Summary
يصف هذا البروتوكول إعداد شرائح قشرة الأنف -entorhinal الأفقية (HEC) من الفئران التي تظهر نشاطًا عفويًا لموجة حادة. يتم احتضان الشرائح في غرفة احتجاز واجهة مبسطة ويتم تنفيذ التسجيلات في ظروف مغمورة مع السائل النخاعي الاصطناعي المتدفق بسرعة لتعزيز الأوكسجين الأنسجة والظهور التلقائي للنشاط على مستوى الشبكة.
Abstract
القوارض الحادة تشريح الدماغ يقدم نهجا تجريبيا يمكن الحصول على نظرة ثاقبة في تنظيم ووظيفة الدوائر العصبية مع دقة خلية واحدة باستخدام الفيزيولوجيا الكهربائية، والمجهر، والصيدلة. ومع ذلك ، فإن أحد الاعتبارات الرئيسية في تصميم التجارب في المختبر هو مدى استشرافات شريحة مختلفة من الأنماط الطبيعية للنشاط العصبي كما لوحظ في الجسم الحي. في الدماغ سليمة، شبكة فرس النهر يولد النشاط السكاني متزامنة للغاية تعكس الحالة السلوكية للحيوان، كما يتضح من مجمعات موجة حادة تموج (SWRs) التي تحدث أثناء الاستيقاظ الدول المستهلكة أو النوم غير REM. يمكن أن تظهر SWRs وغيرها من أشكال نشاط الشبكة بشكل عفوي في شرائح فرس النهر المعزولة في ظل الظروف المناسبة. من أجل تطبيق مجموعة أدوات شريحة الدماغ القوية للتحقيق في نشاط شبكة فرس النهر ، من الضروري استخدام نهج يحسن صحة الأنسجة والحفاظ على الاتصال الوظيفي داخل شبكة فرس النهر. يتم ذبذبة الفئران عبر القلب مع السائل النخاعي الاصطناعي البارد القائم على السكروز. يتم قطع الشرائح الأفقية التي تحتوي على قرن آمون بسمك 450 ميكرومتر للحفاظ على الاتصال المتشابك. تسترد الشرائح في غرفة على غرار الواجهة ويتم نقلها إلى غرفة مغمورة للتسجيلات. تم تصميم غرفة التسجيل للضخ السطحي المزدوج للسائل النخاعي الاصطناعي بمعدل تدفق مرتفع لتحسين أكسجة الشريحة. هذا البروتوكول ينتج أنسجة صحية مناسبة للتحقيق في نشاط الشبكة المعقد والعفوي في المختبر.
Introduction
القياس الكهربائي من شرائح فرس النهر الحية في المختبر هو نهج تجريبي قوي مع العديد من المزايا. يمكن للمجرب استخدام المجهر ، micromanipulators ، ونظام تسجيل لتصور مباشرة وجمع القياسات من الخلايا العصبية الفردية في الأنسجة. شرائح الأنسجة هي أيضا في متناول جدا للتجارب الضوئية أو المخدرات أو تسليم للتجارب optogenetic، كيموجينيك، أو الدوائية.
شبكة فرس النهر يولد النشاط السكاني متزامن للغاية في الجسم الحي، مرئية كما التذبذبات في المجال المحلي خارج الخلية المحتملة1،2،3،4،5. وقد تم الاستفادة من أساليب شريحة الدماغ للحصول على نظرة ثاقبة في الآليات الخلوية والدوائر الكامنة في هذه التذبذبات شبكة الخلايا العصبية. العمل التأسيسي من ماير وآخرون أظهرت أن مجمعات موجة حادة تموج (SWRs) يمكن أن تظهر تلقائيا في شرائح من الحصين البطني6,7. وقد أوضحت الدراسات اللاحقة من العديد من المحققين تدريجيا العديد من جوانب SWRs، بما في ذلك دور neuromodulators في تنظيم حالة شبكة قرن آمون8،9،10 والآليات متشابك التي تدفع إعادة تنشيط في المختبر من الفرق العصبية النشطة سابقا خلال السلوك في الجسم الحي11. كما وفرت تجارب شريحة الدماغ نظرة ثاقبة في تذبذب نطاق جاما (30-100 هرتز)، وهي حالة شبكة فرس النهر متميزة يعتقد أنها تدعم ترميز الذاكرة واستدعاء12،13. وأخيرا، الاعتراف بالدور المركزي لحصان القرن والهياكل المرتبطة بها في الفيزيولوجيا المرضية للصرع الفص الصدغي14،15، وقد استخدم الباحثون الاستعدادات شريحة قرن آمون للتحقيق في توليد وانتشار نشاط الصرع. أثبت كارتر وآخرون أن شرائح قشرة الأنف المدمجة المعدة من الحيوانات المصابة بالصرع المزمن يمكن أن تولد تلقائياً إفرازات الصرع في المختبر16. في وقت لاحق، Karlócai وآخرون استكشاف الآليات الكامنة الكامنة في إفرازات الصرع في شرائح فرس النهر باستخدام السائل النخاعي الاصطناعي المعدل (ACSF) مع تركيزات أيونة معدلة (مخفضة Mg2+ أو مرتفعة K+) أو الأدوية المضافة (4AP أو gabazine)17.
وقد طور المحققون العديد من نهج شريحة قرن آمون التي تختلف بطرق رئيسية: (1) منطقة الحصين الواردة في الشريحة (الظهرية، وسيطة، أو فينتيال)؛ (1) منطقة الحصين الموجود في شريحة فرسان( (2) وجود أو عدم وجود أنسجة خارج المخيمات مثل قشرة الأنف؛ (3) التوجه المستخدم لقطع شرائح (إكلية، القوس، الأفقي، أو مائل)؛ و (4) الظروف التي يتم الحفاظ على الأنسجة بعد التقطيع (مغمورة بالكامل في ACSF أو عقدت في واجهة ACSF ورطوبة، وcarogen الغنية الهواء).
اختيار أي نهج تشريح للاستخدام ينبغي أن يحددها الهدف التجريبي. على سبيل المثال، تم استخدام شرائح عرضية أو إكليلية من الحصين الظهري الحفاظ على الظروف المغمورة بشكل فعال جدا للتحقيق في الدوائر داخل الحمل واللدونة متشابك18،19،20. ومع ذلك، فإن مثل هذه الاستعدادات لا تولد تلقائيا التذبذبات الشبكة بسهولة كما شرائح من الحصين البطني21،22،23. على الرغم من أن حالة من نشاط SWR المستمر يمكن أن يكون سببها التحفيز tetanic في شرائح عرضية من الحصين الظهري والبينتال24, ويلاحظ أكثر SWRs عفوية بسهولة في شرائح بطنية7,25.
ويدعم التمييز الفسيولوجية والتشريحية المتأصلة بين الحصين الظهري وقنين البطني من خلال الدراسات التي أجريت في كل من الجسم الحي وفي المختبر26. وكشفت التسجيلات في الفئران إيقاعات ثيتا متماسكة بقوة في جميع أنحاء الحصين الظهري والمتوسط، ومع ذلك ضعف التماسك بين منطقة البطن وبقية الحصين27. SWRs في الجسم الحي تنتشر بسهولة بين الحصين الظهري والمتوسط، في حين SWRs التي تنشأ في الحصين البطني غالبا ما تبقى المحلية28. الإسقاطات الجمعياتية التي تنشأ من الخلايا العصبية الهرمية CA3 التي توجد في مشروع الحصين الظهري والمتوسط مسافات طويلة على طول المحور الطولي من الحصين. CA3 التوقعات التي تنشأ من المناطق فينترال لا تزال محلية نسبيا، وبالتالي أقل احتمالا أن تكون مقطوعة خلال عملية تشريح29،30. لذلك، قد تحافظ شرائح البطينال على الشبكة المتكررة اللازمة لتوليد تزامن السكان. قد يعكس ميل شرائح البطن لتوليد أنشطة الشبكة العفوية في المختبر أيضًا إثارة جوهرية أعلى للخلايا العصبية الهرمية أو تثبيط GABAergic الأضعف في الحصين البطني مقارنة بالمناطق الظهرية31. في الواقع، شرائح فرس النهر البطني هي أكثر عرضة لنشاط الصرع32،33. وهكذا، استخدمت العديد من الدراسات الفيزيولوجية العفوية8،9،11،24 أو المرضية16،34،35،36 تذبذب شبكة تقليديا نهج التقطيع الأفقي ، وأحيانا مع زاوية طفيفة في اتجاه الأمامية القذال ، والتي تنتج شرائح الأنسجة موازية للطائرة عرضية من الحصين البطني.
يتأثر اتصال الشبكة بشكل لا مفر منه من قبل إجراء التقطيع حيث سيتم قطع العديد من الخلايا في الشريحة. وينبغي النظر في زاوية وسمك شريحة والأنسجة التي تحتفظ بها في إعداد لتحسين الاتصال في دوائر الاهتمام. وقد استخدمت العديد من الدراسات الأفقية مجتمعة شرائح قشرة entorhinal فرس النهر (HEC) لاستكشاف التفاعلات بين الهيكلين في سياق التذبذبات الفسيولوجية أو المرضية الشبكة. روث وآخرون تنفيذ تسجيلات مزدوجة من ca1 subfield من الحصين وطبقة V من القشرة entorhinal وسيط لإثبات انتشار نشاط SWR من خلال شريحة HEC37. وقد استخدمت العديد من الدراسات من النشاط الصرع إعداد شريحة HEC للتحقيق في كيفية انتشار إفرازات الصرع من خلال شبكة كورتيكوهيبابوكامبال16,35,36,38. من المهم أن نلاحظ أن الحفاظ على حلقة الكورتيكوهيبابوكامبال سليمة ليست شرطا مسبقا لSWRs عفوية, إفرازات الصرع, أو ذبذبات غاما; يمكن أن تنشأ التذبذبات الشبكية في شرائح عرضية من الحصين الظهري أو البطني مع عدم وجود أنسجة باراهيبابوكامبي المرفقة21،22،23، 25،39،40،41. وهناك عامل أكثر أهمية لتوليد التلقائية من التذبذبات الشبكة في شرائح فرس النهر قد يكون سمك كل شريحة، كما شريحة سمكا (400-550 μm) سوف تحافظ على المزيد من الاتصال في CA2/CA3 شبكة متكررة21،22،25.
على الرغم من أن شرائح هيك الأفقي الزاوية (قطع مع ما يقرب من 12 درجة زاوية في اتجاه الأمامية القذالي) وقد استخدمت لدراسة الاتصال الوظيفي من حلقة كورتيكوهيبابوكامبال11,16,34,35,42, لا يلزم مثل هذه الاستعدادات الزاوية لنشاط شبكة عفوية43,44,45. ومع ذلك ، فإن استخدام طائرة تشريح الزاوية لا يسمح للمحقق لجعل انتقائي شرائح تحافظ على أفضل شكل من الأشكال على lamellae عرضية المنحى من قرن آمون البطني أو المتوسط ، اعتمادا على ما إذا كان يتم تطبيق زاوية نزولية أو تصاعدية(الشكل 1). هذا النهج هو مشابه من الناحية المفاهيمية لتلك التي يستخدمها Papatheodoropoulos وآخرون، 2002، الذين تشريح كل قرن آمون الحرة ثم استخدم مروحية الأنسجة لإنشاء شرائح عرضية على طول المحور البطني الظهري بأكمله21. في ضوء التمييز الوظيفي المذكور أعلاه بين قرن آمون البطني والحصن الظهري الوسيط، ينبغي للمحققين النظر في الأصل التشريحي للشرائح عند تصميم التجارب أو تفسير النتائج. استخدام منحدر أجار أثناء إجراء تشريح هو وسيلة بسيطة لإنتاج شرائح بشكل تفضيلي من إما قرن آمين المتوسطة أو البطنية.
يمكن الحفاظ على شرائح فرس النهر إما في غرفة مغمورة (مع الأنسجة مغمورة بالكامل في ACSF) ، أو غرفة على غرار الواجهة (مثل غرفة أوسلو أو هاس ، مع شرائح مغطاة فقط بغشاء رفيع من الوسائط المتدفقة). صيانة واجهة يعزز الأوكسجين من الأنسجة, الذي يعزز بقاء الخلايا العصبية ويسمح لمستويات عالية مستدامة من النشاط interneuronal. تقليدياً، تستخدم ظروف التسجيل المغمورة معدل تدفق أبطأ ACSF لا يوفر الأكسجين الكافي للأنسجة للتعبير المستقر عن التذبذبات على مستوى الشبكة. في فرس النهر المغمورة شرائح تذبذبات غاما الناجمة عن carbachol لوحظ فقط عابرة46،47، في حين أنها يمكن أن تكون ثابت في غرف تسجيل واجهة10،48،49. على هذا النحو، وقد اعتمدت العديد من الدراسات من النشاط العفوي المعقدة في المختبر على غرف تسجيل واجهة للتحقيق في مجمعات موجة حادة تموج6،7،8،9،10،25،37، ذبذبات غاما10،13، والنشاط الصرع16،38،45،47.
في غرفة تسجيل على غرار مغمورة، يمكن استخدام هدف المجهر الغمر لتصور الخلايا الفردية واستهداف انتقائي الخلايا صحية المظهر للتسجيلات. كما يسمح الإعداد المغمور بالسيطرة الدقيقة على الوسط الخلوي ، حيث يسهل الغمر الانتشار السريع للأدوية أو المركبات الأخرى في الأنسجة. وهكذا، فإن أي منهجية معدلة يتم فيها الحفاظ على التذبذبات الشبكية المستقرة في ظروف مغمورة تمثل نهجاً تجريبياً قوياً. ويتمثل هذا النهج في عمل Hájos وآخرون، حيث تسترد شرائح فرس النهر في غرفة احتجاز مبسطة على غرار الواجهة لعدة ساعات قبل نقلها إلى غرفة تسجيل مغمورة معدلة مع معدل تدفق مرتفع من ACSF (~6 مل/دقيقة) لتعزيز إمدادات الأكسجين إلى الأنسجة12،48،49. وفي ظل هذه الظروف، يمكن الحفاظ على مستويات عالية من نشاط التورين الداخلي والتذبذبات الشبكية التلقائية المستقرة في غرفة تسجيل مغمورة. هذا النهج المعدل يسمح للمحققين لأداء بصريا تسترشد كامل خلية التصحيح التسجيلات المشبك وتوصيف مساهمة أنواع الخلايا التي تم تحديدها شكليا لذبذبات غاما الناجمة عن كارباكول12. يمكن أن تحدث SWRs أيضا بشكل عفوي في شرائح فرس النهر المغمورة مع معدل تدفق سريع من ACSF11،48،49. ماير وآخرون أظهرت أن شرائح فرس النهر التي تعافت في غرفة واجهة قبل نقلها إلى غرفة تسجيل مغمورة أظهرت بشكل موثوق SWRs عفوية، في حين أن الشرائح التي تعافت غارقة في beaker قبل نقلها إلى غرفة تسجيل مغمورة أظهرت استجابات ميدانية أصغر، ومستويات أقل من التيارات متشابك عفوية، ونادرا جدا جدا أظهرت SWRs عفوية43. استخدم Schlingloff وآخرون هذه المنهجية المحسنة لإثبات دور خلايا السلة التي تعبر عن البارفالومين في توليد SWRsالتلقائي 44.
البروتوكول التالي يقدم طريقة تشريح من خلالها الخلايا العصبية النشطة تلقائيا في شرائح فرس النهر الأفقي يمكن استردادها في ظل ظروف واجهة والاحتفاظ بها في وقت لاحق في غرفة تسجيل مغمورة مناسبة للتلاعب الدوائية أو optogenetic والتسجيلات الموجهة بصريا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت على جميع الطرق المذكورة هنا من قبل لجنة الرعاية الحيوانية المؤسسية واستخدامها في جامعة كولومبيا (AC-AAAU9451).
1. إعداد الحلول
- إعداد محلول السكروز لقطع تقطيع كما هو موضح في الجدول 1.
ملاحظة: بعد إعداد 1 لتر من محلول السكروز، قم بتجميد كمية صغيرة (حوالي 100-200 مل) في صينية الثلج. سيتم مزج مكعبات الثلج السكروز المجمدة هذه في الطين الجليدي (انظر الخطوة 4.3). - تحضير السائل النخاعي الاصطناعي (ACSF) للتسجيل كما هو موضح في الجدول 2.
- إعداد 1 م من NaCl لتحفيز الماصات عن طريق حل 0.05844 غرام من NaCl في 1 مل من المياه النقية التي تم تصفيتها لإزالة المعادن النزرة والشوائب الأخرى.
ملاحظة: محلول Sucrose للقطع وينبغي إعداد ACSF طازجة لكل تجربة.
2. إعداد منحدر أجار
- إعداد 4٪ أجار (على سبيل المثال، 2 غرام من أجار في 50 مل من الماء) عن طريق حل مسحوق أغار في المياه النقية التي تمت تصفيتها لإزالة المعادن النزرة وغيرها من الشوائب. سخني الخليط في الميكروويف حتى يبدأ في الغليان (حوالي 30-60 s). صب أجار المنصهر في قالب والسماح لها لتبرد وتتوطد في 4 °C في الثلاجة في منحدر 12 درجة تقريبا.
ملاحظة: بالنسبة للقالب، يمكن للمرء استخدام أي حاوية زجاجية أو بلاستيكية في زاوية، مع ما يكفي من أجار المنصهر سكب في لتشكيل منحدر من 4 سم في الطول وحوالي 0.8 سم في الارتفاع.
3. مرحلة منطقة التقطيع
- ملء 400 مل من القارب التي تحتوي على غرفة الانتعاش شريحة مع ما يقرب من 250 مل من ACSF; وضعه في حمام مائي الدفء إلى 32 درجة مئوية وتبدأ مع كاربوجين (95٪ غاز الأكسجين / 5٪ غاز ثاني أكسيد الكربون).
ملاحظة: ملء الكانسر الانتعاش مع السوائل فقط بما فيه الكفاية لوضع شبكة النايلون من غرفة عقد في سطح المحلول، بحيث سيتم عقد شرائح في واجهة من خليط حل دافئ والهواء(الشكل 1). ضع قطع صغيرة من ورق العدسة على شبكة النايلون. ستستلقي الشرائح فوق ورق العدسة، والتي يمكن استخدامها لاحقًا لنقل الشرائح بشكل فردي إلى غرفة التسجيل (انظر الخطوة 6.6). - وضع قارورة مع محلول السكروز في دلو الثلج لتهدئة وتبدأ محتدما مع كاربوجين.
ملاحظة: يجب أن يكون محلول الاستخلاص من الزخرف والمبردين دافئين ومبردين، على التوالي، مع فقاعات كاربوجين لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل وضع الماوس في غرفة الأيزوفلوران. - سحب صينية من قبل مسبقة، المجمدة محلول السكروز مكعبات الثلج من الثلاجة ومكان على مقاعد البدلاء لذوبان جزئيا.
- ضع نصف شفرة حلاقة نظيفة ذات حدين في الدقيقة ومعايرتها إذا لزم الأمر. جانبا النصف الآخر من شفرة الحلاقة لاستخدامها أثناء تشريح.
- تشغيل خط كاربوجين ودرجة الحرارة التحقيق في غرفة تشريح وتحيط مع الجليد لتهدئة الغرفة.
- إعداد مقعد نظيفة أو طاولة مغطاة مع اثنين من منصات ماصة المتاح. وضع جميع أدوات التشريح وثلاث قطع من شريط المختبر على لوحة اليسار، حيث سيتم تنفيذ الضخ عبر القلب.
ملاحظة: أدوات تشريح تشمل مقص بون الصغيرة، مقص تشريح، ملعقة كبيرة / ملعقة، ميكروبساتولا، مشرط مع شفرة جديدة، ملعقة، مقص جراحية حادة / حادة، ملقط الأنسجة الكبيرة، وملقط الأنسجة الصغيرة (انظر جدول المواد). - على لوحة ماصة أخرى إلى يمين منطقة الضخ، ضع قطعة دائرية من ورقة تصفية في غطاء طبق بيتري الزجاج قطره 100 ملم. ضع الجزء السفلي من طبق بيتري بجوار الغطاء ووضع خط كاربوجين في كل من قطع الطبق.
- استخدام شفرة الحلاقة أو مشرط لقطع منحدر صغير من أجار (ما يقرب من 4 سم على طول سطح الزاوية، 0.8 سم في الارتفاع، 2 سم في العرض). قطع قطعة من المنحدر من نهاية طويل القامة وعكسه لخلق كتلة دعم من أجار. استخدام لاصق سيانوكريلات للصق منحدر أجار وكتلة دعم إلى منصة تشريح وتوضع جانبا.
ملاحظة: كتلة دعم أجار يساعد على استقرار الدماغ أثناء التقطيع ويوفر السطح الذي تشريح بعيدا الأنسجة غير الضرورية من كل شريحة(الشكل 1).
4. الانفعال عبر القلب
- تعليق حقنة سعة 60 مل كخزان لمحلول قطع السكروز حوالي 18 بوصة فوق سطح المقعد (على سبيل المثال، باستخدام مشبك دوار ثلاثي المحاور على وظيفة رأسية). نعلق أنابيب إلى الجزء السفلي من الخزان، تشغيل الأنابيب من خلال المشبك الأسطوانة، وربط الطرف الآخر من الأنبوب إلى إبرة نظيفة 20 G.
- ملء خزان 60 مل مع ما يقرب من 30 مل من محلول السكروز المبردة وتوجيه خط كاربوجين في خزان السكروز لافقاعات باستمرار perfusate.
ملاحظة: تأكد من أن السكروز يتدفق عبر الأنابيب والإبرة دون أي فقاعات المحاصرين. يجب أن يكون معدل التدفق سريعًا بما يكفي للحصول على تيار ثابت ومستمر من السكروز اليقطر من الإبرة. - باستخدام الخلاط، سحق ومزج السكروز المجمدة في الطين الجليدية واستخدام ملعقة كبيرة / ملعقة لتوزيع الطين.
- وضع كمية صغيرة من الطين السكروز حول حواف غطاء طبق بيتري الزجاج. إضافة كمية صغيرة من الطين السكروز إلى أسفل طبق بيتري.
- إضافة ما يقرب من 20-30 مل من الطين السكروز إلى خزان السائل فيض، خلط جيدا مع 30 مل من السكروز السائل المبرد حتى الخزان يحتوي على خليط من السكروز الباردة جدا، في الغالب السائل مع بعض المحلول المجمدة المتبقية.
- ضع الماوس في غرفة متصلة بمرذاذ ايزوفلوران. مع تدفق الأكسجين في حوالي 2 لتر / دقيقة، بدوره الطلب الهاتفي من المبخر لتقديم ايزوفلوران في تركيز 5٪ وبدء جهاز توقيت.
ملاحظة: حافظ على هذا المؤقت طوال دورة التقطيع لقياس مدى سرعة الحصول على الشرائح. وينبغي أن يتم الإجراء في أسرع وقت ممكن، بحيث تشريح كاملة، والأنسجة يتعافى في غرفة واجهة في غضون 15-20 دقيقة من الحيوان دخول غرفة isoflurane. مشاهدة الماوس لضمان تحقيق حالة من التخدير العميق. بعد حد أدنى من 5 دقائق، يجب أن يكون الماوس تخدير عميق ولا يستجيب لقرص إصبع. - قبل إزالة الماوس مباشرة من غرفة isoflurane، املأ غطاء طبق بيتري بمحلول السكروز المبرد إلى عمق 3-5 مم تقريبًا وملء قاع طبق بيتري بمحلول سكروز مبرد بعمق 1.0 سم تقريبًا.
- نقل الماوس بسرعة إلى لوحة ماصة اليسار واستخدام 3 قطع من الشريط لتأمين forelimbs والذيل. إجراء قرصة إصبع قدم من hindlimb للتأكد من أن الماوس لا يستجيب قبل أن يتم تنفيذ أي شق. باستخدام ملقط الأنسجة الكبيرة والمقص الجراحي، خيمة الجلد وجعل شق بالطول من الجزء السفلي من القص إلى أعلى الصدر. باستخدام ملقط سحب ما يصل على القص واستخدام مقص لقطع من خلال الحجاب الحاجز.
ملاحظة: ينبغي أن يتم تنفيذ تحديد المواقع الأولية للماوس والشقوق عدة الأولى لقطع الحجاب الحاجز بأسرع وقت ممكن لضمان عدم استعادة الماوس وعيه. لضمان عمق كاف من التخدير طوال العملية، يمكن وضع مخروط الأنف على الماوس لتقديم ايزوفلوران أثناء الضخ. - استخدام مقص لقطع من خلال القفص الصدري على كل جانب، وقطع في حركة واحدة كبيرة نحو النقطة التي يلتقي فيها forelimb الجسم. مع ملقط، سوينغ الجزء الأمامي من القفص الصدري بعيداً و ups نحو الرأس، ثم قم بإزالته بالكامل بقطع أفقي باستخدام المقص الكبير. أمسك القلب في مكانه باستخدام ملقط كبير وأدخل إبرة الضخ 20 G في البطين الأيسر. بمجرد وضع الإبرة بشكل صحيح ، يجب أن يكون الجانب الأيسر من القلب شاحبًا بسرعة لأن محلول السكروز المبرد يملأ البطين.
- استخدم مقص التشريح الصغير لقطع الأذين الأيمن والسماح للدم بالتدفق من الدورة الدموية. إذا تم تنفيذ الشقوق بشكل صحيح ، يجب أن يكون هناك ضرر بسيط للقلب ، ويجب أن يستمر في الضخ طوال الضخ.
ملاحظة: يمكن استخدام قطع من ورق الأنسجة المدلفنة للتخلص من الدم وحل السكروز من القلب والحفاظ على رؤية إبرة التسريب أثناء الإجراء. - تأكد من أن إبرة التسريب تبقى في مكانها ولا تسقط من البطين الأيسر. مع معدل تدفق السليم والتنسيب، وسوف تبدأ الكبد إلى شاحب إلى اللون تان / البيج الخفيفة مع 20-30 s.
- بعد 30-45 s، استخدم مقص كبير لقطع رأس الماوس. عقد الرأس في اليد اليسرى، ودفع أو قشر الجلد بعيدا عن الجمجمة. في مُندمج جيداً، يجب أن تكون الجمجمة شاحبة جداً، وينبغي أن يظهر الدماغ بلون وردي فاتح جداً (يقترب من اللون الأبيض) من خلال الجمجمة دون أن تظهر الأوعية الدموية بوضوح.
5. استخراج الدماغ وقطع شرائح
- باستخدام مقص بون الصغيرة، جعل اثنين من التخفيضات الجانبي من خلال الجمجمة نحو خط الوسط في الجزء الأمامي من الجمجمة، بالقرب من العينين. قم بعمل جرحين إضافيين على جانبي قاعدة الجمجمة.
- نقل الرأس إلى الجزء السفلي من طبق بيتري الزجاج حيث ينبغي أن تكون مغمورة في الغالب في محلول السكروز المبردة. استخدم مقص بون الصغير لقطع خط الوسط على طول الجمجمة ، وسحب ما يصل مع المقص لتقليل الضرر الذي يلحق بأنسجة الدماغ الأساسية. باستخدام ملقط الأنسجة الصغيرة، فهم بحزم كل جانب من الجمجمة والتأرجح لأعلى وبعيدا عن الدماغ، مثل فتح كتاب.
- استخدام أصابع اليد اليسرى لعقد اللوحات من الجمجمة مفتوحة وإدراج microspatula تحت الدماغ بالقرب من المصابيح الشمية. قم بقلب الدماغ من الجمجمة إلى السكروز واستخدم الميكروساتولا لقطع جذع الدماغ. اغسل الدماغ لإزالة أي دم متبقي أو فرو أو أنسجة أخرى.
- استخدام ملعقة كبيرة / ملعقة لنقل الدماغ إلى غطاء طبق بيتري الزجاج. مع النصف الآخر من شفرة الحلاقة ذات الحدين وضعت سابقا جانبا، وجعل اثنين من التخفيضات التاجية لإزالة المخيخ أولا ثم الجزء الأمامي من الدماغ، بما في ذلك المصابيح الشمية (الشكل 1).
- تطبيق مادة السيانواكريلات لاصقة على منحدر أجار. وضع الدماغ لفترة وجيزة جدا على قطعة من ورقة مرشح الجافة باستخدام ملقط الأنسجة الكبيرة ومن ثم نقله على الفور إلى منحدر أجار، ووضع السطح البطني للدماغ على لاصقة.
ملاحظة: بالنسبة لشرائح قرن آمون المتوسطة، ينبغي توجيه الدماغ مع الأمامي التي تواجه المنحدر من المنحدر، والخلفي أقرب إلى شفرة. بالنسبة لشرائح الحصين البطني، قم بتوجيه الدماغ مع الطرف الأمامي إلى أسفل منحدر المنحدر، مع الطرف الخلفي في الجزء العلوي من المنحدر، بعيداً عن النصل. في كلتا الحالتين، يجب وضع الدماغ في الجزء العلوي من المنحدر، بحيث السطح التاجي قطع من الدماغ اتصالات كتلة دعم أجار(الشكل 1). - ضع منصة التقطيع مع أجار والدماغ في غرفة التقطيع من microtome واغمرها تمامًا مع محلول السكروز المبرد. استخدام ملعقة كبيرة / ملعقة لنقل بعض الطين السكروز إلى الغرفة، واثارة لإذابة أي السكروز المجمدة وتسقط بسرعة إلى أسفل درجة حرارة الخليط إلى ~ 1-2 درجة مئوية.
ملاحظة: مشاهدة مقياس درجة الحرارة في جميع أنحاء تشريح. إذا كان محلول السكروز يدفأ فوق 3 درجة مئوية، أضف المزيد من الملاط واخلطه ل تنخفض درجة الحرارة مرة أخرى. - قطع شرائح بسمك 450 ميكرومتر مع سرعة microtome تعيين إلى 0.07 مم / ث. كما يتم تحرير كل شريحة، واستخدام ملقط الأنسجة الصغيرة ومشرط حاد لفصل أول نصفي الكرة الأرضية، ومن ثم لقطع بعيدا الأنسجة حتى شريحة يتكون في المقام الأول من قرن آمون ومناطق باراهيببكامبال (الشكل 1).
- استخدام ماصة نقل البلاستيك لنقل شرائح بشكل فردي إلى غرفة الانتعاش واجهة، وضمان أن يتم وضعها في واجهة ACSF والهواء مع الغضروف الغضروف رقيقة فقط من ACSF تغطي شرائح. بإحكام إغلاق غطاء من الغرفة والسماح لشرائح لاسترداد في 32 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- بعد الانتعاش الأولي في 32 درجة مئوية، وجلب غرفة الانتعاش واجهة للخروج من حمام الماء ووضع على مجموعة من التحريك إلى سرعة بطيئة بحيث شريط ضجة المغناطيسي يعزز تداول ACSF داخل الغرفة. السماح لها لتبرد تدريجيا إلى درجة حرارة الغرفة كما شرائح استرداد لمدة 90 دقيقة إضافية. تأكد من أن غرفة الاسترداد هي باستمرار فقاعة مع كاربوجين ولا تسمح فقاعات كبيرة لتصبح محاصرين تحت شرائح.
6. تنفيذ إمكانية المجال المحلي (LFP) تسجيلات النشاط العفوي
- الاستعداد لتسجيلات LFP عن طريق تشغيل جميع المعدات اللازمة، بما في ذلك الكمبيوتر الذي يدير برنامج الاستحواذ، والشاشة المتصلة بالكمبيوتر، والمحفزات، وmicromanipulator، وحدة تحكم درجة الحرارة، ومصدر ضوء المجهر، والكاميرا المرفقة بالمجهر، ومكبر للصوت microelectrode، والرقم، ومضخة ال peristaltic. إذا كان استخدام نظام فراغ مركزي، فتح صمام الجدار لإعداد خط الفراغ الذي سيتم إزالة ACSF من غرفة التسجيل.
- ملء خزان ساخنة مع ACSF، ثم وضع نهاية واحدة من الأنابيب في 400 مل من القارض يحتوي على ACSF محتدما. تشغيل مضخة م peristaltic لتوجيه ACSF من الكواب 400 مل إلى خزان ساخنة، ومن الخزان فصاعدا إلى غرفة التسجيل. اضغط أو قرصة الأنابيب لإطلاق سراح أي فقاعات المحاصرين.
- ضبط مضخة ال peristaltic لضمان أن معدل تدفق ACSF من خلال غرفة تسجيل سريع (~ 8-10 مل / دقيقة). استخدم مسبار درجة الحرارة لضمان أن ACSF هو 32 درجة مئوية في وسط غرفة التسجيل.
ملاحظة: إذا تم تسليم ACSF إلى غرفة التسجيل باستخدام مضخة م peristaltic، يمكن أن يؤدي معدل تدفق عالية إلى تقلبات كبيرة في معدل التدفق. ويمكن تحقيق معدلات تدفق متسقة باستخدام مثبط نبض بسيط يتكون من سلسلة من الحقن الفارغة دمجها في أنابيب (الشكل 2). - إعداد التحفيز وتسجيل ماصات من الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات باستخدام سحب خيوط ساخنة. يجب أن يتم تكوين بروتوكول سحب ل تسفر عن الماصات مع مقاومة من 2-3 MOhm لتحفيز أو أقطاب تسجيل المجال المحلية المحتملة.
- ملء المواص التحفيز مع 1 M NaCl و LFP المواص مع ACSF.
- لفترة وجيزة المشبك الأنابيب وإيقاف المضخة لوقف تدفق ACSF. نقل شريحة إلى غرفة تسجيل باستخدام ملقط غرامة لفهم زاوية من ورق العدسة الشريحة يستريح على شريحة سوف تلتصق ورقة العدسة. ضع ورق العدسة وشرائحها في غرفة التسجيل مع الشريحة التي تواجه لأسفل ، ثم "قشر" ورق العدسة تاركًا الشريحة مغمورة في غرفة التسجيل. تأمين شريحة باستخدام القيثارة.
ملاحظة: يمكن شراء القيثارة مسبقة الصنع أو مصنوعة في المختبر باستخدام قطعة على شكل حرف U من الفولاذ المقاوم للصدأ أو البلاتين وخيوط النايلون الناعمة. - ضع ماصة التحفيز المليئة ب NaCl في ميكرو مانوربولاتور اليدوي وتقدم ببطء طرف الماصات في سطح الشريحة (على سبيل المثال، في طبقة الشعاع الطبقي) بزاوية 30-45 درجة تقريبًا. بمجرد أن يدخل طرف الماصة الأنسجة ، تقدم الماصات إلى الأمام ببطء والامتناع عن الحركات الكبيرة في الاتجاه الجانبي أو الرأسي التي يمكن أن تلحق الضرر غير الضروري بمحور عصبي داخل الشريحة. ضع طرف الماصة بعمق 50-100 ميكرومتر على الأقل في الشريحة لتجنب الخلايا القريبة من السطح التي تضررت أثناء التقطيع.
- ضع ماصة LFP مليئة بـ ACSF في حامل الماصات المرفق بالماينوميبولاتر الآلية. تطبيق ضغط إيجابي خفيف جدا باستخدام إما ضغط الفم أو حقنة 1 مل متصلة عن طريق صمام stopcock وطول قصير من أنابيب إلى حامل ماصة.
ملاحظة: ضع ماصات LFP داخل الشريحة من أجل تسجيل إشارات الاهتمام: في حالة تموجات الموجة الحادة، ينبغي وضع ماصة LFP واحدة في الهرم الطبقي (SP) وماصة ثانية في شعاع الطبقة (SR). هذا التكوين يسمح لتسجيلات متزامنة من السلبية حادة الموجة في ريال وتذبذب موجة عالية التردد في SP(الشكل 3). - باستخدام micromanipulator ببطء تقدم غيض من ماصة LFP في المنطقة ذات الاهتمام (على سبيل المثال، CA1 طبقة الخلية الهرمية) بزاوية من 30-45 درجة تقريبا. ضع طرف الماصة بعمق 50-100 ميكرومتر على الأقل في الشريحة لتجنب الخلايا القريبة من السطح التي تضررت أثناء التقطيع. في حين تقدم ماصة LFP، وتقديم باستمرار نبض اختبار الجهد الصغير باستخدام برنامج اقتناء ومشاهدة لزيادة مفاجئة في مقاومة الأقطاب الكهربائية. وقد يشير ذلك إلى انسداد الماصات أو ضغطها على خلية.
- بمجرد وضع ماصة LFP في المنطقة ذات الاهتمام ، قم بتحرير الضغط الإيجابي بعناية عن طريق فتح الصمام على الأنابيب المرفقة مع حامل الماصات.
- لتسجيل LFP في موقع ثانٍ في وقت واحد، كرر الخطوات 6.8-6.10 مع ماصة ثانية وmicromanipulator.
- استخدام مكبر للصوت microelectrode في التكوين المشبك الحالي لتسجيل النشاط العفوي في المجال المحلي المحتملة بعد استخدام وظيفة توازن الجسر في اقتناء البرمجيات لتصحيح لمقاومة سلسلة من ماصة. سوف تظهر SWRs التلقائية كما انحرافات إيجابية في الإمكانات خارج الخلية من طبقة SP(الشكل 3).
- من أجل تسجيل إمكانات الحقل المُثارة ، استخدم المحفزات المتصلة بجهاز الالتقاط الرقمي لتقديم نبض جهد مربع قصير (200 منا) من خلال ماصة التحفيز المملوءة ب NaCl. ضبط الطلب الجهد التحفيز لاستحضار مجموعة من السعات استجابة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وترد هنا تسجيلات تمثيلية من شرائح HEC أعدت كما هو موضح في هذا البروتوكول. بعد الانتعاش في غرفة عقد واجهة(الشكل 1C)،يتم نقل شرائح بشكل فردي إلى غرفة تسجيل المغمورة (الشكل 2B). يتم توفير غرفة التسجيل مع ACSF المشبعة بالكاربون باستخدام مضخة م peristaltic(الشكل 2A). المضخة توجه أولا ACSF من القارب القابضة في خزان ساخن. يتم وضع خطوط كاربوجين في كل من الكاندر القابض والخزان الساخن لتوفير الأوكسجين المستمر لوسائل الإعلام. يتم وضع مثبط النبض ، الذي يتكون من سلسلة من المحاقن المملوءة بالهواء ، بين المضخة ال peristaltic وغرفة التسجيل لتقليل التقلبات في معدل التدفق الناتج عن ال peristalsis السريع. يمتص جيب الهواء في كل حقنة التغيرات في الضغط الناتج عن كل دورة من المضخات ، بحيث تتلقى غرفة التسجيل تدفقًا سلسًا وثابتًا من ACSF52،53. سخان مضمنة وضع بعد المثبط النبض يضمن أن يتم عقد درجة حرارة ACSF في 32 درجة مئوية كما أنه يدخل غرفة التسجيل.
في هذا المثال، يتكون جهاز تسجيل الضخ المزدوج السطح من ثلاث طبقات مطبوعة ثلاثية الأبعاد (الشكل 2B). الطبقة السفلية لديها انقطاع مستطيلة لتناسب غطاء، مؤمنة مع الشحوم فراغ. الطبقة الوسطى تحتوي على النصف السفلي من غرفة بيضاوية ممدود، مع اثنين من الدعامات الأفقية. يتم موتر خيوط النايلون عبر هذه الدعامات (تقريبا كل 0.5 ملم) ومؤمنة مع مادة السيانواكريلات اللاصقة. سوف تقع الشريحة على رأس هذه خيوط موتر. الطبقة العليا تحتوي على النصف العلوي من الغرفة البيضاوية جنبا إلى جنب مع الآبار الصغيرة التي يمكن وضع الكريات الأرضية كلوريد الفضة. تم تصميم الشكل البيضاوي ممدود من الغرفة لتعزيز تدفق التصفيح السريع لل ACSF.
ويعرض الشكل 3 تسجيلات تمثيلية من شرائح HEC معدة وفقاً لهذا البروتوكول. لتقييم صحة الشريحة في البداية ، يتم استحضار الإمكانات الميدانية بعد المسنين (fPSPs) في راديتوم الطبقة (SR) باستخدام ماصة مليئة بـ 1 M من NaCl. في شرائح صحية، وينبغي أن تنتج التحفيز الكهربائي fPSP مع كرة صغيرة الألياف presynaptic وإمكانات ما بعد ينابتيك كبيرة مع هبوط أولي سريع(الشكل 3B، أعلى اليسار). في شرائح صحية، عفوية موجة حادة تموجات (SWRs) مرئية كما انحرافات إيجابية في LFP في الهرم الطبقة (الشكل 3B، أسفل اليسار). في شرائح دون المستوى الأمثل أثار fPS تظهر طائرة الألياف الكبيرة وإمكانات ما بعد الرينبتيك صغيرة نسبيا، وهذه الشرائح لا تظهر SWRs عفوية(الشكل 3B، والحق). SWRs في المختبر تظهر الخصائص بما يتفق مع الأوصاف المنشورة: احتمالية إيجابية في مجال طبقة SP مع تذبذب تردد عال متراكب، يقترن احتمال حقل سلبي في طبقة ريال(الشكل 3C). يشار إلى SWR واحدة سجلت في CA2 مع علامة نجمية(الشكل 3C، والحق). SWRs في شرائح HEC تنشأ داخل الدوائر CA2/CA3 المتكررة والانتشار إلى CA1. يشار إلى SWR واحد لوحظ في CA2 و CA1 طبقة SP مع علامة نجمية(الشكل 3D، والحق). في هذا المثال التمثيلي، يؤدي CA2 SWR (الأخضر) إلى أن CA1 (الأزرق) من قبل عدة مللي ثانية، كما هو مبين في تراكب المغلف SWR (تمت تصفيتها في 2-30 هرتز) المسجلة في كل منطقة.
الشكل 1: إعداد شرائح قشرة فرس النهر ذات الزوايا الأفقية ( HEC ). (أ) (ط) بعد استخراج الدماغ، تنفيذ اثنين من التخفيضات التاجية مع شفرة حلاقة لإزالة الأجزاء الخلفية والأدلة من الدماغ. (ii) يتكون منحدر agar من جزأين من الزاوية ملتصقين بمنصة التقطيع الدقيقة. لإعداد شرائح من قرن آمون المتوسطة، ضع كتلة الدماغ على منحدر أجار مع السطح الأمامي الذي يواجه المنحدر ويجعل الاتصال مع الجزء الداعم طويل القامة من المنحدر. لإعداد شرائح من الحصين البطني أكثر، ضع كتلة الدماغ على منحدر أجار مع السطح الأمامي الذي يواجه أسفل المنحدر، بحيث يجعل سطح القطع الخلفي الاتصال مع الجزء الداعم طويل القامة من المنحدر. (iii) كما يتم تحرير كل شريحة، تنفيذ عدة تخفيضات أكثر مع مشرط لفصل نصفي الكرة الأرضية وإزالة الأنسجة غير الضرورية. (B) صورة تمثيلية للشريحة الناتجة مع نواة الخلية التي تحمل علامة DAPI. (C) في غرفة استرداد الواجهة، يتم وضع الشرائح على قطعة من ورق العدسة فوق شبكة من الفولاذ المقاوم للصدأ أو النايلون، مع مستوى مع سطح ACSF. فقاعات السيراميك ينقل كاربوجين في الغرفة وشريط ضجة المغناطيسي يمزج باستمرار السائل في الغرفة. ويغطي فيلم رقيق من ACSF السطح العلوي من الشريحة، وتعزيز انتشار الأكسجين من الهواء الرطب الغنية بالكربوغن من الغرفة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: غرفة تسجيل الضخ السطحي المزدوج مع مثبط النبض في أنابيب التسليم ACSF. (أ) مخطط نظام الضخ الفائق. يتم تدفئة ACSF إلى 32 درجة مئوية ، وفقاعات باستمرار مع غاز كاربوجين ، وتسليمها في حوالي 8-10 مل / دقيقة باستخدام مضخة ال peristaltic مع مثبطات النبض تتكون من سلسلة من المحاقن مملوءة بالهواء. (ب)تتكون غرفة التسجيل من ثلاث طبقات مطبوعة ثلاثية الأبعاد، وسطها معلقة بخيوط النايلون. تقع الشريحة على هذه الخيوط المُرَكّلة وتدفقات ACSF فوق الأنسجة وتحتها. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تسجيلات تمثيلية لموجات موجة حادة عفوية من شرائح HEC. (أ) رسم تخطيطي مبسط لشريحة HEC يوضح مواضع أقطاب التسجيل والتحفيز. (ب)تسجيلات تمثيلية لنشاط LFP من شريحة نشطة وصحية وشريحة دون المستوى الأمثل. تُظهر الشريحة الصحية (إلى اليسار، باللون الأخضر) استجابات ميدانية كبيرة مُثارة وتموجات عفوية حادة الموجة (SWRs)، مرئية على شكل انحرافات إيجابية تحدث بشكل غير منتظم في الإمكانات الميدانية المحلية لطبقة SP. في المقابل، تظهر شريحة غير صحية استجابات حقلية صغيرة مثيرة ولا نشاط عفوي (يمين، باللون الرمادي). (C)تسجيلات تمثيلية لـ SWRs في منطقة CA2، تتكون من انحراف سلبي في LFP في طبقة ريال سعودي وتذبذب عالي التردد مع انحراف إيجابي في LFP في طبقة SP. يتم تمييز القمم في كل قناة أكبر من ثلاثة انحرافات معيارية من السعة إشارة باللون الأحمر. يقوم فلتر النطاقات من 2-30 هرتز بعزل المغلف الموجب والسالب الأساسي للموجة الحادة في طبقة SP وR، على التوالي، بينما يستخدم فلتر 80-250 هرتز لعزل التذبذب عالي التردد للتموج في طبقة SP. (د) SWRs في المختبر نشر من CA2/CA3 إلى CA1. في هذه التسجيلات التمثيلية، SWRs في CA2 (الأخضر، الأسفل) تسبق ذلك في CA1 (الأزرق، أعلى) بواسطة عدة مللي ثانية. يتم تمييز القمم في كل قناة أكبر من ثلاثة انحرافات معيارية من السعة إشارة باللون الأحمر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الوزن الجزيئي (غرام / مول) | التركيز النهائي (mM) | غرام / 1 L السكروز حل القطع | ||
| السكروز | C12H22O11 | 342.3 | 195 | 66.749 |
| كلوريد الصوديوم | NaCl | 58.44 | 10 | 0.584 |
| الجلوكوز | C6H12O6 | 180.08 | 10 | 1.801 |
| بيكربونات الصوديوم | NaHCO3 | 84.01 | 25 | 2.1 |
| كلوريد البوتاسيوم | KCl | 74.55 | 2.5 | 0.186 |
| فوسفات الصوديوم أحادية الباسية | NaH2PO4 | 137.99 | 1.25 | 0.173 |
| بيروفات الصوديوم | C3H3NaO3 | 110.04 | 2 | 0.22 |
| تركيز المخزون (M) | التركيز النهائي (mM) | milliliters / 1L محلول قطع السكروز | ||
| كلوريد الكالسيوم | CaCl2 | 1 | 0.5 | 0.5 |
| كلوريد المغنيسيوم | MgCl2 | 1 | 7 | 7 |
الجدول 1: تركيب محلول قطع السكروز. تبدأ مع ما يقرب من 0.75 لتر من المياه النقية التي تمت تصفيتها لإزالة المعادن النزرة والشوائب الأخرى. يُحل كلّ من المُتَلّكات الصلبة أثناء خلط المحلّل مع شريط حركي مغناطيسي. مرة واحدة يتم حل جميع المواد الصلبة، فقاعة غاز كاربوجين من خلال الحل لمدة 10 دقيقة. أضف حلول MgCl2 وCaCl2 واضيف الماء إلى 1 L. اخلط مع شريط حركية مغناطيسي لمدة 10 دقائق لضمان خلط الحل بشكل موحد. وينبغي أن يكون التناضح بين 315 و 325 mOsm، وينبغي أن يكون من 7.4 تقريبا.
| الوزن الجزيئي (غرام / مول) | التركيز النهائي (mM) | غرام / 2L ACSF | ||
| كلوريد الصوديوم | NaCl | 58.44 | 125 | 14.61 |
| الجلوكوز | C6H12O6 | 180.08 | 12.5 | 4.502 |
| بيكربونات الصوديوم | NaHCO3 | 84.01 | 25 | 4.201 |
| كلوريد البوتاسيوم | KCl | 74.55 | 3.5 | 0.522 |
| فوسفات الصوديوم أحادية الباسية | NaH2PO4 | 137.99 | 1.25 | 0.345 |
| حمض الاسكوربيك | C6H8O6 | 176.12 | 1 | 0.352 |
| بيروفات الصوديوم | C3H3NaO3 | 110.04 | 3 | 0.66 |
| تركيز المخزون (M) | التركيز النهائي (mM) | ملليلتر / 2L ACSF | ||
| كلوريد الكالسيوم | CaCl2 | 1 | 1.6 | 3.2 |
| كلوريد المغنيسيوم | MgCl2 | 1 | 1.2 | 2.4 |
الجدول 2: تكوين السائل النخاعي الاصطناعي. تبدأ مع ما يقرب من 1.5 لتر من المياه النقية التي تم تصفيتها لإزالة المعادن النزرة والشوائب الأخرى. يُحل كلّ من المُتَلّكات الصلبة أثناء خلط المحلّل مع شريط حركي مغناطيسي. مرة واحدة يتم حل جميع المواد الصلبة، فقاعة غاز كاربوجين من خلال الحل لمدة 10 دقيقة. أضف حلول MgCl2 وCaCl2 واضيف الماء إلى 2 L. اخلط مع شريط حركية مغناطيسي لمدة 10 دقائق لضمان خلط الحل بشكل موحد. وينبغي أن يكون التناضح بين 315 و 325 mOsm، وينبغي أن يكون من 7.4 تقريبا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هناك عدة خطوات في هذا البروتوكول تشريح مصممة لتعزيز صحة الأنسجة وتفضل ظهور النشاط التلقائي الشبكة الطبيعية: الماوس هو transcardially مع محلول قطع السكروز المبردة; يتم قطع شرائح قشرة الأنف الأفقي (HEC) بسمك 450 ميكرومتر من الحصين المتوسط أو البطني؛ شرائح استرداد في واجهة ACSF الدافئة ورطوبة، والكربون الغنية الهواء؛ خلال التسجيلات يتم تراكب شرائح مع ACSF الدفء إلى 32 درجة مئوية وتسليمها بمعدل تدفق سريع مع الضخ السطحي المزدوج في غرفة تسجيل مغمورة.
شريحة الصحة هو من الأهمية بمكان لتوليد التذبذبات الشبكة في المختبر. الحيوانات الصغيرة سوف تسفر عن شرائح صحية أكثر، وعموما مع الفئران الأحداث أو المراهقين يمكن تخطي خطوة التسريب عبر القلب. مع تقدم الحيوانات في العمر ، يصبح من الصعب بشكل متزايد صنع شرائح صحية ، ومع ذلك فإن بعض التحقيقات (مثل نماذج المرض أو الدراسات الطولية) تتطلب استخدام الحيوانات البالغة أو الشيخوخة. على سبيل المثال، استخدم Dengler et al.، الانفعالات عبر القلب في إعدادها لشرائح HEC من فئران البالغين المصابين بالصرع المزمن المعالجة من بيلوكربين50. مع الفئران البالغة ، من المفيد إجراء ضخ عبر القلب مع محلول قطع السكروز المبرد لتبريد الأنسجة ، وتطهير الدم من الدماغ ، والحد من النشاط الأيضي قبل إزالة الدماغ من الجمجمة51. ومع ذلك، من المهم ملاحظة أن الانفعالات عبر القلب تتطلب التدريب لكي يتم أداؤها بشكل صحيح، ويجب الحرص على ضمان تنفيذ الإجراء بسرعة وبطريقة لا تشكل خطراً على رفاهية الحيوان. وينبغي، عند الإمكان، تصميم التجارب لاستخدام الحيوانات الصغيرة بحيث تحول دون استخدام الضخات عبر القلب. في إعداد شريحة دون المستوى الأمثل، لن يكون هناك ما يكفي من الخلايا السليمة، ولا سيما interneurons، لدعم التذبذبات الشبكة الجارية. لتقييم صحة شريحة خلال التجربة، فمن المفيد أن سجل أول إمكانات حقل أثار (على سبيل المثال، مع ماصة التحفيز وماصة تسجيل في راديتوم ستراتوم،ريال). في شريحة صحية، سوف التحفيز في طبقة ريال استحضار حقل كبير من المحتملات postsynaptic (fPSP) مع كرة الألياف presynaptic صغيرة نسبيا(الشكل 3).
الشرائح التي ينتجها هذا البروتوكول هي شرائح فرس النهر الأفقية الزاوية (HEC). الأهم من ذلك، لا إدراج الأنسجة parahippocampal ولا قطع الزاوية ضرورية لشرائح فرس النهر لتوليد تلقائيا أنشطة الشبكة مثل SWRs. في الواقع، استخدمت العديد من الدراسات شرائح فرس النهر الأفقية أو العرضية لاستجواب جوانب من الفسيولوجية25،40،41،44 أو التذبذبات شبكة المرضية33،38. في هذا البروتوكول وضع الدماغ على منحدر أجار يسمح للمجرب لإنتاج انتقائي شرائح أكثر من قرن آمون بطني أو متوسط(الشكل 1)، والتي قد تكون مفيدة للأهداف التجريبية التي تأخذ في الاعتبار عدم التجانس الوظيفية الموجودة على طول المحور الطولي من الحصين26،31. إذا لم يكن الأصل التشريحي للشرائح عاملاً، يمكن استبعاد منحدر أجار، وسيسفر مستوى القطع الأفقي الحقيقي عن شرائح من قرن آمون متوسط إلى بطني. كما يتم تحرير كل شريحة الأنسجة الأفقية، يمكن إزالة معظم الأجزاء الدخيلة من شريحة مع ثلاث قطع بسيطة، وترك شريحة مستطيلة تقريبا التي تحتوي على الحصين وبعض الأنسجة المحيطة بها، بما في ذلك منطقة باراهيببوكيم (الشكل 1). ويمكن إجراء تشريح آخر لإزالة جميع الأنسجة خارج الhippocampal، ولكن إدراج الأنسجة المحيطة مفيد، في أن شريحة القيثارة يمكن وضعها بسهولة بحيث خيوط النايلون لا يستريح عبر الحصين السليم. كما نوقش أعلاه، وشريحة HEC مجتمعة هو أيضا إعداد مفيدة التي للتحقيق أكبر شبكة كورتيكوهيبابوكامبال في سياقالفسيولوجية 37 أو المرضية16,35,36,38 شبكة التذبذبات.
العامل الرئيسي في هذا البروتوكول هو تحسين إمدادات الأكسجين إلى الأنسجة، سواء خلال مرحلة الانتعاش أو أثناء التسجيلات. يتم إجراء العديد من الدراسات للتذبذبات الشبكية في شرائح يتم نقلها مباشرة من microtome إلى غرفة تسجيل الواجهة ويسمح لها بالتعافي مع التسريب المستمر للـ ACSF الطازجة. بعد عدة ساعات من الانتعاش، يمكن بعد ذلك أن يتم تنفيذ التسجيلات في غرفة واجهة واحدة. وهكذا، يتم عقد شرائح في واجهة ACSF والهواء الرطب الغنية كاربوجين لمدة كاملة من التجربة. في المنهجية البديلة المعروضة في هذا البروتوكول، تسترد الشرائح في غرفة احتجاز على غرار الواجهة لمدة ساعتين على الأقل قبل أن يتم نقل الشرائح الفردية إلى غرفة تسجيل مغمورة على غرار معدلات تدفق ACSF سريعة بما فيه الكفاية. يمكن أن تظهر الشرائح المعدة في ظل هذه الظروف ذبذبات غاما مستقرة12 أو نشاط SWR التلقائي43. الانتعاش شريحة في غرفة عقد على غرار واجهة هو خطوة حاسمة: ماير وآخرون أظهرت أن الشرائح التي تتعافى في الكباب مغمورة تماما في ACSF المعرض إمكانات حقل أصغر أثار، أقل تواترا التيارات ما بعد المينابك، ونادرا ما تنتج نشاط الشبكة التلقائي43. وبالمثل، أظهر Hájos وآخرون أن معدلات تدفق ACSF السريعة تؤدي إلى زيادة وتيرة التيارات المثبطة التلقائية للتشنج، مما يشير إلى تحسن النشاط الداخلي49. خلال فترة التسجيل، مزدوجة السطح الضخ ليس من الضروري تماما، شريطة أن غرفة تسجيل يحمل حجم صغير نسبيا من ACSF تسليمها بمعدل تدفق سريع (على الأقل 6 مل/دقيقة)43. غرفة التسجيل المطبوعة ثلاثية الأبعاد المعروضة في هذا البروتوكول(الشكل 2B)هي فعالة نسبياً من حيث التكلفة و خيار بسيط، ولكن هناك أيضاً غرف تسجيل مغمورة متاحة تجارياً مصممة لعقد مجلدات أصغر، أو تعزيز تدفق اللامينار لوسائل الإعلام، أو توفير سخور سطح مزدوج (على النقيض من غرف التسجيل الدائرية، على سبيل المثال، والتي تسمح بالحجم الميت الزائد من ACSF).
في حين أن هذا البروتوكول يسمح لأحد لتسجيل التذبذبات شبكة دون شرط من غرفة تسجيل واجهة التقليدية ، وهناك عدة قيود. على الرغم من أن يتم عقد شرائح في واجهة ACSF-الهواء خلال فترة الانتعاش، فإنها لا تتلقى ضخ مستمر من وسائل الإعلام الطازجة كما يحدث في غرف تسجيل واجهة نمط هاس التقليدية. يجب نقل الشرائح بشكل فردي (باستخدام ملقط رفيع) من غرفة الاسترداد إلى غرفة التسجيل المغمورة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن معدلات التدفق السريع يسبب عدم الاستقرار والحركة القطع الأثرية إشكالية لبعض التسجيلات، لا سيما إذا تم تسليم ACSF مع مضخة ال peristaltic. من أجل الحفاظ على معدلات التدفق السريع وتقليل الاضطرابات الميكانيكية ، يمكن دمج مثبطات النبض البسيطة في نظام الضخ (الشكل 2). يعمل هذا المثبط النبض باستخدام تأثير Windkessel52، حيث تحتوي الحقن الفارغة على جيوب الهواء التي تعمل كخزانات مرنة ، وتمتص الضغط المتقلب الناتج عن بكرات المضخة ال peristaltic53. ومع ذلك، يمكن أن يضيف دمج مثبط النبض طولًا إلى الأنبوب الذي يوفر ACSF إلى غرفة التسجيل ويؤثر على إمدادات الأكسجين إلى الشريحة. وينبغي أن تكون معدلات التدفق فقط بالسرعة اللازمة لتحقيق تذبذبات شبكة مستقرة، وإذا تم استخدام مضخة ال peristaltic فإنه ينبغي أن يكون من الناحية المثالية مضخة التي تستخدم عددا كبيرا من بكرات (> 12) للحد من النبض الناجم عن ال peristalsis، ومنع استخدام المثبط نبض، وضمان أن الأنابيب التي تقدم ACSF إلى غرفة تسجيل قصيرة قدر الإمكان. كما أن عمليات التسجيل التي يتم تنفيذها بمعدلات تدفق سريعة تتطلب أيضاً كميات كبيرة من الـ ACSF، والتي قد تكون مشكلة إذا تطلبت التجارب إضافة أدوية أو مركبات قيمة أو باهظة الثمن إلى وسائل الإعلام. على الرغم من أن غرفة الضخ الفائق مزدوجة السطح تتطلب غرفة تسجيل شيدت خصيصا مع اثنين من المداخل السائلة لتقديم وسائط المؤكسج على جانبي شريحة، يمكن ملاحظة التذبذبات شبكة عفوية مع معدلات تدفق ACSF معتدلة48. ويستخدم هذا البروتوكول كلا من معدل التدفق السريع (المستقر مع مثبط النبض) وغرفة الضخ الفائق المزدوجة السطح لتحسين احتمال مراقبة النشاط العفوي.
وأخيراً، فإن هذا البروتوكول له مردود منخفض فيما يتعلق بعدد الشرائح المنتجة لكل. يؤدي التقطيع الأفقي بسمك 450 ميكرومتر إلى عدد قليل من شرائح HEC عند التوجه المفضل (حيث تكون الشريحة موازية بشكل فعال للمحور العرضي لحصان الحصين). من هذه الشرائح، عادة، واحد أو اثنين فقط لكل فرس النهر معارض نشاط SWR عفوية، أقل مما تم الإبلاغ عنه في أماكن أخرى43. على الرغم من أن الشرائح الأكثر سمكاً تحتوي على درجة أكبر من الاتصال المتكرر، إلا أن قطع الشرائح الأكثر نحافة قليلاً (400 ميكرومتر) قد تسفر عن عدد أكبر لكل فأرة من الشرائح الموجهة بشكل مستعرض مع نشاط SWR. بالإضافة إلى ذلك، احتمال أن شرائح متعددة عرض موثوق النشاط SWR عفوية قد تكون أعلى في التجارب التي تستخدم شرائح حقيقية أفقية أو للأسفل من الحصين البطني. يتضمن البروتوكول الحالي استخدام شرائح أفقية لأعلى الزاوية من الحصين الوسيط ، والتي قد تكون أقل عرضة لعرض نشاط الشبكة التلقائية بالمقارنة مع شرائح من الحصين البطني25،26،31. وأخيراً، استخدم هذا البروتوكول شرائح من فئران مراهقين وبالغين. في حين يمكن أن تؤدي عمليات التسريب عبر القلب إلى تحسين جودة الشرائح من الحيوانات القديمة ، فإن احتمال مراقبة أنشطة الشبكة العفوية قد يتم تحسينه باستخدام شرائح من الحيوانات الأصغر سنا12،41،44.
باختصار، يقدم هذا البروتوكول نهج تقطيع دماغ الماوس الذي ينتج شرائح قشرة فرس النهر الأفقية الزاوية من تشكيل فرس النهر الوسيط أو البطني الذي يمكن أن يحمل نشاطًا شبكيًا عفويًا معقدًا في شكل مجمعات حادة تموج الموجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحب البلاغ ما يكشف عنه.
Acknowledgments
ويود صاحب البلاغ أن يشكر ستيف سيغلباوم على دعمه. يتم توفير التمويل من قبل 5R01NS106983-02 وكذلك 1 F31 NS113466-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Lulzbot | LulzBot TAZ 6 | |
| Acute brain slice incubation holder | NIH 3D Print Exchange | 3DPX-001623 | Designed by ChiaMing Lee, available at https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623 |
| Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma Aldrich | A9187-500MG | |
| Ag-Cl ground pellets | Warner | 64-1309, (E205) | |
| agar | Becton, Dickinson | 214530-500g | |
| ascorbic acid | Alfa Aesar | 36237 | |
| beaker (250 mL) | Kimax | 14000-250 | |
| beaker (400 mL) | Kimax | 14000-400 | |
| biocytin | Sigma Aldrich | B4261 | |
| blender | Oster | BRLY07-B00-NP0 | |
| Bonn scissors, small | becton, Dickinson | 14184-09 | |
| borosilicate glass capillaries with filament (O.D. 1.5 mm, I.D. 0.86 mm, length 10 cm) | Sutter Instruments | BF150-86-10HP | Fire polished capillaries are preferable. |
| calcium chloride solution (1 M) | G-Biosciences | R040 | |
| camera | Olympus | OLY-150 | |
| compressed carbogen gas (95% oxygen / 5% carbon dioxide) | Airgas | X02OX95C2003102 | |
| compressed oxygen | Airgas | OX 200 | |
| constant voltage isolated stimulator | Digitimer Ltd. | DS2A-Mk.II | |
| coverslips (22x50 mm) | VWR | 16004-314 | |
| cyanoacrylate adhesive | Krazy Glue | KG925 | Ideally use the brush-on form for precision |
| data acquisition software | Axograph | N/A | Any equivalent software (e.g. pClamp) would work. |
| Dell Precision T1500 Tower Workstation Desktop | Dell | N/A | Catalog number will depend on specific computer - any computer will work as long as it can run electrophysiology acquisition software. |
| Digidata 1440A | Molecular Devices | 1-2950-0367 | |
| digital timer | VWR | 62344-641 | 4-channel Traceable timer |
| disposable absorbant pads | VWR | 56616-018 | |
| dissector scissors | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| double-edge razor blades | Personna | BP9020 | |
| dual automatic temperature controller | Warner Instrument Corporation | TC-344B | |
| dual-surface or laminar-flow optimized recording chamber | N/A | N/A | The chamber presented in this protocol is custom made. A commercial equivalent would be the RC-27L from Warner Instruments. |
| equipment rack | Automate Scientific | FR-EQ70" | A rack is not strictly necessary but useful for organizing electrophysiology |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethyiether)- N,N,N',N'-teetraacetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | 324626-25GM | |
| filter paper | Whatman | 1004 070 | |
| fine scale | Mettler Toledo | XS204DR | |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| glass petri dish (100 x 15 mm) | Corning | 3160-101 | |
| glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G8877-250MG | |
| ice buckets | Sigma Aldrich | BAM168072002-1EA | |
| isoflurane vaporizer | General Anesthetic Services | Tec 3 | |
| lab tape | Fisher Scientific | 15-901-10R | |
| lens paper | Fisher Scientific | 11-996 | |
| light source | Olympus | TH4-100 | |
| magnesium chloride solution (1 M) | Quality Biological | 351-033-721EA | |
| magnetic stir bars | Fisher Scientific | 14-513-56 | Catalog number will be dependent on the size of the stir bar. |
| micromanipulator | Luigs & Neumann | SM-5 | |
| micromanipulator (manual) | Scientifica | LBM-2000-00 | |
| microscope | Olympus | BX51WI | |
| microspatula | Fine Science Tools | 10089-11 | |
| monitor | Dell | 2007FPb | |
| MultiClamp 700B Microelectrode Amplifier | Molecular Devices | MULTICLAMP 700B | The MultiClamp 700B should include headstages, pipette holders, and a model cell. |
| N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), (HEPES) | Sigma Aldrich | H3375-25G | |
| needle (20 gauge, 1.5 in length) | Becton, Dickinson | 305176 | |
| nylon filament | YLI Wonder Invisible Thread | 212-15-004 | size 0.004. This cat. # is from Amazon.com |
| nylon mesh | Warner Instruments Corporation | 64-0198 | |
| perstaltic pump | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
| Phosphocreatine di(tris) salt | Sigma Aldrich | P1937-1G | |
| pipette holders | Molecular Devices | 1-HL-U | |
| platinum wire | World Precision | PT0203 | |
| polylactic acid (PLA) filament | Ultimaker | RAL 9010 | |
| potassium chloride | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| potassium gluconate | Sigma Aldrich | 1550001-200MG | |
| potassium hydroxide | Sigma Aldrich | 60377-1KG | |
| razor blades | VWR | 55411-050 | |
| roller clamp | World Precision Instruments | 14041 | |
| scale | Mettler Toledo | PM2000 | |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| slice harp | Warner | SHD-26GH/2 | |
| sodium bicarbonate | Fisher Chemical | S233-500 | |
| sodium chloride | Sigma Aldrich | S9888-1KG | |
| sodium phosphate monobasic anhydrous | Fisher Chemical | S369-500 | |
| sodium pyruvate | Fisher Chemical | BP356-100 | |
| spatula | VWR | 82027-520 | |
| spatula/spoon, large | VWR | 470149-442 | |
| sterile scalpel blades | Feather | 72044-10 | |
| stirrer / hot plate | Corning | 6795-220 | |
| stopcock valves, 1-way | World Precision Instruments | 14054 | |
| stopcock valves, 3-way | World Precision Instruments | 14036 | |
| sucrose | Acros Organics | AC177142500 | |
| support for swivel clamps | Fisher Scientific | 14-679Q | |
| surgical scissors, sharp/blunt | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| syringe (1 mL) | Becton, Dickinson | 309659 | |
| syringe (60 mL with Luer-Lok tip) | Becton, Dickinson | 309653 | |
| three-pronged clamp | Fisher Scientific | 05-769-8Q | |
| tissue forceps, large | Fine Science Tools | 11021-15 | |
| tissue forceps, small | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| tubing | Tygon | E-3603 | ID 1/16 inch, OD 3/16 inch |
| tubing | Tygon | R-3603 | ID 1/8 inch, OD 1/4 inch |
| vacuum grease | Dow Corning | 14-635-5D | |
| vibrating blade microtome | Leica | VT 1200S | |
| vibration-dampening table with faraday cage | Micro-G / TMC-ametek | 2536-516-4-30PE | |
| volumetric flask (1 L) | Kimax | KIM-28014-1000 | |
| volumetric flask (2 L) | PYREX | 65640-2000 | |
| warm water bath | VWR | 1209 |
References
- Buzsáki, G., Lai-Wo, S., Vanderwolf, C. H. Cellular bases of hippocampal EEG in the behaving rat. Brain Research Reviews. 6, 139-171 (1983).
- Buzsáki, G. Hippocampal sharp waves: Their origin and significance. Brain Research. 398, 242-253 (1986).
- Buzsáki, G., Horváth, Z., Urioste, R., Hetke, J., Wise, K. High-frequency network oscillation in the hippocampus. Science. 256, 1025-1027 (1992).
- Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents — EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews Neuroscience. 13, 407-420 (2012).
- Buzsáki, G. Hippocampal sharp wave-ripple: A cognitive biomarker for episodic memory and planning. Hippocampus. 25, 1073 (2015).
- Maier, N., et al. Reduction of high-frequency network oscillations (ripples) and pathological network discharges in hippocampal slices from connexin 36-deficient mice. Journal of Physiology. 541, 521-528 (2002).
- Maier, N., Nimmrich, V., Draguhn, A. Cellular and network mechanisms underlying spontaneous sharp wave-ripple complexes in mouse hippocampal slices. Journal of Physiology. 550, 873-887 (2003).
- ul Haq, R., et al. Adrenergic modulation of sharp wave-ripple activity in rat hippocampal slices. Hippocampus. 22, 516-533 (2012).
- ul Haq, R., et al. Serotonin dependent masking of hippocampal sharp wave ripples. Neuropharmacology. 101, 188-203 (2016).
- Maier, P., Kaiser, M. E., Grinevich, V., Draguhn, A., Both, M. Differential effects of oxytocin on mouse hippocampal oscillations in vitro. European Journal of Neuroscience. 44, 2885-2898 (2016).
- Mizunuma, M., et al. Unbalanced excitability underlies offline reactivation of behaviorally activated neurons. Nature Neuroscience. 17, 503-505 (2014).
- Hájos, N., et al. Spike timing of distinct types of GABAergic interneuron during hippocampal gamma oscillations in vitro. Journal of Neuroscience. 24, 9127-9137 (2004).
- Geschwill, P., et al. Synchronicity of excitatory inputs drives hippocampal networks to distinct oscillatory patterns. Hippocampus. , (2020).
- Rutecki, P. A., Grossmann, R. G., Armstrong, D., Irish-Loewen, S. Electrophysiological connections between the hippocampus and entorhinal cortex in patients with complex partial seizures. Journal of Neurosurgery. 70, 667-675 (1989).
- Lothman, E. W., Bertram, E. H., Stringer, J. L. Functional anatomy of hippocampal seizures. Progress in Neurobiology. 37, 1-82 (1991).
- Carter, D. S., Deshpande, L. S., Rafiq, A., Sombati, S., Delorenzo, R. J. Characterization of spontaneous recurrent epileptiform discharges in hippocampal - cortical slices prepared from chronic epileptic animals. Seizure: European Journal of Epilepsy. 20, 218-224 (2011).
- Karlócai, M. R., et al. Physiological sharp wave-ripples and interictal events in vitro: What's the difference. Brain. 137, 463-485 (2014).
- Leroy, F., et al. Input-timing-dependent plasticity in the hippocampal CA2 region and its potential role in social memory. Neuron. 95, 1089-1102 (2017).
- Sun, Q., et al. Proximodistal heterogeneity of hippocampal CA3 pyramidal neuron intrinsic properties, connectivity, and reactivation during memory recall. Neuron. 95, 656-672 (2017).
- Masurkar, A. V., et al. Medial and lateral entorhinal cortex differentially excite deep versus superficial CA1 pyramidal neurons. Cell Reports. 18, 1-13 (2017).
- Papatheodoropoulos, C., Kostopoulos, G. Spontaneous, low frequency (∼2-3 Hz) field activity generated in rat ventral hippocampal slices perfused with normal medium. Brain Research Bulletin. 57, 187-193 (2002).
- Papatheodoropoulos, C., Kostopoulos, G. Spontaneous GABAA-dependent synchronous periodic activity in adult rat ventral hippocampal slices. Neuroscience Letters. 319, 17-20 (2002).
- Kubota, D., Colgin, L. L., Casale, M., Brucher, F. A., Lynch, G. Endogenous waves in hippocampal slices. Journal of Neurophysiology. 89, 81-89 (2003).
- Behrens, C. J., Van Den Boom, L. P., De Hoz, L., Friedman, A., Heinemann, U. Induction of sharp wave - complexes in vitro and reorganization of hippocampal networks. Nature Neuroscience. 8, 1560-1567 (2005).
- Kouvaros, S., Papatheodoropoulos, C. Prominent differences in sharp waves, ripples and complex spike bursts between the dorsal and the ventral rat hippocampus. Neuroscience. 352, 131-143 (2017).
- Strange, B. A., Witter, M. P., Lein, E. S., Moser, E. I. Functional organization of the hippocampal longitudinal axis. Nature Reviews Neuroscience. 15, 655-669 (2014).
- Patel, J., Fujisawa, S., Berényi, A., Royer, S., Buzsáki, G. Traveling Theta Waves along the Entire Septotemporal Axis of the Hippocampus. Neuron. 75, 410-417 (2012).
- Patel, J., Schomburg, E. W., Berényi, A., Fujisawa, S., Buzsáki, G. Local generation and propagation of ripples along the septotemporal axis of the hippocampus. Journal of Neuroscience. 33, 17029-17041 (2013).
- Fricke, R., Cowan, W. M. An autoradiographic study of the commissural and ipsilateral hippocampo-dentate projections in the adult rat. Journal of Comparative Neurology. 181, 253-269 (1978).
- Ishizuka, N. O. R., Weber, J., Amaral, D. G. Organization of intrahippocampal projections originating from CA3 pyramidal cells in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 623, 580-623 (1990).
- Papatheodoropoulos, C. Electrophysiological evidence for long-axis intrinsic diversification of the hippocampus. Frontiers in Bioscience - Landmark. 23, 109-145 (2018).
- Gilbert, M., Racine, R. J., Smith, G. K. Epileptiform burst responses in ventral vs dorsal hippocampal slices. Brain Research. 361, 389-391 (1985).
- Papatheodoropoulos, C., Moschovos, C., Kostopoulos, G. Greater contribution of N-methyl-D-aspartic acid receptors in ventral compared to dorsal hippocampal slices in the expression and long-term maintenance of epileptiform activity. Neuroscience. 135, 765-779 (2005).
- Jones, R. S. G., Heinemann, U. Synaptic and intrinsic responses of medial entorhinal cortical cells in normal and magnesium-free medium in vitro. Journal of Neurophysiology. 59, (1988).
- Rafiq, A., Delorenzo, R. J., Coulter, D. A. Generation and propagation of epileptiform discharges in a combined entorhinal cortex / hippocampal slice. Journal of Neurophysiology. 70, 1962-1974 (1993).
- Stoop, R., Pralong, E. Functional connections and epileptic spread between hippocampus, entorhinal cortex and amygdala in a modified horizontal slice preparation of the rat brain. European Journal of Neuroscience. 12, 3651-3663 (2000).
- Roth, F. C., Beyer, K. M., Both, M., Draguhn, A., Egorov, A. V. Downstream effects of hippocampal sharp wave ripple oscillations on medial entorhinal cortex layer V neurons in vitro. Hippocampus. 26, 1493-1508 (2016).
- Bertsche, A., Bruehl, C., Pietz, J., Draguhn, A. Region- and pattern-specific effects of glutamate uptake blockers on epileptiform activity in rat brain slices. Epilepsy Research. 88, 118-126 (2010).
- Wu, C., Shen, H., Luk, W. P., Zhang, L. A fundamental oscillatory state of isolated rodent hippocampus. Journal of Physiology. 540, 509-527 (2002).
- Colgin, L. L., Jia, Y., Sabatier, J. M., Lynch, G. Blockade of NMDA receptors enhances spontaneous sharp waves in rat hippocampal slices. Neuroscience Letters. 385, 46-51 (2005).
- Ellender, T. J., Nissen, W., Colgin, L. L., Mann, E. O., Paulsen, O. Priming of hippocampal population bursts by individual perisomatic-targeting interneurons. The Journal of Neuroscience. 30, 5979-5991 (2010).
- Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. A. Comparison of different slicing planes in preservation of major hippocampal pathway fibers in the mouse. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 1-17 (2017).
- Maier, N., Morris, G., Johenning, F. W., Schmitz, D. An approach for reliably investigating hippocampal sharp wave-ripples in vitro. PLoS One. 4, 6925 (2009).
- Schlingloff, D., Kali, S., Freund, T. F., Hajos, N., Gulyas, A. I. Mechanisms of sharp wave initiation and ripple generation. Journal of Neuroscience. 34, 11385-11398 (2014).
- McCloskey, D. P., Scharfman, H. E. Progressive, potassium-sensitive epileptiform activity in hippocampal area CA3 of pilocarpine-treated rats with recurrent seizures. Epilepsy Research. 97, 92-102 (2011).
- McMahon, L. L., Williams, J. H., Kauer, J. A. Functionally distinct groups of interneurons identified during rhythmic carbachol oscillations in hippocampus in vitro. Journal of Neuroscience. 18, 5640-5651 (1998).
- Pöschel, B., Heinemann, U., Draguhn, A. High frequency oscillations in the dentate gyrus of rat hippocampal slices induced by tetanic stimulation. Brain Research. 959, 320-327 (2003).
- Hájos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. European Journal of Neuroscience. 29, 319-327 (2009).
- Hájos, N., Mody, I. Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content. Journal of Neuroscience Methods. 183, 107-113 (2009).
- Dengler, C. G., Yue, C., Takano, H., Coulter, D. A. Massively augmented hippocampal dentate granule cell activation accompanies epilepsy development. Nature Publishing Group. , 1-17 (2017).
- Ting, J. T., et al. Preparation of acute brain slices using an optimized N -methyl-D-glucamine protective recovery method. Journal of Visualized Experiments. 132, 1-13 (2018).
- Westerhof, N., Lankhaar, J. W., Westerhof, B. E. The arterial windkessel. Medical and Biological Engineering and Computing. 47, 131-141 (2009).
- Shi, W. X., Bunney, B. S. A small volume chamber for electrical recording from submerged brain slices and a pulse-free medium supply system using a peristalic pump. Journal of Neuroscience Methods. 35, 235-240 (1990).
