Summary
此协议描述了从表现出自发锐波波纹活动的小鼠身上制作水平海马-内皮层 （HEC） 切片的准备工作。切片在简化的接口夹腔中孵育，并在水下条件下用快速流动的人工脑脊液进行录音，以促进组织氧合和网络水平活动的自发出现。
Abstract
急性啮齿动物脑切片提供了一种可伸缩的实验方法，利用电生理学、显微镜和药理学，通过单细胞分辨率深入了解神经回路的组织和功能。然而， 体外 实验设计的一个主要考虑因素是，不同的切片制剂在多大程度上回顾了 在体内 观察到的神经活动的自然形态。在完好无损的大脑中，海马网络产生反映动物行为状态的高度同步的种群活动，在清醒的完善状态或非REM睡眠期间发生的剧烈波纹复合物（SWR）就是例证。SWR 和其他形式的网络活动可以在适当的条件下在孤立的海马片中自发出现。为了将强大的脑切片工具包应用于海马网络活动的调查，有必要采用一种优化海马网络内组织健康和保持功能连接的方法。小鼠通过心电图注入冷蔗糖为基础的人工脑脊液。含有海马的水平切片被切成450μm的厚度，以保持突触连接。切片在接口式腔室中恢复，并转移到水下腔室进行录制。录音室设计用于以高流速对人造脑脊液进行双表面超级输液，以改善切片的氧合。此协议产生适合体 外复杂和自发的网络活动研究的健康组织。
Introduction
体外活海马片 的 电生理测量是一种强大的实验方法，具有诸多优点。实验者可以使用显微镜、微操纵器和记录系统直接可视化和收集组织中单个神经元的测量结果。组织切片也非常容易用于光刺激或药物输送，用于光遗传学、化学遗传学或药理学实验。
海马网络在体内产生高度同步的人动，可见于细胞外局部场的振荡潜力1 ， 2 ， 3 ， 4 ， 5 。脑切片方法已被利用来深入了解这些神经元网络振荡背后的细胞和回路机制。迈尔等人的基础工作表明，尖锐的波纹复合物（SWR）可以自发地出现在腹海马6，7的切片中。来自多个研究者的后续研究已经逐渐阐明了SWR的许多方面，包括神经调节器在调节海马8、9、10的网络状态方面的作用，以及推动神经元合奏在体内活动期间体外重新激活的突触机制。脑切片实验也提供了对伽马范围振荡（30-100赫兹）的洞察，这是一种独特的海马网络状态，被认为支持内存编码和回忆12，13。最后，认识到海马和相关结构在时间叶癫痫病理生理学中的核心作用14、15，研究人员利用海马切片制剂研究癫痫活性的生成和繁殖。Carter等人证明，从慢性癫痫动物身上制备的海马-内皮层组合片可以在体外16中自发产生癫痫放电。随后，Karlécai等人利用经过改良的人工脑脊液（ACSF）改变离子浓度（降低Mg2+或升高K+）或添加药物（4AP或加巴津）17，探索了海马片中癫痫放电的机制。
研究者已经开发出许多海马切片方法，这些方法在关键方面有所不同：（1） 切片中海马的区域（多孔、中间或腹腔）：（二）内皮层等外皮组织的存在或者不存在的：（3） 用于切割切片（冠状、下垂、水平或倾斜）的方向：（4） 切片后组织维持的条件（完全浸入ACSF或保存在ACSF的接口和加湿，富含碳水化合物的空气）。
使用哪种切片方法的选择应由实验目标决定。例如，在水下条件下保存的背海马的横向或日冕切片已非常有效地用于研究海马内电路和突触可塑性18、19、20。然而，这种准备不会像21、22、23号海马的叶片那样自发地产生网络振荡。虽然从多佛和心室海马24的横向切片中，破伤风刺激可以诱发持续的SWR活动状态，但自发性SWR更容易在腹腔切片7、25中观察到。
在体内和体外26进行的研究支持了多骨和心室海马之间固有的生理和解剖学区别。大鼠的录音显示，整个脊椎和中海马的节奏非常连贯，但腹腔区域与海马27号其余部分之间的连贯性较差。体内的 SWR 很容易在多拉尔和中海马之间传播，而源自腹海马体的 SWR 通常仍然是本地的 28。来自位于背心和中海马体的CA3金字塔神经元的关联投影沿着海马的纵轴进行长距离投射。来自腹地的CA3预测仍然相对局部，因此在切片过程中不太可能被切断。因此，心室切片可以更好地保存生成人口同步所需的经常性网络。室室切片在体外产生自发网络活动的倾向也可能反映金字塔神经元的内在兴奋性更高，或与更多的背部区域31相比，心室海马体中较弱的GABAErgic抑制。事实上，腹海马片更容易受到癫痫活性32，33。因此，许多关于自发生理8、9、11、24或病理学16、34、35、36网络振荡的研究传统上都采用水平切片方法，有时在前脑方向有轻微的角度，产生与心室海马横向平面平行的组织切片。
网络连接不可避免地受到切片过程的影响，因为切片中的许多单元格将被切断。应考虑切片和制备中保留的组织的角度和厚度，以优化感兴趣的电路中的连接性。许多研究利用水平组合海马-内皮层切片（HEC）来探索两种结构在生理或病理网络振荡背景下的相互作用。Roth等人从海马的CA1子场和中腹皮层的V层进行了双重录音，以证明通过 HEC 切片37传播 SWR 活动。许多有关癫痫活性的研究都利用 HEC 切片制剂来研究癫痫菌体如何通过皮质皮质细胞网络 16、35、36、38 传播。需要注意的是，保存完好的皮质皮质环不是自发 SWR、癫痫放电或伽马振荡的先决条件：网络振荡可以在圆周或心室海马的横向切片中产生，没有附加的寄生虫组织21，22，23，25，39，40，41。 海马片中自发生成网络振荡的一个更重要的因素可能是每片的厚度，因为较厚的切片（400-550μm）将保留CA2/CA3复发网络21、22、25的更多连接。
虽然角水平 HEC 切片（在前部方向的切口角约为 12°角）已用于研究皮质希波坎帕尔环 11、16、34、35、42 的功能连接，但这种角度准备对于自发网络活动43、44、45并不需要。但是，使用倾斜的切片平面确实允许研究者选择性地制作切片，以最好地保存腹腔或中海马体的横向偏斜，具体取决于是否应用向下或向上的角度（图 1）。这种方法在概念上与2002年帕帕西奥多罗普洛斯等人所使用的方法相似，他们免费解剖了每个海马，然后使用组织斩波器沿着整个正交轴21创建横向切片。根据上述腹腔和正向中间海马之间的功能差异，研究人员在设计实验或解释结果时应考虑切片的解剖起源。在切片过程中使用琼脂坡道是一种从中间或心室海马体中优先生产切片的简单方法。
海马切片可以保存在水下室（组织完全浸入ACSF），或界面风格的腔室（如奥斯陆或哈斯室，切片只覆盖由流动介质薄膜覆盖）。接口维护可增强组织的氧化，促进神经元存活，并允许持续高水平的内分活动。传统上，水下记录条件使用较慢的ACSF流速，不能提供足够的组织氧合，以稳定地表达网络水平振荡。在水下海马片中，只观察到卡巴乔尔引起的伽马振荡，瞬时只有46，47，而它们可以稳定地维持在界面记录室10，48，49。因此，许多关于体外复杂自发活动的研究都依赖于界面记录室来研究剧烈波纹复合体6、7、8、9、10、25、37、伽马振荡10、13和癫痫活性16、38、45、47。
在水下风格的录音室中，浸入式显微镜目标可用于可视化单个细胞，并选择性地瞄准健康外观的细胞进行录制。水下制剂还允许对细胞环境进行精细控制，因为潜水有助于药物或其他化合物快速扩散到组织。因此，在水下条件下保持稳定的网络振荡的修改方法是一种强有力的实验方法。Höjos等人的工作就是例证，海马切片在简化的界面式支架室中恢复数小时，然后转移到具有高流量ACSF（约6 mL/min）的经过改造的水下录音室，以增强对组织12、48、49的氧气供应。在这种情况下，在水下录音室中可以保持高水平的自相残杀活动和稳定的自发网络振荡。这种修改的方法允许调查人员执行视觉引导的全细胞贴片夹子录音，并描述形态识别的细胞类型对卡巴乔尔诱导的伽马振荡12的贡献。SWR也可以自发地出现在水下海马片中，其快速流速为ACSF 11、48、49。迈尔等人证明，海马片在转移到水下录音室之前在接口室中恢复，可靠地表现出自发的SWR，而在转移到水下录音室之前在烧杯中恢复的片状物则显示出较小的引起场反应，自发突触电流水平较低，而且很少显示自发的SWR43。施林洛夫等人利用这种改进的方法，展示了帕瓦尔布明表达篮细胞在产生自发SWR44中的作用。
以下协议提出了一种切片方法，通过这种方法，可以在接口条件下恢复水平海马切片中的自发活跃神经元，随后保存在适合药理学或光遗传学操作和视觉引导记录的水下录音室中。
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Protocol
这里描述的所有方法都得到了哥伦比亚大学机构动物护理和使用委员会（AC-AAU9451）的批准。
1. 准备解决方案
- 准备蔗糖切割溶液，用于切片，如 表 1中所述。
注：在准备了1升蔗糖溶液后，在冰盘中冷冻少量（约100-200毫升）。这些冷冻蔗糖冰块将被混合成冰浆（见步骤4.3）。 - 准备人工脑脊液（ACSF）进行记录，如 表2所述。
- 将 0.05844 克 NaCl 溶解在经过过滤的 1 mL 纯净水中，以去除微量金属和其他杂质，从而准备 1 M NaCl 刺激移液器。
注：蔗糖切割解决方案和ACSF应为每个实验准备新鲜。
2. 准备阿加坡道
- 通过将琼脂粉溶解到经过过滤以去除微量金属和其他杂质的纯净水中，准备 4% 琼脂（例如，50 mL 水中的 2 克琼脂）。将混合物加热到微波炉中，直到它开始沸腾（大约30-60 s）。将熔融的琼脂倒入模具中，使其在大约 12° 倾斜的冰箱中以 4 °C 冷却和凝固。
注：对于模具，可以使用任何玻璃或塑料容器设置在一个角度，有足够的熔融琼脂倒入形成一个坡道4厘米长，约0.8厘米的高度。
3. 阶段切片区域
- 用大约 250 mL 的 ACSF 填充一个包含切片回收室的 400 mL 烧杯;将其放在加热到32°C的水浴中，开始用碳水化合物冒泡（95%的氧气/5%的二氧化碳气体）。
注：在回收烧杯中填充足够的液体，将夹子的尼龙网放在溶液的表面，以便将切片放在温溶液混合物和空气的接口处（图1）。将小片镜头纸放在尼龙网上。切片将放在镜头纸的顶部，后者以后可用于将切片单独转移到录音室（见步骤 6.6）。 - 将带蔗糖溶液的烧瓶放入冰桶中冷却，并开始用碳水化合物冒泡。
注：回收烧杯和蔗糖溶液应分别加热和冷却，在将鼠标放入异氟室之前，碳水化合物冒泡至少30分钟。 - 从冰柜中取出预制的冷冻蔗糖溶液冰块托盘，放在长凳上部分解冻。
- 将清洁的双刃剃须刀刀片的一半放入微切口中，并在必要时校准。将剃须刀刀片的另一半放在一边，用于解剖。
- 运行一个碳水化合物线和温度探头到切片室和周围的冰冷却室。
- 准备一个干净的长凳或桌子覆盖着两个一次性吸水垫。将所有解剖工具和三块实验室胶带放在左垫上，在那里进行心电图灌注。
注：解剖工具包括小波恩剪刀、解剖剪刀、大铲/勺、微孢子、带新刀片的手术刀、铲子、锋利/钝化手术剪刀、大组织钳和小组织钳（见 材料表）。 - 在灌注区右侧的另一个吸水垫上，将一张圆形滤纸放入直径为 100 mm 的玻璃培养皿的盖子中。将培养皿的底部放在盖子旁边，将碳水化合物线放入菜的两块中。
- 使用剃须刀刀片或手术刀切割一小坡道（沿倾斜表面约4厘米，高度0.8厘米，宽2厘米）。从高端切断一块坡道，并将其倒车，以创建一个阿加的后背块。使用青花胶粘剂将琼脂坡道和后背块贴在切片平台上并放在一边。
注：agar的后背块有助于在切片过程中稳定大脑，并提供一个表面，从每片中解剖不必要的组织（图1）。
4. 心肌输液
- 将 60 mL 容量的注射器作为蔗糖切割溶液的储液池，在台面上方约 18 英寸处（例如，在垂直柱子上使用三管齐下旋转夹）。将管子连接到储层底部，通过滚筒夹运行管子，并将管的另一端连接到干净的 20 G 针。
- 用大约 30 mL 的冰镇蔗糖溶液填充 60 mL 水库，并将碳水化合物线引导到蔗糖储层中，以持续冒泡香水。
注意：确保蔗糖流过管子和针头，没有任何捕获的气泡。流速应该足够快，有一个稳定的，持续的滴蔗糖从针。 - 使用搅拌机，将冷冻蔗糖粉碎并混合到冰冷的泥浆中，然后使用大铲子/勺子分配浆料。
- 将少量蔗糖浆放在玻璃培养皿盖的边缘。向培养皿底部添加少量蔗糖浆。
- 将大约 20-30 mL 的蔗糖浆添加到注入液库中，将其与 30 mL 的冰镇液体蔗糖很好地混合，直到储液库包含非常冷的、主要是液体的蔗糖与一些残留的冷冻溶液的混合物。
- 将鼠标放入连接到异氟蒸发器的室内。当氧气在大约 2 L / min 动时，转动蒸发器的表盘以 5% 的浓度提供异氟化液，并启动一个测时器。
注意：在整个切片过程中保持此计时器，以测量切片的获取速度。手术应尽快完成，以便切片完成，组织在动物进入异氟室的15-20分钟内在接口室恢复。观察鼠标，以确保达到深度麻醉状态。至少5分钟后，鼠标应深度麻醉，对脚趾捏无反应。 - 在将鼠标从异物室中取出之前，立即将 Petri 菜盖填充，将冷冻蔗糖溶液填充至约 3-5 mm 的深度，并在 Petri 菜底填充冰镇蔗糖溶液，深度约为 1.0 厘米。
- 快速将鼠标转移到左吸水垫，并使用 3 块胶带固定前肢和尾部。执行后肢脚趾捏合，以确保鼠标在执行任何切口之前无响应。使用大组织钳和手术剪刀，帐篷的皮肤，使从胸骨底部到胸部顶部的长切口。用钳子拉起胸骨，用剪刀切开隔膜。
注：应尽快执行鼠标的初始定位和切口以切断隔膜的前几个切口，以确保鼠标不会恢复知觉。为了确保在整个过程中麻醉的足够深度，可以在灭鼠器上放置一个鼻锥，以便在注入过程中提供异丙苯丙。 - 使用剪刀切开两侧的肋骨笼，向前肢与身体交汇处切开一个大动作。用钳子，将肋骨笼的前部向左摆动，朝头部向上摆动，然后用大剪刀用水平切口将其完全取出。使用大钳子将心脏保持到位，并将 20 G 注水针插入左心室。一旦针头定位正确，心脏的左侧应迅速苍白，因为冰镇蔗糖溶液填充心室。
- 使用小解剖部门剪刀切入右中庭，让血液从循环系统流出。如果切口执行得当，心脏的损伤应该最小，并且应该在整个灌注过程中继续泵送。
注意：卷起的纸巾可用于从心脏吸走血液和蔗糖溶液，并在手术过程中保持输液针的可见性。 - 确保香水针保持原位，不要从左心室脱落。随着适当的流速和放置，肝脏将开始苍白到浅褐色/米色与20-30s。
- 30-45岁以后，用大剪刀斩首鼠标。将头部握在左手上，将皮肤从头骨上推开或剥落。在一个精心注入的动物，头骨应该非常苍白，大脑应该出现一个非常浅的粉红色（接近白色）通过头骨没有清晰可见的血管。
5. 提取大脑并切片
- 使用小波恩剪刀，使两个横向切口通过头骨朝中线在头骨的前面，靠近眼睛。在头骨底部的两侧再做两个切口。
- 将头部转移到玻璃培养皿的底部，在那里它应该主要浸泡在冰镇蔗糖溶液中。使用小波恩剪刀沿着头骨的长度切下中线，用剪刀拉起，以尽量减少对底层脑组织的损伤。使用小组织钳，牢牢抓住头骨的每一侧，摆动它向上和远离大脑，像打开一本书。
- 用左手的手指把头骨的皮瓣打开，在嗅灯泡附近的大脑下插入微孢子。将大脑从头骨中翻转到蔗糖中，然后用微孢子切断脑干。洗脑以去除任何残留的血液、毛皮或其他组织。
- 使用大铲子/勺子将大脑转移到玻璃培养皿的盖子上。与双刃剃须刀刀片的另一半以前预留，使两个日冕切割，首先删除小脑，然后大脑的最前部分，包括嗅灯泡（图1）。
- 将青亚酸胶粘剂涂抹在琼脂坡道上。非常短暂地将大脑放在一块干燥的滤纸上，使用大组织钳，然后立即将其转移到琼脂坡道，将大脑的腹腔表面放在胶粘剂上。
注：对于中间海马的切片，大脑应面向前方朝上坡道的斜坡，后部更接近刀片。对于腹海马的切片，用前端定向大脑指向坡道的斜坡，后端在坡道顶部，远离刀片。无论哪种情况，大脑都应该位于坡道的顶部，这样大脑的冠状切口表面就会接触到琼脂背块（图1）。 - 将切片平台与琼脂和大脑放入微切片的切片室，并完全浸入冰镇蔗糖溶液。使用大铲子/勺子将一些蔗糖浆转移到腔室，搅拌融化任何冷冻蔗糖，并迅速将混合物的温度降低到 ±1-2 °C。
注：在整个切片过程中观看温度计。如果蔗糖溶液加热到3°C以上，添加更多的泥浆和混合，使温度回落。 - 切片厚度为 450μm，微原子速度设置为 0.07 mm/s。当每个切片被释放时，使用小组织钳和锋利的手术刀首先分离两个半球，然后切开组织，直到切片主要由海马和准希波坎帕尔区域组成（图1）。
- 使用塑料转移移液器将切片单独转移到接口恢复室，确保切片位于ACSF和空气的接口处，只有薄薄的ACSF半月板覆盖切片。紧紧地关闭房间的盖子，让切片在32°C下恢复30分钟。
- 在 32 °C 的初始恢复后，将接口恢复室从水浴中取出，并放置在搅拌器上，使其速度变慢，使磁搅拌杆促进室内ACSF的循环。允许它逐渐冷却到室温，因为切片恢复额外的90分钟。确保回收室不断用碳水化合物冒泡，不要让大气泡困在切片下面。
6. 执行自发活动的本地现场潜力 （LFP） 录音
- 通过打开所有必要的设备（包括运行采集软件的计算机、连接到计算机的监视器、刺激器、微操纵器、温度控制器、显微镜光源、显微镜连接摄像头、微电子放大器、数字化器和永久泵）来准备 LFP 录制。如果使用中央真空系统，请打开墙壁阀，准备真空线，将ACSF从录音室中取出。
- 用ACSF填充加热的储层，然后将管子的一端放入含有冒泡ACSF的400 mL烧杯中。打开永久泵，将ACSF从400 mL烧杯引向加热的储层，然后从水库进入录音室。点击或捏住管子以释放任何被困的气泡。
- 调整腹腔泵，以确保通过录音室的ACSF流速快（~8-10 mL/min）。使用温度探针确保记录室中心 ACSF 为 32 °C。
注：如果ACSF使用长息泵输送到录音室，高流量可能导致流速显著波动。使用简单的脉动阻尼器（图 2），可以实现一致的流速，该阻尼器由集成到管中的一系列空注射器组成。 - 使用加热灯丝拉拔器准备来自波罗西拉特玻璃毛细血管的刺激和记录移液器。应配置拉拔器协议，以产生电阻为 2-3 MOhm 的移液器，用于刺激或局部场电位记录电极。
- 用 ACSF 填充 1 M NaCl 和 LFP 移液器的刺激移液器。
- 短暂地夹住油管并关闭泵以暂停ACSF的流量。使用细钳将切片转移到录音室，以抓住镜头纸的一角，切片放在镜头纸上。将镜头纸放入录音室，朝下切片，然后"剥"掉镜头纸，将切片浸入录音室。使用竖琴固定切片。
注：竖琴可以使用U形不锈钢或铂金和细尼龙灯丝在实验室内购买预制或制造。 - 将充满 NaCl 的刺激移液器放入手动微操纵器中，以大约 30-45° 的角度缓慢地将移液器尖端推进到切片表面（例如 ，在地层散热 层中）。一旦移液器的尖端进入组织，缓慢地向前推进移液器，避免在横向或垂直方向进行大运动，这些运动可能会不必要地损坏切片内的轴突。将移液器的尖端至少 50-100μm 深放入切片中，以避免在切片过程中损坏的表面附近的细胞。
- 将充满ACSF的LFP移液器放入连接到电动微操纵器的移液器支架中。使用口腔压力或 1 mL 注射器施加非常轻的正压力，该注射器通过塞式阀门连接，并将短长度的管子连接到移液器支架上。
注：将LFP移液器放置在切片中以记录兴趣信号：在剧烈波纹的情况下，应将一个LFP移液器放置在地层金字塔（SP）中，将第二个移液器放置在地层辐射（SR）中。此配置允许同时录制 SR 中的负锐波和 SP 中的高频波纹振荡（图 3）。 - 使用微操纵器将LFP移液器的尖端以大约30-45°的角度缓慢地推进到感兴趣的区域（例如CA1金字塔细胞层）。将移液器的尖端至少 50-100μm 深放入切片中，以避免在切片过程中损坏的表面附近的细胞。在推进LFP移液器的同时，使用采集软件不断提供小电压测试脉冲，并观察电极电阻的突然增加。这可能表明移液器已堵塞或压在细胞上。
- 一旦LFP移液器放置在感兴趣的区域，通过打开连接到移液器支架的管子上的阀门，小心释放正压力。
- 要同时在第二个位置记录 LFP，需要用第二个移液器和微操纵器重复步骤 6.8-6.10。
- 使用当前夹子配置中的微电子放大器，在采集软件中使用桥平衡功能纠正移液器的系列电阻后，记录本地场潜力中的自发活动。自发 SWR 将显示为 SP 层（图 3）的细胞外电位的正偏转。
- 为了记录唤起的场电位，使用连接到数字化器的刺激器通过充满 NaCl 的刺激移液器传递短（200 我们）方形电压脉冲。调整刺激电压表盘以唤起一系列响应振幅。
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Representative Results
此处介绍的是本协议中描述的 HEC 切片中的代表性录音。在接口保持室（图1C）中恢复后，切片被单独转移到水下录音室（图2B）。录音室使用长眠泵（图2A）提供碳水化合物饱和的ACSF。泵首先将ACSF从手持烧杯中拉入加热储层。碳水化合物线被放置在手持烧杯和加热储层中，以提供介质的连续氧合。脉动阻尼器由一系列充满空气的注射器组成，位于垂直泵和记录室之间，以尽量减少快速围置产生的流速波动。每个注射器中的气囊吸收泵每个周期造成的压力变化，使录音室接收 ACSF52、53的平稳、一致的流量。脉动阻尼器后放置的内联加热器可确保 ACSF 在进入录音室时温度保持在 32 °C。
在此示例中，双表面超级输液记录室由三个 3D 打印层（图 2B）组成。底层有一个矩形切口，以适应盖片，用真空油脂固定。中间层包含拉长椭圆形室的下半部分，有两个水平支架。尼龙灯丝串在这些支架上（大约每 0.5 毫米一次），并配有青亚酸胶粘剂。切片将放在这条串长丝的上面。顶层包含椭圆形腔室的上半部分以及可以放置氯化银地面颗粒的小井。房间的拉长椭圆形旨在促进ACSF的快速层流。
图 3 展示了根据此协议准备的 HEC 切片中的代表性录音。为了初步评估切片健康，使用装满 1 M NaCl 的移液器在 地层辐射 （SR） 中唤起现场后突触潜力 （fPSP）。在健康的切片中，电刺激应产生具有小预制纤维排球和大后突触电位的 fPSP，具有快速初始下降（图 3B，左上角）。在健康的切片中，自发的锐波波纹 （SWR） 在 层金字塔 中的 LFP 中可见为正偏转（图 3B，左下）。在引起fPSP的次优切片中，显示一个大的纤维排球和相对较小的后突触电位，而这种切片并不显示自发的SWR（图3B，右图）。 体外 SW 显示与已发布的描述一致的特征：SP 层中的正字段潜力与覆盖的高频振荡，与 SR 层中的负字段电位（图 3C）配对。CA2 中记录的单个 SWR 以星号表示（图 3C，右图）。HEC 切片中的 SWR 源自 CA2/CA3 经常性电路，并传播到 CA1。CA2 和 CA1 SP 层中观察到的单个 SWR 用星号表示（图 3D，右图）。在此具有代表性的示例中，CA2 SWR（绿色）将 CA1（蓝色）中铅数毫秒，如每个区域记录的 SWR 信封叠加（以 2-30 Hz 过滤）所示。
图1：准备水平角海马-腹皮质（HEC）片。（A）（i） 提取大脑后，用剃须刀刀片进行两次冠状切口，以去除大脑的后部和前部。（ii） 阿加坡道由两个倾斜部分组成，粘附在微切片平台上。要准备中间海马的切片，请将大脑块放置在琼脂坡道上，前表面朝上斜坡，并与坡道的高背部分接触。要准备更多的腹海马片，将大脑块放置在琼脂坡道上，前表面朝下坡面，以便后切面与坡道的高背部分接触。（iii） 当每片切片被释放时，用手术刀再进行几次切口，以分离半球并去除不必要的组织。（B） 由 DAPI 标记的带细胞核的生成切片的代表性图像。（C） 在接口回收室中，切片被放置在不锈钢或尼龙网的镜头纸片上，与ACSF表面平起平地。陶瓷泡泡器将碳水化合物输送到室内，磁搅拌棒不断将室内的液体混合。ACSF 的薄膜覆盖了切片的顶部表面，增强了来自室内潮湿的富含碳水化合物的空气中的氧气扩散。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图2：ACSF输送管中带脉动阻尼器的双表面超级输液记录室。 （A） 超级输液系统的图表。ACSF 加热到 32 °C，不断用碳水化合物气体冒泡，使用带脉动阻尼器（由一系列充满空气的注射器组成的脉动阻尼器）以大约 8-10 mL/min 的速度输送。（B） 录音室由三层3D打印组成，中间系有尼龙灯丝。切片位于这种串长丝上，ACSF 在组织上方和下方流动。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图3：HEC切片自发锐波波纹的代表性记录。 （A） HEC 切片的简化图，显示录制和刺激电极的位置。（B） 活性、健康切片和亚优切片的LFP活性代表性记录。健康的切片（左，绿色）显示大唤起的场响应和自发的尖锐波纹 （SWR），可见为 SP 层局部场潜力中不规则发生的正偏转。相比之下，不健康的切片显示小引起现场反应，没有自发活动（右，灰色）。（C） CA2 区域的 SWR 代表性记录，包括 SR 层 LFP 中的负偏转和 SP 层 LFP 中具有潜在正偏转的高频振荡。每个信道中大于信号振幅三个标准偏差的峰值以红色突出显示。带通滤波器为 2-30 Hz，分别隔离 SP 和 SR 层中锐波的潜在正负包络，而带通滤波器为 80-250 Hz，用于隔离 SP 层波纹的高频振荡。（D） 从 CA2/CA3 到 CA1 的 体外 传播的 SWR。在这些有代表性的记录中，CA2 中的 SWR（绿色、底部）先于 CA1（蓝色、顶部）几毫秒。每个信道中大于信号振幅三个标准偏差的峰值以红色突出显示。 请点击这里查看此数字的较大版本。
| 分子量（克/摩尔） | 最终浓度（mM） | 克/1 L蔗糖切割溶液 | ||
| 蔗糖 | C12H22O11 | 342.3 | 195 | 66.749 |
| 氯化钠 | Nacl | 58.44 | 10 | 0.584 |
| 葡萄糖 | C6H12O6 | 180.08 | 10 | 1.801 |
| 碳酸氢钠 | 纳科3 | 84.01 | 25 | 2.1 |
| 氯化钾 | 氯化钾 | 74.55 | 2.5 | 0.186 |
| 磷酸钠单基无水 | 纳赫2PO4 | 137.99 | 1.25 | 0.173 |
| 紫罗酸钠 | C3H3诺3 | 110.04 | 2 | 0.22 |
| 股票浓度 （M） | 最终浓度（mM） | 毫升/1L蔗糖切割溶液 | ||
| 氯化钙 | 卡克2 | 1 | 0.5 | 0.5 |
| 氯化镁 | MgCl2 | 1 | 7 | 7 |
表1：蔗糖切割溶液的组成。 首先从约0.75升的纯净水开始，经过过滤以去除微量金属和其他杂质。溶解每个固体，同时将溶液与磁搅拌棒混合。一旦所有的固体溶解，泡沫碳水化合物气体通过溶液10分钟。加入 MgCl2 和 CaCl2 解决方案，加入水，将总体积达到 1 L. 与磁搅拌棒混合 10 分钟，以确保溶液均匀混合。渗透度应在 315 至 325 mOsm 之间，pH值应约为 7.4。
| 分子量（克/摩尔） | 最终浓度（mM） | 克/2L ACSF | ||
| 氯化钠 | Nacl | 58.44 | 125 | 14.61 |
| 葡萄糖 | C6H12O6 | 180.08 | 12.5 | 4.502 |
| 碳酸氢钠 | 纳科3 | 84.01 | 25 | 4.201 |
| 氯化钾 | 氯化钾 | 74.55 | 3.5 | 0.522 |
| 磷酸钠单基无水 | 纳赫2PO4 | 137.99 | 1.25 | 0.345 |
| 抗坏血酸 | C6H8O6 | 176.12 | 1 | 0.352 |
| 紫罗酸钠 | C3H3诺3 | 110.04 | 3 | 0.66 |
| 股票浓度 （M） | 最终浓度（mM） | 毫升/2升ACSF | ||
| 氯化钙 | 卡克2 | 1 | 1.6 | 3.2 |
| 氯化镁 | MgCl2 | 1 | 1.2 | 2.4 |
表2：人工脑脊液的组成。 首先从大约1.5升的纯净水开始，经过过滤以去除微量金属和其他杂质。溶解每个固体，同时将溶液与磁搅拌棒混合。一旦所有的固体溶解，泡沫碳水化合物气体通过溶液10分钟。加入 MgCl2 和 CaCl2 解决方案，加入水，将总体积达到 2 L. 与磁搅拌棒混合 10 分钟，以确保溶液均匀混合。渗透度应在 315 至 325 mOsm 之间，pH值应约为 7.4。
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Discussion
这个切片协议有几个步骤，旨在促进组织健康，有利于自发的自然网络活动的出现：小鼠在心电图上注入冰镇蔗糖切割溶液：水平内皮质 （HEC） 切片的厚度为 450μm，从中间或腹海马;切片在加热的ACSF和加湿，富含碳水化合物的空气的界面恢复：在录制过程中，切片被超级注入ACSF加热到32°C，并以快速流速交付，双表面超级输液在水下录音室。
切片健康对于 体外网络振荡的产生至关重要。幼年动物将产生更健康的切片，一般与幼鼠或青少年小鼠的输液步骤可以跳过。随着动物年龄的增长，制作健康切片变得越来越困难，但一些研究（如疾病模型或纵向研究）需要使用成年或老化的动物。例如，邓勒等人在准备50只接受皮洛卡平治疗的慢性癫痫成年小鼠的 HEC 切片时，使用了心肌输液。对于成年小鼠，在从头骨中取出大脑之前，用冰镇蔗糖切液进行心肌蒸液，以冷却组织，清除大脑中的血液，减少代谢活性，是有益的。然而，必须指出，输液需要正确进行训练，必须小心谨慎，以确保手术迅速进行，不会对动物福利造成风险。如果可能，实验应设计为使用幼年动物，从而排除使用心肌敷液。在次优切片准备中，将没有足够的健康细胞，特别是内皮细胞来支持正在进行的网络振荡。为了评估实验过程中的切片健康，首先记录唤起的场位潜力（例如，在 层辐射（SR）中使用刺激移液器和记录移液器是有用的。在健康切片中，SR 层中的刺激将唤起具有相对较小的预制纤维排球（图 3）的大场后突触电位 （fPSP）。
此协议产生的切片是倾斜水平海马-内皮层 （HEC） 切片。重要的是，海马切片既不需要加入寄生虫组织，也不需要角切口来自发生成网络活动，如SWR。事实上，许多研究已经利用水平或横向海马片来询问生理学方面25，40，41，44或病理网络振荡33，38。在此协议中，大脑放置在琼脂坡道上，使实验者能够有选择地从腹腔或中海马体（图1）中产生更多的切片，这可能有利于考虑到海马26、31纵轴沿线存在的功能异质性的实验目标。如果切片的解剖起源不是一个因素，那么可以排除琼脂坡道，一个真正的水平切割平面将产生中腹海马的切片。当每个水平组织切片被释放时，切片的大多数无关部分可以通过三个简单的切口去除，留下一个大致矩形的切片，其中包含海马和一些周围的组织，包括准希波坎帕尔区域（图1）。可以进行进一步解剖，以去除所有外皮组织，但周围组织的加入是有益的，因为切片竖琴可以很容易地放置，使尼龙灯丝不休息整个海马体本身。如上所述，合并的 HEC 切片也是一个有用的准备，用于在生理 37 或病理学16、35、36、38网络振荡的背景下研究更大的皮质皮质细胞网络。
此协议的关键因素是在恢复阶段和录制期间优化对组织的氧气供应。许多网络振荡研究都是在切片中进行的，这些切片直接从微原子转移到界面记录室，并允许通过不断注入新鲜的ACSF进行恢复。恢复数小时后，录音可在同一接口室中执行。因此，切片在ACSF和潮湿的富含碳水化合物的空气的界面上保存，整个实验期间。在本协议中提出的替代方法中，切片在接口式保持室中恢复至少两个小时，然后将单个切片转移到具有足够快的 ACSF 流速的水下式记录室。在这些条件下准备的切片可以表现出稳定的伽马振荡12 或自发的SWR活动43。接口式保持室中的切片恢复是关键步骤：Maier 等人证明，在 ACSF 完全淹没的烧杯中恢复的切片具有较小的激发场潜力、较少频繁的自发后突触电流，并且很少产生自发的网络活动43。同样，Höjos等人表明，快速的ACSF流速导致自发抑制性后突触电流的频率更高，这表明内部活动49的改善。在录制期间，双表面超级输液不是绝对必要的，只要录音室持有相对较小的ACSF量以快速流速（至少6mL/min）43交付。本协议（图2B）中介绍的3D打印录音室是一个相对经济高效和简单的选项，但也有商业上可用的水下录音室，旨在容纳较小的音量，促进媒体的层流，或提供双表面超级输液（例如，与圆形录音室相比，允许过量的ACSF死容量）。
虽然此协议允许一个人在没有传统界面记录室要求的情况下记录网络振荡，但有几个限制。虽然切片在恢复期间保存在ACSF-Air接口中，但它们不会像传统的哈斯式界面录音室那样不断注入新鲜介质。切片必须单独（使用细钳子）从回收室转移到水下录音室。此外，快速流速可能会导致一些录音的不稳定性和运动伪影有问题，特别是如果 ACSF 是用静态泵交付的。为了保持快速的流速和尽量减少机械干扰，一个简单的脉动阻尼器可以集成到敷液系统（图2）中。这种脉动阻尼器使用Windkessel效应52运行，其中空注射器含有作为弹性储层的气囊，吸收了53号垂直泵滚筒产生的波动压力。但是，脉冲阻尼器的加入可以增加将ACSF输送到录音室的管子的长度，并影响切片的氧气供应。流速应尽可能快地产生稳定的网络振荡，如果使用静止泵，最好是使用大量滚筒（+12）的泵，以尽量减少静止引起的脉动，排除使用脉动阻尼器，并确保将ACSF输送到录音室的管子尽可能短。以快速流速进行的录音也需要大量的ACSF，如果实验需要在媒体上添加贵重或昂贵的药物或化合物，这可能有问题。虽然双表面超级输液室需要一个专门建造的录音室，内有两个液流入口，以便向切片的两侧输送含氧介质，但可以观察到自发的网络振荡，其中度ACSF流速为48。此协议同时利用快速流速（用脉动阻尼器稳定）和双表面超级输液室，以提高观察自发活动的可能性。
最后，本协议对每只动物生产的切片数量的产量较低。厚度为 450 μm 的水平切片在首选方向上产生少量 HEC 切片（其中切片与海马的横向轴有效平行）。在这些切片中，通常每个海马只有一两个表现出自发的SWR活动，比其他地方报道的43个要少。虽然较厚的切片可能含有更大程度的经常性连接，但切割稍微薄一点的切片（400 μm）可能会产生更多具有 SWR 活性的横向切片。此外，在利用心室海马的真正水平或向下角度切片的实验中，多个切片可靠地表现出自发 SWR 活动的可能性可能更高。目前的协议包括使用中海马的向上角水平切片，这可能不太可能表现出自发的网络活动相比，从腹海马25，26，31切片。最后，本协议使用了青少年和成年小鼠的切片。虽然输液可以改善老年动物切片的质量，但使用12、41、44岁幼年动物的切片可以提高观察自发网络活动的可能性。
总之，此协议提出了一种小鼠大脑切片方法，从中腹海马形成中产生倾斜的水平海马-内皮层切片，从而以尖锐波纹复合物的形式表现出复杂的自发网络活动。
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Disclosures
提交人没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者要感谢史蒂夫·西格尔鲍姆的支持。资金由5R01NS106983-02以及1 F31 NS113466-01提供。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Lulzbot | LulzBot TAZ 6 | |
| Acute brain slice incubation holder | NIH 3D Print Exchange | 3DPX-001623 | Designed by ChiaMing Lee, available at https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623 |
| Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma Aldrich | A9187-500MG | |
| Ag-Cl ground pellets | Warner | 64-1309, (E205) | |
| agar | Becton, Dickinson | 214530-500g | |
| ascorbic acid | Alfa Aesar | 36237 | |
| beaker (250 mL) | Kimax | 14000-250 | |
| beaker (400 mL) | Kimax | 14000-400 | |
| biocytin | Sigma Aldrich | B4261 | |
| blender | Oster | BRLY07-B00-NP0 | |
| Bonn scissors, small | becton, Dickinson | 14184-09 | |
| borosilicate glass capillaries with filament (O.D. 1.5 mm, I.D. 0.86 mm, length 10 cm) | Sutter Instruments | BF150-86-10HP | Fire polished capillaries are preferable. |
| calcium chloride solution (1 M) | G-Biosciences | R040 | |
| camera | Olympus | OLY-150 | |
| compressed carbogen gas (95% oxygen / 5% carbon dioxide) | Airgas | X02OX95C2003102 | |
| compressed oxygen | Airgas | OX 200 | |
| constant voltage isolated stimulator | Digitimer Ltd. | DS2A-Mk.II | |
| coverslips (22x50 mm) | VWR | 16004-314 | |
| cyanoacrylate adhesive | Krazy Glue | KG925 | Ideally use the brush-on form for precision |
| data acquisition software | Axograph | N/A | Any equivalent software (e.g. pClamp) would work. |
| Dell Precision T1500 Tower Workstation Desktop | Dell | N/A | Catalog number will depend on specific computer - any computer will work as long as it can run electrophysiology acquisition software. |
| Digidata 1440A | Molecular Devices | 1-2950-0367 | |
| digital timer | VWR | 62344-641 | 4-channel Traceable timer |
| disposable absorbant pads | VWR | 56616-018 | |
| dissector scissors | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| double-edge razor blades | Personna | BP9020 | |
| dual automatic temperature controller | Warner Instrument Corporation | TC-344B | |
| dual-surface or laminar-flow optimized recording chamber | N/A | N/A | The chamber presented in this protocol is custom made. A commercial equivalent would be the RC-27L from Warner Instruments. |
| equipment rack | Automate Scientific | FR-EQ70" | A rack is not strictly necessary but useful for organizing electrophysiology |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethyiether)- N,N,N',N'-teetraacetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | 324626-25GM | |
| filter paper | Whatman | 1004 070 | |
| fine scale | Mettler Toledo | XS204DR | |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| glass petri dish (100 x 15 mm) | Corning | 3160-101 | |
| glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G8877-250MG | |
| ice buckets | Sigma Aldrich | BAM168072002-1EA | |
| isoflurane vaporizer | General Anesthetic Services | Tec 3 | |
| lab tape | Fisher Scientific | 15-901-10R | |
| lens paper | Fisher Scientific | 11-996 | |
| light source | Olympus | TH4-100 | |
| magnesium chloride solution (1 M) | Quality Biological | 351-033-721EA | |
| magnetic stir bars | Fisher Scientific | 14-513-56 | Catalog number will be dependent on the size of the stir bar. |
| micromanipulator | Luigs & Neumann | SM-5 | |
| micromanipulator (manual) | Scientifica | LBM-2000-00 | |
| microscope | Olympus | BX51WI | |
| microspatula | Fine Science Tools | 10089-11 | |
| monitor | Dell | 2007FPb | |
| MultiClamp 700B Microelectrode Amplifier | Molecular Devices | MULTICLAMP 700B | The MultiClamp 700B should include headstages, pipette holders, and a model cell. |
| N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), (HEPES) | Sigma Aldrich | H3375-25G | |
| needle (20 gauge, 1.5 in length) | Becton, Dickinson | 305176 | |
| nylon filament | YLI Wonder Invisible Thread | 212-15-004 | size 0.004. This cat. # is from Amazon.com |
| nylon mesh | Warner Instruments Corporation | 64-0198 | |
| perstaltic pump | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
| Phosphocreatine di(tris) salt | Sigma Aldrich | P1937-1G | |
| pipette holders | Molecular Devices | 1-HL-U | |
| platinum wire | World Precision | PT0203 | |
| polylactic acid (PLA) filament | Ultimaker | RAL 9010 | |
| potassium chloride | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| potassium gluconate | Sigma Aldrich | 1550001-200MG | |
| potassium hydroxide | Sigma Aldrich | 60377-1KG | |
| razor blades | VWR | 55411-050 | |
| roller clamp | World Precision Instruments | 14041 | |
| scale | Mettler Toledo | PM2000 | |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| slice harp | Warner | SHD-26GH/2 | |
| sodium bicarbonate | Fisher Chemical | S233-500 | |
| sodium chloride | Sigma Aldrich | S9888-1KG | |
| sodium phosphate monobasic anhydrous | Fisher Chemical | S369-500 | |
| sodium pyruvate | Fisher Chemical | BP356-100 | |
| spatula | VWR | 82027-520 | |
| spatula/spoon, large | VWR | 470149-442 | |
| sterile scalpel blades | Feather | 72044-10 | |
| stirrer / hot plate | Corning | 6795-220 | |
| stopcock valves, 1-way | World Precision Instruments | 14054 | |
| stopcock valves, 3-way | World Precision Instruments | 14036 | |
| sucrose | Acros Organics | AC177142500 | |
| support for swivel clamps | Fisher Scientific | 14-679Q | |
| surgical scissors, sharp/blunt | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| syringe (1 mL) | Becton, Dickinson | 309659 | |
| syringe (60 mL with Luer-Lok tip) | Becton, Dickinson | 309653 | |
| three-pronged clamp | Fisher Scientific | 05-769-8Q | |
| tissue forceps, large | Fine Science Tools | 11021-15 | |
| tissue forceps, small | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| tubing | Tygon | E-3603 | ID 1/16 inch, OD 3/16 inch |
| tubing | Tygon | R-3603 | ID 1/8 inch, OD 1/4 inch |
| vacuum grease | Dow Corning | 14-635-5D | |
| vibrating blade microtome | Leica | VT 1200S | |
| vibration-dampening table with faraday cage | Micro-G / TMC-ametek | 2536-516-4-30PE | |
| volumetric flask (1 L) | Kimax | KIM-28014-1000 | |
| volumetric flask (2 L) | PYREX | 65640-2000 | |
| warm water bath | VWR | 1209 |
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