Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

मेटाबोलिक प्रोफाइलिंग इसोथरमल माइक्रोकैलोरिमरी का उपयोग करके नए प्राकृतिक उत्पादों के बैक्टीरियिडल या बैक्टीरियोस्टैटिक प्रभावों का निर्धारण करने के लिए

Published: October 29, 2020 doi: 10.3791/61703
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2
1Helmholtz Institute for Pharmaceutical Research Saarland, Department of Microbial Natural Products, Helmholtz Centre for Infection Research and Department of Pharmacy, Saarland University, 2Partner Site Hannover-Braunschweig, German Centre for Infection Research (DZIF)
* These authors contributed equally

Summary

एक उपन्यास एंटीबायोटिक की मोड-ऑफ-एक्शन की स्पष्टता दवा खोज प्रक्रिया में एक चुनौतीपूर्ण कार्य है। यहां वर्णित विधि का लक्ष्य एंटीबैक्टीरियल प्रोफाइलिंग में कैलस्क्रीनर का उपयोग करके आइसोथेरमल माइक्रोकैलोरिमरी का अनुप्रयोग है ताकि दवा-माइक्रोब इंटरैक्शन में अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्रदान की जा सके।

Abstract

बढ़ते रोगाणुरोधी प्रतिरोध के वैश्विक खतरे के कारण, उपन्यास एंटीबायोटिक दवाओं की तत्काल आवश्यकता है। हम इस तरह के नए यौगिकों के एक अभिनव स्रोत के रूप में Myxobacteria से प्राकृतिक उत्पादों की जांच । इस प्रक्रिया में एक अड़चन आम तौर पर उनके मोड-ऑफ-एक्शन की स्पष्टता है। हमने हाल ही में एक नियमित प्रोफाइलिंग पाइपलाइन के हिस्से के रूप में आइसोथेरमल माइक्रोकैलोरिमरी की स्थापना की है। यह तकनीक कुल बैक्टीरियल मेटाबोलिक प्रतिक्रिया पर एंटीबायोटिक एक्सपोजर के प्रभाव की जांच करने की अनुमति देती है, जिसमें बायोमास गठन से अलग होने वाली प्रक्रियाएं शामिल हैं। महत्वपूर्ण बात, माप के दौरान किसी भी उपयोगकर्ता के हस्तक्षेप के बिना बैक्टीरियोस्टैटिक और बैक्टीरियासाइड प्रभाव आसानी से अलग होते हैं। हालांकि, आइसोथर्मल माइक्रोकैलोरिमेट्री एक नया दृष्टिकोण है और इस विधि को विभिन्न जीवाणु प्रजातियों में लागू करने के लिए आमतौर पर उपयुक्त माप स्थितियों के पूर्व-मूल्यांकन की आवश्यकता होती है। कुछ बैक्टीरिया के कुछ संदर्भ थर्मोग्राम उपलब्ध हैं, जो परिणामों की व्याख्या को बहुत सुविधाजनक बनाते हैं। चूंकि संदर्भ डेटा का पूल तेजी से बढ़ रहा है, हम उम्मीद करते हैं कि कार्यप्रणाली का भविष्य में प्रभाव बढ़ रहा है और उम्मीद है कि यह एंटीबायोटिक वर्गों के भेदभाव को सक्षम करने के लिए गहराई से फिंगरप्रिंट विश्लेषण की अनुमति े ।

Introduction

इस विधि का उद्देश्य नए जीवाणुरोधी यौगिकों की मोड-ऑफ-एक्शन (एमओए) प्रोफाइलिंग में एक माध्यम थ्रूपुट परख के रूप में आइसोथेरमल माइक्रोकैलोरिमेरी (आईएमसी) को लागू करना है। यह विधि बैक्टीरियल प्रजातियों पर यौगिकों की गतिविधि के बारे में डेटा का पता चलता है और यौगिक की जीवाणु या जीवाणु प्रकृति के बारे में जानकारी प्रदान करता है।

उभरते रोगाणुरोधी प्रतिरोध (एएमआर) का उदय एक वैश्विक समस्या है और यह ज्ञात एंटीबायोटिक दवाओं के साथ सामान्य संक्रमणों के कम प्रभावी उपचार की ओर जाता है1। हालांकि, नए यौगिकों और दवाओं के लिए खोज है कि जगह या ज्ञात एंटीबायोटिक दवाओं के साथ संयोजन में काम कर सकते है चल रहे है और यह विविध दृष्टिकोण पर बनाया गया है । प्राकृतिक उत्पाद वर्तमान दवा खोज अभियानों में और विशेष रूप से एंटी-इन्फेक्टिव दवा खोज2में एक प्रमुख खिलाड़ी हैं। हालांकि, एंटीबायोटिक विकास के लिए नई लीड संरचनाओं की पहचान करना एक लंबी और आर्थिक रूप से मांग करने वाली प्रक्रियाहै 3। इस प्रकार, खोज के शुरुआती कदम पहले से ही प्रारंभिक चरण में सबसे होनहार मचान पर फ़िल्टर करने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण हैं। प्राकृतिक उत्पाद दवा की खोज में प्रारंभिक कदम एक यौगिक की संरचना प्राप्त करने, MoA और लक्ष्य पहचान के साथ विट्रो में गतिविधि का निर्धारण शामिल हैं । आगे के विकास के लिए पात्र होने वाले अधिकांश सफल यौगिकों को गतिविधि के अनुकूल स्पेक्ट्रम (यानी, जीवाणुरोधी के मामले में व्यापक स्पेक्ट्रम गतिविधि) और एक उपन्यास एमओए प्रदर्शित करना चाहिए जिसके द्वारा पहले से मौजूद एएमआर को दूर किया जा सकता है। होनहार मचान तो आम तौर पर माध्यमिक परख में जांच कर रहे हैं, जो वीवो जैव उपलब्धता, विषाक्तता, और चयापचय4में शामिल हैं । वित्तीय चिंताओं के अलावा, प्राकृतिक उत्पाद दवा की खोज लागत और यौगिक अलगाव और शुद्धिकरण से संबंधित तकनीकी कठिनाइयों से संबंधित आगे की चुनौतियों कासामनाकर रही है, जो बदले में, खोज प्रक्रिया5, 6,के प्रारंभिक दौर में बहु-मिलीग्राम या यहां तक कि ग्राम राशि प्राप्त करना मुश्किल बना सकती है। इसलिए, प्राकृतिक उत्पाद अनुसंधान में यह अत्यंत महत्वपूर्ण है कि वे एक उपन्यास प्राकृतिक उत्पाद को पूर्व-नैदानिक विकास के लिए सुलभ बनाने के लिए आगे के निवेश के बारे में एक अच्छी तरह से सूचित निर्णय लेने के लिए न्यूनतम यौगिक मात्रा के साथ अत्याधुनिक प्राथमिक स्क्रीनिंग करने में सक्षम हों। जीवाणुरोधी प्रोफाइलिंग के लिए आईएमसी के उपयोग के साथ, मानक विधियों की तुलना में आवश्यक यौगिक की मात्रा काफी कम हो जाती है। यह तकनीक माइक्रोबियल समुदाय7के साथ नई दवाओं की बातचीत के बारे में अधिक गहराई से जानकारी भी प्रदान करती है ।

आईएमसी एक जैविक प्रणाली में सभी जैविक, भौतिक और जैव रासायनिक प्रक्रियाओं और प्रतिक्रियाओं के परिणामस्वरूप कुल ऊर्जा को मापने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित विधि है। जीवाणु ऊर्जा रिलीज कुल मेटाबोलिक प्रतिक्रियाओं के आनुपातिक है8. एक बंद प्रणाली के भीतर, जैसे प्रयुक्त माइक्रोकैलोरीमीटर, बैक्टीरिया,11,9,10, 11, 12के मेटाबोलिक काइनेटिक्स का अध्ययन करने के लिए गर्मी के स्तर को माइक्रोवाट रेंज में मापा जा सकता है।,12 बैक्टीरिया द्वारा जारी की जाने वाली गर्मी (ऊर्जा) सेलुलर कार्यों से जुड़ी होती है जो उनके चयापचय को रेखांकित करती है और यह जरूरी नहीं कि सेलुलर बायोमास के आनुपातिक हो।

प्रारंभ में, माइक्रोबायोलॉजिकल परखों के लिए आइसोथर्मल कैलोरीमेट्री की प्रयोज्यता कम थ्रूपुट और उच्च परीक्षण मात्रा के कारण सीमित रही है। हालांकि, इस्तेमाल किया गया माइक्रोकैलोरीमीटर अद्वितीय है क्योंकि यह इसोथरमल कैलोरीमेट्री के फायदों को बढ़ी हुई थ्रूपुट और कम यौगिक आवश्यकताओं के साथ जोड़ता है, जो इसे दवा खोज अनुप्रयोगों10के लिए एक मूल्यवान उपकरण बनाता है। इसके अलावा, यह उपकरण बैक्टीरियल ग्रोथ काइनेटिक्स को मापने के लिए वैकल्पिक तरीकों पर आगे लाभ प्रदान करता है, जैसे मानक टर्बिडिटी विधि, जो 600 एनएम (ओडी एंड एलटी;600)पर ऑप्टिकल घनत्व के माप पर आधारित है। ओडी600 को मापना इस धारणा पर आधारित है कि बढ़ी हुई ऑप्टिकल घनत्व माइक्रोबियल विकास के बराबर है, जिससे गैर-व्यवहार्य कोशिकाओं की उपस्थिति की उपेक्षा होती है। इस विधि की आलोचना भी की गई है क्योंकि इसमें छोटे कॉलोनी वेरिएंट और11को सटील कोशिकाएं शामिल नहीं हैं । इसके विपरीत, आईएमसी किसी भी प्रकार की व्यवहार्य कोशिकाओं के वास्तविक समय अवलोकन की अनुमति देता है। यदि कोशिकाएं निष्क्रिय हैं, तो वे अभी भी मेटाबोलिक गतिविधि प्रदर्शित करती हैं और इस प्रकार उन्हें आईएमसी द्वारा पता लगाया जा सकता है, जबकि ऐसी घटनाएं मानक टर्बिडिटी विधि11द्वारा पता लगाने योग्य नहीं हैं। आईएमसी के अन्य फायदों में एक छोटा एंटीमाइक्रोबियल संवेदनशीलता परीक्षण समय शामिल है, जो नमूना7को नष्ट किए बिना एक जटिल समुदाय और मानक विश्लेषण विधियों में दवा बातचीत को मापता है।

आईएमसी तकनीक को माइक्रोबायोलॉजी से लेकर थर्मोजेनेसिस और कैंसर जीव विज्ञान,,,13, 14, 15,16,,17 से लेकर कई अध्ययनों में लागू किया गया है ।151617 माइक्रोबियल अनुप्रयोगों में विभिन्न जीवाणु उपभेदों के खिलाफ यौगिकों की न्यूनतम निरोधात्मक सांद्रता (एमआईसी) का निर्धारण शामिल है। कई अध्ययन किए गए हैं और यह निष्कर्ष निकाला गया है कि अधिकांश जीवाणु प्रजातियों के लिए आइसोथेरमल कैलोरीमेट्री से एमआईसी डेटा तेजी से प्राप्त किया जा सकता,है और परिणाम एमआईसी निर्धारण12, 18,,19के लिए अन्य (मानक) विधियों की तुलना में समान हैं।19 आईएमसी के आगे के अनुप्रयोगों में दवाओं की बातचीत और बायोफिल्म्स11जैसे जटिल जीवाणु समुदायों के साथ दवा उपचार के संयोजन को देखना शामिल है । MoA प्रोफाइलिंग पर ध्यान केंद्रित करने वाले एक अध्ययन से पता चला है कि माइक्रोकैलोरीमीटर पहली और दूसरी पीढ़ी के सिफेलोस्पोरिन्स में अंतर का पता लगा सकता है, जबकि एक ही एमओए के साथ विभिन्न एंटीबायोटिक्स एक दूसरे की तुलना में एक समान गर्मी प्रवाह वक्र प्रदर्शित करते हैं18।

यहां, हम नए आइसोथेरमल माइक्रोकैलोरिम्री उपकरण का उपयोग करके नए प्राकृतिक उत्पादों की एमओए प्रोफाइलिंग के लिए आईएमसी के उपयोग का वर्णन करते हैं। विधि का उपयोग प्रभावी एंटीबायोटिक सांद्रता निर्धारित करने और बैक्टीरिया या बैक्टीरियोस्टैटिक तंत्र के संदर्भ में एंटीबायोटिक दवाओं की विशेषताओं का वर्णन करने के लिए किया जाता है। विधि मोटे तौर पर यौगिकों की MoA प्रोफाइलिंग में लागू किया जा सकता है और यह जगह या कम से कम मानक माइक्रोबायोलॉजिकल तरीकों के पूरक हो सकता है । भविष्य के अध्ययनों में गहराई से फिंगरप्रिंट विश्लेषण शामिल होंगे जो लक्ष्य तंत्र के आधार पर एंटीबायोटिक वर्गों के भेदभाव को सक्षम करेंगे ।

Protocol

नोट: उपकरण तापमान प्रणाली की स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए कम से कम एक दिन पहले इस्तेमाल जीवाणु के अनुसार सेट किया जाना चाहिए। यहां 30 डिग्री सेल्सियस पर असीनोबैक्टर बौमनी डीएसएम 30008 सैंपल चलाए जाते हैं।

1. संस्कृति की तैयारी

  1. जांच के तहत तनाव बाहर लकीर (यहां: ए baumannii)एक CASO आगर प्लेट पर और 30 डिग्री सेल्सियस पर एक स्थिर इनक्यूबेटर में रात भर इनक्यूबेट ।
  2. एमएचबी (म्यूलर-हिंटन शोरबा) में एक कॉलोनी को इनोक्यूलेट करके एक रात की संस्कृति तैयार करें और 30 डिग्री सेल्सियस पर 180 आरपीएम पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर पर इनक्यूबेट करें।

2. नमूना तैयार करना

  1. चयनित दवा या यौगिक की एकाग्रता रेंज तैयार करने के लिए 1.5 एमएल ट्यूब का उपयोग करें (उदाहरण के लिए, डीएमएसओ में 100x स्टॉक समाधानों के 1.5 माइक्रोन जोड़कर; चरण 2.3 देखें)।
  2. एमएचबी मीडियम में रातोंरात संस्कृति को पतला करें ।
    1. 600 एनएम की तरंगदैर्ध्य पर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके रातोंरात संस्कृति के ऑप्टिकल घनत्व को मापें।
    2. ताजा एमएचबी माध्यम में 5 x 105 कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीएलयू) /एमएल प्राप्त करने के लिए संस्कृति को पतला करें। एक के एक ओडी६०० लगभग 5 x 108 सीएफयू/एमएल (जैसे, एस्चेरिचिया कोलाई, स्टेफिलोकोकस ऑरियस, ए baumannii)के बराबर होती है ।
      नोट: लागू खेती की स्थिति के तहत प्रत्येक व्यक्तिगत जीवाणु तनाव के लिए रूपांतरण कारक OD600 को CFU/एमएल को कैलिब्रेट करना महत्वपूर्ण है।
  3. चरण 2.1 में तैयार टेस्ट ट्यूबों में कोशिकाओं के 150 μL जोड़ें, परीक्षण दवा या यौगिक की सही अंतिम एकाग्रता सुनिश्चित करने और अंतिम कोशिका एकाग्रता को सही सुनिश्चित करें।
  4. भंवर से यौगिक को कोशिकाओं के साथ मिलाएं।
    नोट: नमूना प्लेट (सामग्री की तालिकादेखें) में छह पंक्तियां हैं, जिनमें से प्रत्येक में आठ कुएं हैं, कुल 48-कुएं हैं; पंक्ति ए और पंक्ति एफ थर्मोडायनामिक संदर्भ हैं। इसलिए, उन कुओं में कोई नमूने लोड नहीं किए जा सकते हैं, इसी मीडिया को उन कुओं में लोड किया जाता है । पंक्तियों बी-ई में कुओं का उपयोग करते हुए प्रति रन ३२ परीक्षण नमूनों को मापा जा सकता है । व्यक्तिगत परीक्षण नमूने को डुप्लिकेट में न्यूनतम चलाया जाना चाहिए (यहां: सभी नमूनों को ट्रिपलीकेट के रूप में चलाया गया था)। विकास नियंत्रण को शामिल किया जाना चाहिए ।

3. तैयारी डालें

  1. प्लास्टिक आवेषण के लिए कदम 2.4 में तैयार मिश्रण से 120 μL स्थानांतरित करें।
    नोट: प्लास्टिक आवेषण के किनारों पर तरल को छिड़काव से रोकने के लिए चरण 3.1 में रिवर्स पिपटिंग का उपयोग करें, जिससे सही सिग्नल रीडआउट के साथ हस्तक्षेप हो सकता है।
  2. चिमटी के साथ धारकों (सामग्री की तालिकादेखें) में सभी टाइटेनियम शीशियों रखें।
  3. धीरे-धीरे धारक प्लेट में टाइटेनियम शीशियों में आवेषण स्थानांतरित करें।
  4. सभी टाइटेनियम शीशियों पर टाइटेनियम के ढक्कन को शिथिल रखें।

4. लोडिंग डालें

  1. नमूना स्टेशन पर टाइटेनियम कप के साथ धारक को स्थानांतरित करें और निर्धारित क्षेत्र पर रखें।
  2. सभी ढक्कन को कसने के लिए, 40 सीएनएम बल पर सेट टॉर्क रिंच का उपयोग करें।

5. नमूनों की रनिंग

  1. CalView सॉफ्टवेयर में, एक नया प्रयोग शुरू(पूरक चित्रा 1)।
  2. उपकरण से नमूना प्रविष्टि हाथ वापस लेना।
  3. कप धारक को "पुल" पर रखें, कॉलम 8 नमूना प्रविष्टि खोलने का सामना करना पड़ रहा है और धीरे से नामित "स्थिति 1" पर उपकरण में कप धारक धक्का । सिस्टम को स्थिर करने के लिए 10 मिनट इंतजार करें। प्रायोगिक कुओं को लेबल करें।
  4. जब तक कप धारक नामित "स्थिति 2" पर है नमूना प्रविष्टि हाथ पुश। सिस्टम को स्थिर करने के लिए 20 मिनट इंतजार करें।
  5. नमूना प्रविष्टि हाथ को "स्थिति 3" में पुश करें और नमूना प्रविष्टि हाथ को वापस लें जब तक कि यह "रनिंग पोजीशन" पर न हो। सॉफ्टवेयर में सभी कुओं को हाइलाइट करें और रिएक्शन स्टार्ट (पूरक चित्रा 4) काचयन करें।
  6. प्रयोग तब तक चलाएं जब तक कि गर्मी उत्सर्जन पढ़ता है शून्य पर वापस स्थिर हैं।
    नोट: सुनिश्चित करें कि सभी कुओं इन चरणों के भीतर समान व्यवहार करते हैं । पूरक चित्रा 5 दिखाता है कि यदि कुओं को सही ढंग से लोड किया जाता है तो क्या देखा जाना चाहिए। यदि गलत तरीके से लोड किया जाता है, तो चरण 5.2-5.4 दोहराएं।

6. कप धारक को हटा दें

  1. सॉफ्टवेयर में, स्टॉप (पूरक चित्रा 6) काचयन करें। इसके बाद सॉफ्टवेयर पूछेगा कि क्या "आप सुनिश्चित हैं", हां (पूरक चित्रा 7)का चयन करें और डेटा विश्लेषण के लिए ड्राइव या डेस्कटॉप पर प्रयोग कोसहेजें (पूरक चित्रा 8)।
  2. नमूना प्रविष्टि हाथ पूरी तरह से साधन में डालें और कप धारक को पुनः प्राप्त करने के लिए मैग्नेट संलग्न करें।
  3. ढक्कन को ढीला करें, आवेषण और शीशियों और ढक्कन को कांच धारकों में हटा दें और 180 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए रखें और इसके बाद शीशियों और ढक्कन को एक डेसीकेटर में रखकर ढक्कन और शीशियों को सूखा सुनिश्चित करने के लिए रखें।

7. आंकड़ों का विश्लेषण

  1. सॉफ्टवेयरखोलें (पूरक चित्रा 9),बाएं ऊपरी कोने में खुला प्रयोग का चयन करें(पूरक चित्रा 10)। पॉपअप विंडो में ब्याज और प्रेस ओपन (पूरक चित्रा 11)के प्रयोग का चयन करें । आवेदन डिफ़ॉल्ट वेल्स व्यू(पूरक चित्रा 12)में प्रयोग खोलेगा ।
  2. प्रेस सभी या Ctrl + A (पूरक चित्रा 13)का चयन करें ।
  3. प्रेस परिभाषित बेसलाइन,यह पैरामीटर प्रत्येक स्थिति(पूरक चित्र 14)में डेटा को सामान्य करता है। पॉपअप विंडो में अंतराल चरण में स्थित >30 मिनट की समयावधि का चयन करें (गर्मी का प्रवाह शून्य और दस माइक्रोनडब्ल्यू के बीच कम होना चाहिए; पूरक चित्रा 15)। बेस लाइन समय अवधि के चयन के बाद चुना बेसलाइन थर्मोग्राम में हरे रंग में दिखाई देगा। परिभाषित बेसलाइन सेक्शन विंडो बंद करें।
  4. प्रेस सेव या सीटीआरएल + एस और सॉफ्टवेयर(पूरक चित्रा 16)बंद करें।
  5. ओपन वेब-आधारित सिंसेल कैलोरिमेट्री विश्लेषण आवेदन (https://symcel.shinyapps.io/symcel_calorimetricgrowth/)।
  6. फाइल को कैलोरिमेट्री एनालिसिस एप्लीकेशन पर अपलोड करने के लिए, प्रेषक ब्राउज़ (पूरक चित्रा 17),प्रयोग का चयन करें और ओपन (पूरक चित्रा 18) दबाए जाएं। मेटाबॉलिक मापदंडों की गणना वेब एप्लिकेशन(पूरक चित्रा 19)में 32 नमूनों के लिए स्वचालित रूप से की जाएगी।
  7. आदेश में Gompertz और/या रिचर्ड के विकास मॉडल क्लिक करें विकास समारोहके लिए गर्मी प्रवाह डेटा फिट करने के लिए । विकास मॉडल फिट अनुभाग "संचयी" में प्रदर्शित किया जाएगा, यह भी अनुभाग "प्रवाह"(पूरक चित्रा 20)में कच्चे डेटा की तुलना में ।
  8. सभी गणना मापदंडों को डाउनलोड करने के लिए, डाउनलोड उपाय दबाएं। फ़ाइल स्थान का चयन करें और प्रेस सेव (पूरक चित्रा 21)। आगे की गणना के लिए फाइल को स्प्रेडशीट में निर्यात किया जाएगा ।

Representative Results

गर्मी के संकेत को रिकॉर्ड करने के लिए उपकरण के लिए गर्मी पैदा करने वाले बैक्टीरिया की पर्याप्त संख्या की आवश्यकता होती है। यदि गर्मी के प्रवाह का पता लगाने योग्य होने तक समय में देरी होती है तो इसका मतलब है कि बैक्टीरिया अभी तक पता लगाने की सीमा से ऊपर गर्मी संकेत का उत्पादन नहीं करते हैं। इसलिए बैक्टीरियल सैंपल से जारी हीट का पता लगाना बैक्टीरियल ग्रोथ सहित बैक्टीरियल एक्टिविटी बढ़ाने से सीधे तौर पर जुड़ा हुआ है । जीवाणु विकास और अन्य मेटाबोलिक गतिविधियों को एक जीवाणुरोधी दवा के अलावा दृढ़ता से प्रभावित होने के लिए जाना जाता है। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या जांच के तहत एक नया प्राकृतिक उत्पाद जीवाणु या जीवाणु प्रभाव या दोनों MoAs का संयोजन डालती है, हमने संदर्भ दवाओं का एक छोटा सा सेट चुना है और हमने थर्मोग्राम दर्ज किया है जिसके लिए हमने प्राकृतिक उत्पाद के साथ प्रयोगों से डेटा की तुलना की । चयनित एंटीबायोटिक दवाओं की शक्ति के आधार पर सांद्रता की एक श्रृंखला को माइक्रोब्रोथ कमजोर पड़ने के निर्धारित न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता (एमआईसी) को बंद करने के लिए चुना गया था।

सिप्रोफ्लोक्सेसिन बैक्टीरियल डीएनए जाइरेज और टोपोइसोमरैस चतुर्थ को लक्षित करता है और नतीजतन, यह एक जीवाणु एमओए प्रदर्शित करता है। हालांकि, सिप्रोफ्लोक्सेसिन द्वारा प्रेरित बैक्टीरियल किलिंग एकाग्रता पर निर्भर है और जब इसे अपर्याप्त सांद्रता पर किया जाता है तो इसका जीवाणु प्रभाव21भी हो सकता है। टेट्रासाइक्लिन और क्लोराम्फेनिकोल क्रमशः 30S और 50S उपइकाइक में राइबोसोम को लक्षित करते हैं, और वे प्रोटीन संश्लेषण22, 23,23के अवरोध के कारण बैक्टीरियोस्टैटिक कार्य करते हैं। रिफाम्पिकिन डीएनए-निर्भर आरएनए पॉलीमरेज को बाधित करके कार्य करता है औरइसमें 24उपयोग की गई खुराक के आधार पर बैक्टीरियासाइड और बैक्टीरियोस्टैटिक प्रभाव दोनों हो सकते हैं। प्राकृतिक उत्पाद है कि हम यहां जांच कर रहे है Myxobacteria से अलग था और यह ग्राम नकारात्मक और ग्राम सकारात्मक जीवाणु रोगजनकों के खिलाफ शक्तिशाली गतिविधि दिखाया । अपने MoA और आणविक लक्ष्य की जांच करते समय, हम यह निर्धारित करने में रुचि रखते थे कि क्या नया प्राकृतिक उत्पाद जीवाणु और/या जीवाणुगत प्रभाव डालती है और क्या इलाज Acinetobacter baumannii की गर्मी प्रोफाइल बैक्टीरिया है कि संदर्भ दवाओं के साथ इलाज किया गया से थर्मोग्राम के समान है ऊपर उल्लेख किया ।

धारावाहिक कमजोर पड़ने में सिप्रोफ्लोक्सेसिन को ए बाउमैनी डीएसएम-30008 को उजागर करके प्राप्त थर्मोग्राम चित्रा 1 एमें प्रदर्शित किए गए हैं। 0.005 माइक्रोन और 0.1 माइक्रोनएम के बीच सांद्रता का ए बाउमैनी के विकास और चयापचय पर न्यूनतम प्रभाव पड़ता है। हालांकि, 0.5 माइक्रोन माइक्रोप्रोफ्लोक्सेसिन के साथ कोशिकाओं का इलाज करने से अंतराल चरण अवधि में एक महत्वपूर्ण बदलाव होता है और अधिकतम गर्मी प्रवाह कम होता है। ये दोनों परिवर्तन एक साथ पीक करने के लिए समय को प्रभावितकरते हैं (चित्रा 1C),जो लगभग 6 घंटे की वृद्धि हुई है । चित्रा 1Bमें, संचयी जारी गर्मी समय के खिलाफ साजिश रची है । यहां, हम सांद्रता का प्रभाव देखते हैं, जो ढलान के झुकाव से परिलक्षित होता है। थर्मोग्राम के झुकाव का मात्राकरण हमें सिप्रोफ्लोक्सेसिन की उपस्थिति में ए बाउमैनी की अधिकतम मेटाबॉलिक दर देता है जैसा कि चित्र 1 डीमें प्रदर्शित किया गया है, जहां हम 0.5 माइक्रोन्ड सिप्रोफ्लोक्सेसिन के साथ इलाज की जाने वाली कोशिकाओं की मेटाबोलिक दर की सहवर्ती कमी का अवलोकन कर सकते हैं। कम सांद्रता के साथ इलाज कोशिकाओं की मेटाबोलिक दर में परिवर्तन कम हैं। इस प्रयोग को 0.1-1 माइक्रोन रेंज को कवर करने वाले मध्यवर्ती सांद्रता के अलावा और सुधार किया जा सकता है ताकि सांद्रता के बीच अधिक स्पष्ट क्रमिक परिवर्तन का निरीक्षण किया जा सके जिसका कोई प्रभाव नहीं पड़ता है और एकाग्रता जिसके परिणामस्वरूप अंतराल चरण और मेटाबोलिक दर में काफी देरी होती है। हालांकि, परिवर्तन के रुझान सिप्रोफ्लोक्सासिन के एक जीवाणु MoA का समर्थन करते हैं।

Figure 1A
चित्रा 1A: कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 1B
चित्रा 1B: कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 1C
चित्रा 1C: कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 1D
चित्रा 1D: ए बाउमैनी डीएसएम-30008 वृद्धि और चयापचय पर सिप्रोफ्लोक्सेसिन का प्रभाव। (A)थर्मोग्राम को हीट फ्लो (μW) बनाम समय (एच) फॉर वाइल्ड टाइप (डब्ल्यूटी) ए बाउमैनी डीएसएम-30008, नॉन-ट्रीट और सिप्रोफ्लोक्सेसिन के संपर्क में दिखाया गया है । (B)संचयी गर्मी (एमजे) बनाम समय (एच) । (ग)त्रुटि सलाखों (मानक विचलन) के साथ समय से पीक (एच) । (घ)मेटाबॉलिक रेट (μW) त्रुटि सलाखों (मानक विचलन) के साथ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

टेट्रासाइक्लिन के मामले में, हमने 8 घंटे के बाद शुरू होने वाले देर से घातीय चरण तक परीक्षण किए गए सभी सांद्रता के लिए थर्मोग्राम में महत्वपूर्ण परिवर्तनों का निरीक्षण नहीं किया (चित्रा 2Aदेखें)। फिर भी, स्थिर चरण गर्मी उत्सर्जन में बड़े परिवर्तन देखे जाते हैं, जहां गर्मी प्रवाह की दूसरी चोटी को 5μM और 10 माइक्रोन टेट्रासाइक्लिन के साथ इलाज किए गए ए बाउमैनी के लिए काफी कम किया जाता है। कम सांद्रता का प्रभाव भी था, जो हालांकि कम स्पष्ट था। यह प्रभाव भी समय में एक दीर्घीकरण के कारण पीक के रूप में चित्रा 2Cमें प्रदर्शित होता है । संचयी जारी गर्मी घटता(चित्रा 2B)से पता चलता है कि गैर-उपचारित और उपचारित कोशिकाएं समग्र वक्र आकार में महत्वपूर्ण अंतर प्रदर्शित नहीं करती हैं लेकिन प्रवृत्ति से, घटता की ढलान टेट्रासाइक्लिन की उच्च सांद्रता पर गिरावट आती है। यह चित्र 2 डीमें प्रदर्शित मात्रात्मक मेटाबोलिक दरों में भी अनुवाद करता है, जहां एकाग्रता पर निर्भर प्रभाव, (यानी, एंटीबायोटिक दवाओं की सांद्रता बढ़ाने पर मेटाबोलिक दर में कमी) देखा जाता है। ये निष्कर्ष इस तथ्य का समर्थन करते हैं कि टेट्रासाइक्लिन का बैक्टीरियोस्थिक प्रभाव पड़ता है।

Figure 2A
चित्रा 2A: कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2B
चित्रा 2B: कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2C
चित्रा 2C: कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2D
चित्रा 2डी: ए बाउमैनी डीएसएम-30008 विकास और चयापचय पर टेट्रासाइक्लिन का प्रभाव। (A)थर्मोग्राम को हीट फ्लो (μW) बनाम समय (एच) फॉर वाइल्ड टाइप (डब्ल्यूटी) ए बॉमनी डीएसएम-30008, नॉन-ट्रीट और टेट्रासाइक्लिन के संपर्क में दिखाया गया है । (B)संचयी गर्मी (एमजे) बनाम समय (एच) । (ग)त्रुटि सलाखों (मानक विचलन) के साथ समय से पीक (एच) । (घ)मेटाबॉलिक रेट (μW) त्रुटि सलाखों (मानक विचलन) के साथ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्रोटीन संश्लेषण अवरोधक क्लोराम्फेनिकोल के साथ ए बाउमैनी का इलाज करते समय और भी अधिक स्पष्ट प्रभाव देखे जा सकते हैं जो 50 के दशक के रिबोसोमल सबयूनिट को लक्षित करते हैं। क्लोरम्फेनिकोल की सांद्रता बढ़ाने के संपर्क में आने से अंतराल चरण का दीर्घीकरण होता है और स्थिर चरण(चित्रा 3 ए और चित्रा 3बी)में मेटाबोलिक गतिविधि के महत्वपूर्ण परिवर्तन होते हैं। मेटाबोलिक दर में कोई परिवर्तन सबसे कम परीक्षण एकाग्रता के लिए मनाया जाता है और सबसे अधिक परीक्षण एकाग्रता चुना (50 माइक्रोन) नमूने की सबसे अधिक ऊर्जा रिलीज को रोकता है। मध्यवर्ती परीक्षा सांद्रता (5 माइक्रोन और 10 माइक्रोन) को देखते हुए, पीक करने का समय लगभग 8-9 घंटे(चित्रा 3C)से काफी बढ़ जाता है। इसके साथ ही, इलाज कोशिकाओं की मेटाबॉलिक दर काफी कम हो जाती है, जिसमें 50 माइक्रोन घातक(चित्रा 3 डी) होताहै। कुल मिलाकर, 10 माइक्रोनम क्लोरम्फेनिकोल तक सांद्रता में देखे गए परिवर्तन इस एंटीबायोटिक वर्ग के जीवाणु प्रभाव के अनुरूप हैं।

Figure 3A
चित्रा 3A: कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3B
चित्रा 3B: कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3C
चित्रा 3C: कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3D
चित्रा 3 डी: ए baumannii DSM-30008 विकास और चयापचय पर क्लोरम्फेनिकोल का प्रभाव। (A)थर्मोग्राम को हीट फ्लो (μW) बनाम समय (एच) फॉर वाइल्ड टाइप (डब्ल्यूटी) ए बॉमनी डीएसएम-30008, क्लोरम्फेनिकोल के संपर्क में न आने और उजागर करने के लिए दिखाया गया है । (B)संचयी गर्मी (एमजे) बनाम समय (एच) । (ग)त्रुटि सलाखों (मानक विचलन) के साथ समय से पीक (एच) । (घ)मेटाबॉलिक रेट (μW) त्रुटि सलाखों (मानक विचलन) के साथ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चयनित एकाग्रता रेंज में रिफाम्पिकिन उपचार का ए बाउमैनी डीएसएम-30008 के थर्मोग्राम पर एक नाटकीय प्रभाव पड़ता है जो अंतराल चरण अवधि और देर से स्थिर चरण(चित्रा 4 ए)तक विकास पर प्रभाव से संबंधित है। हीट उत्सर्जन में एक महत्वपूर्ण कमी चित्रा 4B में देखी जा सकती है जो मेटाबोलिक गतिविधि में कमी के साथ जाती है। चित्रा 4C और चित्रा 4D अंतराल चरण के दीर्घीकरण और स्थिर चरण में मेटाबोलिक गतिविधि के परिवर्तन के प्रभाव को दर्शाते हैं। चित्रा 4C उपयोग की जाने वाली सभी सांद्रता के लिए पीक करने के लिए समय में एक निश्चित वृद्धि दिखाता है। चित्रा 4D मेटाबोलिक दर में कमी को दिखाता है जो आमतौर पर जीवाणु प्रभाव के लिए जिम्मेदार है, सभी सांद्रता के लिए ढलान में कमी के कारण होता है। बैक्टीरियल कोशिकाओं की एंटीबायोटिक प्रेरित हत्या के कारण, मेटाबोलिक गतिविधि मौजूद सक्रिय बैक्टीरिया की एक छोटी संख्या के कारण कम होने की उम्मीद है । एकत्र किए गए डेटा इस तथ्य से सहमत हैं कि रिफाम्पिकिन बैक्टीरियासाइड और बैक्टीरियोस्टैटिक कार्य कर सकता है, और यहां प्रस्तुत डेटा चुने हुए सांद्रता के मुख्य रूप से जीवाणु प्रभावों का समर्थन करते हैं।

Figure 4A
चित्रा 4A: कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4B
चित्रा 4B: कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4C
चित्रा 4C: कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4D
चित्रा 4डी: ए बाउमैनी डीएसएम-30008 वृद्धि और चयापचय पर रिफाम्पिकिन का प्रभाव। (ए)थर्मोग्राम को हीट फ्लो (μW) बनाम समय (एच) फॉर वाइल्ड टाइप (डब्ल्यूटी) ए बॉमनी डीएसएम-30008, नॉन-ट्रीट और रिफाम्पिकिन के संपर्क में दिखाया गया है । (B)संचयी गर्मी (एमजे) बनाम समय (एच) । (ग)त्रुटि सलाखों (मानक विचलन) के साथ समय से पीक (एच) । (घ)मेटाबॉलिक रेट (μW) त्रुटि सलाखों (मानक विचलन) के साथ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्राकृतिक उत्पाद एंटीबायोटिक (0.25 माइक्रोन) की सबसे कम चयनित परीक्षण एकाग्रता ए बॉमैनी डीएसएम-30008 के थर्मोग्राम पर कोई या केवल सीमांत प्रभाव नहीं है। हालांकि, अन्य परीक्षण सांद्रता अंतराल चरण अवधि पर कुछ प्रभाव प्रदर्शित करती है, और देर से स्थिर चरण(चित्रा 5 ए)तक विकास को प्रभावित करती है। सबसे स्पष्ट प्रभाव स्थिर चरण में गर्मी उत्सर्जन की महत्वपूर्ण कमी है। चित्रा 5B में प्रदर्शित डेटा स्पष्ट रूप से पता चलता है कि जारी ऊर्जा काफी सभी प्रभावी सांद्रता के लिए कम है और ढलान के रूप में अच्छी तरह से कम है । ये प्रभाव पीक टू पीक(चित्रा 5 सी)के समय की कमी में अनुवाद करते हैं और इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि मेटाबोलिक दर में एक महत्वपूर्ण और स्पष्ट रूप से खुराक पर निर्भर कमी(चित्रा 5D)देखी जाती है। नए माइक्सोबैक्टीरियल प्राकृतिक उत्पाद की जांच से संयुक्त जीवाणु और जीवाणु प्रभाव का पता चला।

Figure 5A
चित्रा 5A: कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5B
चित्रा 5B: कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5C
चित्रा 5C: कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5D
चित्रा 5डी: ए बाउमैनी डीएसएम-30008 विकास और चयापचय पर एक नए जीवाणुरोधी प्राकृतिक उत्पाद का प्रभाव। (A)थर्मोग्राम को हीट फ्लो (μW) बनाम समय (एच) फॉर वाइल्ड टाइप (डब्ल्यूटी) ए बॉमनी डीएसएम-30008, प्राकृतिक उत्पाद के संपर्क में न आने और उजागर करने के लिए दिखाया गया है । (B)संचयी गर्मी (एमजे) बनाम समय (एच) । (ग)त्रुटि सलाखों (मानक विचलन) के साथ समय से पीक (एच) । (घ)मेटाबॉलिक रेट (μW) त्रुटि सलाखों (मानक विचलन) के साथ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 1: सॉफ्टवेयर इंटरफेस में एक नया प्रयोग का चयन करना। एक लाल वर्ग में एक नया प्रयोग का चयन करने के लिए कदम चित्रित किया गया है। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 2: सॉफ्टवेयर इंटरफेस में एक नया प्रयोग नामकरण। एक लाल वर्ग में नाम और नए प्रयोग की पुष्टि करने के लिए कदम चित्रित किया गया है । इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 3: सॉफ्टवेयर इंटरफेस में एक नया प्रयोग शुरू करना। एक लाल वर्ग में एक नया प्रयोग शुरू करने के लिए कदम चित्रित किया गया है। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 4: सॉफ्टवेयर इंटरफेस में अच्छी तरह से चयन और प्रतिक्रिया शुरू करें। सभी प्रतिक्रिया कुओं का चयन किया जाता है (गहरे नीले रंग में रंगीन कुएं, बटन सभी को लाल वर्ग में चित्रित किया गया है) और प्रतिक्रिया शुरू का चयन किया जाता है (लाल वर्ग में चित्रित)। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 5: कप धारक की सही लोडिंग। संदर्भ कुओं का चयन किया जाता है (गहरे नीले रंग, लाल वर्ग) और थर्मोग्राम एक पॉपअप खिड़की में प्रदर्शित होते हैं। जब लोडिंग सही ढंग से किया जाता है, तो हम गर्मी उत्सर्जन संकेत में भारी गिरावट का निरीक्षण करते हैं जो एक पठार चरण तक पहुंचना चाहिए और लगभग 2-3 मिनट के लिए इस चरण में रहना चाहिए, बाद में सिग्नल शुरुआती बिंदु पर लौटता है। जब यह देखा जाता है तो कप धारक की लोडिंग सही होती है। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्र 6: प्रयोग का अंत। लाल रंग में, प्रयोग में स्टॉप बटन को चित्रित किया गया है। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 7: प्रयोग के अंत की पुष्टि। लाल रंग में, चल रहे प्रयोग के अंत की पुष्टि करने के लिए हां बटन चित्रित किया गया है। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्र 8: प्रयोग फ़ाइल को सहेजना। सेव फाइल विकल्पों के साथ एक पॉपअप विंडो दिखाई गई है और लाल रंग में बटन सेव को चित्रित किया गया है। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 9: सॉफ्टवेयर इंटरफेस। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 10: सहेजे गए प्रयोगों तक पहुंचना। लाल रंग में सेव किए गए प्रयोगों तक पहुंचने के लिए बटन ओपन प्रयोग को चित्रित किया गया है। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्र 11: चयनित प्रयोग फ़ाइल का उद्घाटन। लाल रंग में बटन खुला दर्शाया गया है। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 12: डिफ़ॉल्ट वेल्स देखें। सभी प्रयोगात्मक अच्छी तरह से और इसी थर्मोग्राम दिखाई दे रहे हैं। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्र 13: विश्लेषण के लिए कुओं का चयन। लाल रंग में बटन चुनें सभी को दर्शाया गया है। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 14: आधार रेखा को परिभाषित करना। लाल रंग में बटन परिभाषित आधार रेखा चित्रित किया गया है। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 15: बेसलाइन सिग्नल का चयन करना। लैग फेज में सिग्नल का न्यूनतम 30 मिनट (रेड बॉक्स) चुना जाता है। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्र 16: प्रायोगिक फ़ाइल में परिवर्तन की बचत। लाल रंग में बटन सेव दर्शाया गया है। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 17: वेब आधारित कैलोरीमेट्री विश्लेषण आवेदन। ऑनलाइन सॉफ्टवेयर इंटरफेस और फाइल अपलोड पाथवे दिखाया गया है। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्र 18: चयनित प्रायोगिक फाइल अपलोड करें। लाल रंग में बटन खुला दर्शाया गया है। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 19: थर्मोग्राम का विश्लेषण। प्रत्येक प्रयोगात्मक अच्छी तरह से गणना मेटाबोलिक मापदंडों को लाल रंग में चित्रित किया गया है। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 20: सैद्धांतिक विकास मॉडल के लिए प्रयोगात्मक डेटा फिटिंग। हीट फ्लो डेटा या तो एक Gompertz या एक रिचर्ड के विकास मॉडल के लिए फिट है । इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 21: माप का निर्यात। लाल रंग में बटन डाउनलोड उपाय और सहेजें चित्रित कर रहे हैं। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

Isothermal microcalorimetry समय के साथ एक नमूने से उत्सर्जित ऊर्जा उपाय और इस ऊर्जा रिलीज सभी जैविक, भौतिक और (जैव) रासायनिक प्रक्रियाओं का परिणाम है । मापा गर्मी प्रवाह का मूल्यांकन या पदार्थों के जीवाणुरोधी प्रभावों का निर्धारण करने के लिए शोषण किया जा सकता है क्योंकि यह मेटाबोलिक गतिविधि की निरंतर वास्तविक समय निगरानी में सक्षम बनाता है।

विश्लेषण के लिए विश्वसनीय डेटा प्राप्त करने के लिए, सही शुरुआती कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों (सीआईयू) को प्रत्येक प्रजाति या उपयोग किए जाने वाले तनाव के लिए व्यक्तिगत रूप से निर्धारित करने की आवश्यकता है। यदि टीएफयू गिनती बहुत कम है, तो यह लंबे समय तक अंतराल चरण की ओर जाता है क्योंकि सिस्टम को पर्याप्त गर्मी पैदा करने वाले बायोमास की एक महत्वपूर्ण मात्रा तक पहुंचने में अधिक समय लगता है। यदि सीएलयू गिनती बहुत अधिक है तो अंतराल चरण बहुत कम होगा, और उत्पादित गर्मी की मात्रा पड़ोसी सेंसर कोशिकाओं (संदर्भ और प्रयोगात्मक कुओं) में गर्मी हस्तांतरण का कारण बन सकती है और थर्मोग्राम की विकृतियों का कारण बन सकती है। सीआईयू की उच्च संख्या से भी तेजी से ऑक्सीजन की कमी होगी और अवायवीय स्थितियों में स्विच होगा। इस बात को भी ध्यान में रखना होगा कि प्रयोग के पहले 30 मिनट के दौरान जब सिस्टम का संतुलन होता है तो डाटा कलेक्शन संभव नहीं होता और प्रभावों की वास्तविक रिकॉर्डिंग में देरी होती है । इसके अलावा, गलत सीआईयू दृढ़ संकल्प झूठी एमआईसी दृढ़ संकल्प की ओर जाता है, अंततः प्रयोग को प्रभावित करता है औरपरिवर्तन 25मनाया जाता है। एक अन्य महत्वपूर्ण मुद्दा आधार रेखा का सही निर्धारण है । आमतौर पर, लैग चरण के दौरान बेसलाइन सिग्नल का चयन किया जाता है जब गर्मी प्रवाह संकेत शून्य होता है और आदर्श रूप से, बेसलाइन परिभाषा के लिए समय सीमा >30 मिनट होती है। हालांकि, यह हमेशा संभव नहीं होता है क्योंकि बैक्टीरिया को गर्मी सिग्नल डिटेक्शन सीमा तक पहुंचने की आवश्यकता होती है उपभेदों और प्रजातियों के बीच अलग होती है। कुछ प्रजातियों या उपभेदों को हीट सिग्नल डिटेक्शन लिमिट तक पहुंचने के लिए 30 मिनट से अधिक की आवश्यकता होती है जबकि अन्य उपभेद या प्रजातियां पहले 30 मिनट के भीतर पहुंचती हैं। उस स्थिति में, प्रयोग के अंत में बेसलाइन सिग्नल का चयन करना संभव है जब सभी गर्मी संकेत शून्य पर वापस आ गए हैं और स्थिर बने हुए हैं। वैकल्पिक रूप से, एक ही बैक्टीरियल स्ट्रेन के साथ अन्य प्रयोगों से बेसलाइन का उपयोग किया जा सकता है, जिसकी हालांकि सिफारिश नहीं की जाती है।

सिस्टम डिजाइन और प्रयोगों और समस्या निवारण के अनुकूलन के मामले में कुछ लचीलेपन के लिए अनुमति देता है। प्लास्टिक आवेषण के बिना टाइटेनियम कप का उपयोग करते समय प्लास्टिक आवेषण और 100-600 माइक्रोन का उपयोग करते समय उपयोग की जाने वाली मात्रा 100-300 माइक्रोन की सीमा में होती है। निर्माता द्वारा अनुशंसित काम करने की मात्रा 120 माइक्रोन है। एक नई प्रयोगात्मक श्रृंखला स्थापित करने में विभिन्न खंडों का उपयोग, और माप के लिए इष्टतम शर्तों को खोजने के दौरान, मुख्य रूप से दो मापदंडों पर प्रभाव पड़ता है। कम मात्रा का उपयोग करके, आवश्यक परीक्षण यौगिक की मात्रा को कम किया जा सकता है, जो यौगिकों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, जो केवल छोटी मात्रा में उपलब्ध हैं। इसके अलावा, इस्तेमाल की गई मात्रा सीधे माप के दौरान ऑक्सीजन की उपलब्धता को प्रभावित करती है जिसमें कम मात्रा बैक्टीरियल विकास के लिए आवश्यक उपलब्ध ऑक्सीजन की मात्रा में वृद्धि होती है। ऑक्सीजन की कमी प्रयोग की अधिकतम संभव अवधि में योगदान देने वाले मुख्य कारकों में से एक है। महत्वपूर्ण बात यह है कि ठोस मीडिया का उपयोग करना संभव है, न केवल तरल मीडिया। यह धीमी गति से बढ़ते सूक्ष्मजीवों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि ठोस और गैस चरण के बीच इंटरफेस पर विकास बेहतर ऑक्सीजन एक्सेस9को सक्षम बनाता है।

आईएमसी भौतिकी, रसायन विज्ञान और जीव विज्ञान में अनुप्रयोगों के साथ अज्ञात प्रक्रियाओं की खोज करने के लिए एक उपयोगी विश्लेषणात्मक उपकरण है। विधि एक बंद प्रणाली के भीतर गर्मी विनिमय उपाय और दर्ज गर्मी विनिमय के विश्लेषण अतिरिक्त जानकारी है कि हमेशा मानक तरीकों के साथ प्राप्त नहीं किया जा सकता है प्रदान करता है । माइक्रोबायोलॉजी और एंटीबायोटिक्स अनुसंधान में, आईएमसी के सबसे बड़े फायदों में से एक लाइव, डेड और एक्सिप्टर या निष्क्रिय कोशिकाओं के बीच अंतर करने की क्षमता है, जो मानक टर्बिडिटी विधियों का उपयोग करके संभव नहीं है11। इसके अलावा, आईएमसी अत्यधिक संवेदनशील है और यह 104-105 कोशिकाओं 9 के रूप में कुछ से गर्मी उत्सर्जन का पता लगासकताहै। एक और लाभ यह है कि प्रयोगात्मक सेटअप तेज और आसान है, और यह निरंतर, वास्तविक समय ट्रैकिंग के लिए अनुमति देता है जिसमें न्यूनतम उपयोगकर्ता हस्तक्षेप नहीं होता है। इसके अलावा, आईएमसी गैर विनाशकारी है, जो नमूनों के आगे विश्लेषण करने में सक्षम बनाता है । डेटा विश्लेषण देर से घातीय या प्रारंभिक स्थिर चरण और स्थिर चरण में मेटाबोलिक गतिविधि तक बायोमास गठन को अलग करने की अनुमति देता है।

ऊपर उल्लिखित उपन्यास और रोमांचक अनुप्रयोग सुविधाओं के अलावा, इस विधि में कमियां भी हैं। प्रमुख सीमा यह है कि आईएमसी उपकरण एक विशिष्ट प्रणाली के भीतर उत्पादित और जारी की गई कुल गर्मी को मापते हैं, जिसमें गैर-विशिष्ट संकेत भी शामिल हैं। यह उचित नियंत्रण के साथ प्रयोगात्मक योजना के महत्व पर प्रकाश डाला गया है ताकि गर्मी के संकेत में होने वाले परिवर्तनों का आकलन किया जा सके जो गर्मी के प्रवाह को रिकॉर्ड करके मापाजाताहै9 ,20

हमारे हाथों में, आईएमसी नए प्राकृतिक उत्पादों के जीवाणुरोधी प्रभावों का अध्ययन करने और प्रभावी एकाग्रता पर्वतमाला निर्धारित करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है। जीवाणु और जीवाणु प्रभावों में अंतर करने के अलावा, इसका उपयोग भविष्य में लक्ष्य पहचान अध्ययन और एमओए निर्धारण के हिस्से के रूप में किया जा सकता है । यह यहां प्रदर्शित नए सक्रिय यौगिकों के थर्मोग्राम के लिए विभिन्न एंटीबायोटिक कक्षाओं के थर्मोग्राम की तुलना करके किया जा सकता है। हालांकि, अभी भी इस बात की जांच की जानी चाहिए कि क्या मापा गया डेटा से निकाले जा सकने वाले कुछ मात्रात्मक पैरामीटर ऐसी तुलनाओं के लिए पर्याप्त हैं या यदि पूर्ण थर्मोग्राम के आधार पर उंगलियों के निशान देने वाले एल्गोरिदम पर काम करना आवश्यक होगा । एंटीबायोटिक अनुसंधान के क्षेत्र में एक और संभावित आवेदन प्रतिरोधी क्लोन के लिए वाइल्डटाइप की तुलना है, पूरे जीनोम अनुक्रमण के साथ मिलकर, जो नए जीवाणुरोधी के मोड-ऑफ-रेजिस्टेंस (एमओआर) को स्पष्ट करने में मदद कर सकता है। विधि की स्थिर प्रकृति के कारण, बायोफिल्म गठन या पहले से स्थापित बायोफिल्मों पर नए एजेंटों की प्रभावकारिता की जांच से जैविक प्रक्रिया की बेहतर समझ हो सकती है और निद्रा के विभिन्न चरणों में रोगाणुओं पर चयनित एजेंटों का प्रभाव हो सकता है। आईएमसी गर्मी के रूप में जारी कुल ऊर्जा को रिकॉर्ड करता है जिससे यह सक्रिय पदार्थों के उप-निरोधात्मक प्रभावों की जांच करने के लिए एक उपयुक्त विधि बन जाती है जिसे ट्रांसक्रिप्टोमिक्स के साथ मिलकर किया जा सकता है। इस विधि का उपयोग नैदानिक सेटिंग्स में भी किया जा सकता है ताकि नमूनों के संदूषण का पता लगाया जा सके या एंटीबायोग्राम के निर्धारण के लिएरोगियोंके निश्चित उपचार पर तेजी से निर्णय लेने में मदद मिल सके ।

Disclosures

इस परियोजना को कैलस्क्रीनर तकनीक के डेवलपर सिम्सल के सहयोग से अंजाम दिया गया । लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक सार्थक चर्चाओं के लिए सिसेल की टीम को धन्यवाद देना चाहते हैं और हम गैना ओलियनिक और विल्हेम पाउलैंडर के महान समर्थन को स्वीकार करना चाहेंगे। हम भी कुशल तकनीकी सहायता के लिए प्राकृतिक उत्पाद और स्टेफनी श्मिट प्रदान करने के लिए डैनियल Kohnhäuser शुक्रिया अदा करना चाहते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acinetobacter baumannii DSMZ DSM-30008 reference strain used in this study
calPlate Symcel 1220093 48-well plate for titanium cups to be inserted
calScreener Symcel 1200001 isothermal microcalorimetry instrument
calView software Symcel collection and analysis software
calWell Symcel 1901004 micro-bio grade (non-active) 48-well plate with plastic inserts which are inserted into the titanium cups
CASO agar Carl Roth X937.1 isolation and cultivation of microorganisms
Chloroamphenicol Sigma-Aldrich C0378 antibiotic
Ciprofloxacin Sigma-Aldrich 17850 antibiotic
Cuvettes Brand 759015 1.5 mL cuvettes
Disposable inoculation loops Sarsted 86.1562.050 10 µL inoculation loops
Dimethylsulfoxid (DMSO) Thermo Fisher Scientific 85190
Eppendorf tubes Eppendorf 30120086 1.5 mL eppendorf safe-lock tubes
Ethanol Thermo Fisher Scientific 10428671
Falcon Tubes Sarsted 62.554.502 15 mL falcon tubes
Hydrochloride (HCL) Thermo Fisher Scientific 10316380
Methanol Thermo Fisher Scientific A412-500
Mueller Hinton Broth Sigma-Aldrich 70192 liquid medium for antibiotic susceptibility studies
Mueller Hinton Broth II cation adjusted media Sigma-Aldrich 90922 Mueller Hinton Broth cation-adjusted to 1.25 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2
Petri dishes LABSOLUTE 7696404
Pipette 100 - 1000 µL Brand 705880
Pipette 2 - 20 µL Brand 705872
Pipette 20 - 200 µL Brand 705878
Pipette tips 100 - 1000 L Brand 732032
Pipette tips 2 - 200 µL Brand 732028
Polymyxin B sulfate Sigma-Aldrich P0972 antibiotic
Rifampicin Sigma-Aldrich R3501 antibiotic
Serological pipette Thermo Fisher Scientific 170356N 10 mL Nunc serological pipette
Spectrophotometer Eppendorf AG 6135 000.017
Sterile filters Minisart 16534----------K 0.2 µm pore size sterile filters
Syringe 50 mL NORM-JECT 22778
Tetracycline Sigma-Aldrich 87128 antibiotic
Titanium cups Symcel 1220089 inserted in 48-well titanium calPlate
Titanium lids Symcel 1220091 screwed and tightend to the titanium cups
Trimethroprim Sigma-Aldrich T7883 antibiotic
Tweezers Symcel 1900602

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization (WHO). Antibiotic resistance. World Health Organization (WHO). , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antibiotic-resistance (2018).
  2. Herrmann, J., Abou Fayad, A., Müller, R. Natural products from myxobacteria: novel metabolites and bioactivities. Natural Product Reports. 34 (2), 135-160 (2017).
  3. Cassar, S., et al. Use of Zebrafish in Drug Discovery Toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33 (1), 95-118 (2020).
  4. Bhusnure, O. G., et al. Drug Target Screening and its Validation by Zebrafish as a Novel Tool. Pharmaceutica Analytica Acta. 6 (10), 426 (2015).
  5. Kraus, J., Tobin, G., Development, Discovery, Deveopment, and Regulation of Natural Products. Using Old Solutions to New Problems - Natural Drug Discovery in the 21st Century. Kulka, M. , InTech. Rijeka, HR. 4-36 (2013).
  6. Tabassum, N., Tai, H., Jung, D., Williams, D. R. Fishing for Nature's Hits: Establishment of the Zebrafish as a Model for Screening Antidiabetic Natural Products. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015 (1), 287847 (2015).
  7. Antimicrobial Development. Symcel. , Available from: https://symcel.com/applications/microbiology/antimicrobials-development (2019).
  8. Robador, A., LaRowe, D. E., Finkel, S. E., Amend, J. P., Nealson, K. H. Changes in Microbial Energy Metabolism Measured by Nanocalorimetry during Growth Phase Transitions. Frontiers in Microbiology. 2018 (9), 109 (2018).
  9. Braissant, O., Wirz, D., Göpfert, B., Daniels, A. U. Use of isothermal microcalorimetry to monitor microbial activities. FEMS Microbiology Letter. 303 (1), 1-8 (2010).
  10. Braissant, O., et al. Isothermal microcalorimetry accurately detects bacteria, tumorous microtissues, and parasitic worms in a label-free well-plate assay. Biotechnology Journal. 10 (3), 460-468 (2015).
  11. Butini, M. E., Abbandonato, G., Di Rienzo, C., Trampuz, J., Di Luca, M. Isothermal microcalorimetry detects the presence of persister cells in a Staphylococcus aureus biofilm after vancomycin treatment. Frontiers in Microbiology. 25 (10), 332 (2019).
  12. Tellapragda, C., et al. Isothermal microcalorimetry minimal inhibitory concentration testing in extensively drug resistant Gram-negative bacilli - A multicenter study. Clinical Microbiology and Infection. , (2020).
  13. Abdillahi, S., et al. Collagen VI Contains Multiple Host Defense Peptides with Potent In Vivo Activity. The Journal of Immunology. 201 (3), 1007-1020 (2018).
  14. Astasov-Frauenhoffer, M., et al. Exopolysaccharides regulate calcium flow in cariogenic biofilms. PLoS ONE. 12 (10), 1-14 (2017).
  15. Gros, S., et al. Personalized Treatment Response Assessment for Rare Childhood Tumors Using Microcalorimetry-Exemplified by Use of Carbonic Anhydrase IX and Aquaporin 1 Inhibitors. International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 4984 (2019).
  16. Kriszt, R., et al. Optical visualisation of thermogenesis in stimulated single-cell brown adipocytes. Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).
  17. Wadsö, I., et al. A well-plate format isothermal multi-channel microcalorimeter for monitoring the activity of living cells and tissues. Thermochimica Acta. 652 (1), 141-149 (2017).
  18. von Ah, U., Wirz, D., Daniels, A. U. Isothermal micro calorimetry - a new method for MIC determinations: results for 12 antibiotics and reference strains of E. coli and S. aureus. BMC Microbiology. 9 (106), (2009).
  19. Howell, M., Wirz, D., Daniels, A. U., Braissant, O. Application of a Microcalorimetric Method for Determining Drug Susceptibility in Mycobacterium Species. Journal of Clinical Microbiology. 50 (1), (2012).
  20. Wadsö, I. Isothermal Microcalorimetry: Current problems and prospects. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 64 (2001), 75-84 (2001).
  21. LeBel, M. Ciprofloxacin: chemistry, mechanism of action, resistance, antimicrobial spectrum, pharmacokinetics, clinical trials, and adverse reactions. Pharmacotherapy. 8 (1), 3-33 (1988).
  22. Chopra, I., Roberts, M. Tetracycline antibiotics: mode of action, applications, molecular biology, and epidemiology of bacterial resistance. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 65 (2), 232-260 (2001).
  23. Allison, J. L., et al. Mode of action of chloramphenicol. VII. Growth and multiplication of Escherichia coli in the presence of chloramphenicol. Journal of Bacteriology. 83 (3), 609-615 (1962).
  24. Wehrli, W. Rifampin: mechanisms of action and resistance. Reviews of Infectious Diseases. 5, Suppl 3 407-411 (1983).
  25. Hancock, R. E. W., et al. Agar and broth methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nature Protocols. 3 (2), 163-175 (2008).

Tags

बायोइंजीनियरिंग अंक 164 इसोथरमल माइक्रोकैलोरिमरी एंटीमाइक्रोबियल प्रतिरोध प्राकृतिक उत्पाद माइक्रोबायोलॉजी जीवाणुरोधी जीवाणु जीवाणु जीवाणु माइक्सोबैक्टीरिया
मेटाबोलिक प्रोफाइलिंग इसोथरमल माइक्रोकैलोरिमरी का उपयोग करके नए प्राकृतिक उत्पादों के बैक्टीरियिडल या बैक्टीरियोस्टैटिक प्रभावों का निर्धारण करने के लिए
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cirnski, K., Coetzee, J., Herrmann,… More

Cirnski, K., Coetzee, J., Herrmann, J., Müller, R. Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry. J. Vis. Exp. (164), e61703, doi:10.3791/61703 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter