hvilket kan føre til interferens med korrekte signaludlæsninger. - Anlæt alle titaniumhætteglas i holderne (se Materialetabel)med en pincet.
- Overfør forsigtigt idesætterne i titaniumhætteglassene i holderpladen.
- Placer titaniumlåg på alle titaniumhætteglas løst.
4. Indsætning af indsættelse
- Overfør holderen med titanium kopper på prøvestationen og sted på udpeget område.
- Brug momentnøglen, sat til 40 cNm kraft, til at stramme alle lågene.
5. Kørsel af prøver
- I calView-software skal du starte et nyteksperiment ( Supplerende figur 1).
- Træk prøveindføringsarmen tilbage fra instrumentet.
- Kopholderen anbringes på "broen", kolonne 8, der vender mod prøveindføringsåbningen, og skub forsigtigt kopholderen ind i instrumentet ved den angivne "Position 1". Vent 10 minutter på, at systemet stabiliserer sig. Mærl de eksperimentelle brønde.
- Skub prøveindføringsarmen, indtil kopholderen er placeret på den angivne "Position 2". Vent 20 minutter på, at systemet stabiliserer sig.
- Prøveindføringsarmen skubbes ind i "Position 3", og prøveindføringsarmen trækkes tilbage, indtil den er i "Køreposition". Fremhæv alle brøndene i softwaren, og vælg Reaktionsstart ( Supplerende figur 4).
- Kør eksperimentet, indtil varmeemissionen aflæser, er tilbage på nul.
BEMÆRK: Sørg for, at alle brønde opfører sig ens inden for disse trin. Supplerende figur 5 illustrerer, hvad der skal observeres, hvis brøndene er indlæst korrekt. Hvis den indlæses forkert, skal du gentage trin 5.2-5.4.
6. Fjern kopholderen
- I softwaren skal du vælge Stop ( supplerendefigur 6). Softwaren vil derefter spørge, om "du er sikker", skal du vælge Ja ( SupplerendeFigur 7) og gemme eksperimentet på et drev eller desktop til dataanalyse ( Supplerende Figur8).
- Sæt prøveindføringsarmen helt ind i instrumentet, og sæt magneterne i indgreb for at hente kopholderen.
- Løsn lågene, fjern skærene og læg hætteglas og låg i glasholdere, og placer dem i 4 timer ved 180 °C efterfulgt af, at hætteglassene og lågene anbringes i en ekssikator for at sikre, at låg og hætteglas er tørre.
7. Analyse af data
- Åbn softwaren (Supplerende figur 9), vælg Åbn eksperiment i øverste venstre hjørne ( Supplerendefigur 10). Vælg interesseeksperimentet i pop op-vinduet, og tryk på Åbn ( supplerende figur11). Ansøgningen vil åbne eksperimentet i standard brønde visning(Supplerende Figur 12).
- Tryk på Marker alle eller Ctrl+A ( Supplerende figur 13).
- Tryk på Definergrundlinje , normaliserer denne parameter dataene i hver position (supplerende figur 14). I pop op-vinduet skal du vælge en tidsperiode på >30 min placeret i lagfasen (varmestrømmen skal være lav, mellem nul og ti μW; Supplerende figur 15). Efter valg af basislinjetidsperiode vises den valgte grundlinje med grønt i termogrammet. Luk vinduet Definer oprindelig sektion.
- Tryk på Gem eller Ctrl+S, og luk softwaren( supplerende figur 16).
- Åbn webbaseret Symcel Calorimetri-analyseprogram (https://symcel.shinyapps.io/symcel_calorimetricgrowth/).
- Hvis du vil overføre filen til calorimetrianalyseprogrammet, skal du trykke på Gennemse (supplerende figur 17), vælge eksperimentet og trykke på Åbn (supplerende figur 18). De metaboliske parametre beregnes automatisk for de 32 prøver i webapplikationen (supplerende figur 19).
- For at tilpasse varmeflowdataene til Gompertz og/eller Richards vækstmodeller skal du klikke på Vækstfunktion. Vækstmodeller passer vil blive vist i afsnittet "Kumulative", også i forhold til de rå data i afsnittet "Flow" (Supplerende figur 20).
- Tryk på Download Mål for at hente alle beregnede parametre. Vælg filplaceringen, og tryk på Gem ( supplerende figur 21). Filen eksporteres til et regneark til yderligere beregninger.
Representative Results
Der er behov for et tilstrækkeligt antal bakterier, der producerer varme, for at instrumentet kan registrere et varmesignal. Hvis der er en forsinkelse i tiden, indtil en varmestrøm kan påvises, betyder det, at bakterierne endnu ikke producerer et varmesignal over detektionsgrænsen. Påvisning af frigivet varme fra bakterieprøven er derfor direkte relateret til stigende bakterieaktivitet, herunder bakterievækst. Bakterievækst og andre metaboliske aktiviteter er kendt for at være stærkt påvirket af tilsætning af et antibakterielt lægemiddel. For at afgøre, om et nyt naturprodukt, der undersøges, udøver baktericid eller bakterostatiske virkninger eller en kombination af begge MoAs, har vi valgt et lille sæt referencelægemidler, og vi har registreret termogrammer, som vi sammenlignede data fra forsøg med det naturlige produkt med. Baseret på styrken af udvalgte antibiotika blev der valgt en række koncentrationer, som var tæt på den minimale hæmmende koncentration (MIC) som bestemt ved mikrobrothfortynding.
Ciprofloxacin mål bakteriel DNA gyrase og topoisomerase IV og dermed, det udviser en bakteriedræbende MoA. Bakteriel aflivning forårsaget af ciprofloxacin er dog koncentrationsafhængig, og når det doseres ved utilstrækkelige koncentrationer, kan det også have en bakteratisk effekt21. Tetracyklin og chloramphenicol mål ribosomet på 30S og 50S underenhed, henholdsvis, og de virker bakterteriatiske på grund af hæmning af proteinsyntese22,23. Rifampicin virker ved at hæmme DNA-afhængig RNA-polymerase, og det kan have både baktericid og bakterostatiske virkninger, afhængigt af den anvendtedosis 24. Det naturlige produkt, som vi undersøger her, blev isoleret fra Myxobacteria, og det viste potent aktivitet mod Gram-negative og Gram-positive bakteriepatogener. Under undersøgelsen af dens MoA og molekylære mål, vi var interesseret i at afgøre, om det nye naturlige produkt udøver baktericid og / eller bakterostatiske virkninger, og om varmeprofiler af behandlede Acinetobacter baumannii ligner termogrammer fra bakterier, der blev behandlet med de reference lægemidler, der er nævnt ovenfor.
Termogrammer, der fremkommer ved at udsætte A. baumannii DSM-30008 for ciprofloxacin i serielle fortyndinger, vises i figur 1A. Koncentrationer mellem 0,005 μM og 0,1 μM har en minimal effekt på A. baumanniis vækst og stofskifte. Men, behandling af celler med 0,5 μM ciprofloxacin fører til en betydelig ændring i lag fase varighed og lavere maksimal varmestrøm. Disse to ændringer påvirker tilsammen den tid, der topper (figur 1C), som øges med ca. 6 timer. I figur 1B afbildesden kumulative frigivne varme mod tiden. Her ser vi effekten af koncentrationer, som afspejles af en hældning af hældning. Kvantificering af termogrammets hældning giver os den maksimale stofskifte af A. baumannii ved tilstedeværelse af ciprofloxacin som vist i figur 1D, hvor vi kan observere et samtidig fald i stofskiftet af celler behandlet med 0,5 μM ciprofloxacin. Ændringer i stofskiftet af celler behandlet med lavere koncentrationer er minimale. Dette forsøg kunne forbedres yderligere ved at tilsætte mellemkoncentrationer, der dækker 0,1-1 μM-området, for at observere en mere udtalt gradvis ændring mellem koncentrationerne, som ikke har nogen virkning, og en koncentration, der medfører en betydelig forsinkelse af forsinkelsesfasen og stofskiftet. Men, tendenserne for forandring understøtter en bakteriedræbende MoA af ciprofloxacin.
Figur 1A: Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 1B: Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 1C: Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 1D: Effekt af ciprofloxacin på A. baumannii DSM-30008 vækst og stofskifte. a) Termogrammer vist som varmestrøm (μW) vs. tid (h) for vildtype (WT) A. baumannii DSM-30008, ikke-behandlet og eksponeret for ciprofloxacin. (B) Kumulativ varme (mJ) vs. tid (h). (C) Tid til at toppe (h) med fejllinjer (standardafvigelse). d)Stofskifte (μW) med fejlstænger (standardafvigelse). Klik her for at se en større version af dette tal.
For tetracyklin observerede vi ikke signifikante ændringer i termogrammer for alle testede koncentrationer før sen eksponentiel fase, der startede efter 8 timer (se figur 2A). Ikke desto mindre observeres der større ændringer i stationær fasevarmeemission, hvor den anden varmestrøm sænkes betydeligt for A. baumannii behandlet med 5 μM og 10 μM tetracyclin. Lavere koncentrationer havde også en effekt, som dog var mindre udtalt. Denne effekt medfører også en tidsforlængelse som vist i figur 2C. De kumulative frigivne varmekurver (Figur 2B) viser, at ikke-behandlede og behandlede celler ikke udviser signifikante forskelle i den samlede kurveform, men ved tendens falder kurvernes hældning ved højere koncentrationer af tetracyklin. Dette giver sig også udslag i kvantificerede stofskifter, der vises i figur 2D, hvor der observeres en koncentrationsafhængig effekt (dvs. fald i stofskiftet ved stigende antibiotikakoncentrationer). Disse resultater understøtter det faktum, at tetracyclin har en bakterostatisk effekt.
Figur 2A: Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2B: Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2C: Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2D: Tetracycyklins effekt på A. baumannii DSM-30008 vækst og stofskifte. a)Termogrammer vist som varmestrøm (μW) vs. tid (h) for vildtype (WT) A. baumannii DSM-30008, ikke-behandlet og udsat for tetracyklin. (B) Kumulativ varme (mJ) vs. tid (h). (C) Tid til at toppe (h) med fejllinjer (standardafvigelse). d)Stofskifte (μW) med fejlstænger (standardafvigelse). Klik her for at se en større version af dette tal.
Endnu mere udtalte virkninger kan observeres ved behandling af A. baumannii med proteinsyntesehæmmeren chloramphenicol, der er rettet mod 50S ribosomal underenhed. Eksponering for stigende koncentrationer af chloramphenicol fører til forlængelse af lagfasen og signifikante ændringer af den metaboliske aktivitet i den stationære fase (figur 3A og figur 3B). Der observeres ingen ændring i stofskiftet for den laveste testede koncentration, og den højeste valgte testkoncentration (50 μM) forhindrer, at prøven frigives mest energi. Ser man på de mellemliggende testkoncentrationer (5 μM og 10 μM), øges den tid, der er på toppen, betydeligt med ca. 8-9 timer (Figur 3C). Samtidig reduceres stofskiftet for behandlede celler betydeligt, og 50 μM er dødelig (Figur 3D). Samlet set er de ændringer, der observeres i koncentrationer op til 10 μM chloramphenicol, i overensstemmelse med en bakterteriatisk effekt af denne antibiotikaklasse.
Figur 3A: Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3B: Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3C: Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3D: Chloramphenicols effekt på A. baumannii DSM-30008 vækst og stofskifte. a)Termogrammer vist som varmestrøm (μW) vs. tid (h) for vildtype (WT) A. baumannii DSM-30008, ikke-behandlet og udsat for chloramphenicol. (B) Kumulativ varme (mJ) vs. tid (h). (C) Tid til at toppe (h) med fejllinjer (standardafvigelse). d)Stofskifte (μW) med fejlstænger (standardafvigelse). Klik her for at se en større version af dette tal.
Rifampicinbehandling i det valgte koncentrationsområde har en dramatisk effekt på termogrammet A. baumannii DSM-30008 relateret til den forsinkede fases varighed og virkninger på væksten indtil den sene stationære fase (Figur 4A). En betydelig reduktion af varmeemissionen kan ses i figur 4B, der går sammen med et fald i metabolisk aktivitet. Figur 4C og Figur 4D illustrerer påvirkningen af forlængelsen af lagfasen og ændringer af den metaboliske aktivitet i den stationære fase. Figur 4C viser en klar stigning i tid til at toppe for alle anvendte koncentrationer. Figur 4D illustrerer faldet i stofskiftet forårsaget af faldet i hældningen for alle koncentrationer, der normalt tilskrives en bakteriedræbende virkning. På grund af antibiotisk-induceret drab på bakterieceller, den metaboliske aktivitet forventes at være lavere på grund af et mindre antal aktive bakterier til stede. De indsamlede data er i overensstemmelse med det faktum, at rifampicin kan virke baktericid og bakteriostatisk, og de data, der præsenteres her, understøtter hovedsagelig baktericidvirkninger af de valgte koncentrationer.
Figur 4A: Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4B: Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4C: Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4D: Effekt af rifampicin på A. baumannii DSM-30008 vækst og stofskifte. a)Termogrammer vist som varmestrøm (μW) vs. tid (h) for vildtype (WT) A. baumannii DSM-30008, ikke-behandlet og udsat for rifampicin. (B) Kumulativ varme (mJ) vs. tid (h). (C) Tid til at toppe (h) med fejllinjer (standardafvigelse). d)Stofskifte (μW) med fejlstænger (standardafvigelse). Klik her for at se en større version af dette tal.
Den laveste valgte testkoncentration af naturproduktet antibiotika (0,25 μM) har ingen eller kun marginale virkninger på termogrammet af A. baumannii DSM-30008. Andre testede koncentrationer har dog en vis effekt på fasevarigheden og påvirker væksten indtil den sene stationære fase (Figur 5A). Den mest indlysende effekt er den betydelige reduktion af varmeemissionen i den stationære fase. Data, der vises i figur 5B, viser tydeligt, at frigivet energi er faldet betydeligt for alle effektive koncentrationer, og hældningen er også faldet. Disse virkninger giver sig udslag i et fald i tid til top (figur 5C) og endnu vigtigere, en betydelig og klart dosis-afhængige fald i stofskiftet er observeret (Figur 5D). Undersøgelsen af det nye myxobakterielle naturprodukt afslørede en kombineret bakterostatisk og bakterik effekt.
Figur 5A: Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5B: Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5C: Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5D: Effekten af et nyt antibakterielt naturprodukt på A. baumannii DSM-30008 vækst og stofskifte. a) Termogrammer vist som varmestrøm (μW) vs. tid (h) for vildtype (WT) A. baumannii DSM-30008, ikke-behandlet og eksponeret for naturproduktet. (B) Kumulativ varme (mJ) vs. tid (h). (C) Tid til at toppe (h) med fejllinjer (standardafvigelse). d)Stofskifte (μW) med fejlstænger (standardafvigelse). Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: Valg af et nyt eksperiment i softwaregrænsefladen. I en rød firkant er trinnet til at vælge et nyt eksperiment afbildet. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 2: Navngivning af et nyt eksperiment i softwaregrænsefladen. I en rød firkant er trinnet for at navngive og bekræfte det nye eksperiment afbildet. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 3: Start af et nyt eksperiment i softwaregrænsefladen. I en rød firkant er trinnet til at starte et nyt eksperiment afbildet. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 4: Godt valg og reaktion start i software interface. Alle reaktionsbæde er valgt (brønde farvet i dyb blå farve, knap Vælg alle afbildet i en rød firkant), og reaktionsstart vælges (afbildet i en rød firkant). Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 5: Korrekt lastning af kopholder. Reference brønde er valgt (dyb blå farve, rød firkant) og termogrammer vises i et popup-vindue. Når belastningen udføres korrekt, observerer vi et kraftigt fald i det observerede varmeemissionssignal, der skal nå en plateaufase og forblive i denne fase i ca. 2-3 min. Når dette observeres, er læsningen af kopholderen korrekt. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 6: Eksperimentets afslutning. Med rødt er stopknappen i eksperimentet afbildet. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 7: Bekræftelse af forsøgets afslutning. Med rødt vises knappen Ja for at bekræfte afslutningen på det kørende eksperiment. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 8: Lagring af eksperimentfilen. Der vises et pop op-vindue med indstillinger for lagringsfil, og med rødt er knappen Gem afbildet. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 9: Softwaregrænseflade. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 10: Adgang til gemte eksperimenter. I rødt er knappen Åbn eksperiment for at få adgang til gemte eksperimenter afbildet. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 11: Åbning af udvalgte eksperimentfil. I rødt er knappen Åbn afbildet. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 12: Standardbrowservisning. Alle eksperimentelle brønd og tilsvarende termogrammer er synlige. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 13: Valg af brønde til analyse. I rødt er knappen Markér alt afbildet. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 14: Definition af basislinjen. Med rødt er knappen Definer grundlinje afbildet. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 15: Valg af basissignalet. Mindst 30 minutters signal i lagfasen er valgt (rød boks). Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 16: Lagring af ændringer i forsøgsfilen. I rødt er knappen Gem afbildet. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 17: Webbaseret kalorimetrianalyseapplikation. Online software interface og fil upload vej er vist. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 18: Upload af udvalgte eksperimentelle fil. I rødt er knappen Åbn afbildet. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 19: Analyse af termogrammer. Metaboliske parametre beregnet for hver eksperimentel brønd er afbildet med rødt. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 20: Montering af forsøgsdata til teoretiske vækstmodeller. Varmeflowdata er monteret enten på en Gompertz eller en Richards vækstmodel. Klik her for at downloade dette tal.
Supplerende figur 21: Eksport af målingerne. I rødt er knapperne Download Measures og Gem afbildet. Klik her for at downloade dette tal.
Discussion
Isotermisk mikrocalortri måler energi, der udsendes fra en prøve over tid, og denne energiudsætning er et resultat af alle biologiske, fysiske og (bio)kemiske processer. Den målte varmestrøm kan udnyttes til at evaluere eller bestemme antibakterielle virkninger af stoffer, da det muliggør kontinuerlig real-time overvågning af metabolisk aktivitet.
For at opnå pålidelige analysedata skal korrekte startkolonidannende enheder (CFU) bestemmes individuelt for hver anvendte art eller stamme. Hvis CFU-optællingen er for lav, fører det til en langvarig forsinkelsesfase, da det tager længere tid for systemet at nå en kritisk mængde biomasse, der producerer nok varme til at blive opdaget. I tilfælde af CFU tælle er for høj lag fase vil være meget kort, og mængden af varme produceret kan forårsage varmeoverførsel til tilstødende sensor celler (reference og eksperimentelle brønde) og forårsage forvrængninger af termogrammer. Et stort antal CFU vil også føre til en hurtigere iltsvind og skifte til anaerobe forhold. Det skal også tages i betragtning, at det i løbet af eksperimentets første 30 minutter, når systemet er ligevægt, ikke er muligt at indsamle data, og at den faktiske registrering af virkningerne er forsinket. Desuden fører ukorrekt CFU-bestemmelse til falsk MIC-bestemmelse, som i sidste ende påvirker eksperimentet og de observerede ændringer25. Et andet kritisk punkt er den korrekte bestemmelse af basislinjen. Normalt vælges basissignalet i lagfasen, når varmeflowsignalet er nul, og ideelt set er tidsintervallet for baselinedefinition >30 min. Dette er dog ikke altid muligt, da den tid, bakterierne har brug for for at nå varmesignaldetekteringsgrænsen, varierer mellem stammer og arter. Nogle arter eller stammer kræver mere end 30 minutter at nå varmesignaldetekteringsgrænsen, mens andre stammer eller arter når den inden for de første 30 minutter. I så fald er det muligt at vælge grundsignalet i slutningen af forsøget, når alle varmesignalerne er faldet tilbage til nul og forbliver stabile. Alternativt kan baselines fra andre forsøg med samme bakteriestamme anvendes, hvilket dog ikke anbefales.
Systemet giver mulighed for en vis fleksibilitet med hensyn til design og optimering af eksperimenter og fejlfinding. De anvendte mængder er inden for intervallet 100-300 μL ved brug af plastindsatser og 100-600 μL ved brug af titaniumkopper uden plastindsatser. Producentens anbefalede arbejdsvolumen er 120 μL. Brugen af forskellige volumener i forbindelse med oprettelsen af en ny forsøgsserie og samtidig med at der er fundet optimale målbetingelser, har hovedsagelig indvirkning på to parametre. Ved at bruge lavere mængder, mængden af nødvendige testforbindelse kan reduceres, hvilket er særligt vigtigt for forbindelser, som kun er tilgængelige i små mængder. Desuden påvirker den anvendte volumen direkte ilttilgængelighed under målingen med lavere volumener, der øger mængden af tilgængelig ilt, der kræves til bakterievækst. Iltsvind er en af de vigtigste faktorer, der bidrager til den størst mulige varighed af forsøget. Vigtigere er det muligt at bruge faste medier, ikke kun flydende medier. Dette er især vigtigt for langsomt voksende mikroorganismer, da vækst på grænsefladen mellem fast- og gasfasen giver bedre adgang til ilt9.
IMC er et nyttigt analytisk værktøj til at opdage ukendte processer med applikationer inden for fysik, kemi og biologi. Metoden måler varmeudvekslingen inden for et lukket system, og analyse af den registrerede varmeudveksling giver yderligere oplysninger, som ikke altid kan opnås ved hjælp af standardmetoder. I mikrobiologi og antibiotika forskning, en af de største fordele ved IMC er dens evne til at skelne mellem levende, døde og vedvarende eller sovende celler, hvilket ikke er muligt ved hjælp af standard turbiditet metoder11. Desuden er IMC meget følsom, og det kan detektere varmeemissioner fra så få som 104-105 celler9. En anden fordel er, at den eksperimentelle opsætning er hurtig og nem, og det giver mulighed for kontinuerlig, real-time tracking med minimal til ingen brugerinterferens. Desuden er IMC ikke-destruktiv, hvilket muliggør yderligere analyse af prøver. Dataanalyse giver mulighed for afkobling af biomassedannelse indtil slutningen af eksponentiel eller tidlig stationær fase og metabolisk aktivitet i stationær fase.
Ud over de nye og spændende ansøgning funktioner, der er nævnt ovenfor, er der også ulemper ved denne metode. Den største begrænsning er, at IMC-instrumenter måler den samlede varme, der produceres og frigives i et specifikt system, som også omfatter ikke-specifikke signaler. Dette understreger vigtigheden af eksperimentel planlægning med passende styringer for at kunne vurdere de ændringer i varmesignalet , der måles ved registrering af varmestrømmen9,20.
I vores hænder er IMC et vigtigt redskab til at studere antibakterielle virkninger af nye naturlige produkter og til at bestemme effektive koncentrationsserier. Bortset fra at differentiere bakterostatiske og bakteriid virkninger, det kunne anvendes i fremtiden som en del af mål identifikation undersøgelser og MoA bestemmelse. Dette kan gøres ved at sammenligne termogrammer af forskellige antibiotikaklasser med termogrammer af nye aktive forbindelser som vist her. Det skal dog stadig undersøges, om visse kvantificerbare parametre, der kan udtrækkes fra de målte data, er tilstrækkelige til sådanne sammenligninger, eller om det vil være nødvendigt at arbejde på algoritmer, der giver fingeraftryk baseret på fuld termogram. En anden mulig anvendelse inden for antibiotisk forskning er sammenligningen af wildtype til resistente kloner, kombineret med hele genom sekventering, som kan hjælpe med at belyse tilstanden-of-resistens (MoR) af nye antibakterielle lægemidler. På grund af metodens statiske karakter kan undersøgelse af nye agensers effektivitet på enten biofilmdannelse eller på allerede etablerede biofilm føre til en bedre forståelse af den biologiske proces og virkningen af udvalgte agenser på mikrober i forskellige stadier af hvile. IMC registrerer den samlede energi, der frigives i form af varme, hvilket gør det til en egnet metode til også at undersøge subhæmmende virkninger af aktive stoffer, der kan kobles til transskriptionomics. Denne metode kan også anvendes i kliniske miljøer til påvisning af kontaminering af prøver eller til bestemmelse af antibiogrammer, der hjælper med hurtigt at træffe beslutning om endelig behandling af patienterne11.
Disclosures
Projektet blev udført i samarbejde med Symcel, udvikler af calScreener-teknologien. Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke symcels team for frugtbare diskussioner, og vi vil gerne anerkende den store støtte fra Ganna Oliynyk og Wilhelm Paulander. Vi vil også gerne takke Daniel Kohnhäuser for at levere det naturlige produkt og Stefanie Schmidt for dygtig teknisk support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acinetobacter baumannii | DSMZ | DSM-30008 | reference strain used in this study |
| calPlate | Symcel | 1220093 | 48-well plate for titanium cups to be inserted |
| calScreener | Symcel | 1200001 | isothermal microcalorimetry instrument |
| calView software | Symcel | collection and analysis software | |
| calWell | Symcel | 1901004 | micro-bio grade (non-active) 48-well plate with plastic inserts which are inserted into the titanium cups |
| CASO agar | Carl Roth | X937.1 | isolation and cultivation of microorganisms |
| Chloroamphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | antibiotic |
| Ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | antibiotic |
| Cuvettes | Brand | 759015 | 1.5 mL cuvettes |
| Disposable inoculation loops | Sarsted | 86.1562.050 | 10 µL inoculation loops |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Thermo Fisher Scientific | 85190 | |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL eppendorf safe-lock tubes |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | 10428671 | |
| Falcon Tubes | Sarsted | 62.554.502 | 15 mL falcon tubes |
| Hydrochloride (HCL) | Thermo Fisher Scientific | 10316380 | |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific | A412-500 | |
| Mueller Hinton Broth | Sigma-Aldrich | 70192 | liquid medium for antibiotic susceptibility studies |
| Mueller Hinton Broth II cation adjusted media | Sigma-Aldrich | 90922 | Mueller Hinton Broth cation-adjusted to 1.25 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2 |
| Petri dishes | LABSOLUTE | 7696404 | |
| Pipette 100 - 1000 µL | Brand | 705880 | |
| Pipette 2 - 20 µL | Brand | 705872 | |
| Pipette 20 - 200 µL | Brand | 705878 | |
| Pipette tips 100 - 1000 L | Brand | 732032 | |
| Pipette tips 2 - 200 µL | Brand | 732028 | |
| Polymyxin B sulfate | Sigma-Aldrich | P0972 | antibiotic |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
| Serological pipette | Thermo Fisher Scientific | 170356N | 10 mL Nunc serological pipette |
| Spectrophotometer | Eppendorf AG | 6135 000.017 | |
| Sterile filters | Minisart | 16534----------K | 0.2 µm pore size sterile filters |
| Syringe 50 mL | NORM-JECT | 22778 | |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | 87128 | antibiotic |
| Titanium cups | Symcel | 1220089 | inserted in 48-well titanium calPlate |
| Titanium lids | Symcel | 1220091 | screwed and tightend to the titanium cups |
| Trimethroprim | Sigma-Aldrich | T7883 | antibiotic |
| Tweezers | Symcel | 1900602 |
References
- World Health Organization (WHO). Antibiotic resistance. World Health Organization (WHO). , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antibiotic-resistance (2018).
- Herrmann, J., Abou Fayad, A., Müller, R. Natural products from myxobacteria: novel metabolites and bioactivities. Natural Product Reports. 34 (2), 135-160 (2017).
- Cassar, S., et al. Use of Zebrafish in Drug Discovery Toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).
- Bhusnure, O. G., et al. Drug Target Screening and its Validation by Zebrafish as a Novel Tool. Pharmaceutica Analytica Acta. 6 (10), 426 (2015).
- Kraus, J., Tobin, G., Development, Discovery, Deveopment, and Regulation of Natural Products. Using Old Solutions to New Problems - Natural Drug Discovery in the 21st Century. Kulka, M. , InTech. Rijeka, HR. 4-36 (2013).
- Tabassum, N., Tai, H., Jung, D., Williams, D. R. Fishing for Nature's Hits: Establishment of the Zebrafish as a Model for Screening Antidiabetic Natural Products. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015 (1), 287847 (2015).
- Antimicrobial Development. Symcel. , Available from: https://symcel.com/applications/microbiology/antimicrobials-development (2019).
- Robador, A., LaRowe, D. E., Finkel, S. E., Amend, J. P., Nealson, K. H. Changes in Microbial Energy Metabolism Measured by Nanocalorimetry during Growth Phase Transitions. Frontiers in Microbiology. 2018 (9), 109 (2018).
- Braissant, O., Wirz, D., Göpfert, B., Daniels, A. U. Use of isothermal microcalorimetry to monitor microbial activities. FEMS Microbiology Letter. 303 (1), 1-8 (2010).
- Braissant, O., et al. Isothermal microcalorimetry accurately detects bacteria, tumorous microtissues, and parasitic worms in a label-free well-plate assay. Biotechnology Journal. 10 (3), 460-468 (2015).
- Butini, M. E., Abbandonato, G., Di Rienzo, C., Trampuz, J., Di Luca, M. Isothermal microcalorimetry detects the presence of persister cells in a Staphylococcus aureus biofilm after vancomycin treatment. Frontiers in Microbiology. 25 (10), 332 (2019).
- Tellapragda, C., et al. Isothermal microcalorimetry minimal inhibitory concentration testing in extensively drug resistant Gram-negative bacilli - A multicenter study. Clinical Microbiology and Infection. , (2020).
- Abdillahi, S., et al. Collagen VI Contains Multiple Host Defense Peptides with Potent In Vivo Activity. The Journal of Immunology. 201 (3), 1007-1020 (2018).
- Astasov-Frauenhoffer, M., et al. Exopolysaccharides regulate calcium flow in cariogenic biofilms. PLoS ONE. 12 (10), 1-14 (2017).
- Gros, S., et al. Personalized Treatment Response Assessment for Rare Childhood Tumors Using Microcalorimetry-Exemplified by Use of Carbonic Anhydrase IX and Aquaporin 1 Inhibitors. International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 4984 (2019).
- Kriszt, R., et al. Optical visualisation of thermogenesis in stimulated single-cell brown adipocytes. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
- Wadsö, I., et al. A well-plate format isothermal multi-channel microcalorimeter for monitoring the activity of living cells and tissues. Thermochimica Acta. 652 (1), 141-149 (2017).
- von Ah, U., Wirz, D., Daniels, A. U. Isothermal micro calorimetry - a new method for MIC determinations: results for 12 antibiotics and reference strains of E. coli and S. aureus. BMC Microbiology. 9 (106), (2009).
- Howell, M., Wirz, D., Daniels, A. U., Braissant, O. Application of a Microcalorimetric Method for Determining Drug Susceptibility in Mycobacterium Species. Journal of Clinical Microbiology. 50 (1), (2012).
- Wadsö, I. Isothermal Microcalorimetry: Current problems and prospects. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 64 (2001), 75-84 (2001).
- LeBel, M. Ciprofloxacin: chemistry, mechanism of action, resistance, antimicrobial spectrum, pharmacokinetics, clinical trials, and adverse reactions. Pharmacotherapy. 8 (1), 3-33 (1988).
- Chopra, I., Roberts, M. Tetracycline antibiotics: mode of action, applications, molecular biology, and epidemiology of bacterial resistance. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 65 (2), 232-260 (2001).
- Allison, J. L., et al. Mode of action of chloramphenicol. VII. Growth and multiplication of Escherichia coli in the presence of chloramphenicol. Journal of Bacteriology. 83 (3), 609-615 (1962).
- Wehrli, W. Rifampin: mechanisms of action and resistance. Reviews of Infectious Diseases. 5, Suppl 3 407-411 (1983).
- Hancock, R. E. W., et al. Agar and broth methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nature Protocols. 3 (2), 163-175 (2008).
