Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von horizontalen Hippocampus-entorhinalen Kortex-Scheiben (HEC) von Mäusen, die eine spontane scharfe Wellenwelligkeit saufen. Slices werden in einer vereinfachten Grenzraum-Haltekammer inkubiert und Aufnahmen werden unter getauchten Bedingungen mit schnell fließender künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit durchgeführt, um die Sauerstoffversorgung des Gewebes und die spontane Entstehung von Netzwerkaktivität zu fördern.
Abstract
Akutes Nagetier-Gehirnschneiden bietet einen belastbaren experimentellen Ansatz, um Einblicke in die Organisation und Funktion neuronaler Schaltkreise mit einzelliger Auflösung mittels Elektrophysiologie, Mikroskopie und Pharmakologie zu gewinnen. Ein wichtiger Aspekt bei der Gestaltung von In-vitro-Experimenten ist jedoch das Ausmaß, in dem verschiedene Scheibenpräparate naturalistische Muster der neuronalen Aktivität rekapitulieren, wie sie in vivo beobachtet werden. Im intakten Gehirn erzeugt das Hippocampus-Netzwerk eine hochsynchronisierte Populationsaktivität, die den Verhaltenszustand des Tieres reflektiert, wie die scharfwelligen Wellenkomplexe (SWRs) am Beispiel der scharfwelligen Wellenkomplexe (SWRs) am Beispiel des Aufwachens oder des Nicht-REM-Schlafs. SWRs und andere Formen der Netzwerkaktivität können unter geeigneten Bedingungen spontan in isolierten Hippocampusscheiben entstehen. Um das leistungsstarke Gehirn-Slice-Toolkit auf die Untersuchung der Hippocampus-Netzwerkaktivität anzuwenden, ist es notwendig, einen Ansatz zu nutzen, der die Gewebegesundheit und die Erhaltung der funktionellen Konnektivität innerhalb des Hippocampus-Netzwerks optimiert. Mäuse werden transkardial mit kalter, auf Saccharose basierender künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit durchlässig. Horizontale Scheiben, die den Hippocampus enthalten, werden mit einer Dicke von 450 m geschnitten, um die synaptische Konnektivität zu erhalten. Slices werden in einer Kammer im Interface-Stil wiederhergestellt und für Aufnahmen in eine untergetauchte Kammer übertragen. Die Aufnahmekammer ist für die doppelte Oberflächensuperfusion von künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit bei hoher Durchflussrate ausgelegt, um die Sauerstoffversorgung der Scheibe zu verbessern. Dieses Protokoll liefert gesundes Gewebe, das für die Untersuchung komplexer und spontaner Netzwerkaktivitäten in vitrogeeignet ist.
Introduction
Die elektrophysiologische Messung von lebenden Hippocampusscheiben in vitro ist ein kraftvoller experimenteller Ansatz mit zahlreichen Vorteilen. Der Experimentator kann ein Mikroskop, Mikromanipulatoren und ein Aufzeichnungssystem verwenden, um Messungen von einzelnen Neuronen im Gewebe direkt zu visualisieren und zu sammeln. Gewebescheiben sind auch sehr zugänglich für Photostimulation oder Arzneimittelabgabe für optogenetische, chemogenetische oder pharmakologische Experimente.
Das Hippocampus-Netzwerk erzeugt eine hochsynchrone Populationsaktivität in vivo, sichtbar als Schwingungen im extrazellulären lokalen Feldpotential1,2,3,4,5. Gehirn-Slice-Methoden wurden genutzt, um Einblicke in die zellulären und Schaltkreis-Mechanismen zu gewinnen, die diesen neuronalen Netzwerk-Oszillationen zugrunde liegen. Grundlagenarbeiten von Maier et al. zeigten, dass scharfe Wellenwellenkomplexe (SWRs) spontan in Scheiben des ventralen Hippocampus entstehen können6,7. Nachfolgende Studien von mehreren Forschern haben nach und nach viele Aspekte von SWRs aufgeklärt, einschließlich der Rolle von Neuromodulatoren bei der Regulierung des Netzwerkzustandes des Hippocampus8,9,10 und der synaptischen Mechanismen, die die In-vitro-Reaktivierung neuronaler Ensembles vorantreiben, die zuvor während des Verhaltens in vivo11aktiv waren. Hirn-Scheibenexperimente haben auch Einblick in die Gamma-Bereichs-Oszillation (30–100 Hz) gegeben, einen ausgeprägten Hippocampus-Netzwerkzustand, von dem angenommen wird, dass er die Speichercodierung und den Rückrufvon 12,13unterstützt. Schließlich haben Forscher, um die zentrale Rolle des Hippocampus und der damit verbundenen Strukturen in der Pathophysiologie der temporalen Lappenepilepsie14,15zu erkennen, Hippocampus-Scheibenpräparate verwendet, um die Erzeugung und Ausbreitung von epiptiformer Aktivität zu untersuchen. Carter et al. zeigten, dass kombinierte hippocampal-entorhinale Kortexscheiben, die von chronisch epileptischen Tieren hergestellt werden, spontan epileptische Einleitungen in vitro16erzeugen können. Anschließend untersuchten die Mittel, die den epileptiforformen Entladungen in Hippocampus-Scheiben zugrunde liegen, die Mechanismen, die den Epileptenableitungen zugrunde liegen, unter Verwendung modifizierter künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) mit veränderten Ionenkonzentrationen (reduziert mg2+ oder erhöhte K+) oder zugesetzten Medikamenten (4AP oder Gabazin)17.
Die Forscher haben zahlreiche Hippocampus-Scheibenansätze entwickelt, die sich in schlüsselweisen Unterscheiden: (1) die Region des Hippocampus, die in der Scheibe enthalten ist (dorsal, mittel- oder ventral); (2) das Vorhandensein oder Fehlen von extrahippocampalen Geweben wie dem entorhinalen Kortex; (3) die Ausrichtung, die zum Schneiden von Scheiben (koronal, sagittal, horizontal oder schräg) verwendet wird; und (4) die Bedingungen, unter denen das Gewebe nach dem Schneiden gehalten wird (vollständig in ACSF getaucht oder an der Schnittstelle von ACSF und befeuchteter, autobogenreicher Luft gehalten).
Die Wahl des zu verwendenden Schneidansatzes sollte durch das Versuchsziel bestimmt werden. Zum Beispiel wurden quer- oder koronale Scheiben des dorsalen Hippocampus, die unter getauchten Bedingungen gepflegt werden, sehr effektiv für die Untersuchung von intrahippocampalen Schaltkreisen und synaptischer Plastizität18,19,20verwendet. Solche Präparate erzeugen jedoch nicht spontan Netzwerkschwingungen, so leicht wie Scheiben aus dem ventralen Hippocampus21,22,23. Obwohl ein Zustand anhaltender SWR-Aktivität durch tetanische Stimulation in Querscheiben aus dem dorsalen und ventralen Hippocampus24induziert werden kann, werden spontane SWRs leichter in ventralen Scheiben7,25beobachtet.
Eine inhärente physiologische und anatomische Unterscheidung zwischen dem dorsalen und ventralen Hippocampus wird durch Studien unterstützt, die sowohl in vivo als auch in vitrodurchgeführt werden26. Aufnahmen bei Ratten zeigten stark kohärente Theta-Rhythmen im dorsalen und mittleren Hippocampus, aber eine schlechte Kohärenz zwischen der ventralen Region und dem Rest des Hippocampus27. SWRs in vivo vermehren sich leicht zwischen dem dorsalen und mittleren Hippocampus, während SWRs, die ihren Ursprung im ventralen Hippocampus haben, oft lokal bleiben28. Die Assoziationsprojektionen, die von CA3-Pyramidenneuronen stammen, die sich im dorsalen und mittleren Hippocampus befinden, projizieren große Entfernungen entlang der Längsachse des Hippocampus. CA3-Projektionen aus ventralen Regionen bleiben relativ lokal und werden daher während des Schneidprozesses weniger wahrscheinlich durchtrennt29,30. Ventralslices können daher das wiederkehrende Netzwerk, das zur Erzeugung von Populationssynchronität erforderlich ist, besser erhalten. Die Neigung von ventralen Scheiben, spontane Netzwerkaktivitäten in vitro zu erzeugen, kann auch eine höhere intrinsische Erregbarkeit von pyramidenförmigen Neuronen oder eine schwächere GABAerge Hemmung im ventralen Hippocampus im Vergleich zu mehr dorsalen Regionen widerspiegeln31. Tatsächlich sind ventrale Hippocampusscheiben anfälliger für epilepptrime Aktivität32,33. So haben viele Studien der spontanen physiologischen8,9,11,24 oder pathologischen16,34,35,36 Netzwerkschwingungen traditionell einen horizontalen Schneidansatz verwendet, manchmal mit einem leichten Winkel in fronto-okzipitaler Richtung, der Gewebescheiben parallel zur Querebene des ventralen Hippocampus ergibt.
Die Netzwerkkonnektivität wird durch das Schneidverfahren unweigerlich beeinträchtigt, da viele Zellen im Slice getrennt werden. Der Winkel und die Dicke der Scheibe und das in der Zubereitung zurückgehaltene Gewebe sollten berücksichtigt werden, um die Konnektivität in den von Interesse interessierten Schaltkreisen zu optimieren. Viele Studien haben horizontale kombinierte Hippocampus-entorhinale Kortexscheiben (HEC) verwendet, um Wechselwirkungen zwischen den beiden Strukturen im Kontext physiologischer oder pathologischer Netzwerkschwingungen zu untersuchen. Roth et al. führten zwei Aufnahmen aus dem CA1-Unterfeld des Hippocampus und der Schicht V des medialen entorhinalen Kortex durch, um die Ausbreitung der SWR-Aktivität durch die HEC-Scheibe37zu demonstrieren. Viele Studien der epileppitischen Aktivität haben die HEC-Scheibenpräparation verwendet, um zu untersuchen, wie sich epileptische Entladungen durch das kortikohippocampale Netzwerk16,35,36,38ausbreiten. Es ist wichtig zu beachten, dass die Erhaltung der intakten Kortokhippocampalschleife keine Voraussetzung für spontane SWRs, epileptiforme Entladungen oder Gamma-Oszillationen ist; Netzwerkschwingungen können in Querscheiben des dorsalen oder ventralen Hippocampus ohne angehängte parahippocampale Gewebe21,22,23, 25,39,40,41erzeugt werden. Ein wichtigerer Faktor für die spontane Erzeugung von Netzwerkschwingungen in Hippocampus-Scheiben kann die Dicke jeder Scheibe sein, da eine dickere Scheibe (400–550 m) mehr Konnektivität im wiederkehrenden CA2/CA3-Netzwerk21,22,25erhalten wird.
Obwohl abgewinkelte horizontale HEC-Scheiben (mit einem ca. 12° Winkel in Front-Okzipital-Richtung geschnitten) verwendet wurden, um die funktionelle Konnektivität der Kortikohippocampal-Schleife11,16,34,35,42, solche abgewinkelten Präparate sind nicht erforderlich für spontane Netzwerkaktivität43,44,45. Die Verwendung einer abgewinkelten Schnittebene ermöglicht es dem Prüfer jedoch, selektiv Scheiben herzustellen, die die quer ausgerichtete Lamellen des ventralen oder mittleren Hippocampus am besten erhalten, je nachdem, ob ein Abwärts- oder ein Aufwärtswinkel angewendet wird (Abbildung 1). Dieser Ansatz ähnelt konzeptionell dem von Papatheodoropoulos et al., 2002, der jeden Hippocampus frei sezierte und dann einen Gewebechopper verwendete, um Querscheiben entlang der gesamten dorsal-ventralen Achse21zu erstellen. Angesichts der oben genannten funktionellen Unterscheidungen zwischen dem ventralen und dem dorsal-zwischengeschalteten Hippocampus sollten die Forscher den anatomischen Ursprung von Scheiben bei der Gestaltung von Experimenten oder bei der Interpretation von Ergebnissen berücksichtigen. Die Verwendung einer Agarrampe während des Schneidvorgangs ist eine einfache Möglichkeit, bevorzugt Scheiben aus dem mittleren oder ventralen Hippocampus herzustellen.
Hippocampalscheiben können entweder in einer untergetauchten Kammer (mit vollständig empfänglichem Gewebe in ACSF) oder in einer Kammer im Interface-Stil (z. B. Oslo- oder Haas-Kammer, mit Scheiben, die nur von einem dünnen Film fließender Medien bedeckt sind) aufbewahrt werden. Die Schnittstellenpflege verbessert die Sauerstoffversorgung des Gewebes, was das neuronale Überleben fördert und eine anhaltend hohe intereuronale Aktivität ermöglicht. Traditionell verwenden die Bedingungen für die untergetauchte Aufzeichnung eine langsamere ACSF-Durchflussrate, die keine ausreichende Gewebesauerstoffversorgung für eine stabile Expression von Netzwerk-Level-Oszillationen bietet. In untergetauchten Hippocampusscheiben werden Carbachol-induzierte Gamma-Oszillationen nur vorübergehend46,47beobachtet, während sie in Schnittstellenaufnahmekammern10,48,49stabil gehalten werden können. Als solche haben sich viele Studien komplexer spontaner Aktivität in vitro auf Schnittstellenaufzeichnungskammern verlassen, um scharfwellige Wellenkomplexe6,7,8,9,10,25,37, Gamma-Oszillationen10,13und epileptiforme Aktivität16,38,45,47zu untersuchen.
In einer Aufnahmekammer im Untergetauchtstil kann ein Tauchmikroskopobjektiv verwendet werden, um einzelne Zellen zu visualisieren und gezielt gesund aussehende Zellen für Aufnahmen zu zielen. Das untergetauchte Präparat ermöglicht auch eine feine Kontrolle über das zelluläre Milieu, da das Tauchen eine schnelle Diffusion von Medikamenten oder anderen Verbindungen in das Gewebe erleichtert. Eine modifizierte Methodik, bei der stabile Netzwerkschwingungen unter unter Getauchtbedingungen aufrechterhalten werden, stellt somit einen starken experimentellen Ansatz dar. Ein Beispiel für diesen Ansatz ist die Arbeit von H.jos et al., bei der sich Hippocampusscheiben in einer vereinfachten Haltekammer im Grenzflächenstil für mehrere Stunden erholen, bevor sie in eine modifizierte Unterbrennkammer mit einer hohen Durchflussrate von ACSF (ca. 6 ml/min) übertragen werden, um die Sauerstoffversorgung des Gewebes zu verbessern12,48,49. Unter diesen Bedingungen können in einer untergetauchten Aufnahmekammer ein hohes Niveau der interneuronen Aktivität und stabile spontane Netzwerkschwingungen aufrechterhalten werden. Dieser modifizierte Ansatz ermöglicht es den Forschern, visuell geführte Ganzzell-Patchklemmenaufzeichnungen durchzuführen und den Beitrag morphologisch identifizierter Zelltypen zu Carbachol-induzierten Gammaoszillationen12zu charakterisieren. SWRs können auch spontan in untergetauchten Hippocampus-Scheiben mit einer schnellen Durchflussrate von ACSF11,48,49auftreten. Maier et al. zeigten, dass Hippocampus-Scheiben, die sich vor der Übertragung in eine untergetauchte Aufnahmekammer in einer Grenzkammer erholten, zuverlässig spontane SWRs zeigten, während Scheiben, die sich vor der Übertragung in eine untergetauchte Aufnahmekammer in ein Becherglas zurückzogen, kleinere evokierte Feldreaktionen, niedrigere Konzentrationen spontaner synaptischer Ströme zeigten und nur sehr selten spontane SWRs43zeigten. Schlingloff et al. nutzten diese verbesserte Methodik, um die Rolle von parvalbumin-exezierenden Korbzellen bei der Erzeugung spontaner WW44zu demonstrieren.
Das folgende Protokoll stellt eine Schneidmethode vor, mit der spontan aktive Neuronen in horizontalen Hippocampusscheiben unter Schnittstellenbedingungen zurückgewonnen und anschließend in einer untergetauchten Aufnahmekammer aufbewahrt werden können, die für pharmakologische oder optogenetische Manipulationen und visuell geführte Aufnahmen geeignet ist.
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Protocol
Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Columbia University (AC-AAAU9451) genehmigt.
1. Vorbereiten von Lösungen
- Herstellung der Saccharoseschneidlösung zum Schneiden, wie in Tabelle 1beschrieben.
HINWEIS: Nach der Zubereitung von 1 L Saccharoselösung eine kleine Menge (ca. 100–200 ml) in einer Eisschale einfrieren. Diese gefrorenen Saccharosewürfel werden zu einer eisigen Gülle vermischt (siehe Schritt 4.3). - Bereiten Sie künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) für die Aufzeichnung vor, wie in Tabelle 2beschrieben.
- Bereiten Sie 1 M NaCl für Stimulationspipetten vor, indem Sie 0,05844 g NaCl in 1 ml gereinigtem Wasser auflösen, das gefiltert wurde, um Spurenmetalle und andere Verunreinigungen zu entfernen.
HINWEIS: Saccharose-Schneidlösung und ACSF sollten für jedes Experiment frisch vorbereitet werden.
2. Bereiten Sie Agar Rampe
- Bereiten Sie 4% Agar (z. B. 2 g Agar in 50 ml Wasser) durch Auflösen von Agarpulver in gereinigtes Wasser vor, das gefiltert wurde, um Spurenmetalle und andere Verunreinigungen zu entfernen. Erhitzen Sie das Gemisch in einer Mikrowelle, bis es gerade zu kochen beginnt (ca. 30-60 s). Gießen Sie den geschmolzenen Agar in eine Form und lassen Sie ihn abkühlen und erstarren bei 4 °C im Kühlschrank bei einer Causa ca. 12° Steigung.
HINWEIS: Für eine Form kann man jedes Glas- oder Kunststoffbehälter in einem Winkel verwenden, mit genügend geschmolzenem Agar, der zu einer Rampe von 4 cm Länge und ca. 0,8 cm Höhe eingegossen wird.
3. Stufen Sie den Schneidbereich
- Füllen Sie einen 400 ml Becher mit einer Scheibenrückgewinnungskammer mit ca. 250 ml ACSF; In ein auf 32 °C erwärmtes Wasserbad stellen und mit Carbogen (95% Sauerstoffgas/5% Kohlendioxidgas) zu sprudeln beginnen.
HINWEIS: Füllen Sie den Rückgewinnungsbecher mit gerade genug Flüssigkeit, um das Nylongewebe der Haltekammer an der Oberfläche der Lösung zu platzieren, so dass Scheiben an der Schnittstelle des warmen Lösungsgemisches und der Luft gehalten werden (Abbildung 1). Legen Sie kleine Stücke Linsenpapier auf das Nylongewebe. Die Scheiben liegen auf dem Linsenpapier, mit dem später Scheiben einzeln in die Aufnahmekammer übertragen werden können (siehe Schritt 6.6). - Legen Sie einen Kolben mit der Saccharoselösung in einen Eiskübel, um zu kühlen und mit Carbogen zu sprudeln.
HINWEIS: Die Rückgewinnungsbecher- und Saccharoselösung sollte erwärmt bzw. gekühlt werden, wobei Carbogen mindestens 30 Min. sprudelt, bevor die Maus in die Isoflurankammer gelegt wird. - Ziehen Sie das Tablett mit vorgefertigten, gefrorenen Saccharoselösung Eiswürfel aus dem Gefrierschrank und legen Sie auf der Bank teilweise tauen.
- Legen Sie die Hälfte einer sauberen zweischneidigen Rasierklinge in das Mikrotom und kalibrieren Sie sie bei Bedarf. Legen Sie die andere Hälfte der Rasierklinge für den Einsatz während der Zerlegung beiseite.
- Führen Sie eine Carbogen-Leitung und Temperatursonde in die Schneidkammer und umgeben Sie mit Eis, um die Kammer zu kühlen.
- Bereiten Sie eine saubere Bank oder einen Tisch vor, der mit zwei Einweg-Absorberpads bedeckt ist. Legen Sie alle Sezierwerkzeuge und drei Teile Laborband auf dem linken Pad, wo die transkardiale Perfusion durchgeführt wird.
HINWEIS: Zu den Dissektionswerkzeugen gehören eine kleine Bonner Schere, eine Dissektorschere, ein großer Spachtel/Löffel, Mikrospatula, Skalpell mit neuer Klinge, Spachtel, scharfe/stumpfe chirurgische Schere, große Gewebezangen und kleine Gewebezangen (siehe Tabelle der Materialien). - Auf dem anderen saugfähigen Pad rechts vom Perfusionsbereich ein kreisförmiges Stück Filterpapier in den Deckel einer Glaspetrischale mit 100 mm Durchmesser legen. Legen Sie den Boden der Petrischale neben den Deckel und legen Sie eine Carbogen-Linie in beide Stücke der Schale.
- Verwenden Sie eine Rasierklinge oder Skalpell, um eine kleine Rampe von Agar zu schneiden (ca. 4 cm entlang der abgewinkelten Oberfläche, 0,8 cm in der Höhe, 2 cm in der Breite). Schneiden Sie ein Stück der Rampe vom hohen Ende ab und kehren Sie es um, um einen Hinterbaublock von Agar zu erstellen. Verwenden Sie Cyanoacrylat-Klebstoff, um die Agar-Rampe und den Stützblock an der Schneideplattform zu befestigen und beiseite zu legen.
HINWEIS: Der Trägerblock von Agar hilft, das Gehirn während des Schneidens zu stabilisieren und bietet eine Oberfläche, auf der unnötige Gewebe von jeder Scheibe abgetrennt werden können (Abbildung 1).
4. Transkardiale Perfusion
- Eine 60 ml Tragfähigkeitsspritze als Reservoir für Saccharose-Schneidlösung ca. 18 Zoll über der Tischplatte aufhängen (z. B. mit einer dreizackigen Schwenkklemme an einem vertikalen Pfosten). Befestigen Sie Schläuche an der Unterseite des Reservoirs, führen Sie die Schläuche durch eine Rollenklemme und verbinden Sie das andere Ende des Rohres mit einer sauberen 20 G Nadel.
- Füllen Sie das 60 ml Reservoir mit ca. 30 ml gekühlter Saccharoselösung und leiten Sie eine Carbogen-Leitung in das Saccharosereservoir, um die Perfusate kontinuierlich zu sprudeln.
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Saccharose ohne eingeschlossene Blasen durch den Schlauch und die Nadel fließt. Die Durchflussmenge sollte gerade schnell genug sein, um einen stetigen, kontinuierlichen Strom von tropfender Saccharose aus der Nadel zu haben. - Mit einem Mixer die gefrorene Saccharose zerkleinern und in eine eisige Gülle mischen und mit dem großen Spachtel/Löffel die Gülle verteilen.
- Legen Sie eine kleine Menge Saccharose Gülle um die Ränder des Glases Petri Schale Deckel. Fügen Sie eine kleine Menge Saccharose Gülle auf den Petrischale Boden.
- Etwa 20 bis 30 ml Saccharose-Slurry in das Perfusionsflüssigkeitsreservoir geben und gut mit den 30 ml gekühlter Flüssigsaccharose vermischen, bis das Reservoir eine Mischung aus sehr kalter, überwiegend flüssiger Saccharose mit einer Restlösung enthält.
- Legen Sie die Maus in eine Kammer, die mit einem Isofluran-Verdampfer verbunden ist. Bei einem Sauerstofffluss von ca. 2 l/min drehen Sie das Zifferblatt des Verdampfers, um Isofluran in 5% Konzentration zu liefern, und starten Sie einen Timer.
HINWEIS: Halten Sie diesen Timer während des Verlaufs des Schneidens unterwegs, um zu messen, wie schnell die Slices erhalten werden. Das Verfahren sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden, so dass das Schneiden abgeschlossen ist und sich das Gewebe in der Grenzkammer innerhalb von 15–20 min des Tieres erholt, das in die Isoflurankammer eintritt. Beobachten Sie die Maus, um sicherzustellen, dass ein Zustand der tiefen Anästhesie erreicht wird. Nach mindestens 5 min sollte die Maus tief beästhetisiert sein und nicht auf Zehenkneifen reagieren. - Unmittelbar vor dem Entfernen der Maus aus der Isoflurankammer den Petrischalendeckel mit gekühlter Saccharoselösung bis zu einer Tiefe von ca. 3–5 mm füllen und den Petrischalenboden mit gekühlter Saccharoselösung bis zu einer Tiefe von ca. 1,0 cm füllen.
- Übertragen Sie die Maus schnell auf das linke saugfähige Pad und verwenden Sie die 3 Stück Klebeband, um die Vorderbeine und den Schwanz zu sichern. Führen Sie eine Hinterbder Zehenklemme durch, um sicherzustellen, dass die Maus nicht reagiert, bevor ein Schnitt durchgeführt wird. Mit den großen TissueZangen und chirurgischen Scheren, Zelt die Haut und machen längs Schnitt von der Unterseite des Brustbeins bis zur Oberseite der Brust. Mit den Zangen ziehen Sie auf das Brustbein und verwenden Sie die Schere, um durch die Membran zu schneiden.
HINWEIS: Die anfängliche Positionierung der Maus und zuerst mehrere Einschnitte, um das Zwerchfell zu trennen, sollten so schnell wie möglich durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass die Maus das Bewusstsein nicht wiedererlangt. Um eine ausreichende Tiefe der Anästhesie während des gesamten Verfahrens zu gewährleisten, kann ein Nasenkegel auf die Maus gelegt werden, um Isofluran während der Perfusion zu liefern. - Verwenden Sie die Schere, um den Rippenkäfig auf jeder Seite zu schneiden, schneiden Sie in einer großen Bewegung in Richtung der Stelle, wo die Vorderbeine trifft den Körper. Mit der Zange, schwingen Sie die Vorderseite des Rippenkäfigs weg und nach oben zum Kopf, und entfernen Sie es dann vollständig mit einem horizontalen Schnitt mit der großen Schere. Halten Sie das Herz mit den großen Zangen an Ort und Stelle und setzen Sie die 20 G Perfusionsnadel in den linken Ventrikel ein. Sobald die Nadel richtig positioniert ist, sollte die linke Seite des Herzens schnell verblassen, da gekühlte Saccharoselösung den Ventrikel füllt.
- Verwenden Sie die kleine Dissektorschere, um in das rechte Atrium zu schneiden und das Blut aus dem Kreislaufsystem fließen zu lassen. Wenn die Schnitte richtig durchgeführt werden, sollte es minimale Schäden am Herzen geben, und es sollte weiterhin während der Durchblutung pumpen.
HINWEIS: Aufgerollte Teile von Tissuepapier können verwendet werden, um Blut und Saccharoselösung aus dem Herzen zu leiten und die Sichtbarkeit der Perfusionsnadel während des Eingriffs zu erhalten. - Stellen Sie sicher, dass die Perfusionsnadel an Ort und Stelle bleibt und nicht aus dem linken Ventrikel fällt. Mit einer richtigen Durchflussrate und Platzierung beginnt die Leber mit 20–30 s zu einer leichten Bräune/Beigefarbe zu verblassen.
- Nach 30–45 s verwenden Sie die große Schere, um die Maus zu enthaupten. Halten Sie den Kopf in der linken Hand, schieben oder schälen Sie die Haut weg vom Schädel. Bei einem gut durchbluteten Tier sollte der Schädel sehr blass sein, und das Gehirn sollte eine sehr hellrosa Farbe (anweißen) durch den Schädel ohne gut sichtbare Blutgefäße erscheinen.
5. Extrahieren Sie das Gehirn und schneiden Sie Scheiben
- Mit der kleinen Bonner Schere machen Sie zwei seitliche Schnitte durch den Schädel in Richtung der Mittellinie an der Vorderseite des Schädels, in der Nähe der Augen. Machen Sie zwei zusätzliche Schnitte auf beiden Seiten der Basis des Schädels.
- Übertragen Sie den Kopf auf den Boden der Glas Petrischale, wo sie meist in gekühlte Saccharoselösung getaucht werden sollte. Verwenden Sie die kleine Bonner Schere, um die Mittellinie entlang der Schädellänge zu schneiden, indem Sie mit der Schere hochziehen, um Schäden am darunter liegenden Hirngewebe zu minimieren. Mit den kleinen Tissue-Zangen, fest greifen jede Seite des Schädels und schwingen Sie es auf und weg vom Gehirn, wie ein Buch zu öffnen.
- Verwenden Sie die Finger der linken Hand, um die Schädelklappen offen zu halten und setzen Sie die Mikrospatula unter dem Gehirn in der Nähe der olfaktorischen Glühbirnen ein. Drehen Sie das Gehirn aus dem Schädel in die Saccharose und verwenden Sie die Mikrospatula, um den Hirnstamm zu trennen. Waschen Sie das Gehirn, um Restblut, Fell oder anderes Gewebe zu entfernen.
- Verwenden Sie den großen Spachtel/Löffel, um das Gehirn auf den Deckel der glasigen Petrischale zu übertragen. Mit der anderen Hälfte der zweischneidigen Rasierklinge zuvor beiseite gelegt, machen zwei koronare Schnitte, um zuerst das Kleinhirn und dann den vorderen Teil des Gehirns zu entfernen, einschließlich der olfaktorischen Glühbirnen (Abbildung 1).
- Cyanoacrylatkleber auf die Agarrampe auftragen. Legen Sie das Gehirn kurz mit den großen Tissuezangen auf ein Stück trockenes Filterpapier und übertragen Sie es dann sofort auf die Agarrampe, wobei die ventrale Oberfläche des Gehirns auf den Klebstoff aufgebracht wird.
HINWEIS: Bei Scheiben des mittleren Hippocampus sollte das Gehirn mit dem vorderen Nachhang nach oben und dem Hinterteil näher an der Klinge ausgerichtet sein. Für Scheiben des ventralen Hippocampus, orientieren Sie das Gehirn mit dem vorderen Ende zeigt den Hang der Rampe, mit dem hinteren Ende an der Spitze der Rampe, weiter weg von der Klinge. In beiden Fällen sollte das Gehirn an der Oberseite der Rampe positioniert werden, so dass die koronal geschnittene Oberfläche des Gehirns den Agar-Backing-Block kontaktiert (Abbildung 1). - Die Schneideplattform mit Agar und Gehirn in die Schneidkammer des Mikrotomlegens legen und vollständig mit gekühlter Saccharoselösung eintauchen. Verwenden Sie den großen Spachtel/Löffel, um einige Saccharose-Slurry in die Kammer zu übertragen, unter Rühren, um gefrorene Saccharose zu schmelzen und die Temperatur der Mischung schnell auf 1 bis 2 °C zu senken.
HINWEIS: Beobachten Sie das Temperaturmessgerät während des gesamten Schneidens. Wenn die Saccharoselösung über 3 °C erwärmt, fügen Sie mehr Gülle hinzu und mischen Sie, um die Temperatur wieder nach unten zu bringen. - Schneiden Sie Scheiben mit einer Dicke von 450 m mit einer Mikrotome-Geschwindigkeit von 0,07 mm/s. Wenn jede Scheibe freigesetzt wird, verwenden Sie die kleinen Gewebezangen und ein scharfes Skalpell, um zuerst die beiden Hemisphären zu trennen und dann Gewebe zu schneiden, bis die Scheibe hauptsächlich aus den Hippocampus- und Parahippocampal-Regionen besteht (Abbildung 1).
- Verwenden Sie eine Kunststoff-Transferpipette, um die Scheiben einzeln in die Schnittstellenrückgewinnungskammer zu übertragen, um sicherzustellen, dass sie an der Schnittstelle des ACSF und der Luft mit nur einem dünnen Meniskus von ACSF positioniert werden, der die Scheiben bedeckt. Schließen Sie den Deckel der Kammer fest und lassen Sie die Scheiben 30 min bei 32 °C erholen.
- Nach der ersten Erholung bei 32 °C die Schnittstellenrückgewinnungskammer aus dem Wasserbad holen und auf einen Rührer aufstellen, der so langsam eingestellt ist, dass der magnetische Rührbalken die Zirkulation von ACSF innerhalb der Kammer fördert. Lassen Sie es nach und nach auf Raumtemperatur abkühlen, wenn sich die Scheiben für weitere 90 min erholen. Stellen Sie sicher, dass die Rückgewinnungskammer ständig mit Carbogen geblasen wird und lassen Sie keine großen Blasen unter den Scheiben einfangen.
6. Führen Sie lokale Feldpotential (LFP) Aufzeichnungen von spontanen Aktivitäten
- Bereiten Sie sich auf LFP-Aufnahmen vor, indem Sie alle erforderlichen Geräte einschalten, einschließlich des Computers, auf dem die Erfassungssoftware ausgeführt wird, den mit dem Computer verbundenen Monitor, die Stimulatoren, den Mikromanipulator, den Temperaturregler, die Mikroskop-Lichtquelle, die mit dem Mikroskop befestigte Kamera, den Mikroelektrodenverstärker, den Digitizer und die Peristaltikpumpe. Wenn Sie ein zentrales Vakuumsystem verwenden, öffnen Sie das Wandventil, um die Vakuumleitung vorzubereiten, die ACSF aus der Aufnahmekammer entfernt.
- Füllen Sie das beheizte Reservoir mit ACSF, und legen Sie dann ein Ende des Schlauches in den 400 ml Becher mit dem sprudelnden ACSF. Schalten Sie die peristaltische Pumpe ein, um ACSF vom 400-ml-Becher auf das beheizte Reservoir und vom Reservoir weiter in die Aufnahmekammer zu leiten. Tippen oder kneifen Sie die Schläuche, um alle gefangenen Blasen zu lösen.
- Stellen Sie die Peristaltikpumpe so ein, dass der ACSF-Durchfluss durch die Aufnahmekammer schnell ist (ca. 8–10 mL/min). Verwenden Sie einen Temperaturfühler, um sicherzustellen, dass der ACSF 32 °C in der Mitte der Aufnahmekammer beträgt.
HINWEIS: Wenn ACSF mit einer Peristaltikpumpe an die Aufnahmekammer geliefert wird, kann eine hohe Durchflussrate zu einer signifikanten Fluktuation der Durchflussrate führen. Konsistente Durchflussraten können mit einem einfachen Pulsationsdämpfer erreicht werden, der aus einer Reihe von leeren Spritzen besteht, die in den Schlauch integriert sind (Abbildung 2). - Bereiten Sie Stimulations- und Aufzeichnungspipetten aus Borosilikatglaskapillaren mit einem beheizten Filamentzieher vor. Das Puller-Protokoll sollte so konfiguriert werden, dass Pipetten mit einem Widerstand von 2–3 MOhm für Stimulation oder lokale Feldpotenzial-Aufzeichnungselektroden erhalten werden.
- Füllen Sie Stimulationspipetten mit 1 M NaCl und LFP Pipetten mit ACSF.
- Halten Sie die Schläuche kurz ein und schalten Sie die Pumpe aus, um den ACSF-Fluss zu unterbrechen. Übertragen Sie eine Scheibe in die Aufnahmekammer mit feinen Zangen, um eine Ecke des Linsenpapiers zu greifen, das die Scheibe auf dem Linsenpapier ruht, wird auf dem Linsenpapier kleben. Legen Sie das Linsenpapier und schneiden Sie es mit der Scheibe nach unten in die Aufnahmekammer, dann "schälen" Sie das Linsenpapier, so dass die Scheibe in der Aufnahmekammer versunken ist. Sichern Sie die Scheibe mit einer Harfe.
HINWEIS: Harfen können vorgefertigt oder im Labor mit einem U-förmigen Stück Edelstahl oder Platin und feinem Nylonfilament erworben werden. - Legen Sie eine NaCl-gefüllte Stimulationspipette in den manuellen Mikromanipulator und bringen Sie die Spitze der Pipette langsam in die Oberfläche der Scheibe (z.B. in die Stratum-Radiatum-Schicht) in einem Winkel von ca. 30–45° vor. Sobald die Spitze der Pipette in das Gewebe eindringt, bringen Sie die Pipette langsam nach vorne und verzichten Sie auf große Bewegungen in seitlicher oder vertikaler Richtung, die Axt in der Scheibe unnötig beschädigen könnten. Legen Sie die Spitze der Pipette mindestens 50–100 m tief in die Scheibe, um Zellen in der Nähe der Oberfläche zu vermeiden, die beim Schneiden beschädigt wurden.
- Legen Sie eine ACSF-gefüllte LFP-Pipette in den Pipettenhalter, der am motorisierten Mikromanipulator befestigt ist. Wenden Sie einen sehr leichten positiven Druck entweder mit Munddruck oder einer 1 ml Spritze an, die über ein Hahnenventil und eine kurze Schlauchlänge mit dem Pipettenhalter verbunden ist.
HINWEIS: Positionieren Sie LFP-Pipetten innerhalb der Scheibe, um die Signale von Interesse aufzuzeichnen: Bei scharfen Wellenwellen sollte eine LFP-Pipette in die Stratum pyramidale (SP) und eine zweite Pipette in der Stratum radiatum (SR) platziert werden. Diese Konfiguration ermöglicht gleichzeitige Aufnahmen der negativen Scharfwelle im SR und der Hochfrequenz-Wellenschwingung im SP (Abbildung 3). - Mit dem Mikromanipulator wird die Spitze der LFP-Pipette langsam in den Interessenbereich (z.B. die PYRAMIDalzellschicht CA1) in einem Winkel von ca. 30–45° vorrücken. Legen Sie die Spitze der Pipette mindestens 50–100 m tief in die Scheibe, um Zellen in der Nähe der Oberfläche zu vermeiden, die beim Schneiden beschädigt wurden. Während sie die LFP-Pipette voranbringen, liefern Sie kontinuierlich einen kleinen Spannungstestimpuls mit der Erfassungssoftware und achten Sie auf eine plötzliche Erhöhung des Elektrodenwiderstands. Dies kann darauf hindeuten, dass die Pipette verstopft oder gegen eine Zelle gedrückt wurde.
- Sobald die LFP-Pipette im Interessenbereich positioniert ist, lassen Sie den positiven Druck vorsichtig los, indem Sie das Ventil an den Rohren öffnen, die am Pipettenhalter befestigt sind.
- Um den LFP gleichzeitig an einer zweiten Position aufzuzeichnen, wiederholen Sie die Schritte 6.8–6.10 mit einer zweiten Pipette und einem Mikromanipulator.
- Verwenden Sie den Mikroelektrodenverstärker in der aktuellen Klemmenkonfiguration, um spontane Aktivitäten im lokalen Feldpotenzial aufzuzeichnen, nachdem Sie die Brückenbilanzfunktion in der Erfassungssoftware verwendet haben, um den Serienwiderstand der Pipette zu korrigieren. Spontane SWRs erscheinen als positive Verformungen im extrazellulären Potential der SP-Schicht (Abbildung 3).
- Um evozierte Feldpotentiale aufzuzeichnen, verwenden Sie die an den Digitizer angeschlossenen Stimulatoren, um einen kurzen (200 us) quadratischen Spannungsimpuls durch die NaCl-gefüllte Stimulationspipette zu liefern. Passen Sie das Stimulationsspannungsrad an, um eine Reihe von Reaktionsamplituden zu evozieren.
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Representative Results
Hier werden repräsentative Aufnahmen von HEC-Slices präsentiert, die wie in diesem Protokoll beschrieben vorbereitet werden. Nach der Wiederherstellung in einer Schnittstellenhaltekammer (Abbildung 1C) werden die Scheiben einzeln in eine untergetauchte Aufnahmekammer übertragen (Abbildung 2B). Die Aufnahmekammer wird mit autobogengesättigtem ACSF mit einer peristaltischen Pumpe geliefert (Abbildung 2A). Die Pumpe zieht ACSF zunächst aus einem Haltebecher in ein beheiztes Reservoir. Carbogen-Linien werden sowohl in den Haltebecher als auch in das beheizte Reservoir gelegt, um eine kontinuierliche Sauerstoffversorgung der Medien zu gewährleisten. Zwischen der peristaltischen Pumpe und der Aufnahmekammer befindet sich ein Pulsationsdämpfer, der aus einer Reihe von luftgefüllten Spritzen besteht, um die Durchflussschwankungen durch eine schnelle Peristaltik zu minimieren. Die Lufttasche in jeder Spritze absorbiert die Durchdruckänderungen, die durch jeden Zyklus der Pumpe verursacht werden, so dass die Aufnahmekammer einen glatten und gleichmäßigen Durchfluss von ACSF52,53erhält. Ein Nach dem Pulsationsdämpfer positionierter Inline-Heizer sorgt dafür, dass die Temperatur des ACSF beim Betreten der Aufnahmekammer bei 32 °C gehalten wird.
In diesem Beispiel besteht die zwei-Oberflächen-Superfusionsaufnahmekammer aus drei 3D-gedruckten Schichten (Abbildung 2B). Die untere Schicht hat einen rechteckigen Ausschnitt, um einen Deckelschlupf zu passen, mit Vakuumfett gesichert. Die mittlere Schicht enthält die untere Hälfte einer langgestreckten ovalen Kammer mit zwei horizontalen Stützen. Nylon-Filament wird über diese Stützen (etwa alle 0,5 mm) gespannt und mit Cyanoacrylat-Klebstoff gesichert. Die Scheibe ruht auf diesem gespannten Filament. Die obere Schicht enthält die obere Hälfte der ovalen Kammer zusammen mit kleinen Brunnen, in die die Silberchlorid-Bodenpellets platziert werden können. Die längliche ovale Form der Kammer wurde entwickelt, um einen schnellen laminaren Fluss von ACSF zu fördern.
Abbildung 3 zeigt repräsentative Aufnahmen von HEC-Slices, die gemäß diesem Protokoll erstellt wurden. Um zunächst die Schnittzustand zu bewerten, werden feldpostsynaptische Potentiale (fPSPs) in der Stratum radiatum (SR) mit einer Pipette mit 1 M NaCl gefüllt evoziert. In gesunden Scheiben sollte die elektrische Stimulation ein fPSP mit einem kleinen präsynaptischen Faservolley und einem großen postsynaptischen Potential mit einem schnellen anfänglichen Abstieg erzeugen (Abbildung 3B, oben links). In gesunden Scheiben sind spontane Scharfwellenwellen (SWRs) als positive Verformungen im LFP in der Stratum pyramidale sichtbar (Abbildung 3B, unten links). In suboptimalen Slices zeigen evozierte fPSPs einen großen Faservolley und ein relativ kleines postsynaptisches Potenzial, und solche Slices zeigen keine spontanen SWRs (Abbildung 3B, rechts). SWRs in vitro zeigen Merkmale, die mit veröffentlichten Beschreibungen übereinstimmen: ein positives Feldpotential in der SP-Schicht mit einer überlagerten Hochfrequenzoszillation, gepaart mit einem negativen Feldpotential in der SR-Schicht ( Abbildung3C). Ein einzelner In CA2 aufgezeichneter SWR wird mit einem Sternchen angezeigt (Abbildung 3C, rechts). SWRs in HEC-Slices stammen aus CA2/CA3-Restromkreisen und vermehren sich an CA1. Ein einzelner SWR, der in der CA2- und CA1-SP-Schicht beobachtet wurde, wird mit einem Sternchen angezeigt (Abbildung 3D, rechts). In diesem repräsentativen Beispiel führt der CA2-SWR (grün) um mehrere Millisekunden in CA1 (blau), wie in der Überlagerung des SWR-Umschlags (gefiltert bei 2–30 Hz) in jeder Region dargestellt.
Abbildung 1: Vorbereitung von horizontal gewinkelten Hippocampus-entorhinalen Kortex -Scheiben (HEC). (A) (i) Nach dem Extrahieren des Gehirns, führen Sie zwei koronale Schnitte mit einer Rasierklinge, um die hinteren und vorderen Teile des Gehirns zu entfernen. (ii) Die Agarrampe besteht aus zwei abgewinkelten Teilen, die an die Mikrotome-Schneidplattform geklebt sind. Um Scheiben des zwischengeschalteten Hippocampus vorzubereiten, legen Sie den Hirnblock auf die Agarrampe mit der vorderen Oberfläche, die den Hang hinaufbetrachtet und mit dem hohen Unterbauderteil der Rampe in Kontakt gebracht wird. Um Scheiben von mehr ventralen Hippocampus vorzubereiten, legen Sie den Hirnblock auf die Agarrampe mit der vorderen Oberfläche nach unten den Hang, so dass die hintere schnitt Oberfläche Kontakt mit dem hohen Unterbauteil der Rampe macht. (iii) Da jede Scheibe freigesetzt wird, führen Sie mehrere weitere Schnitte mit dem Skalpell durch, um die Hemisphären zu trennen und unnötiges Gewebe zu entfernen. (B) Repräsentatives Bild der resultierenden Scheibe mit Zellkernen, die von DAPI beschriftet sind. (C) In einer Oberflächenrückgewinnungskammer werden Scheiben auf Linsenpapierstücke auf einem Edelstahl- oder Nylongewebe platziert, das mit der Oberfläche des ACSF gleichist. Eine Keramikblase transportiert Carbogen in die Kammer und ein magnetischer Rührstab mischt die Flüssigkeit in der Kammer kontinuierlich. Ein dünner Film von ACSF bedeckt die Oberseite der Scheibe und verbessert die Diffusion von Sauerstoff aus der feuchten autobogenreichen Luft der Kammer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Dual-Oberflächen-Superfusionsaufnahmekammer mit Pulsationsdämpfer im ACSF-Förderschlauch. (A) Diagramm des Superfusionssystems. ACSF wird auf 32 °C erwärmt, ständig mit Carbogengas geblasen und mit einer Peristaltikpumpe mit pulsationsdämpfer, bestehend aus einer Reihe von luftgefüllten Spritzen, mit ca. 8–10 ml/min geliefert. (B) Die Aufnahmekammer besteht aus drei 3D-gedruckten Schichten, deren Mitte mit Nylonfilamenten aufgereiht ist. Die Scheibe ruht auf diesem gespannten Filament und ACSF fließt über und unter dem Gewebe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative Aufnahmen spontaner Scharfwellenwellen aus HEC-Scheiben. (A) Ein vereinfachtes Diagramm der HEC-Scheibe, das die Positionen der Aufnahme- und Stimulationselektroden anzeigt. (B) Repräsentative Aufzeichnungen der LFP-Aktivität sowohl von einem aktiven, gesunden Slice als auch von einem suboptimalen Slice. Die gesunde Scheibe (links, grün) zeigt große evozierte Feldreaktionen und spontane Scharfwellenwellen (SWRs), die als unregelmäßig auftretende positive Verformungen im lokalen Feldpotenzial der SP-Schicht sichtbar sind. Im Gegensatz dazu zeigt ein fehlerhaftes Slice kleine evozierte Feldantworten und keine spontane Aktivität (rechts, grau). (C) Repräsentative Aufzeichnungen von SWRs im CA2-Gebiet, bestehend aus einer negativen Durchbiegung im LFP in der SR-Schicht und einer hochfrequenten Oszillation mit einer zugrunde liegenden positiven Durchbiegung im LFP in der SP-Schicht. Spitzen in jedem Kanal, die größer als drei Standardabweichungen der Signalamplitude sind, werden rot hervorgehoben. Ein Bandpassfilter von 2–30 Hz isoliert den zugrunde liegenden positiven und negativen Umschlag der scharfen Welle in der SP- bzw. SR-Schicht, während ein Bandpassfilter von 80–250 Hz verwendet wird, um die hochfrequente Schwingung der Welligkeit in der SP-Schicht zu isolieren. (D) SWRs in vitro vermehren sich von CA2/CA3 nach CA1. In diesen repräsentativen Aufzeichnungen gehen SWRs in CA2 (grün, unten) der in CA1 (blau, oben) um mehrere Millisekunden voraus. Spitzen in jedem Kanal, die größer als drei Standardabweichungen der Signalamplitude sind, werden rot hervorgehoben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Molekulargewicht (Gramm / Mol) | Endkonzentration (mM) | Gramm / 1 L Saccharose-Schneidlösung | ||
| Saccharose | C12H22O11 | 342.3 | 195 | 66.749 |
| Natriumchlorid | Nacl | 58.44 | 10 | 0.584 |
| Glukose | C6H12O6 | 180.08 | 10 | 1.801 |
| Natriumbicarbonat | NaHCO3 | 84.01 | 25 | 2.1 |
| Kaliumchlorid | Kcl | 74.55 | 2.5 | 0.186 |
| Natriumphosphat monobasist wasserfrei | NaH2PO4 | 137.99 | 1.25 | 0.173 |
| Natriumpyruvat | C3H3NaO3 | 110.04 | 2 | 0.22 |
| Lagerkonzentration (M) | Endkonzentration (mM) | Milliliter / 1L Saccharose-Schneidlösung | ||
| Calciumchlorid | CaCl2 | 1 | 0.5 | 0.5 |
| Magnesiumchlorid | MgCl2 | 1 | 7 | 7 |
Tabelle 1: Zusammensetzung der Saccharoseschneidlösung. Beginnen Sie mit ca. 0,75 l gereinigtem Wasser, das gefiltert wurde, um Spurenmetalle und andere Verunreinigungen zu entfernen. Lösen Sie jeden Feststoff auf, während Sie die Lösung mit einem magnetischen Rührstab mischen. Sobald alle Feststoffe gelöst sind, Blasen Carbogen Gas durch die Lösung für 10 min. Fügen Sie die MgCl2 und CaCl2 Lösungen hinzu und fügen Sie Wasser hinzu, um das Gesamtvolumen auf 1 L zu bringen. Mischen Sie mit einem magnetischen Rührstab für 10 min, um sicherzustellen, dass die Lösung gleichmäßig gemischt wird. Die Osmolarität sollte zwischen 315 und 325 mOsm liegen, und der pH-Wert sollte etwa 7,4 betragen.
| Molekulargewicht (Gramm / Mol) | Endkonzentration (mM) | Gramm / 2L ACSF | ||
| Natriumchlorid | Nacl | 58.44 | 125 | 14.61 |
| Glukose | C6H12O6 | 180.08 | 12.5 | 4.502 |
| Natriumbicarbonat | NaHCO3 | 84.01 | 25 | 4.201 |
| Kaliumchlorid | Kcl | 74.55 | 3.5 | 0.522 |
| Natriumphosphat monobasist wasserfrei | NaH2PO4 | 137.99 | 1.25 | 0.345 |
| Ascorbinsäure | C6H8O6 | 176.12 | 1 | 0.352 |
| Natriumpyruvat | C3H3NaO3 | 110.04 | 3 | 0.66 |
| Lagerkonzentration (M) | Endkonzentration (mM) | Milliliter / 2L ACSF | ||
| Calciumchlorid | CaCl2 | 1 | 1.6 | 3.2 |
| Magnesiumchlorid | MgCl2 | 1 | 1.2 | 2.4 |
Tabelle 2: Zusammensetzung der künstlichen Zerebrospinalflüssigkeit. Beginnen Sie mit ca. 1,5 l gereinigtem Wasser, das gefiltert wurde, um Spurenmetalle und andere Verunreinigungen zu entfernen. Lösen Sie jeden Feststoff auf, während Sie die Lösung mit einem magnetischen Rührstab mischen. Sobald alle Feststoffe gelöst sind, Blasen Carbogen Gas durch die Lösung für 10 min. Fügen Sie die MgCl2 und CaCl2 Lösungen hinzu und fügen Sie Wasser hinzu, um das Gesamtvolumen auf 2 L zu bringen. Mischen Sie mit einem magnetischen Rührstab für 10 min, um sicherzustellen, dass die Lösung gleichmäßig gemischt wird. Die Osmolarität sollte zwischen 315 und 325 mOsm liegen, und der pH-Wert sollte etwa 7,4 betragen.
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Discussion
Es gibt mehrere Schritte in diesem Schneideprotokoll entwickelt, um die Gesundheit des Gewebes zu fördern und die Entstehung von spontanen naturalistischen Netzwerkaktivität zu fördern: die Maus ist transkardial durchlässig mit gekühlten Saccharose Schneiden Lösung; horizontal-entorhinale Kortex-Scheiben (HEC) werden mit einer Dicke von 450 m aus dem mittleren oder ventralen Hippocampus geschnitten; Scheiben erholen sich an der Schnittstelle von erwärmter ACSF und befeuchteter, autobogenreicher Luft; Während der Aufnahmen werden Slices mit AUF 32 °C erwärmtem ACSF überlagert und mit einer schnellen Durchflussrate mit zweilagiger Superfusion in einer untergetauchten Aufnahmekammer geliefert.
Slice Health ist von größter Bedeutung für die Erzeugung von Netzwerkschwingungen in vitro. Junge Tiere werden mehr gesunde Scheiben liefern, und in der Regel mit jugendlichen oder jugendlichen Mäusen kann der transkardiale Perfusionsschritt übersprungen werden. Mit zunehmendem Alter der Tiere wird es immer schwieriger, gesunde Scheiben herzustellen, doch einige Untersuchungen (wie Krankheitsmodelle oder Längsschnittstudien) erfordern die Verwendung von erwachsenen oder alternden Tieren. Dengler et al. verwendeten beispielsweise transkardiale Perfusionen bei der Herstellung von HEC-Scheiben von pilocarpine behandelten chronisch epileptischen erwachsenen Mäusen50. Bei erwachsenen Mäusen ist es vorteilhaft, eine transkardiale Perfusion mit gekühlter Saccharose-Schneidlösung durchzuführen, um das Gewebe zu kühlen, Blut aus dem Gehirn zu entfernen und die Stoffwechselaktivität zu reduzieren, bevor das Gehirn aus dem Schädel entfernt wird51. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass transkardiale Perfusionen eine ordnungsgemäße Schulung erfordern und dass darauf geachtet werden muss, dass das Verfahren schnell und in einer Weise durchgeführt wird, die keine Gefahr für das Wohlergehen der Tiere darstellt. Wenn möglich, sollten Versuche so konzipiert werden, dass Junge Tiere verwendet werden, um die Verwendung von transkardialen Perfusionen zu verhindern. In einer suboptimalen Scheibenpräparation wird es nicht genügend gesunde Zellen, insbesondere Interneurons, geben, um laufende Netzwerkschwingungen zu unterstützen. Um die Schnittzustand während des Experiments zu bewerten, ist es sinnvoll, zuerst evozierte Feldpotentiale aufzuzeichnen (z. B. mit einer Stimulationspipette und einer Aufnahmepipette im Stratum radiatum, SR). In einer gesunden Scheibe wird die Stimulation in der SR-Schicht ein großes feldpostsynaptisches Potenzial (fPSP) mit einem relativ kleinen präsynaptischen Faservolley evozieren (Abbildung 3).
Die durch dieses Protokoll erzeugten Scheiben sind abgewinkelte horizontale Hippocampus-entorhinal cortex (HEC) Scheiben. Wichtig ist, dass weder die Aufnahme von Parahippocampalgewebe noch der abgewinkelte Schnitt notwendig sind, damit Hippocampusscheiben spontan Netzwerkaktivitäten wie SWRs erzeugen können. Tatsächlich haben viele Studien horizontale oder transversale Hippocampusscheiben verwendet, um Aspekte physiologischer25,40,41,44 oder pathologischer Netzwerkschwingungen33,38zu befragen. In diesem Protokoll ermöglicht die Platzierung des Gehirns auf einer Agarrampe dem Experimentator, selektiv mehr Scheiben aus dem ventralen oder mittleren Hippocampus zu produzieren (Abbildung 1), was für experimentelle Ziele von Vorteil sein kann, die die funktionelle Heterogenität berücksichtigen, die entlang der Längsachse des Hippocampus26,31existiert. Wenn der anatomische Ursprung der Scheiben kein Faktor ist, kann die Agarrampe ausgeschlossen werden und eine echte horizontale Schnittebene ergibt Scheiben des mittel-ventralen Hippocampus. Da jede horizontale Gewebescheibe freigesetzt wird, können die meisten überflüssigen Teile der Scheibe mit drei einfachen Schnitten entfernt werden, so dass eine ungefähr rechteckige Scheibe, die den Hippocampus und einige umgebende Gewebe enthält, einschließlich der parahippocampalen Region(Abbildung 1). Weitere Sezierungen können durchgeführt werden, um alle extrahippocampalen Gewebe zu entfernen, aber die Aufnahme von umgebendem Gewebe ist vorteilhaft, da die Scheibe Harfe leicht so platziert werden kann, dass die Nylon-Filamente nicht über dem Hippocampus ruhen. Wie oben besprochen, ist die kombinierte HEC-Scheibe auch ein nützliches Präparat, um ein größeres kortikohippocampales Netzwerk im Kontext physiologischer37 oder pathologischer16,35,36,38 Netzwerkschwingungen zu untersuchen.
Der Schlüsselfaktor in diesem Protokoll ist die Optimierung der Sauerstoffversorgung des Gewebes, sowohl während der Erholungsphase als auch während der Aufnahmen. Viele Studien über Netzwerkschwingungen werden in Scheiben durchgeführt, die direkt vom Mikrotome in eine Schnittstellenaufnahmekammer übertragen werden und sich mit kontinuierlicher Durchblutung von frischem ACSF erholen können. Nach mehrstündiger Wiederherstellung können die Aufnahmen dann in derselben Schnittstellenkammer durchgeführt werden. So werden Scheiben an der Schnittstelle von ACSF und feuchter Autobogen-reicher Luft für die gesamte Dauer des Experiments gehalten. In der in diesem Protokoll vorgestellten alternativen Methode werden Slices in einer grenzübergreifenden Haltekammer für mindestens zwei Stunden wiederhergestellt, bevor einzelne Slices in eine Aufnahmekammer im Unterwasserstil mit ausreichend schnellen ACSF-Durchflussraten übertragen werden. Unter diesen Bedingungen hergestellte Scheiben können stabile Gammaschwingungen12 oder spontane SWR-Aktivität43aufweisen. Die Slice Recovery in einer grenzübergreifenden Haltekammer ist ein kritischer Schritt: Maier et al. demonstrierten, dass Scheiben, die sich in einem becherförmigen, vollständig in ACSF getauchten Becher erholen, kleinere evozierte Feldpotentiale aufweisen, seltener spontane postsynaptische Ströme aufweisen und nur selten spontane Netzwerkaktivität erzeugen43. In ähnlicher Weise zeigten die Folgenden, dass schnelle ACSF-Durchflussraten zu einer höheren Häufigkeit spontanhemmender postsynaptischer Ströme führen, was auf eine verbesserte intereuronale Aktivität49hindeutet. Während des Aufnahmezeitraums ist eine zweibändige Superfusion nicht unbedingt notwendig, sofern die Aufnahmekammer ein relativ geringes ACSF-Volumen hält, das mit einer schnellen Durchflussrate (mindestens 6 ml/min)43geliefert wird. Die in diesem Protokoll vorgestellte 3D-gedruckte Aufnahmekammer (Abbildung 2B) ist eine relativ kostengünstige und einfache Option, aber es gibt auch handelsübliche Unterbrennkammern, die kleinere Volumina aufnehmen, den laminaren Medienfluss fördern oder eine zweibändige Superfusion bieten (im Gegensatz zu kreisförmigen Aufnahmekammern, die beispielsweise ein überschüssiges Totvolumen von ACSF ermöglichen).
Während dieses Protokoll es erlaubt, Netzwerkschwingungen ohne die Anforderung einer herkömmlichen Schnittstellenaufzeichnungskammer aufzuzeichnen, gibt es mehrere Einschränkungen. Obwohl Während der Erholungsphase Scheiben in der ACSF-Luftschnittstelle gehalten werden, erhalten sie keine kontinuierliche Durchblutung von frischen Medien, wie es in herkömmlichen Schnittstellenaufnahmekammern im Haas-Stil der Fall ist. Die Scheiben müssen einzeln (mit Feinerzange) von der Rückgewinnungskammer in die untergetauchte Aufnahmekammer übertragen werden. Darüber hinaus können schnelle Durchflussraten für einige Aufnahmen zu Instabilität und Bewegungsartefakten führen, insbesondere wenn ACSF mit einer peristaltischen Pumpe geliefert wird. Um schnelle Durchflussraten zu halten und mechanische Störungen zu minimieren, kann ein einfacher Pulsationsdämpfer in das Perfusionssystem integriert werden (Abbildung 2). Dieser Pulsationsdämpfer arbeitet mit dem Windkessel-Effekt52, bei dem leere Spritzen Lufttaschen enthalten, die als elastische Reservoirs fungieren und den schwankenden Druck absorbieren, der durch die Rollen der Peristaltikpumpe erzeugt wird53. Die Einbindung eines Pulsdämpfers kann jedoch die Länge des Schlauches verlängern, der ACSF an die Aufnahmekammer liefert und die Sauerstoffversorgung der Scheibe beeinträchtigt. Die Durchflussraten sollten nur so schnell sein, wie notwendig ist, um stabile Netzwerkschwingungen zu erzielen, und wenn eine peristaltische Pumpe verwendet wird, sollte es idealerweise eine Pumpe sein, die eine große Anzahl von Walzen (> 12) verwendet, um die Pulsation durch Peristaltik zu minimieren, die Verwendung eines Pulsationsdämpfers auszuschließen und sicherzustellen, dass die Schläuche, die ACSF an die Aufnahmekammer liefern, so kurz wie möglich sind. Aufnahmen, die mit schnellen Durchflussraten durchgeführt werden, erfordern auch große Mengen an ACSF, was problematisch sein kann, wenn Experimente die Zugabe wertvoller oder teurer Medikamente oder Verbindungen zu den Medien erfordern. Obwohl eine zweireliegende Superfusionskammer eine speziell konstruierte Aufnahmekammer mit zwei Flüssigkeitseinlässe benötigt, um sauerstoffhaltige Medien auf beiden Seiten der Scheibe zu liefern, können spontane Netzwerkschwingungen mit moderaten ACSF-Durchflussraten48beobachtet werden. Dieses Protokoll nutzt sowohl eine schnelle Durchflussrate (stabilisiert mit einem Pulsationsdämpfer) als auch eine zweilagige Superfusionskammer, um die Wahrscheinlichkeit der Beobachtung spontaner Aktivität zu verbessern.
Schließlich weist dieses Protokoll einen geringen Ertrag in Bezug auf die Anzahl der pro Tier erzeugten Scheiben auf. Horizontales Schneiden mit einer Dicke von 450 m ergibt eine kleine Anzahl von HEC-Scheiben bei der bevorzugten Ausrichtung (wobei die Scheibe effektiv parallel zur Querachse des Hippocampus verläuft). Von diesen Scheiben zeigt in der Regel nur ein oder zwei pro Hippocampi spontane SWR-Aktivität, weniger als anderswo berichtet wurde43. Obwohl dickere Scheiben vermutlich ein höheres Maß an wiederkehrender Konnektivität enthalten, kann das Schneiden von etwas dünneren Slices (400 m) eine größere Anzahl quer orientierter Slices pro Maus mit SWR-Aktivität ergeben. Darüber hinaus kann die Wahrscheinlichkeit, dass mehrere Scheiben zuverlässig spontane SWR-Aktivität aufweisen, in Experimenten höher sein, die echte horizontale oder nach unten abgewinkelte Scheiben des ventralen Hippocampus verwenden. Das aktuelle Protokoll beinhaltet die Verwendung von nach oben gewinkelten horizontalen Scheiben des mittleren Hippocampus, die im Vergleich zu Scheiben aus dem ventralen Hippocampus25,26,31eine spontane Netzwerkaktivität aufweisen können. Schließlich verwendete dieses Protokoll Scheiben von jugendlichen und erwachsenen Mäusen. Während transkardiale Perfusionen die Qualität von Scheiben von älteren Tieren verbessern können, kann die Wahrscheinlichkeit, spontane Netzwerkaktivitäten zu beobachten, durch die Verwendung von Scheiben von jüngeren Tieren verbessert werden12,41,44.
Zusammenfassend stellt dieses Protokoll einen Maus-Gehirn-Slicing-Ansatz dar, der abgewinkelte horizontale Hippocampus-entorhinale Kortex-Scheiben aus der mittleren oder ventralen Hippocampus-Bildung ergibt, die komplexe spontane Netzwerkaktivität in Form von scharfen Wellenwellenkomplexen aufweisen können.
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Disclosures
Der Autor hat nichts zu verraten.
Acknowledgments
Der Autor bedankt sich bei Steve Siegelbaum für die Unterstützung. Die Finanzierung erfolgt durch 5R01NS106983-02 sowie 1 F31 NS113466-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | Lulzbot | LulzBot TAZ 6 | |
| Acute brain slice incubation holder | NIH 3D Print Exchange | 3DPX-001623 | Designed by ChiaMing Lee, available at https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623 |
| Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt | Sigma Aldrich | A9187-500MG | |
| Ag-Cl ground pellets | Warner | 64-1309, (E205) | |
| agar | Becton, Dickinson | 214530-500g | |
| ascorbic acid | Alfa Aesar | 36237 | |
| beaker (250 mL) | Kimax | 14000-250 | |
| beaker (400 mL) | Kimax | 14000-400 | |
| biocytin | Sigma Aldrich | B4261 | |
| blender | Oster | BRLY07-B00-NP0 | |
| Bonn scissors, small | becton, Dickinson | 14184-09 | |
| borosilicate glass capillaries with filament (O.D. 1.5 mm, I.D. 0.86 mm, length 10 cm) | Sutter Instruments | BF150-86-10HP | Fire polished capillaries are preferable. |
| calcium chloride solution (1 M) | G-Biosciences | R040 | |
| camera | Olympus | OLY-150 | |
| compressed carbogen gas (95% oxygen / 5% carbon dioxide) | Airgas | X02OX95C2003102 | |
| compressed oxygen | Airgas | OX 200 | |
| constant voltage isolated stimulator | Digitimer Ltd. | DS2A-Mk.II | |
| coverslips (22x50 mm) | VWR | 16004-314 | |
| cyanoacrylate adhesive | Krazy Glue | KG925 | Ideally use the brush-on form for precision |
| data acquisition software | Axograph | N/A | Any equivalent software (e.g. pClamp) would work. |
| Dell Precision T1500 Tower Workstation Desktop | Dell | N/A | Catalog number will depend on specific computer - any computer will work as long as it can run electrophysiology acquisition software. |
| Digidata 1440A | Molecular Devices | 1-2950-0367 | |
| digital timer | VWR | 62344-641 | 4-channel Traceable timer |
| disposable absorbant pads | VWR | 56616-018 | |
| dissector scissors | Fine Science Tools | 14082-09 | |
| double-edge razor blades | Personna | BP9020 | |
| dual automatic temperature controller | Warner Instrument Corporation | TC-344B | |
| dual-surface or laminar-flow optimized recording chamber | N/A | N/A | The chamber presented in this protocol is custom made. A commercial equivalent would be the RC-27L from Warner Instruments. |
| equipment rack | Automate Scientific | FR-EQ70" | A rack is not strictly necessary but useful for organizing electrophysiology |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethyiether)- N,N,N',N'-teetraacetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | 324626-25GM | |
| filter paper | Whatman | 1004 070 | |
| fine scale | Mettler Toledo | XS204DR | |
| Flaming/Brown micropipette puller | Sutter Instruments | P-97 | |
| glass petri dish (100 x 15 mm) | Corning | 3160-101 | |
| glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma Aldrich | G8877-250MG | |
| ice buckets | Sigma Aldrich | BAM168072002-1EA | |
| isoflurane vaporizer | General Anesthetic Services | Tec 3 | |
| lab tape | Fisher Scientific | 15-901-10R | |
| lens paper | Fisher Scientific | 11-996 | |
| light source | Olympus | TH4-100 | |
| magnesium chloride solution (1 M) | Quality Biological | 351-033-721EA | |
| magnetic stir bars | Fisher Scientific | 14-513-56 | Catalog number will be dependent on the size of the stir bar. |
| micromanipulator | Luigs & Neumann | SM-5 | |
| micromanipulator (manual) | Scientifica | LBM-2000-00 | |
| microscope | Olympus | BX51WI | |
| microspatula | Fine Science Tools | 10089-11 | |
| monitor | Dell | 2007FPb | |
| MultiClamp 700B Microelectrode Amplifier | Molecular Devices | MULTICLAMP 700B | The MultiClamp 700B should include headstages, pipette holders, and a model cell. |
| N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), (HEPES) | Sigma Aldrich | H3375-25G | |
| needle (20 gauge, 1.5 in length) | Becton, Dickinson | 305176 | |
| nylon filament | YLI Wonder Invisible Thread | 212-15-004 | size 0.004. This cat. # is from Amazon.com |
| nylon mesh | Warner Instruments Corporation | 64-0198 | |
| perstaltic pump | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
| Phosphocreatine di(tris) salt | Sigma Aldrich | P1937-1G | |
| pipette holders | Molecular Devices | 1-HL-U | |
| platinum wire | World Precision | PT0203 | |
| polylactic acid (PLA) filament | Ultimaker | RAL 9010 | |
| potassium chloride | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| potassium gluconate | Sigma Aldrich | 1550001-200MG | |
| potassium hydroxide | Sigma Aldrich | 60377-1KG | |
| razor blades | VWR | 55411-050 | |
| roller clamp | World Precision Instruments | 14041 | |
| scale | Mettler Toledo | PM2000 | |
| scalpel handle | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| slice harp | Warner | SHD-26GH/2 | |
| sodium bicarbonate | Fisher Chemical | S233-500 | |
| sodium chloride | Sigma Aldrich | S9888-1KG | |
| sodium phosphate monobasic anhydrous | Fisher Chemical | S369-500 | |
| sodium pyruvate | Fisher Chemical | BP356-100 | |
| spatula | VWR | 82027-520 | |
| spatula/spoon, large | VWR | 470149-442 | |
| sterile scalpel blades | Feather | 72044-10 | |
| stirrer / hot plate | Corning | 6795-220 | |
| stopcock valves, 1-way | World Precision Instruments | 14054 | |
| stopcock valves, 3-way | World Precision Instruments | 14036 | |
| sucrose | Acros Organics | AC177142500 | |
| support for swivel clamps | Fisher Scientific | 14-679Q | |
| surgical scissors, sharp/blunt | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| syringe (1 mL) | Becton, Dickinson | 309659 | |
| syringe (60 mL with Luer-Lok tip) | Becton, Dickinson | 309653 | |
| three-pronged clamp | Fisher Scientific | 05-769-8Q | |
| tissue forceps, large | Fine Science Tools | 11021-15 | |
| tissue forceps, small | Fine Science Tools | 11023-10 | |
| transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| tubing | Tygon | E-3603 | ID 1/16 inch, OD 3/16 inch |
| tubing | Tygon | R-3603 | ID 1/8 inch, OD 1/4 inch |
| vacuum grease | Dow Corning | 14-635-5D | |
| vibrating blade microtome | Leica | VT 1200S | |
| vibration-dampening table with faraday cage | Micro-G / TMC-ametek | 2536-516-4-30PE | |
| volumetric flask (1 L) | Kimax | KIM-28014-1000 | |
| volumetric flask (2 L) | PYREX | 65640-2000 | |
| warm water bath | VWR | 1209 |
References
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