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Bioengineering

Profilazione metabolica per determinare gli effetti batterici o batteriosfondi dei nuovi prodotti naturali utilizzando la microcalorimetria isotermica

doi: 10.3791/61703 Published: October 29, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Il chiarimento della modalità d'azione di un nuovo antibiotico è un compito impegnativo nel processo di scoperta dei farmaci. L'obiettivo del metodo qui descritto è l'applicazione di microcalorimetria isotermica utilizzando calScreener nella profilazione antibatterica per fornire ulteriori informazioni sulle interazioni farmaco-microbo.

Abstract

A causa della minaccia globale di una crescente resistenza agli antimicrobici, sono urgentemente necessari nuovi antibiotici. Indaghiamo sui prodotti naturali di Myxobacteria come fonte innovativa di tali nuovi composti. Un collo di bottiglia nel processo è in genere il chiarimento della loro modalità di azione. Recentemente abbiamo stabilito la microcalorimetria isotermica come parte di una pipeline di profilazione di routine. Questa tecnologia consente di studiare l'effetto dell'esposizione agli antibiotici sulla risposta metabolica batterica totale, compresi i processi che sono disaccoppiati dalla formazione di biomassa. È importante sottolineare che gli effetti batteriostatici e battericidicidi sono facilmente distinguibili senza alcun intervento da parte dell'utente durante le misurazioni. Tuttavia, la microcalorimetria isotermica è un approccio piuttosto nuovo e l'applicazione di questo metodo a diverse specie batteriche richiede di solito una pre-valutazione delle condizioni di misura idonee. Ci sono alcuni termogrammi di riferimento disponibili di alcuni batteri, facilitando notevolmente l'interpretazione dei risultati. Poiché il pool di dati di riferimento è in costante crescita, ci aspettiamo che la metodologia abbia un impatto crescente in futuro e ci aspettiamo che consenta analisi approfondite delle impronte digitali che consentano la differenziazione delle classi antibiotiche.

Introduction

Lo scopo di questo metodo è quello di applicare la microcalorimetria isotermica (IMC) come analisi della produttività media nella profilazione mode-of-action (MoA) di nuovi composti antibatterici. Questo metodo rivela dati riguardanti l'attività dei composti sulle specie batteriche e fornisce informazioni sulla natura batterica o batteriostatica del composto stesso.

L'aumento della resistenza antimicrobica emergente (AMR) è un problema globale e porta a trattamenti meno efficaci di infezioni comuni con antibiotici noti1. Tuttavia, la ricerca di nuovi composti e farmaci che possono sostituire o lavorare in combinazione con antibiotici noti sono in corso e questo è costruito su diversi approcci. I prodotti naturali sono un attore chiave nelle attuali campagne di scoperta di farmaci e in particolare nella scoperta di farmaci anti-infettivi2. Tuttavia, l'identificazione di nuove strutture di piombo per lo sviluppo di antibiotici è un processo lungo e finanziariamente impegnativo3. Pertanto, le prime fasi della scoperta sono estremamente importanti per filtrare sulla maggior parte degli scaffold più promettenti già in una fase iniziale. I primi passi nella scoperta di farmaci naturali includono l'ottenimento della struttura di un composto, la determinazione dell'attività in vitro insieme al MoA e all'identificazione del bersaglio. La maggior parte dei composti di successo ammissibili per un ulteriore sviluppo dovrebbe mostrare uno spettro favorevole di attività (cioè, attività ad ampio spettro nel caso di antibatterici) e un nuovo MoA con cui la resistenza anti-esistente può essere superata. Le impalcature promettenti vengono quindi in genere vagliate in saggi secondari, che includono la biodisponibilità in vivo, la tossicità e il metabolismo4. Oltre alle preoccupazioni finanziarie, la scoperta di farmaci per prodotti naturali deve affrontare ulteriori sfide riguardanti i costi e le difficoltà tecniche legate all'isolamento e alla purificazione dei composti, che, a loro volta, possono rendere difficile ottenere quantità multi-milligrammo o addirittura grammo nelle prime fasi del processo discoperta 5,6. Pertanto, è della massima importanza nella ricerca sui prodotti naturali essere in grado di eseguire screening primari all'avanguardia con quantità composte minime al fine di prendere una decisione ben informata su ulteriori investimenti per rendere un nuovo prodotto naturale accessibile per lo sviluppo pre-clinico. Con l'uso di IMC per la profilazione antibatterica, la quantità di composto necessario è significativamente ridotta rispetto ai metodi standard. La tecnica fornisce anche informazioni più approfondite riguardanti l'interazione di nuovi farmaci con la comunità microbica7.

IMC è un metodo consolidato per misurare l'energia totale come risultato di tutti i processi biologici, fisici e biochimici e le reazioni in un sistema biologico. Il rilascio di energia batterica è proporzionale alle reazioni metaboliche totali8. All'interno di un sistema chiuso, come il microcalorimetro usato, i livelli di calore possono essere misurati nella gamma di microwatt per studiare la cinetica metabolica dei batteri9,10,11,12. Il calore (energia) che viene rilasciato dai batteri è legato alle funzioni cellulari che sono alla base del loro metabolismo e che non sono necessariamente proporzionali alla biomassa cellulare.

Inizialmente, l'applicabilità della calorimetria isotermica per i test microbiologici è stata limitata a causa della sua bassa produttività e degli elevati volumi di test. Tuttavia, il microcalorimetro usato è unico in quanto combina i vantaggi della calorimetria isotermica con una maggiore produttività e minori requisiti composti, il che lo rende uno strumento prezioso per le applicazioni di scoperta difarmaci 10. Inoltre, lo strumento offre ulteriori vantaggi rispetto ai metodi alternativi per misurare la cinetica della crescita batterica, come il metodo di torbidità standard, che si basa sulla misurazione della densità ottica a 600 nm (OD<600). La misurazione di OD600 si basa sul presupposto che una maggiore densità ottica sia uguale alla crescita microbica, trascurando così la presenza di cellule non vitali. Questo metodo è stato anche criticato in quanto esclude piccole varianti di colonia e le cellule persistenti11. Al contrario, IMC consente l'osservazione in tempo reale di qualsiasi tipo di cellule vitali. Se le cellule sono dormienti, presentano ancora attività metaboliche e possono quindi essere rilevate da IMC, mentre tali fenomeni non sono rilevabili dal metodo di torbidità standard11. Altri vantaggi di IMC includono un tempo di test di suscettibilità antimicrobico più breve, misurare le interazioni farmacologiche in una comunità complessa e metodi di analisi standard senza distruggere il campione7.

La tecnologia IMC è stata implementata in una vasta gamma di studi, che vanno dalla microbiologia alla termogenesi e alla biologia del cancro13,14,15,16,17. Le applicazioni microbiche includono la determinazione delle concentrazioni minime inibitorie (MIC) dei composti contro vari ceppi batterici. Diversi studi sono stati fatti ed è stato concluso che i dati MIC provenienti dalla calorimetria isotermica per la maggior parte delle specie batteriche possono essere ottenuti più velocemente e i risultati sono simili rispetto ad altri metodi (standard) per la determinazione MIC12,18,19. Ulteriori applicazioni di IMC includono l'osservazione dell'interazione di farmaci e la combinazione di trattamenti farmacologici con comunità batteriche complesse come i biofilm11. Uno studio incentrato sulla profilazione moA ha mostrato che il microcalorimetro è in grado di rilevare una differenza nelle cefalosporine di prima e seconda generazione, mentre diversi antibiotici con lo stesso MoA presentano una curva di flusso di calore simile rispettoall'altro 18.

Qui, descriviamo l'uso di IMC per la profilazione MoA di nuovi prodotti naturali utilizzando il nuovo strumento di microcalorimetria isotermica. Il metodo viene utilizzato per determinare concentrazioni antibiotiche efficaci e per descrivere le caratteristiche degli antibiotici in termini di meccanismi batterici o batteriostatici. Il metodo può essere ampiamente implementato nella profilazione MoA dei composti e potrebbe sostituire o almeno integrare i metodi microbiologici standard. Studi futuri includeranno analisi approfondite delle impronte digitali che consentiranno la differenziazione delle classi di antibiotici basate su meccanismi target.

Protocol

NOTA: La temperatura dello strumento deve essere impostata in base al batterio utilizzato con almeno un giorno di anticipo per garantire la stabilità del sistema. Qui, i campioni di Acinetobacter baumannii DSM30008 sono eseguiti a 30 gradi centigradi.

1. Preparazione della cultura

  1. Strisciare il ceppo in esame (qui: A. baumannii) su una piastra di agar CASO e incubare durante la notte in un incubatore statico a 30 gradi centigradi.
  2. Preparare una coltura notturna inoculando una singola colonia in MHB (brodo di Mueller-Hinton) e incubare su un incubatore di tre scosse a 180 giri/min a 30 gradi centigradi.

2. Preparazione del campione

  1. Utilizzare tubi da 1,5 mL per preparare l'intervallo di concentrazione di un farmaco o di un composto selezionato (ad esempio, aggiungendo 1,5 L di 100x soluzioni di stock in DMSO; vedere il punto 2.3).
  2. Diluire la coltura notturna in mezzo MHB.
    1. Misurare la densità ottica della coltura notturna utilizzando uno spettrofotometro ad una lunghezza d'onda di 600 nm.
    2. Diluire la coltura per ottenere 5 x10 5 unità di formazione colonia (CFU)/mL in mezzo MHB fresco. Un OD600 di uno equivale a circa 5 x10 8 CFU/mL (ad esempio, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, A. baumannii).
      NOTA: È importante calibrare il fattore di conversione OD600 in CFU/mL per ogni singolo ceppo batterico nelle condizioni di coltura applicate.
  3. Aggiungere 150 L delle cellule alle provette preparate al punto 2.1, garantendo la corretta concentrazione finale del farmaco o del composto testato e la corretta concentrazione finale delle cellule.
  4. Mescolare il composto con le cellule da vortice.
    NOTA: La piastra campione (vedi Tabella dei Materiali) ha sei file, ognuna contenente otto pozzetti, per un totale di 48 pozzi; La riga A e la riga F sono il riferimento termodinamico. Pertanto, nessun campione può essere caricato in quei pozzi, i supporti corrispondenti vengono caricati in quei pozzi. 32 campioni di prova possono essere misurati per corsa, utilizzando pozzi nelle righe B-E. Il singolo campione di test deve essere eseguito al minimo in duplicato (qui: tutti i campioni sono stati eseguiti come triplicati). Dovrebbero essere inclusi i controlli alla crescita.

3. Inserire la preparazione

  1. Trasferire 120 L dalla miscela preparata al punto 2.4 agli inserti in plastica.
    NOTA: Utilizzare il tubo inverso al punto 3.1 per evitare che il liquido irrorazione sui lati degli inserti di plastica, che può portare a interferenze con le corrette operazioni di lettura del segnale.
  2. Mettere tutte le fiale in titanio nei supporti (vedi Tabella dei Materiali) con una pinzetta.
  3. Trasferire delicatamente gli inserti nelle fiale di titanio nella piastra del supporto.
  4. Posizionare liberamente i coperchi in titanio su tutte le fiale in titanio.

4. Inserire il carico

  1. Trasferire il supporto con tazze di titanio sulla stazione campione e posizionarlo sull'area designata.
  2. Utilizzare la chiave di coppia, impostata su 40 cNm forza, per stringere tutti i coperchi.

5. Esecuzione di campioni

  1. Nel software calView, avviare un nuovo esperimento ( Figura 1 ).
  2. Ritirare il braccio di inserimento del campione dallo strumento.
  3. Posizionare il portacoppa sul "ponte", la colonna 8 di fronte all'apertura dell'inserimento del campione e spingere delicatamente il supporto della tazza nello strumento nella "Posizione 1" designata. Attendere 10 minuti per la stabilizzazione del sistema. Etichettare i pozzi sperimentali.
  4. Spingere il braccio di inserimento del campione fino a quando il supporto della tazza si trova nella "Posizione 2" designata. Attendere 20 minuti per la stabilizzazione del sistema.
  5. Spingere il braccio di inserimento del campione nella "Posizione 3" e ritrarre il braccio di inserimento del campione fino a quando non si trova nella "posizione di corsa". Evidenziare tutti i pozzetti nel software e selezionare Reaction Start (Supplemental Figure 4).
  6. Eseguire l'esperimento fino a quando le letture di emissione di calore sono stabilmente indietro a zero.
    NOTA: Assicurarsi che tutti i pozzetti si comportino in modo simile all'interno di questi passaggi. La Figura supplementare 5 illustra cosa si deve osservare se i pozzi vengono caricati correttamente. Se caricato in modo non corretto, ripetere i passaggi 5.2-5.4.

6. Rimuovere il portacoppa

  1. Nel software, selezionare Interrompi (Figura supplementare 6). Il software chiederà quindi se "si è sicuri", selezionare (Figura supplementare 7) e salvare l'esperimento su un'unità o desktop per l'analisi dei dati (Supplemental Figura 8).
  2. Inserire completamente il braccio di inserimento campione nello strumento e attivare i magneti per recuperare il supporto della tazza.
  3. Allentare i coperchi, togliere gli inserti e posizionare fiale e coperchi in portasoli di vetro e posizionare per 4 ore a 180 gradi centigradi, quindi mettere le fiale e i coperchi in un desiccatore per garantire che i coperchi e le fiale siano asciutti.

7. Analisi dei dati

  1. Aprire il software ( Figura 9 ), selezionare Apri nell'angolo superioresinistro ( Figura 10 ). Open experiment Nella finestra popup selezionare l'esperimento di interesse e premere Apri ( Figura 11 ). L'applicazione aprirà l'esperimento nella visualizzazione pozzi predefinita (Figura supplementare 12).
  2. Premere Seleziona tutto o Ctrl -A (Figura supplementare 13).
  3. Premere Definisci lineadi base , questo parametro normalizza i dati in ogni posizione( Figura supplementare 14). Nella finestra popup selezionare un periodo di tempo di >30 min situato nella fase di ritardo (il flusso di calore deve essere basso, tra zero e dieciW; Supplementare Figura 15). Dopo la selezione del periodo di tempo della linea di base, la linea di base scelta apparirà in verde nel termogramma. Chiudere la finestra Definisci sezione baseline.
  4. Premete Salva (Save) o Ctrl -S e chiudete il software (Supplemental Figure 16).
  5. Aprire l'applicazione di analisi Symcel Calorimetry basata sul Web (https://symcel.shinyapps.io/symcel_calorimetricgrowth/).
  6. Per caricare il file nell'applicazione di analisi Calorimetry, premere Sfoglia ( Figura 17 ), selezionare l'esperimento e premere Apri ( Figura 18 ). I parametri metabolici verranno calcolati automaticamente per i 32 campioni nell'applicazione Web ( Figura 19 ).
  7. Per adattare i dati del flusso di calore ai modelli di crescita di Gompertz e/o Richard, fare clic su Funzione di crescita. I modelli di crescita verranno visualizzati nella sezione "Cumulativo", anche rispetto ai dati non elaborati nella sezione "Flusso" ( Figura 20 ).
  8. Per scaricare tutti i parametri calcolati, premere Scarica misure. Selezionare il percorso del file e premere Salva ( Figura 21 ). Il file verrà esportato in un foglio di calcolo per ulteriori calcoli.

Representative Results

Un numero sufficiente di batteri che producono calore è necessario per lo strumento per registrare un segnale di calore. Se c'è un ritardo nel tempo fino a quando un flusso di calore è rilevabile significa che i batteri non producono ancora un segnale di calore al di sopra del limite di rilevamento. La rilevazione del calore rilasciato dal campione batterico è quindi direttamente correlata all'aumento dell'attività batterica, compresa la crescita batterica. Crescita batterica e altre attività metaboliche sono noti per essere fortemente influenzati dall'aggiunta di un farmaco antibatterico. Per determinare se un nuovo prodotto naturale in esame esercita effetti battericistici o batteriostatici o una combinazione di entrambi i MoA, abbiamo scelto un piccolo insieme di farmaci di riferimento e abbiamo registrato termogrammi a cui abbiamo confrontato i dati provenienti da esperimenti con il prodotto naturale. Sulla base della potenza di antibiotici selezionati è stata selezionata una serie di concentrazioni essendo vicino la concentrazione minima inibitoria (MIC) come determinato dalla diluizione microbroth.

La Ciprofloxacina si rivolge al DNA batterico gyrase e topoisomerase IV e, di conseguenza, presenta un MoA batterico. Tuttavia, l'uccisione batterica indotta dalla ciprofloxacina è dipendente dalla concentrazione e quando viene dosata a concentrazioni insufficienti può anche avere un effetto batteriostatico21. Tetraciclina e cloràfenfenicolo prendono di mira il ribosoma rispettivamente nella sottounità 30S e 50S, e agiscono batteriostatici a causa dell'inibizione della sintesi proteica22,23. La rifampicina agisce inibendo la polimerasi dell'RNA dipendente dal DNA e può avere entrambi, effetti batterici e batteristatici, a seconda della dose utilizzata24. Il prodotto naturale che stiamo studiando qui è stato isolato da Myxobacteria e ha mostrato una potente attività contro i patogeni batterici Gram-negativi e Gram-positivi. Durante lo studio del suo MoA e bersaglio molecolare, eravamo interessati a determinare se il nuovo prodotto naturale esercita effetti battericitici e/o batteriostatici e se i profili di calore di Acinetobacter baumannii trattati sono simili ai termogrammi dei batteri trattati con i farmaci di riferimento di cui sopra.

I termogrammi ottenuti esponendo A. baumannii DSM-30008 alla ciprofloxacina nella diluizione seriale sono visualizzati nella Figura 1A. Le concentrazioni tra 0,005 M e 0,1 M hanno un effetto minimo sulla crescita e sul metabolismo di A. baumannii. Tuttavia, il trattamento delle cellule con 0,5 M ciprofloxacin porta ad un cambiamento significativo nella durata della fase di ritardo e a un minor flusso di calore massimo. Queste due modifiche insieme influiscono sul tempo di picco (Figura 1C), che viene aumentato di circa 6 ore. Nella Figura 1B, il calore cumulativo rilasciato viene tracciato rispetto al tempo. Qui, vediamo l'effetto delle concentrazioni, che si riflette da una pendenza di pendenza. La quantificazione dell'inclinazione del termogramma ci dà il tasso metabolico massimo di A. baumannii in presenza di ciprofloxacina come mostrato nella Figura 1D, dove possiamo osservare una diminuzione concomitante del tasso metabolico delle cellule trattate con 0,5 M ciprofloxacin. I cambiamenti del tasso metabolico delle cellule trattate con concentrazioni più basse sono minimi. Questo esperimento potrebbe essere ulteriormente migliorato con l'aggiunta di concentrazioni intermedie che coprono la gamma di 0,1-1 M per osservare un cambiamento graduale più pronunciato tra le concentrazioni che non hanno alcun effetto e una concentrazione con conseguente ritardo significativo della fase di ritardo e del tasso metabolico. Tuttavia, le tendenze del cambiamento supportano un MoA battericida di ciprofloxacina.

Figure 1A
Figura 1A: Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 1B
Figura 1B: Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 1C
Figura 1C: Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 1D
Figura 1D: Effetto della ciprofloxacina su A. baumannii DSM-30008 crescita e metabolismo. (A) Termogrammi indicati come flusso di calore (W) rispetto al tempo (h) per il tipo selvaggio (WT) A. baumannii DSM-30008, non trattati ed esposti alla ciprofloxacina. (B) Calore cumulativo (mJ) rispetto al tempo (h). (C) Tempo di picco (h) con barre di errore (deviazione standard). (D) Tasso metabolico (W) con barre di errore (deviazione standard). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nel caso della tetraciclina, non abbiamo osservato cambiamenti significativi nei termogrammi per tutte le concentrazioni testate fino alla fase esponenziale tardiva a partire dopo 8 ore (vedere la figura 2A). Tuttavia, si osservano importanti cambiamenti nelle emissioni di calore in fase stazionaria, dove il secondo picco del flusso di calore è significativamente ridotto per A. baumannii trattato con 5 M e 10 tetraciclina. Anche le concentrazioni più basse hanno avuto un effetto, che è stato comunque meno pronunciato. Questo effetto provoca anche un prolungamento nel tempo di picco come mostrato nella Figura 2C. Le curve di calore cumulative rilasciate (Figura 2B) mostrano che le cellule non trattate e trattate non mostrano differenze significative nella forma complessiva della curva, ma per tendenza, la pendenza delle curve diminuisce a concentrazioni più elevate di tetraciclina. Ciò si traduce anche in tassi metabolici quantificati visualizzati nella figura 2D, dove si osserva un effetto dipendente dalla concentrazione (cioè una diminuzione del tasso metabolico all'aumento delle concentrazioni di antibiotici). Questi risultati supportano il fatto che la tetraciclina ha un effetto batteriostatico.

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Figura 2A: Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2B: Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2C: Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2D: Effetto della tetraciclina sulla crescita e il metabolismo A. baumannii DSM-30008. (A) Termogrammi indicati come flusso di calore (W) rispetto al tempo (h) per il tipo selvaggio (WT) A. baumannii DSM-30008, non trattati ed esposti alla tetraciclina. (B) Calore cumulativo (mJ) rispetto al tempo (h). (C) Tempo di picco (h) con barre di errore (deviazione standard). (D) Tasso metabolico (W) con barre di errore (deviazione standard). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Effetti ancora più pronunciati possono essere osservati durante il trattamento di A. baumannii con l'inibitore della sintesi proteica chloramphenicol che si rivolge alla sottounità ribosomica 50S. L'esposizione all'aumento delle concentrazioni di cloamfenicolo porta al prolungamento della fase di ritardo e a cambiamenti significativi dell'attività metabolica nella fase stazionaria(Figura 3A e Figura 3B). Non si osserva alcun cambiamento nel tasso metabolico per la concentrazione più bassa testata e la più alta concentrazione di prova scelta (50 M) impedisce la maggior parte del rilascio di energia del campione. Osservando le concentrazioni intermedie di prova (5 M e 10 M), il tempo di picco è notevolmente aumentato di circa 8-9 ore (Figura 3C). Allo stesso tempo, il tasso metabolico delle cellule trattate è significativamente ridotto, con 50 M letali(Figura 3D). Nel complesso, i cambiamenti osservati a concentrazioni fino a 10 clorofenicol di M sono coerenti con un effetto batteriostatico di questa classe antibiotica.

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Figura 3A: Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3D: Effetto del clorafenicolo sulla crescita e il metabolismo A. baumannii DSM-30008. (A) Termogrammi indicati come flusso di calore (W) rispetto al tempo (h) per il tipo selvaggio (WT) A. baumannii DSM-30008, non trattati ed esposti al clorafenicol. (B) Calore cumulativo (mJ) rispetto al tempo (h). (C) Tempo di picco (h) con barre di errore (deviazione standard). (D) Tasso metabolico (W) con barre di errore (deviazione standard). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il trattamento della rifampicina nell'intervallo di concentrazione selezionato ha un effetto drammatico sui termogrammi di A. baumannii DSM-30008 relativi alla durata della fase di ritardo e agli effetti sulla crescita fino alla fase stazionaria tardiva (Figura 4A). Una significativa riduzione delle emissioni di calore può essere visto in Figura 4B che va con una diminuzione dell'attività metabolica. La figura 4C e la figura 4D illustrano l'influenza del prolungamento della fase di ritardo e dei cambiamenti dell'attività metabolica nella fase stazionaria. La figura 4C mostra un aumento preciso del tempo di picco per tutte le concentrazioni utilizzate. La figura 4D illustra la diminuzione del tasso metabolico causata dalla diminuzione della pendenza per tutte le concentrazioni che di solito è attribuita a un effetto battericida. A causa dell'uccisione indotto da antibiotici delle cellule batteriche, l'attività metabolica dovrebbe essere inferiore a causa di un minor numero di batteri attivi presenti. I dati raccolti sono in accordo con il fatto che la rifampicina può agire battericidale e batteriostatico, e i dati qui presentati supportano principalmente gli effetti batterici delle concentrazioni scelte.

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Figura 4D: Effetto della rifampicina su A. baumannii DSM-30008 crescita e metabolismo. (A) Termogrammi indicati come flusso di calore (W) rispetto al tempo (h) per il tipo selvaggio (WT) A. baumannii DSM-30008, non trattati ed esposti alla rifampicina. (B) Calore cumulativo (mJ) rispetto al tempo (h). (C) Tempo di picco (h) con barre di errore (deviazione standard). (D) Tasso metabolico (W) con barre di errore (deviazione standard). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La più bassa concentrazione di prova selezionata dell'antibiotico del prodotto naturale (0,25 M) non ha effetti marginali o solo marginali sul termogramma di A. baumannii DSM-30008. Tuttavia, altre concentrazioni testate presentano qualche effetto sulla durata della fase di ritardo e influenzano la crescita fino alla fase stazionaria tardiva (Figura 5A). L'effetto più evidente è la significativa riduzione delle emissioni di calore nella fase stazionaria. I dati visualizzati nella figura 5B mostrano chiaramente che l'energia rilasciata è significativamente diminuita per tutte le concentrazioni effettive e anche la pendenza è diminuita. Questi effetti si traducono in una diminuzione del tempo al picco (Figura 5C) e, cosa più importante, si osserva una diminuzione significativa e chiaramente dipendente dalla dose nel tasso metabolico (Figura 5D). L'indagine sul nuovo prodotto naturale mixobacterial ha rivelato un effetto batteriostatico e battericida combinato.

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Figura 5A: Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5B: Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5C: Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5D: Effetto di un nuovo prodotto naturale antibatterico su A. baumannii DSM-30008 crescita e metabolismo. (A) Termogrammi indicati come flusso di calore (W) rispetto al tempo (h) per il tipo selvaggio (WT) A. baumannii DSM-30008, non trattati ed esposti al prodotto naturale. (B) Calore cumulativo (mJ) rispetto al tempo (h). (C) Tempo di picco (h) con barre di errore (deviazione standard). (D) Tasso metabolico (W) con barre di errore (deviazione standard). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Selezione di un nuovo esperimento nell'interfaccia software. In un quadrato rosso viene raffigurato il passaggio per selezionare un nuovo esperimento. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 2: Denominazione di un nuovo esperimento nell'interfaccia software. In un quadrato rosso viene raffigurato il passaggio per nominare e confermare il nuovo esperimento. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 3: Avvio di un nuovo esperimento nell'interfaccia software. In un quadrato rosso viene raffigurato il passo per iniziare un nuovo esperimento. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 4: Ben selezione e reazione avviare nell'interfaccia software. Tutti i pozzetti di reazione sono selezionati (pozzi colorati in colore blu scuro, pulsante Seleziona tutto raffigurato in un quadrato rosso) e viene selezionato l'inizio della reazione (rappresentato in un quadrato rosso). Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 5: corretto caricamento del supporto della tazza. I pozzetti di riferimento sono selezionati (colore blu scuro, quadrato rosso) e i termogrammi vengono visualizzati in una finestra popup. Quando il carico viene eseguito correttamente, osserviamo un forte calo del segnale di emissione di calore rilevato che deve raggiungere una fase di altopiano e rimanere in questa fase per circa 2-3 min, poi il segnale ritorna al punto di partenza. Quando questo si osserva il carico del supporto della tazza è corretto. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 6: Fine dell'esperimento. In rosso, viene raffigurato il pulsante Interrompi nell'esperimento. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 7: Conferma della fine dell'esperimento. In rosso, viene illustrato il pulsante Sì per confermare la fine dell'esperimento in esecuzione. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 8: Salvataggio del file dell'esperimento. Viene visualizzata una finestra popup con le opzioni di salvataggio del file e in rosso viene raffigurato il pulsante Salva. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 9: Interfaccia software. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 10: Accesso agli esperimenti salvati. In rosso viene raffigurato il pulsante Apri esperimento per accedere agli esperimenti salvati. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 11: apertura del file dell'esperimento selezionato. In rosso viene raffigurato il pulsante Apri. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 12: visualizzazione pozzi predefinita. Tutti i ben sperimentali e i termogrammi corrispondenti sono visibili. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 13: Selezione dei pozzetti per l'analisi. In rosso viene raffigurato il pulsante Seleziona tutto. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 14: Definizione della linea di base. In rosso viene raffigurato il pulsante Definisci linea di base. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 15: Selezione del segnale di base. Viene selezionato un minimo di 30 min di segnale nella fase di ritardo (scatola rossa). Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 16: Salvataggio delle modifiche al file sperimentale. In rosso viene raffigurato il pulsante Salva. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 17: Applicazione di analisi Calorimetria basata sul Web. Vengono visualizzati l'interfaccia software online e il percorso di caricamento dei file. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 18: Caricamento del file sperimentale selezionato. In rosso viene raffigurato il pulsante Apri. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 19: Analisi dei termogrammi. I parametri metabolici calcolati per ogni pozzo sperimentale sono raffigurati in rosso. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 20: Adattare i dati sperimentali ai modelli di crescita teorica. I dati del flusso di calore sono adattati a un Gompertz o a un modello di crescita di Richard. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 21: Esportazione delle misurazioni. In rosso vengono raffigurati i pulsanti Scarica misure e Salva. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.

Discussion

La microcalometria isotermica misura l'energia emessa da un campione nel tempo e questo rilascio di energia è il risultato di tutti i processi biologici, fisici e (bio-)chimici. Il flusso di calore misurato può essere sfruttato per valutare o determinare gli effetti antibatterici delle sostanze in quanto consente un monitoraggio continuo in tempo reale dell'attività metabolica.

Per ottenere dati affidabili per l'analisi, è necessario determinare singolarmente le unità di formazione delle colonie di partenza corrette (CFU) per ogni specie o ceppo utilizzato. Nel caso in cui il numero di CFU sia troppo basso, questo porta a una fase di ritardo prolungata in quanto ci vuole più tempo perché il sistema raggiunga una quantità critica di biomassa che produce abbastanza calore da essere rilevato. Nel caso in cui il numero di CFU sia troppo alto, la fase di ritardo sarà molto breve e la quantità di calore prodotta può causare il trasferimento di calore alle celle vicine del sensore (pozzi di riferimento e sperimentali) e causare distorsioni dei termogrammi. Un numero elevato di CFU porterà anche ad un più veloce esaurimento di ossigeno e passare a condizioni anaerobiche. Va inoltre preso in considerazione che durante i primi 30 minuti dell'esperimento, quando il sistema è in equilibrio, la raccolta dei dati non è possibile e la registrazione effettiva degli effetti è ritardata. Inoltre, la determinazione errata della CFU porta alla falsa determinazione del MIC, che in ultima analisi influisce sull'esperimento e sui cambiamentiosservati 25. Un altro punto critico è la corretta determinazione della linea di base. Di solito, il segnale di base viene selezionato durante la fase di ritardo quando il segnale di flusso di calore è zero e idealmente, l'intervallo di tempo per la definizione della linea di base è >30 min. Tuttavia, questo non è sempre possibile in quanto il tempo che i batteri richiedono per raggiungere il limite di rilevamento del segnale di calore differisce tra ceppi e specie. Alcune specie o ceppi richiedono più di 30 minuti per raggiungere il limite di rilevamento del segnale di calore, mentre altri ceppi o specie lo raggiungono entro i primi 30 minuti. In tal caso, è possibile selezionare il segnale di base alla fine dell'esperimento quando tutti i segnali di calore sono scesi a zero e rimangono stabili. In alternativa, possono essere utilizzate linee di base da altri esperimenti con lo stesso ceppo batterico, il che non è tuttavia raccomandato.

Il sistema consente una certa flessibilità in termini di progettazione e ottimizzazione degli esperimenti e risoluzione dei problemi. I volumi utilizzati sono nell'intervallo di 100-300 L quando si utilizzano inserti in plastica e 100-600 L quando si utilizzano tazze in titanio senza gli inserti in plastica. Il volume di lavoro consigliato dal produttore è di 120 L. L'uso di diversi volumi nella creazione di una nuova serie sperimentale, e pur trovando condizioni ottimali per le misurazioni, ha un impatto principalmente su due parametri. Utilizzando volumi più bassi, la quantità di composto di prova richiesto può essere diminuita, che è particolarmente importante per i composti, che sono disponibili solo in piccole quantità. Inoltre, il volume utilizzato influisce direttamente sulla disponibilità di ossigeno durante la misurazione con volumi inferiori che aumentano la quantità di ossigeno disponibile necessaria per la crescita batterica. L'esaurimento dell'ossigeno è uno dei principali fattori che contribuiscono alla durata massima possibile dell'esperimento. È importante sottolineare che è possibile utilizzare supporti solidi, non solo supporti liquidi. Ciò è particolarmente importante per i microrganismi a crescita lenta, in quanto la crescita dell'interfaccia tra fase solida e gassogena consente un migliore accessoall'ossigeno 9.

IMC è un utile strumento analitico per scoprire processi sconosciuti con applicazioni in fisica, chimica e biologia. Il metodo misura lo scambio di calore all'interno di un sistema chiuso e l'analisi dello scambio di calore registrato fornisce informazioni aggiuntive che non possono sempre essere ottenute con metodi standard. Nella ricerca di microbiologia e antibiotici, uno dei maggiori vantaggi di IMC è la sua capacità di distinguere tra cellule vive, morte e persistenti o dormienti, che non è possibile utilizzando i metodi di torbidità standard11. Inoltre, IMC è altamente sensibile e può rilevare l'emissione di calore da appena 104-105 celle9. Un altro vantaggio è che la configurazione sperimentale è semplice e veloce e consente un monitoraggio continuo e in tempo reale con un'interferenza minima o nessuna da parte dell'utente. Inoltre, IMC non è distruttivo, il che consente un'ulteriore analisi dei campioni. L'analisi dei dati consente il disaccoppiamento della formazione della biomassa fino alla fase esponenziale tardiva o precoce e all'attività metabolica in fase stazionaria.

Oltre alle nuove ed entusiasmanti funzionalità dell'applicazione di cui sopra, ci sono anche svantaggi di questo metodo. La limitazione principale è che gli strumenti IMC misurano il calore totale prodotto e rilasciato all'interno di un sistema specifico, che includono anche segnali non specifici. Ciò evidenzia l'importanza della pianificazione sperimentale con controlli appropriati per poter valutare i cambiamenti del segnale di calore misurati registrando il flusso dicalore 9,20.

Nelle nostre mani, IMC è uno strumento importante per studiare gli effetti antibatterici di nuovi prodotti naturali e per determinare le gamme di concentrazione efficaci. Oltre a differenziare gli effetti batteriostatici e batteriricidi, potrebbe essere utilizzato in futuro come parte degli studi di identificazione del bersaglio e della determinazione del MoA. Questo può essere fatto confrontando termogrammi di diverse classi di antibiotici a termogrammi di nuovi composti attivi come mostrato qui. Tuttavia, è ancora necessario verificare se alcuni parametri quantificabili che possono essere estratti dai dati misurati siano sufficienti per tali confronti o se sarà necessario lavorare su algoritmi che dia impronte digitali basate su termogrammi completi. Un'altra possibile applicazione nel campo della ricerca antibiotica è il confronto tra wildtype e cloni resistenti, insieme al sequenziamento dell'intero genoma, che può aiutare a chiarire la modalità di resistenza (MoR) dei nuovi antibatterici. A causa della natura statica del metodo, lo studio dell'efficacia di nuovi agenti sulla formazione di biofilm o su biofilm già stabiliti potrebbe portare a una migliore comprensione del processo biologico e dell'effetto di agenti selezionati sui microbi in diverse fasi di dormienza. IMC registra l'energia totale rilasciata sotto forma di calore rendendolo un metodo adatto per studiare anche gli effetti sub-inibitori di sostanze attive che potrebbero essere accoppiate alla trascridamica. Questo metodo può essere utilizzato anche in ambienti clinici per rilevare la contaminazione dei campioni o per la determinazione di antibiogrammi contribuendo a decidere rapidamente il trattamento definito dei pazienti11.

Disclosures

Il progetto è stato eseguito in collaborazione con Symcel, sviluppatore della tecnologia calScreener. Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano il team di Symcel per le fruttune discussioni e vorremmo riconoscere il grande sostegno di Ganna Oliynyk e Wilhelm Paulander. Ringraziamo anche Daniel Kohnh-user per aver fornito il prodotto naturale e Stefanie Schmidt per un abile supporto tecnico.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acinetobacter baumannii DSMZ DSM-30008 reference strain used in this study
calPlate Symcel 1220093 48-well plate for titanium cups to be inserted
calScreener Symcel 1200001 isothermal microcalorimetry instrument
calView software Symcel collection and analysis software
calWell Symcel 1901004 micro-bio grade (non-active) 48-well plate with plastic inserts which are inserted into the titanium cups
CASO agar Carl Roth X937.1 isolation and cultivation of microorganisms
Chloroamphenicol Sigma-Aldrich C0378 antibiotic
Ciprofloxacin Sigma-Aldrich 17850 antibiotic
Cuvettes Brand 759015 1.5 mL cuvettes
Disposable inoculation loops Sarsted 86.1562.050 10 µL inoculation loops
Dimethylsulfoxid (DMSO) Thermo Fisher Scientific 85190
Eppendorf tubes Eppendorf 30120086 1.5 mL eppendorf safe-lock tubes
Ethanol Thermo Fisher Scientific 10428671
Falcon Tubes Sarsted 62.554.502 15 mL falcon tubes
Hydrochloride (HCL) Thermo Fisher Scientific 10316380
Methanol Thermo Fisher Scientific A412-500
Mueller Hinton Broth Sigma-Aldrich 70192 liquid medium for antibiotic susceptibility studies
Mueller Hinton Broth II cation adjusted media Sigma-Aldrich 90922 Mueller Hinton Broth cation-adjusted to 1.25 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2
Petri dishes LABSOLUTE 7696404
Pipette 100 - 1000 µL Brand 705880
Pipette 2 - 20 µL Brand 705872
Pipette 20 - 200 µL Brand 705878
Pipette tips 100 - 1000 L Brand 732032
Pipette tips 2 - 200 µL Brand 732028
Polymyxin B sulfate Sigma-Aldrich P0972 antibiotic
Rifampicin Sigma-Aldrich R3501 antibiotic
Serological pipette Thermo Fisher Scientific 170356N 10 mL Nunc serological pipette
Spectrophotometer Eppendorf AG 6135 000.017
Sterile filters Minisart 16534----------K 0.2 µm pore size sterile filters
Syringe 50 mL NORM-JECT 22778
Tetracycline Sigma-Aldrich 87128 antibiotic
Titanium cups Symcel 1220089 inserted in 48-well titanium calPlate
Titanium lids Symcel 1220091 screwed and tightend to the titanium cups
Trimethroprim Sigma-Aldrich T7883 antibiotic
Tweezers Symcel 1900602

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References

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Profilazione metabolica per determinare gli effetti batterici o batteriosfondi dei nuovi prodotti naturali utilizzando la microcalorimetria isotermica
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Cirnski, K., Coetzee, J., Herrmann, J., Müller, R. Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry. J. Vis. Exp. (164), e61703, doi:10.3791/61703 (2020).More

Cirnski, K., Coetzee, J., Herrmann, J., Müller, R. Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry. J. Vis. Exp. (164), e61703, doi:10.3791/61703 (2020).

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