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Biochemistry

संभावित एपिजेनेटिक मार्कर के टॉप डाउन मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोफाइलिंग के लिए ज्वार लीफ टिश्यू से हिस्टोन का अलगाव

Published: March 4, 2021 doi: 10.3791/61707
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2, 1, 1, 1, 3, 3, 3, 4,5, 6, 6, 1, 6, 1, 1
1Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, 2DOE-Joint Genome Institute, Lawrence Berkeley Laboratory, 3Kearney Agricultural Research and Extension Center, University of California Agriculture and Natural Resources, 4West Side Research and Extension Center, University of California, 5Department of Plant Sciences, University of California, Davis, 6Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley

Summary

प्रोटोकॉल को प्रभावी ढंग से हिस्टोन के बाद अनुवाद संशोधनों की प्रोफाइलिंग के लिए ज्वार पत्ती सामग्री से बरकरार हिस्टटोन निकालने के लिए विकसित किया गया है जो इंजीनियरिंग सूखा प्रतिरोधी फसलों की सहायता के लिए संभावित एपीजेनेटिक मार्कर के रूप में काम कर सकते हैं ।

Abstract

हिटोन यूकेरियोट्स में अत्यधिक संरक्षित प्रोटीन के परिवार से संबंधित हैं। वे डीएनए को क्रोमेटिन की कार्यात्मक इकाइयों के रूप में न्यूकोसोम में पैक करते हैं। हिस्टन के पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन (पीटीएम) जो अत्यधिक गतिशील होते हैं और एंजाइमों द्वारा जोड़े या हटाए जा सकते हैं, जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। पौधों में, हिस्टोन पीटीएम सहित एपिजेनेटिक कारक पर्यावरण के प्रति उनकी अनुकूली प्रतिक्रियाओं से संबंधित हैं। एपिजेनेटिक नियंत्रण के आणविक तंत्र को समझना अभिनव बायोइंजीनियरिंग समाधानों के लिए अभूतपूर्व अवसर ला सकता है। इसके साथ ही, हम नाभिक को अलग करने और ज्वार के पत्ते के ऊतकों से हिस्टन को शुद्ध करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। निकाले गए हिस्टन का विश्लेषण ऑनलाइन रिवर्स-फेज (आरपी) लिक्विड क्रोमेटोग्राफी (एलसी) के साथ मिलकर टॉप-डाउन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) द्वारा उनके अक्षुण्ण रूपों में किया जा सकता है । एक ही हिस्टोन प्रोटेफॉर्म पर कई पीटीएमएस के संयोजन और स्टोइचिओमेट्री को आसानी से पहचाना जा सकता है। इसके अलावा, हाईस्टोन टेल क्लिपिंग का पता टॉप-डाउन एलसी-एमएस वर्कफ्लो का उपयोग करके लगाया जा सकता है, इस प्रकार, कोर हिस्टोन (एच 4, एच2ए, एच 2 बी, एच 3) के वैश्विक पीटीएम प्रोफाइल का परिणाम है। हमने इस प्रोटोकॉल को पहले बड़े पैमाने पर क्षेत्र अध्ययन से एकत्र ज्वार के पत्ते के ऊतकों से प्रोफाइल हिस्टोन पीटीएम के लिए लागू किया है, जिसका उद्देश्य सूखे प्रतिरोध के एपीजेनेटिक मार्कर की पहचान करना है। प्रोटोकॉल को संभावित रूप से क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिपिटेशन-अनुक्रमण (ChIP-seq) के लिए अनुकूलित और अनुकूलित किया जा सकता है, या इसी तरह के पौधों में हिस्टोन पीटीएम का अध्ययन करने के लिए।

Introduction

सूखे की बढ़ती गंभीरता और बारंबारता से अनाज फसलों की उत्पादकता प्रभावित होने की संभावना है1,2. ज्वार एक अनाज खाद्य और ऊर्जा फसल है जो पानी को सीमित करने की असाधारण क्षमता के लिए जानी जाती है3,4। हम सूखे के तनाव, पौधों के विकास और ज्वार के एपिजेनेटिक्स[ज्वार द्विरंगी (एल) मोंच] पौधों के बीच परस्पर क्रिया की यंत्रवादी समझ का पीछा कर रहे हैं । हमारे पिछले कार्य ने सूखे की वृद्धि और आणविक स्तर 5,6,7पर प्रतिक्रियाओं में पौधे और राइजोसिफेयर माइक्रोबायोम के बीच मजबूत संबंधों का प्रदर्शन किया है । यह शोध भविष्य के जलवायु परिदृश्यों के लिए फसलों को अनुकूल बनाने में एपिजेनेटिक इंजीनियरिंग का उपयोग करने का मार्ग प्रशस्त करेगा । एपिजेनेटिक्स को समझने के प्रयासों के एक भाग के रूप में, हमारा उद्देश्य प्रोटीन मार्कर का अध्ययन करना है जो पौधे के जीव के भीतर जीन अभिव्यक्ति को प्रभावित करते हैं ।

हिस्टोन यूकेरियोट्स में प्रोटीन के एक अत्यधिक संरक्षित परिवार से संबंधित हैं जो डीएनए को गुणसूत्रों की मौलिक इकाइयों के रूप में न्यूकोसोम में पैक करते हैं। हिटोन के पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों (पीटीएम) को क्रोमेटिन संरचना को नियंत्रित करने और जीन अभिव्यक्ति को प्रभावित करने के लिए गतिशील रूप से विनियमित किया जाता है। डीएनए मिथाइलेशन सहित अन्य एपिजेनेटिक कारकों की तरह, हिस्टोन पीटीएम कई जैविक प्रक्रियाओं8, 9में महत्वपूर्ण भूमिकानिभातेहैं। एंटीबॉडी आधारित परख जैसे पश्चिमी धब्बे व्यापक रूप से पहचान और हिस्टोन PTMs की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । इसके अलावा, हिस्टोन पीटीएम और डीएनए की बातचीत को क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिCIPITेशन - अनुक्रमण (ChIP-seq)10द्वारा प्रभावी ढंग से जांच की जा सकती है। ChIP-seq में, विशिष्ट लक्षित हिस्टोन पीटीएम के साथ क्रोमेटिन उस विशिष्ट पीटीएम के खिलाफ एंटीबॉडी द्वारा समृद्ध है। फिर, डीएनए के टुकड़े समृद्ध क्रोमेटिन से जारी किए जा सकते हैं और अनुक्रमित हो सकते हैं। जीन के क्षेत्रों है कि लक्षित हिस्टोन पीटीएम के साथ बातचीत से पता चला रहे हैं । हालांकि, ये सभी प्रयोग उच्च गुणवत्ता वाले एंटीबॉडी पर भारी भरोसा करते हैं। कुछ हिस्टोन वेरिएंट/समरूपता या पीटीएमएस के संयोजन के लिए, मजबूत एंटीबॉडी का विकास बेहद चुनौतीपूर्ण हो सकता है (विशेष रूप से कई पीटीएमएस के लिए)। इसके अलावा, एंटीबॉडी केवल तभी विकसित किया जा सकता है जब लक्षित हिस्टोन पीटीएम ज्ञात हो। 11 इसलिए, हिस्टोन पीटीएम की अलक्षित, वैश्विक प्रोफाइलिंग के लिए वैकल्पिक तरीके आवश्यक हैं।

मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) हिस्टोन पीटीएम की विशेषता के लिए एक पूरक विधि है, जिसमें अज्ञात पीटीएम शामिल हैं, जिसके लिए एंटीबॉडी11,12उपलब्ध नहीं हैं। अच्छी तरह से स्थापित "बॉटम-अप" एमएस वर्कफ्लो तरल क्रोमेटोग्राफी (एलसी) पृथक्करण और एमएस डिटेक्शन से पहले छोटे पेप्टाइड्स में प्रोटीन को पचाने के लिए प्रोटीज का उपयोग करता है। क्योंकि हिस्टन में बड़ी संख्या में बुनियादी अवशेष (lysine और arginine) होते हैं, ट्राइप्सिन पाचन (lysine और आर्जिनिन के लिए विशिष्ट प्रोटीज) मानक बॉटम-अप वर्कफ्लो में प्रोटीन को बहुत कम पेप्टाइड्स में काटता है। छोटे पेप्टाइड्स तकनीकी रूप से मानक एलसी-एमएस द्वारा विश्लेषण करने के लिए मुश्किल हैं, और कनेक्टिविटी और कई PTMs के stoichiometry के बारे में जानकारी की रक्षा नहीं करते हैं । lysines को ब्लॉक करने के लिए अन्य एंजाइमों या रासायनिक लेबलिंग का उपयोग लंबे समय तक पेप्टाइड्स उत्पन्न करता है जो हिस्टोन पीटीएम13,14के लक्षण वर्णन के लिए अधिक उपयुक्त हैं ।

वैकल्पिक रूप से, पाचन कदम को पूरी तरह से छोड़ा जा सकता है। इस "टॉप-डाउन" दृष्टिकोण में, ऑनलाइन एलसी अलगाव के बाद इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई) द्वारा एमएस में अक्षुण्ण प्रोटीन आयनों को पेश किया जाता है, जो बरकरार हिस्टोन प्रोटियोफॉर्म के आयनों को उत्पीडिंग करता है। इसके अलावा, पहचान और पीटीएम स्थानीयकरण के लिए अनुक्रम आयनों को उपज देने के लिए ब्याज के आयनों (यानी, प्रोटियोफॉर्म) को बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर में अलग और खंडित किया जा सकता है। इसलिए, टॉप-डाउन एमएस को प्रोटेफॉर्म-लेवल की जानकारी को संरक्षित करने और एक ही प्रोटेफॉर्म15,16पर कई पीटीएम और टर्मिनल ट्रंकेशन की कनेक्टिविटी पर कब्जा करने का लाभ है। टॉप-डाउन प्रयोग मात्रात्मक जानकारी भी प्रदान कर सकते हैं और बरकरार प्रोटीन स्तर17पर बायोमार्कर की अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। इसके साथ ही, हम ज्वार के पत्ते से हिस्टोन निकालने और ऊपर-नीचे एलसी-एमएस द्वारा बरकरार हिस्टोन का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

चित्रा 1 और चित्रा 2 में दिखाए गए उदाहरण डेटा रोपण के बाद 2 सप्ताह में एकत्र ज्वार के पत्ते से हैं। हालांकि उपज की भिन्नता की उम्मीद है, यह प्रोटोकॉल आम तौर पर विशिष्ट नमूना स्थितियों के लिए नास्तिक है। इसी प्रोटोकॉल का सफलतापूर्वक उपयोग 2, 3, 5, 8, 9 और रोपण के 10 सप्ताह बाद एकत्र ज्वार के पौधे पत्ती ऊतक के लिए किया गया है।

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Protocol

1. ज्वार के पत्ते सामग्री तैयार करना

नोट: ज्वार के पौधे पैरालियर, सीए में खेत में मिट्टी में उगाए गए थे ।

  1. पौधों से ज्वार की पत्तियों को 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में ले जाएं और तुरंत तरल नाइट्रोजन में ट्यूब को फ्रीज कर दें। प्राथमिक टिलर से तीसरे और चौथे पूरी तरह से उभरे पत्ते को फाड़ कर पत्ती के ऊतकों को इकट्ठा करें।
    नोट: क्षेत्र की स्थिति, नमूना विकास, और संग्रह के अधिक विवरण प्रकाशित रिपोर्ट18में पाया जा सकता है ।
  2. पत्तियों को तरल नाइट्रोजन के साथ पीसें और तुरंत एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  3. उपयोग होने तक जमीन के पत्ते को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। प्रत्येक नमूने के हिस्टोन विश्लेषण के लिए क्रायो-ग्राउंड लीफ पाउडर के बारे में 4 ग्राम लें।

2. बफ़र्स और सामग्री तैयार करना (3-4 घंटे)

नोट: उच्च एकाग्रता स्टॉक समाधान समय से पहले बनाया जा सकता है और उपयोग तक संग्रहीत किया जा सकता है। लेकिन सभी काम बफ़र्स निष्कर्षण के दिन ताजा बनाया जाना चाहिए (स्टॉक से कमजोर पड़ने और अन्य सामग्री के साथ मिश्रण) और प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर रखा जाना है। पूरा प्रयोग 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जाना चाहिए जब तक कि अन्यथा अनुशंसित न हो।

  1. लगातार सरगर्मी के साथ एक गिलास कंटेनर में हीट प्लेट पर बाँझ पानी के 15 एमएल में 42.8 ग्राम सुक्रोज (342.30 ग्राम/मोल) को भंग करके 2.5 एम सुक्रोज तैयार करें। एक बार सुक्रोज पूरी तरह से भंग हो जाने के बाद वॉल्यूम को 50 एमएल तक लाएं। उपयोग होने तक सुक्रोज को 4 डिग्री सेल्सियस में स्टोर करें।
  2. 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में एच 2 ओ के 10 एमएल में 1.576 ग्राम ट्राइज एचसीएल को भंग करके1एम ट्रिस पीएच 8 तैयार करें। नाओएच के साथ पीएच को 8 से समायोजित करें और पीएच पेपर के साथ जांच करें। उपयोग होने तक इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. 231 मिलीग्राम डीटीटी (154.25 ग्राम/मोल) वजन करके और इसे 1.5 एमएल बाँझ पानी में घोलकर 1 एम डियिओथ्रेइटॉल (डीटीटी) तैयार करें। डीटीटी को ताजा बनाया जाना चाहिए या संग्रहित जमे हुए एलिकोट का उपयोग किया जाना चाहिए।
  4. (वैकल्पिक) तीन अलग-अलग लवण मिलाकर अतिरिक्त अवरोधक तैयार करें। बाँझ पानी के 1 मिलील में 18.38 मिलीग्राम सोडियम ऑर्थोवानाडेट (183.91 ग्राम/मोल) तैयार करें, फिर बाँझ पानी के 1 एमएल में 11.008 मिलीग्राम सोडियम ब्यूटाइरेट (110.09 ग्राम/मोल) जोड़कर अलग से सोडियम ब्यूटारेट तैयार करें। 1 मिली लीटर पानी में 4.199 मिलीग्राम सोडियम फ्लोराइड (41.99 ग्राम/मोल) डालकर अंतिम नमक तैयार करें। "अतिरिक्त अवरोधकों" (तीन रसायनों में से प्रत्येक के 33 mm) के लिए स्टॉक समाधान के रूप में बराबर मात्रा में तीन नमक समाधानों को एक साथ मिलाएं।
    नोट: सोडियम वैनाडडे तटस्थ पीएच के तहत 0.1 mm से अधिक सांद्रता पर बहुलक है। यह सलाह दी जाती है कि वह प्रकाशित प्रोटोकॉल19के बाद अधिकतम प्रभावकारिता के लिए इसे विकृत करने के लिए सोडियम वैनाडे को सक्रिय करे । वैकल्पिक रूप से, सक्रिय सोडियम वैनाडे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है। इसके साथ ही सोडियम वैनाडे जानबूझकर सक्रिय नहीं था, इसलिए प्रभावकारिता कम नहीं होती है। सक्रिय सोडियम वैनाडे अभी तक इस प्रोटोकॉल के लिए परीक्षण नहीं किया गया है।
  5. 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में एच2 ओ के 10 एमएल में 0.952 ग्राम निर्जल मैग्नीशियम क्लोराइड (95.2 ग्राम/मोल) को भंग करके एमजीसीएल2का 1 एम तैयार करें। उपयोग होने तक4 डिग्री सेल्सियस पर 1 एम एमजीसीएल 2 स्टोर करें।
  6. 10% (v/v) ट्राइटन एक्स-100 को 53.5 ग्राम ट्रिटन एक्स-100 को 35 एमएल बाँझ पानी के साथ मिलाकर तैयार करें, 50 एमएल तक पानी के साथ लाएं और इसे कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  7. 5% ग्वानिडीन बफर पीएच 7 (जिसे "जीडीएन बफर" कहा जाता है) तैयार करें जिसका उपयोग कम से कम रात में राल को कंडीशन करने के लिए किया जाएगा - 870 मिलीग्राम के2एचपीओ 4 वजन और4सी पर 50 मीटर बाँझ पानी और स्टोर में भंग करके 0.1 मीटर पोटेशियम हाइड्रोजन फॉस्फेट डिबेसिक (K2एचपीओ4) तैयार करें।
  8. ग्वानिडीन हाइड्रोक्लोराइड का 0.7 ग्राम वजन और 0.1 एम के2एचपीओ4 में 14 एमएल की अंतिम मात्रा में भंग करें। पीएच पेपर के साथ जांच करके पीएच को 7 तक समायोजित करें।
  9. सूखी कमजोर सेशन एक्सचेंज (WCX) राल को 5% ग्वानिडीन बफर पीएच 7 में रात भर भिगो दें। सुपरनेट को निकालें और ताजा 5% जीडीएन बफर के साथ फिर से भरें और राल को पूरी तरह से बराबर करने के लिए रात भर फिर से भिगोएं (जब तक कि सुपरनैंट में मूल बफर के समान पीएच न हो)।
  10. अगले खंड में प्रयोग शुरू करने से पहले, टेबल1 के आधार पर EB1, EB2A और EB2B बफर बनाने के लिए रिएजेंट्स मिलाएं। उपयोग से ठीक पहले सभी अवरोधकों और डीटीटी को ताजा जोड़ें।
अभिकर्मकों स्टॉक एकाग्रता ईबी1 ईबी2ए ईबी2बी
वॉल्यूम (एमएल) वॉल्यूम (एमएल) वॉल्यूम (एमएल)
इक्षु शर्करा 2.5 मीटर 4.4 1.25 0.5
Tris HCl pH8 1M 0.25 0.125 0.05
डीटीटी 1M 0.125 0.0625 0.025
एच2ओ 20.225 9.6875 4.375
प्रोटीज़ अवरोधक (पीआई) टैबलेट 0.5 गोली 0.5 गोली 0.5 गोली
अतिरिक्त अवरोधक (वैकल्पिक) 33mM 0.25 0.125 0.05
एमजीसीएल2 1M 0.125 0.05
ट्राइटन X100 10% 1.25
कुल मिलाकर वॉल्यूम 25 एमएल 12.5 एमएल 5 एमएल

तालिका 1: निष्कर्षण बफ़र्स (ईबी) के लिए संरचना।

  1. टेबल 2के आधार पर नाभिक लाइसिस बफर (एनएलबी) बनाएं । एनएलबी को पहले से तैयार करें और उपयोग होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। 1x (0.5 टैबलेट प्रति 5 एमएल) पर उपयोग करने से ठीक पहले पीआई टैबलेट जोड़ें। विशिष्ट मात्रा के लिए तालिका 2 देखें।
एनएलबी स्टॉक एकाग्रता वॉल्यूम (एमएल)
नैक 5M 0.4
Tris HCl pH8 1M 0.05
ट्राइटन X100 10% 0.5
एडटा 0.5 मीटर 0.2
एच2ओ 3.85
पीआई टैबलेट 0.5 गोली
अतिरिक्त अवरोधक (वैकल्पिक) 33mM 0.05
कुल मिलाकर वॉल्यूम 5 एमएल

तालिका 2: नाभिक लाइसिस बफर (एनएलबी) के लिए संरचना।

3. नाभिक अलगाव प्रक्रिया

नोट: पहले दिन (2-3 घंटे) के चरण 3.1-3.3 करने की सिफारिश की जाती है, एनएलबी बफर में नाभिक को -80 डिग्री सेल्सियस पर बचाने और प्रोटीन शुद्धिकरण (4 घंटे) के लिए अगले दिन (या बाद में) फिर से शुरू करने की सिफारिश की जाती है। इस प्रोटोकॉल में नाभिक अलगाव कदम संयुक्त जीनोम संस्थान में इस्तेमाल किए जा रहे ज्वार ChIP-seq प्रोटोकॉल से अनुकूलित किए गए थे । Chip-seq अनुप्रयोगों के लिए नाभिक शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त वॉश और सुक्रोज ढाल पृथक्करण की आवश्यकता हो सकती है।

  1. मलबे का छानने का काम (~ 0.5 एच)
    1. जमीन पत्ती पाउडर ~ 4 ग्राम वजन, यह सुनिश्चित करने के लिए सूखी बर्फ या तरल नाइट्रोजन पर रखकर जमे हुए रहता है जब तक उपयोग करने के लिए तैयार है ।
    2. 0.2x (प्रति नमूना 25 एमएल के लिए 0.5 टैबलेट) की अंतिम एकाग्रता के लिए ईबी 1 में प्रोटीज़ अवरोधक गोलियां जोड़ें। बफर में टैबलेट के विघटन में सहायता करने के लिए बफर को जोड़ने से पहले माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में गोलियों को प्री-क्रश करने के लिए एक लघु प्लास्टिक मूसल या पिपेट टिप का उपयोग करें। सामग्री हानि को रोकने के लिए, पीआई टैबलेट जोड़ें और टैबलेट को भंग करने के लिए बफर को सोनिकेट करें।
    3. जमे हुए जमीन पत्ती पाउडर में EB1 के 20 एमएल जोड़ें, धीरे-धीरे भंवर और उन्हें मिश्रण जब तक पाउडर पूरी तरह से निलंबित कर दिया है। ~ 10 मिनट के लिए धीरे-धीरे मिश्रण रखें।
    4. जाल 100 के माध्यम से फ़िल्टर करें, हर बार ईबी 1 के 2 एमएल के साथ दो बार फ़िल्टर की गई सामग्री को कुल्लाएं।
      नोट: फिलट्रेट और फ़िल्टर किए गए मलबे दोनों हरे रंग के होने चाहिए। यदि माइक्रोस्कोप का उपयोग करके ट्रैकिंग करते हैं, तो किसी को इस बिंदु पर फिलट्रेट में बरकरार नाभिक और बरकरार क्लोरोप्लास्ट देखने में सक्षम होना चाहिए। अधिकांश बड़े मलबे अनुपस्थित/समाप्त होने चाहिए । नमूने के साथ मेथिलीन ब्लू जैसे रंगों को मिलाएं। नाभिक आसानी से ~ 3-5 μm व्यास गहरे नीले/एक्वामरीन क्षेत्रों के रूप में नमूदार हैं, जब एक 20x, 40x, और/या 100x उद्देश्य का उपयोग कर कल्पना । नाभिक के सापेक्ष, क्लोरोप्लास्ट आकार में समान होते हैं, लेकिन रंग में हरे रंग और अक्सर आकार में अधिक अंडाकार होते हैं। वैक्यूल्स आकार और आकार में नाभिक के समान भी हैं, लेकिन वे आसानी से मेथिलीन ब्लू डाई नहीं लेंगे।
    5. एक झूल बाल्टी रोटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 3,000 x ग्राम पर संयुक्त फिल्ट्रेट को पेलेट मलबे और नाभिक और क्लोरोप्लास्ट सहित बड़े उपकोशिकीय ऑर्गेनेल्स में।
      नोट: इस स्पिन के दौरान EB2A तैयार करने की सिफारिश की जाती है (चरण 3.2.1 देखें)।
    6. सुपरनैंट को डिजेंट करें, गोली को परेशान न करने के लिए सावधान रहें।
      नोट: जैसा कि अभी तक कोई डिटर्जेंट नहीं जोड़ा गया है, गोली तीव्र हरे रहना चाहिए और सुपरनटेंट होना चाहिए, सबसे कम, पीला हरा/
  2. गैर-लक्षित ऑर्गेनेल्स का लाइसिस (~ 0.5 एच)
    1. 0.4x (0.5 टैबलेट प्रति 12.5 मिलियन ईबी 2ए) की अंतिम एकाग्रता में प्रोटीज अवरोधकों को जोड़कर EB2A तैयार करें।
    2. EB2A के 5 एमएल में कदम 3.1.6 से गोली को फिर से खर्च करें और कोमल मिश्रण के साथ 10 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: डिटर्जेंट एकाग्रता को तरजीही रूप से अक्षुण्ण कोशिकाओं और क्लोरोप्लास्ट को अनुकूलित करने की आवश्यकता है लेकिन नाभिक नहीं। आवश्यक राशि जीवों के बीच भिन्न हो सकती है। क्लोरोप्लास्ट के लाइसिस और माइक्रोस्कोप के तहत बरकरार नाभिक को बनाए रखने की जांच करने की सिफारिश की जाती है।
    3. 15 मिनट के लिए 2,100 x ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक झूल बाल्टी रोटर में गोली मलबे और नाभिक के लिए सेंट्रीफ्यूज।
      नोट: इस स्तर पर, सुपरनैंट तीव्रता से हरा होना चाहिए, और छर्रे को साइटोसोल में क्लोरोप्लास्ट और क्लोरोफिल रिलीज के लाइसिस के कारण पिछले चरणों में मनाया जाने की तुलना में बहुत कम हरा होना चाहिए।
    4. सुपरनैंट को डिजेंट करें, गोली को परेशान न करने के लिए सावधान रहें।
  3. शेष साइटोप्लाज्मिक संदूषकों से नाभिक का अलगाव (~ 0.5 एच)
    1. 1x (0.5 टैबलेट प्रति 5 एमएल EB2B) की अंतिम एकाग्रता में प्रोटीज अवरोधकों को जोड़कर EB2B तैयार करें।
    2. ईबी2बी के 2 एमएल में स्टेप 3.2.3 से क्रूड न्यूक्लियर पेलेट को रीसुस्ट करें।
      नोट: EB2B में ट्राइटन एक्स-100 नहीं है, इसलिए इस बिंदु पर कोई अतिरिक्त लाइसिस नहीं होना चाहिए।
    3. 15 मिनट के लिए 2,100 x ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक झूल बाल्टी रोटर में गोली मलबे और नाभिक के लिए सेंट्रीफ्यूज।
      नोट: छोटे ऑर्गेनेल्स और साइटोप्लाज्मिक घटकों को गोली नहीं रखना चाहिए, इसलिए उन्हें सुपरनैंट में रहना चाहिए।
    4. सुपरनैंट को डिजेंट करें, गोली को परेशान न करने के लिए सावधान रहें।
    5. एनएलबी के 250 माइक्रोन का उपयोग करके गोली को फिर से खर्च करें (5 एमएल के लिए 0.5 प्रोटीज़ अवरोधक टैबलेट ताजा जोड़ें)।
      नोट: लक्ष्य महत्वपूर्ण सामग्री हानि के बिना एनएलबी की एक न्यूनतम राशि में नाभिक को फिर से खर्च करना है। क्योंकि एनएलबी बहुत चिपचिपा है और छर्रों में बड़ी मात्रा में अघुलनशील मलबे होते हैं, पिपेट करना बहुत मुश्किल होता है और पिपेट युक्तियों के अंदर से चिपक जाता है। इस कारण से, जब भी संभव हो, एक ही पिपेट टिप का पुन: उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। यदि एक पिपेट टिप में अवशिष्ट सामग्री से संबंधित है, तो बस टिप के उद्घाटन पर सामग्री एकत्र करने के लिए गुरुत्वाकर्षण की अनुमति देने के लिए ~ 1 मिनट के लिए शेल्फ या रैक से पिपेट लटकाएं। छर्रों को फिर से खर्च करने के लिए आक्रामक रूप से पिपेट न करें। इसके बजाय, पिपेट टिप का उपयोग हलचल रॉड के रूप में करें जब तक कि पैलेट सामग्री को पिपेट टिप में नहीं किया जा सकता है। यानी, बड़े गोली झुरमुटों के लिए इस स्तर पर रहना पूरी तरह से ठीक है जब तक कि इसे पिपेट टिप में खींचा जा सकता है।
    6. भंवर अधिकतम पर 15 एस समरूप और आंशिक रूप से सामग्री को फिर से खर्च करने के लिए । 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए Sonicate, तो -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
      नोट: बाद के चरणों के लिए, ध्यान रखें कि एनएलबी जोड़े गए की कुल राशि 250 माइक्रोन है, लेकिन नमूने की कुल स्पष्ट मात्रा अघुलनशील मलबे के कारण दो गुना तक हो सकती है। नमूना जमे हुए है और नाभिक के lysis में सहायता करने के लिए गल गया है ।
  4. नाभिक लाइसिस और हिस्टोन निष्कर्षण (~ 4 एच)
    1. गल नमूने में 5% जीडीएन बफर का 750 माइक्रोन जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए Sonicate ।
    2. नमूना को एक 2 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम स्पिन करें।
      नोट: सुपरनैंट की संभावना हरे रंग की दिखेगी। निम्नलिखित क्रोमेटोग्राफी चरणों को प्रोटीन से अधिकांश वर्णक को हटा देना चाहिए।
    3. स्टेप 3.4.1 और 3.4.2 पर इंतजार करते हुए, आयन एक्सचेंज क्रोमेटोग्राफी के लिए कॉलम तैयार करें। सतह पर संदूषण को कम करने के लिए 2 एमएल एसीटोनिट्रिल और 4 एमएल पानी के साथ क्रोमेटोग्राफी कॉलम कुल्लाएं।
    4. क्रोमेटोग्राफी कॉलम पर WCX राल (5% जीडीएन बफर के साथ पूर्व-वातानुकूलित) के 200 ~ 300 माइक्रोन लोड करें। राल को व्यवस्थित होने दें। 5% जीडीएन बफर के 1 एमएल के साथ चार बार धोएं। बाकी शुद्धिकरण चरणों के लिए बर्फ पर ट्यूब और कॉलम रखें।
    5. क्रोमेटोग्राफी कॉलम को 2 एमएल कलेक्शन ट्यूब पर रखें। राल को बाधित किए बिना धीरे-धीरे राल बिस्तर पर कदम 3.4.2 से सुपरनेट लोड करें (धीरे-धीरे ट्यूबों के किनारे से छोड़ने की कोशिश करें)। समाधान को गुरुत्वाकर्षण के माध्यम से प्रवाहित होने दें। जैसा कि समाधान के माध्यम से बह रहा है, राल के लिए अधिकतम बाध्यकारी अनुमति देने के लिए कॉलम के शीर्ष पर वापस एल्यूंट लोड करें। इसके बाद एलेंट को त्याग दें।
    6. कॉलम से गैर-हिस्टोन प्रोटीन धोने के लिए 5% जीडीएन बफर के 2 एमएल लोड करें। एलेंट को त्याग दें।
    7. 1 मिलील 20% जीडीएन बफर के साथ एल्यूट हिटोन। एल्यूंट को इकट्ठा करें, जिसमें हिस्टोन प्रोटीन होता है।
    8. चरण 3.4.6 से एलुएंट को डीसाल्ट करने के लिए 3 केडीए आणविक वजन कट ऑफ (MWCO) स्पिन फिल्टर (0.5 एमएल) का उपयोग करें। उपयोग से पहले, लोड 500 माइक्रोन वॉश सॉल्वेंट (3% एसीएन में 0.2% फॉरमिक एसिड) और फिल्टर को साफ करने के लिए इसे दो बार स्पिन करें।
      नोट: समय बचाने के लिए राल क्रोमेटोग्राफी चरणों का प्रदर्शन करते समय MWCO फिल्टर धोने शुरू करने की सिफारिश की जाती है। निम्नलिखित स्पिन फ़िल्टर चरण ~ 3-4 घंटे लेते हैं।
    9. पहले लोड 500 माइक्रोन हिस्टोन नमूना, ~ 25 मिनट के लिए 14,000 x ग्राम पर स्पिन करने के लिए मात्रा को कम करने के लिए ~ 100 μL। फिर ~ 25 मिनट के लिए फिर से 14,000 x ग्राम पर नमूना और स्पिन का एक और 400 μL लोड करें। सैंपल के अंतिम 100 माइक्रोन लोड करें, 300 माइक्रोन वॉश सॉल्वेंट के साथ सैंपल ट्यूब को खंगाल लें और सॉल्वेंट को फिल्टर में लोड करें। ~ 25 मिनट के लिए फिर से 14,000 x ग्राम पर स्पिन करें।
    10. लोड 400 μL धोने विलायक, ~ 25 मिनट के लिए 14, 000 x ग्राम पर स्पिन ~ 100 μL या उससे कम करने के लिए मात्रा को कम करने के लिए। प्रत्येक चक्र नमक एकाग्रता को एक-पांचवें से कम कर देता है। एक और तीन चक्रों के लिए दोहराएं ~ 0.01% करने के लिए ग्वानीडीन एकाग्रता लाने के लिए। फिल्टर को एक साफ संग्रह ट्यूब में रिवर्स करें और 2 मिनट के लिए 1,000 x ग्राम पर स्पिन करें। विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस पर शुद्ध हिस्टोन नमूने को बचाएं।
      नोट: उच्च एकाग्रता प्राप्त करने के लिए नमूना मात्रा को कम करने के लिए अंतिम चरण में लंबे समय तक (30-40 मिनट) स्पिन करने की सिफारिश की जाती है। मात्रा 50-70 माइक्रोन तक जाने में सक्षम होना चाहिए।

4. शुद्ध हिटोन के मास स्पेक्ट्रोमेट्री

  1. तरल क्रोमेटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) डेटा अधिग्रहण
    1. निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए बिसिनकोनिक एसिड (बीसीए) परख द्वारा प्रोटीन एकाग्रता का अनुमान लगाएं।
      नोट: बीसीए केवल कुल प्रोटीन एकाग्रता का अनुमान प्रदान कर सकता है, लेकिन हिस्टोन शुद्धि की गुणवत्ता नहीं। यदि हिस्टोन शुद्धिकरण की गुणवत्ता की जांच के लिए एमएस इंस्ट्रूमेंटेशन आसानी से उपलब्ध नहीं है, तो पश्चिमी दाग का उपयोग किया जा सकता है। उलट-चरण एलसी के साथ मिलकर 210 एनएम पराबैंगनी अवशोषण का पता लगाने के रूप में हमारी पिछली रिपोर्ट में वर्णित भी20इस्तेमाल किया जा सकता है। क्रोमेटोग्राम की तुलना नमूना गुणवत्ता की जांच के लिए एक ज्ञात मानक के साथ की जा सकती है। हालांकि, विभिन्न जीवों में अलग-अलग एल्यूशन प्रोफाइल हो सकते हैं। इसलिए, समान जीवों से हिस्टोन मानकों का उपयोग करना अत्यधिक अनुशंसित है।
    2. C18 उलट चरण (आरपी) विश्लेषणात्मक कॉलम (उदाहरण के लिए, 3 माइक्रोन 300 Å, कनेक्ट करें, कॉलम आंतरिक व्यास 75 माइक्रोन, बाहरी व्यास 360 माइक्रोन, लंबाई 70 सेमी) और एक C18 ट्रैप कॉलम (उदाहरण के लिए, 3.6 माइक्रोन, कॉलम आंतरिक व्यास 150 माइक्रोन, बाहरी व्यास 360 माइक्रोन, लंबाई 5 सेमी) एक दोहरे पंप नैनोफ्लो तरल क्रोमेटोग्राफी सिस्टम (जैसे, जल, नैनोक्ैक्टी)। बाइनरी सॉल्वैंट्स ए हैं: पानी में 0.1% फॉर्मिक एसिड, और बी: एसीटोनीट्रिल में 0.1% फोर्मिक एसिड।
      नोट: दोहरी पंप एलसी एक वॉश पंप और एक ढाल पंप भी शामिल है । दोनों पंप प्रत्येक विश्लेषण में दो चरणों से गुजरते हैं- विश्लेषणात्मक चरण के बाद एक ट्रैपिंग चरण। ट्रैपिंग चरण में, वॉश पंप जाल कॉलम में बहता है और ढाल पंप विश्लेषणात्मक कॉलम में बहता है। विश्लेषणात्मक चरण में, जाल कॉलम विश्लेषणात्मक कॉलम के साथ मिलकर होता है, और ढाल पंप दोनों स्तंभों में बहता है। इसके बाद वॉश पंप कचरे में चला जाता है।
    3. ट्रैपिंग चरण: जाल कॉलम पर पहले लोड 1-2 माइक्रोन के लिए एलसी विधि सेट करें। 10 मिनट के लिए 3 μL/min 5% सॉल्वेंट बी पर वॉश पंप द्वारा नमूना Desalt । समतुल्यता के लिए एनालिटिकल पंप को 0.3 माइक्रोन/न्यूनतम 5% सॉल्वेंट बी पर सेट करें।
    4. विश्लेषणात्मक चरण: ढाल पंप (0.3 μL/मिनट) सेट करने के लिए 5% बी और रैंप से 15 मिनट में 30% से शुरू करते हैं । फिर, अंत में 95% बी तक उच्च कार्बनिक वॉश से पहले 100 मिनट पर 41% बी तक बढ़ाएं।
      नोट: ढाल अलग कॉलम पर विभिन्न प्रतिधारण प्रोफाइल के आधार पर अनुकूलित किया जा सकता है। आमतौर पर, पूर्ण लंबाई हिंगटन निर्दिष्ट एलसी शर्तों पर 30%-40% बी के आसपास elute। अधिक हिस्टोन प्रोटेरोफॉर्म पर कब्जा करने के लिए एमएस 2 स्पेक्ट्रा की संख्या बढ़ाने के लिए लंबे ढाल का उपयोग किया जा सकता है।
    5. इलेक्ट्रॉन ट्रांसफर डिसोसिएशन (ईटीडी) क्षमता के साथ एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन एमएस (जैसे, थर्मो ऑर्बिटरप फ्यूजन लुमोस या इसी तरह) पर डेटा-निर्भर अधिग्रहण विधि सेट करें। बरकरार प्रोटीन मोड का उपयोग करें और निर्माता द्वारा सुझाए गए सभी आवश्यक अंशांकनों का प्रदर्शन करें। महत्वपूर्ण मापदंडों को नीचे वर्णित किया गया है। ये इस्तेमाल किए गए यंत्र के लिए विशिष्ट होंगे।
      1. एमएस1: स्कैन रेंज 600-2,000 मीटर/जेड, संकल्प 120k (एम/जेड २०० पर), 4 माइक्रोस्कैन, एजीसी लक्ष्य 1E6, अधिकतम इंजेक्शन ५० एमएस ।
      2. MS2: संकल्प 120k; 1 माइक्रोस्कैन; AGC लक्ष्य 1E6; डेटा निर्भर एमएस/एमएस: बारी ईटीडी (25 एमएस रिएक्शन टाइम, मैक्स इंजेक्शन टाइम 500 एमएस) और हायर-एनर्जी टक्कर डिसिसिएशन (एचसीडी, 28% नॉर्मलाइज्ड टक्कर ऊर्जा के साथ ±5% स्टेप्ड एनर्जी, मैक्स इंजेक्शन टाइम 100 एमएस); 0.6 डीए की अलगाव खिड़की; उच्चतम प्रभार वाले राज्यों पर प्राथमिकता ।
      3. गतिशील बहिष्कार: 120 एस समय खिड़की, ±0.7 दा मास विंडो। 5 से कम चार्ज राज्यों और अनिर्धारित शुल्क वाले राज्यों को बाहर करें ।
    6. वास्तविक नमूनों को चलाने से पहले, सिस्टम को बराबरी और जांचने के लिए नए स्तंभों पर पेप्टाइड या हिस्टोन मानकों के कुछ इंजेक्शन चलाएं। बड़ी संख्या में नमूनों को चलाने के लिए, ले जाने को कम करने के लिए नमूनों के बीच में छोटे रिक्त स्थान या वॉश जोड़ें। कॉलम अगले नमूने से पहले शुरुआती स्थिति (5% विलायक बी) पर 15-20 मिनट के लिए समान रूप से पेश आने दें।
      नोट: एमएस 2 के लिए लंबे एलसी ग्रेडिएंट और उच्च अधिकतम इंजेक्शन समय अधिक हिस्टोन प्रोटियोफॉर्म की पहचान करने के लिए स्पेक्ट्रल गुणवत्ता में सुधार कर सकते हैं।
  2. एलसी-एमएस डेटा प्रोसेसिंग और प्रोटेफॉर्म पहचान
    1. जेजीआई (https://genome.jgi.doe.gov) या यूनिप्रोट (https://www.uniprot.org/) से फास्टा प्रारूप में (ज्वार) प्रोटीन अनुक्रम प्राप्त करें।
    2. साधन कच्चे डेटा फ़ाइलों (*.raw) को mzML प्रारूप में परिवर्तित करने के लिए MSConvert21 (http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtml) का उपयोग करें।
    3. डेटा प्रोसेसिंग के लिए टॉपपिक सुइट22 (http://proteomics.informatics.iupui.edu/software/toppic/) डाउनलोड करें। कार्यक्रम को कमांड लाइन में या ग्राफिकल इंटरफेस के माध्यम से चलाया जा सकता है।
    4. स्टेप 4.2.2 से एमजेडएमएल फाइल से स्पेक्ट्रा को डिकोवोल्यूट करने के लिए टॉपपिक सुइट में टॉपएफडी का उपयोग करें। डिफ़ॉल्ट मापदंडों का उपयोग किया जा सकता है। लेकिन "अग्रदूत खिड़की" (-w) को 1 मीटर/z तक कम करने की जरूरत है क्योंकि एक संकीर्ण अलगाव खिड़की का उपयोग किया जाता है ।
    5. प्रोटेफॉर्म की पहचान करने के लिए टॉपपिक सुइट में टॉपपिक का इस्तेमाल करें। अधिकांश डिफ़ॉल्ट मापदंडों का उपयोग किया जा सकता है। स्पेक्ट्रम और प्रोटेफॉर्म कटऑफ प्रकार को एफडीआर (झूठी खोज दर) पर सेट करें और कटऑफ वैल्यू को 0.01 (1% एफडीआर) या वांछित के रूप में सेट करें। 5 (डाल्टन) के लिए "प्रोटेफॉर्म त्रुटि सहिष्णुता" सेट करें। स्टेप 4.2.1 से फास्टा फाइल लोड करें और स्टेप 4.2.4 से "*_ms2.msalign" फाइल करें। इसके बाद तलाश शुरू करें।
      नोट: "प्रोटेरोफॉर्म त्रुटि सहिष्णुता" सेटिंग एक के रूप में समान जनता (± 5 डीए) के साथ प्रोटियोफॉर्म को संयोजित करेगी। यह प्रोटेफॉर्म काउंट में अतिरेक को कम करने में मदद करता है। हालांकि, इसका उपयोग सावधानी के साथ किया जाना चाहिए क्योंकि बड़ी सहिष्णुता प्रोटेओफॉर्म को छोटे या कोई बड़े पैमाने पर मतभेदों के साथ मर्ज करेगी। यह पैरामीटर केवल टॉपपिक संस्करण 1.3 या बाद में उपलब्ध है।
    6. पहचाने गए प्रोटियोफॉर्म की जांच "*_proteoform.csv" फ़ाइल में की जा सकती है या आउटपुट के "*_html" फ़ोल्डर के तहत टॉपव्यू मॉड्यूल का उपयोग करके कल्पना की जा सकती है।
    7. टॉपपिक का उपयोग करके ऊपर दिए गए चरणों से उत्पन्न प्रोटियोफॉर्म सूची बड़े पैमाने पर बदलाव के रूप में हिस्टोन पीटीएम को एनोटेट करती है। व्यक्तिगत पीटीएम को स्थानीयकृत करने के लिए, एक संशोधन सूची को शामिल किया जाना चाहिए। विस्तृत विवरण टॉपपिक मैनुअल में पाया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, सूचित-प्रोटेओमिक्स पैकेज23 (https://github.com/PNNL-Comp-Mass-Spec/Informed-Proteomics) का उपयोग करके पूरक डेटा विश्लेषण करने के लिए अगले चरण में आगे बढ़ें।
    8. निर्देशों का पालन करें और एक PBF फ़ाइल करने के लिए साधन कच्चे डेटा को बदलने के लिए PbfGen मॉड्यूल का उपयोग करें। फिर एक ms1ft फ़ाइल (फीचर सूची, प्रत्येक सुविधा द्रव्यमान और प्रतिधारण समय के एक अद्वितीय संयोजन का प्रतिनिधित्व करता है) आउटपुट करने के लिए प्रोमेक्स मॉड्यूल का उपयोग करके MS1 डेटा को विघटित करें।
    9. स्टेप 4.2.6 में टॉपपिक से पहचाने गए प्रोटीन सूची का उपयोग करके सूचित-प्रोटेओमिक्स के लिए एक केंद्रित फास्टा बनाएं।
      नोट: बड़ी संख्या में चर पीटीएमएस के साथ सूचित-प्रोटेओमिक्स का उपयोग करके पूरे जीनोम को खोजना बेहद धीमा हो सकता है और दुर्घटनाओं का कारण बन सकता है। इसलिए, केवल लक्षित प्रोटीन को शामिल करके फास्टा के आकार को कम करने की सिफारिश की जाती है।
    10. उदाहरण फ़ाइल में प्रारूप के बाद हिस्टोन पीटीएम की खोज करने के लिए एक लक्षित संशोधन सूची बनाएं। आम पीटीएमएस में शामिल होने वाले हैं: लिसाइन एसीटाइलेशन, लिसाइन मोनो-मिथाइलेशन, लिसाइन डि-मिथाइलेशन, लिसाइन त्रि-मिथाइलेशन, सेरीन/थ्रेओनाइन/टायरोसिन फॉस्फोरिलेशन, प्रोटीन एन-टर्मिनल एसिटिलेशन, मेथिन सिस्टीन/ऑक्सीडेशन । ज्वार के लिए, प्रोटीन एन-टर्मिनल मोनो-मिथाइलेशन, डी-मिथाइलेशन, और ट्राइमेथाइलेशन जोड़ा जाना चाहिए।
      नोट: सूचित-प्रोटेओमिक्स केवल सूची में निर्दिष्ट पीटीएम की तलाश करते हैं। यदि अनिर्दिष्ट पीटीएम मौजूद हैं, तो प्रोटेओफॉर्म की पहचान नहीं की जा सकती है, या अन्य प्रोटियोफॉर्म के साथ गलत पहचान की जा सकती है। हालांकि सर्च टाइम को कम से कम करने के लिए पीटीएम लिस्ट को यथासंभव कम रखा जाना चाहिए।
    11. स्टेप 4.2.8 से फ़ाइलों का उपयोग करके प्रोटियोफॉर्म की पहचान करने के लिए एमएसपाथफाइंडर मॉड्यूल निष्पादित करें, चरण 4.2.9 से केंद्रित फास्टा, और चरण 4.2.10 से संशोधन सूची। डिफ़ॉल्ट मापदंडों का उपयोग किया जा सकता है।
    12. परिणाम सभी फ़ाइलों को लोड करके एलसीएमएसस्पेक्टर में परिणामों की कल्पना की जा सकती है।
      नोट: अन्य बायोइन्फॉर्मेटिक्स टूल्स टॉप-डाउन डेटा के प्रसंस्करण और कल्पना के लिए उपलब्ध हैं, प्रत्येक अपनी ताकत24,25,26,27, 28के साथ। ज्वार और कई अन्य जीवों डेटाबेस में हिस्टोन पीटीएम के बारे में ज्ञात जानकारी सीमित है। पीटीएम से बड़े पैमाने पर बदलाव की पहचान करने के लिए पहले टॉपपिक का उपयोग करें। यह विश्लेषण आसानी से ज्ञात और अज्ञात दोनों पीटीएम की खोज कर सकता है। फिर, पता लगाया पीटीएम को टार्पिक में पीटीएम सूची निर्दिष्ट करके या अन्य पूरक उपकरणों के साथ लक्षित फैशन में खोजा जा सकता है।

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Representative Results

प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, हिस्टन को एलसी-एमएस विश्लेषण का उपयोग करके निकाला और पहचाना जा सकता है। कच्चे डेटा और प्रसंस्कृत परिणाम परिग्रहण के माध्यम से MassIVE (https://massive.ucsd.edu/) पर उपलब्ध हैं: MSV000085770 । प्रतिनिधि नमूने (मासिव से भी उपलब्ध) से टॉपपिक परिणामों के आधार पर, हमने 303 हिस्टोन प्रोटेरोफॉर्म (106 एच2ए, 72 एच2बी, 103 एच 3, और 22 एच4 प्रोटियोफॉर्म) की पहचान की। सह-शुद्ध राइबोसोमल प्रोटियोफॉर्म का भी पता लगाया गया है, आमतौर पर एलसी में जल्दी eluting । वे आमतौर पर पहचाने गए प्रोटियोफॉर्म के ~ 20% से मिलकर बनता है, लेकिन एलसी ढाल के बाद के चरण में हिस्टोन प्रोटियोफॉर्म्स के साथ ओवरलैप नहीं होता है। परिणामों को नवीनतम टॉपपिक या सूचित-प्रोटेओमिक्स पैकेजों के साथ आसानी से कल्पना की जा सकती है। प्रदर्शन के लिए, हम सूचित-प्रोटेओमिक्स पैकेज का उपयोग करके डेटा विज़ुअलाइज़ेशन पर ध्यान केंद्रित करेंगे, जिसका उपयोग कच्चे एमएस फ़ाइलों को सीधे लोड करने और मैन्युअल रूप से प्रोटेफॉर्म पहचान की जांच करने के लिए किया जा सकता है। कृपया ध्यान दें कि दोनों सॉफ्टवेयर पैकेज विभिन्न एल्गोरिदम और मापदंडों का उपयोग करते हैं। प्रोटियोफॉर्म के रिपोर्ट किए गए नंबर एक समान नहीं होंगे। हम टॉपपिक से प्रोटेरोफॉर्म की गणना रिपोर्ट करने की सलाह देते हैं क्योंकि यह अधिक रूढ़िवादी है, और यह अज्ञात पीटीएम पर विचार करता है। सूचित-प्रोटेओमिक्स पैकेज में आसान मैनुअल सत्यापन के लिए एकीकृत डेटा प्रसंस्करण और दृश्य है। अच्छी तरह से एनोटेटेड पीटीएम वाले जीवों के लिए, हम सबसे अच्छी साइट स्थानीयकरण के लिए प्रोसाइटपीसी24 की सलाहते हैं। कई उपकरणों का उपयोग कर परिणामों के संयोजन की संख्या और प्रोटेफॉर्म पहचान के विश्वास में वृद्धि कर सकते हैं ।

सूचित-प्रोटेओमिक्स के साथ डेटा को संसाधित करने के बाद, एलसी-एमएस फीचर मैप को एलसीमस्पेक्टेटर में कल्पना की जा सकती है, जो एलसी रिटेंशन समय के खिलाफ डिकोवोल्ट प्रोटीन जनता को प्रदर्शित करता है। सॉफ्टवेयर में पहचाने गए प्रोटेकोफॉर्म्स पर क्लिक करके संबंधित फीचर को फीचर मैप में एक छोटे से हरे आयत के साथ हाइलाइट किया जाएगा । प्रमुख हिस्टोन प्रोटीन नक्शे के विशिष्ट क्षेत्रों में देखा जाना चाहिए, जो प्रयोग की सफलता को इंगित करता है । चित्रा 1a बरकरार हिटोन के एक प्रतिनिधि एलसी-एमएस फीचर मानचित्र से पता चलता है । धराशायी बक्से में पूर्ण लंबाई के हिस्टोन प्रोटियोफॉर्म हाइलाइट किए गए हैं। पता लगाया गया अधिकांश प्रोटियोफॉर्म को एमएस2 डेटा का उपयोग करके आत्मविश्वास से पहचाना जा सकता है।

चित्रा 1b H2A और H2B प्रोटेरोफॉर्म के साथ क्षेत्र के ज़ूम से पता चलता है । उनमें से अधिकांश में 42 डीए के एन-टर्मिनल संशोधन हैं। यह नाममात्र द्रव्यमान या तो ट्राइमेथाइलेशन (42.05 डीए) या एसिटिलेशन (42.01 डीए) से मेल खाता है, जो आमतौर पर हिटोन के लिए देखा जाता है। उनकी सटीक जनता केवल 0.04 डीए से भिन्न होती है और बरकरार प्रोटीन स्तर (~ 2 पीपीएम) में अंतर करना मुश्किल होता है। उच्च संकल्प एमएस2 स्पेक्ट्रा में, पीटीएमएस को आसानी से विभेदित और पुष्टि की जा सकती है क्योंकि टुकड़े29के निचले द्रव्यमान के कारण। इसके अलावा, एच2ए और एच2बी हस्टन में बहुत समान दृश्यों के साथ कई समरूप हैं जैसा कि चित्र 1बीमें विभिन्न यूनिप्रोट परिग्रहण संख्याओं द्वारा उल्लेख किया गया है। फिर, उच्च संकल्प एलसी-एमएस विश्लेषण आसानी से पहचान और उन्हें अंतर कर सकते हैं। ज्वार हिस्टन के लिए दो प्रकार के H2As की पहचान की गई थी । चित्रा 1बी में 16 केडीए एच2ए हिटोन ने हिटोन के गैर-संरक्षित क्षेत्रों में टर्मिनल पूंछ का विस्तार किया है। विस्तारित पूंछ (14 केडीए) के बिना H2A हिस्टन का एक और समूह चित्रा 1cमें देखा जा सकता है ।

एच4 हस्टन के लिए, एन-टर्मिनल एसीटिलेशन की पहचान प्रमुख पीटीएम के रूप में की गई थी। चित्रा 1डीमें सुविधाओं के बड़े पैमाने पर अंतर की जांच करके अतिरिक्त lysine एसीटिलेशन और मेथियोनिन ऑक्सीडेशन भी देखा जा सकता है। हमने एन-टर्मिनल एसिटिलेशन (चित्र 1डी में "3Ac" के ऊपर की सुविधा) के अलावा 112.9डीए का अज्ञात संशोधन भी देखा। यह संभावना है कि तैयारी में उपयोग किए जाने वाले रिएजेंट से कुछ अज्ञात एडडक्ट्स हैं। हमने पहले एच 4 पर सल्फेट आयन एडक्ट्स का पता लगाया है, जिसे हिस्टोन प्रोटीन की उच्च बुनियादीता के साथ संयुक्त अवशिष्ट लवण के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। H3 के लिए, दो प्रोटीन दृश्यों की पहचान H3.3 और H3.2(चित्रा 1e)थे । यद्यपि ये दो प्रोटीन दृश्य केवल 4 अवशेषों (32, 42, 88 और 91) में भिन्न होते हैं, फिर भी दोनों आयामों, द्रव्यमान और प्रतिधारण समय में अलगाव के आधार पर उन्हें एलसी-एमएस में आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। एच 3 प्रोटीन मिथाइलेशन और एसिटिलेशन की डिग्री को अलग-अलग करके भारी संशोधित किया जाता है। संशोधन की उच्च डिग्री आसानी से सुविधा नक्शे में घने, समानांतर लाइनों, जो 14 डीए के अलावा कर रहे है द्वारा कल्पना की जा सकती है । हालांकि, तीन मिथाइलेशन समूहों (14 * 3 दा) में एक एसिटिलेशन (42 डीए) के बराबर नाममात्र द्रव्यमान है। क्योंकि इन पीटीएम को अक्षुण्ण प्रोटीन स्तर पर आसानी से हल नहीं किया जा सकता है, इसलिए उन्हें "मिथाइल समकक्ष" (यानी 14 डीए के गुणकों; एक एसीटिलेशन तीन मिथाइल समकक्ष के बराबर होता है) के रूप में संदर्भित किया जाता है । चित्रा 1eमें, एच 3 प्रोटियोफॉर्म को उनके अक्षुण्ण द्रव्यमान के आधार पर मिथाइल समकक्ष के रूप में लेबल किया जाता है। आरपीएलसी अलगाव के सीमित संकल्प के कारण, कई अलग-अलग एच 3 प्रोटेओफॉर्म एक ही स्पेक्ट्रम में सह-eluting और खंडित होने की संभावना है। यहां प्रस्तुत विधि केवल मिथाइलेशन और एसिटिलेशन के सबसे प्रचुर संयोजनों की पहचान करेगी जैसा कि चित्र 2में दर्शाया गया है । एच 3 के अधिक व्यापक लक्षण वर्णन के लिए, अधिक लक्षित विश्लेषण अभी भी30,31की आवश्यकता है।

Figure 1
चित्रा 1: ज्वार के पत्तों से निकाले गए बरकरार हिटोन पर एलसी-एमएस फीचर मैप। यह आंकड़ा सभी पता लगाया प्रोटियोफॉर्म के लिए आणविक द्रव्यमान बनाम एलसी प्रतिधारण समय (मिनटों में) दिखाता है। लॉग बहुतायत शीर्ष नक्शे के बगल में रंग पैमाने (लॉग 10 बहुतायत) द्वारा दिखाया गया है। (क)प्रमुख हिस्टोन चोटियों को धराशायी बक्से द्वारा लेबल किया जाता है । बक्से के बाहर सुविधाओं के अधिकांश हिटोन और राइबोसोमल प्रोटीन काट रहे हैं । हिस्टन के प्रत्येक समूह के लिए ज़ूम-इन विचार:(ख)एच2बी और 16 केडीए एच2ए,(ग)एच 3,(घ)14 केडीए एच2ए, और(ई)एच 3। यूनिप्रॉट परिग्रहण संख्या प्रत्येक सुविधा के साथ नोट की जाती है, जिसके बाद पता लगाया गया पीटीएमएस । "एसी", "मुझे", "+O" क्रमशः एसीटिलेशन, मिथाइलेशन और ऑक्सीकरण का संकेत देता है। (ख)में, दो कटे हुए H2A C5YZA9 प्रोटेरोफॉर्म लेबल किए गए हैं, जिनमें एक या दो सी-टर्मिनल एलेनिन काटा गया था (-ए *, और -एए *) के रूप में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

एमएसपाथफाइंडर का उपयोग करके और एलसीएमएसस्पेक्टेटर में कल्पना का उपयोग करके चित्र 2 में प्रोटियोफॉर्म पहचान का एक प्रतिनिधि उदाहरण दिखाया गया है। चित्रा 2a में विखंडन स्पेक्ट्रम ईटीडी का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था, जो प्रोटीन बैकबोन के साथ सी और जेड प्रकार आयनों की पैदावार करता है। एक ही अग्रदूत के HCD पहचान को मान्य करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन HCD आम तौर पर सीमित अनुक्रम कवरेज20प्रदान करता है । पिछले और अगले MS1 स्पेक्ट्रा में अग्रदूत आयनों को चित्र 2बी, सीमें दिखाया गया है, जिसमें उनके मिलान आइसोटोप चोटियों को बैंगनी रंग में हाइलाइट किया गया है। चित्रा 2डी में अनुक्रम कवरेज मानचित्र किसी भी संभावित पीटीएम को स्थानीय बनाने में मदद कर सकता है। एक उच्च आत्मविश्वास पहचान के अधिकांश टुकड़े मिलान, अग्रदूत आयन मिलान, और अच्छा अनुक्रम कवरेज के लिए PTMs स्थानीयकरण में मदद करनी चाहिए । इस उदाहरण में, एक एच 3.2 प्रोटियोफॉर्म की पहचान दो पीटीएमएस-डी-मेथिलेशन ऑन K9 और मेथिलेशन के साथ K27 पर की गई थी। इसी विधि के बाद, विभिन्न पीटीएम और टर्मिनल ट्रंकेशन के साथ अन्य प्रोटियोफॉर्म को मैन्युअल रूप से मान्य किया जा सकता है।

Figure 2
चित्रा 2: एक पहचाने गए हिस्टोन एच3.2 प्रोटियोफॉर्म का प्रतिनिधि उदाहरण। एच 3.2 ने पिछले एमएस1 स्पेक्ट्रम में अपने(ए)ईटीडी स्पेक्ट्रम,(बी)अग्रदूत आयन, अगले एमएस1 स्पेक्ट्रम में(ग)अग्रदूत आयन और(घ)अनुक्रम कवरेज मानचित्र के साथ प्रीटियोफॉर्म किया। एन-टर्मिनस से सी आयन सियान में लेबल किए जाते हैं, और सी-टर्मिनस से जेड आयन गुलाबी रंग में होते हैं। दो पीटीएम की पहचान की गई और उनके बड़े पैमाने पर बदलाव के साथ पीले रंग में(घ)में प्रकाश डाला गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पता लगाया हिस्टोन प्रोटेओफॉर्म की मात्रात्मक तुलना संभावित एपीजेनेटिक मार्कर प्रकट कर सकते हैं । हमने इस प्रोटोकॉल को पहले क्षेत्र से एकत्र किए गए 48 ज्वार के नमूनों पर लागू किया है ("इस अध्ययन में अतिरिक्त अवरोधकों" का उपयोग नहीं किया गया)29. ज्वार के दो अलग-अलग जीनोटाइप की तुलना पूर्व-फूल या फूलों के बाद सूखे के जवाब में की गई थी। प्रोटियोफॉर्म्स की सापेक्ष बहुतायत की तुलना करके, हमने कटे हुए हिस्टोन प्रोटियोफॉर्म के कुछ दिलचस्प बदलावों की खोज की जो चित्र 3में दिखाए गए नमूने की स्थितियों के लिए विशिष्ट हैं। कुछ नमूनों (चित्र 3ए, बी)के लिए केवल 3 और 9 सप्ताह मेंएच4का सी-टर्मिनल ट्रंकेशन मनाया गया था। H3.2 के लिए, एन-टर्मिनल कटिंग प्रोटियोफॉर्म आम तौर पर 10 सप्ताह(चित्रा 3सी, डी)में अधिक प्रचुर मात्रा में थे। इसके विपरीत, सी-टर्मिनल कटगिर एच 3.2 पहले के समय अंक(चित्रा 3c) में देखा जाता है। इससे भी महत्वपूर्ण बात, दो जीनोटाइप सटीक उसी तरह से जवाब नहीं दिया । आरटीएक्स430(चित्रा 3बी)की तुलना में BTx642 में एच4 सी-टर्मिनल कटिंग प्रोटेरोफॉर्म काफी अधिक प्रचुर मात्रा में थे। इस तरह के डेटा संयंत्र के विकास और तनाव सहिष्णुता के संभावित एपीजेनेटिक मार्कर का पता चलता है कि आगे अंय तकनीकों के साथ परीक्षण किया जा सकता है ।

Figure 3
चित्र 3: हिस्टोन प्रोटियोफॉर्म की मात्रात्मक तुलना। (क)विभिन्न नमूनों में हिस्टोन एच4 प्रोटेरोफॉर्म का हीटमैप । प्रत्येक प्रोटेरोफॉर्म के लिए, ऊपर-नीचे एमएस डेटा से निकाली गई बहुतायत को प्रत्येक विश्लेषण में सभी पहचाने गए एच 4 प्रोटियोफॉर्म के योग में सामान्यीकृत किया गया था, जो "सापेक्ष बहुतायत" का परिणाम था। मान तो प्रत्येक पंक्ति के अधिकतम करने के लिए बेहतर कम बहुतायत प्रोटेओफॉर्म में परिवर्तन दिखाने के लिए पहुंचा रहे थे । स्केल्ड सापेक्ष बहुतायत को हीटमैप के तल पर रंग कुंजी में चिह्नित किया गया है। क्षैतिज धुरी पर विकास की स्थिति का उल्लेख किया जाता है (पूर्व: पूर्व-फूल सूखा, पोस्ट: पोस्ट-फ्लावरिंग सूखा)। तीन प्रतिकृति को एक साथ समूहित किया जाता है और अन्य स्थितियों से काले ऊर्ध्वाधर धारियों से अलग किया जाता है। तारक के साथ लेबल नमूनों के लिए, केवल तकनीकी प्रतिकृति का अधिग्रहण किया गया । प्रोटियोफॉर्म को ऊर्ध्वाधर धुरी पर दर्शाया जाता है, प्रारूप में "अवशेषों को शुरू करना - अवशेषों को समाप्त करना: द्रव्यमान; ख्यात संशोधन "। (ख)कटे हुए एच4 प्रोटेरोफॉर्म 2-99 (बोल्ड इन(क)में हाइलाइट किए गए प्रोटियोफॉर्म्स की सापेक्ष बहुतायत प्लॉट विभिन्न परिस्थितियों में अभिव्यक्त की जाती है । प्रतीकों की कुंजी शीर्ष-दाएं कोने में किंवदंती में दिखाई गई है। त्रुटि सलाखों के बीच में भरे डॉट्स औसत मान हैं। (ग)एच 3.2 प्रोटियोफॉर्म्स केहीटमैप और सभी चिन्हित एन-टर्मिनल कटने वाले एच 3.2 के लिए बहुतायत भूखंड को एच 4 के लिए समान प्रारूप में दिखाया गया है। 8 केडीए से छोटे प्रोटियोफॉर्म(सी)को सादगी के लिए छोड़ दिया गया था। एन-टर्मिनल और सी-टर्मिनल ने एच3.2 प्रोटियोफॉर्म्स को काट दिया, जिसमें विकास की स्थिति में विभिन्न प्रतिक्रियाएं दिखाई दीं । रेफरी29से ELSEVIER से अनुमति के साथ फिर से मुद्रित । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

प्रस्तुत प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे ज्वार के पत्ते (या अधिक आम तौर पर संयंत्र पत्ती) नमूनों से हिटोन निकालने के लिए । औसत हिस्टोन उपज 2-20 माइक्रोन प्रति 4-5 ग्राम ज्वार पत्ती सामग्री होने की उम्मीद है। एलसी-एमएस (ज्यादातर हिस्टोन ~ 20% रिबोसोमल प्रोटीन संदूषण के साथ) द्वारा डाउनस्ट्रीम हिस्टोन विश्लेषण के लिए सामग्री पर्याप्त रूप से शुद्ध हैं। कम उपज नमूना विविधताओं, या प्रोटोकॉल भर में संभावित कुप्रबंधन/विफलताओं के कारण प्राप्त किया जा सकता है । नाभिक लाइसिस कदम से पहले नाभिक की अखंडता को बनाए रखना महत्वपूर्ण है; इसलिए, एनएलबी जोड़ने से पहले आक्रामक भंवर और पाइपिंग से बचा जाना चाहिए। इसके अलावा, छर्रों से सुपरनेटेंट को हटाने पर नाभिक का नुकसान हो सकता है। पाइपिंग करते समय छर्रों को बाधित न करने के लिए सावधानी बरती जानी चाहिए। 1% की ट्राइटन एक्स-100 एकाग्रता को गैर-लक्षित ऑर्गेनेल्स को चुनिंदा रूप से लवित करने के लिए अनुकूलित किया गया था, लेकिन नाभिक (चरण 3.2) नहीं। अन्य ऊतकों या जीवों के लिए इष्टतम डिटर्जेंट एकाग्रता अलग हो सकती है और इसे प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित करने की आवश्यकता होती है। निस्पंदन प्रक्रिया के दौरान सुपरनैंट का रंग परिवर्तन क्लोरोप्लास्ट की अक्षम रिहाई या पत्ती के अपर्याप्त पीसने जैसे संभावित मुद्दों का संकेत दे सकता है। यदि संभव हो, तो प्रोटोकॉल को और अनुकूलित करने के लिए हर कदम के बाद क्लोरोप्लास्ट के लाइसिस और बरकरार नाभिक की अवधारण की जांच करने के लिए माइक्रोस्कोप का उपयोग करें (विशेष रूप से यदि अन्य ऊतकों या पौधों के लिए प्रोटोकॉल को संशोधित करते हैं)। इस प्रोटोकॉल केवल ज्वार पत्ती ऊतक के साथ परीक्षण किया गया है। यह मिट्टी से हस्तक्षेप के कारण ज्वार जड़ ऊतक की संभावना के लिए काम नहीं करता है। अन्य पौधों के पत्ते के ऊतकों के लिए आवेदन का परीक्षण नहीं किया गया है और विभिन्न पौधों के लिए आवेदन अतिरिक्त अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। ChIP-seq अनुप्रयोगों के लिए नाभिक अलगाव प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने के लिए, चरण 3.3.4 (एनएलबी का उपयोग करने से पहले) के बाद एक अतिरिक्त सुक्रोज रेडिएंट घनत्व पृथक्करण को साइटोप्लाज्मिक संदूषण को कम करने की सलाह दी जाती है। व्यापक सफाई कदमों के कारण, अवशिष्ट गैर-नाभिक सामग्रियों की छोटी मात्रा एलसी-एमएस में हिस्टोन विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण हस्तक्षेप का कारण बनने की उम्मीद नहीं है और इसे गोली के साथ छोड़ा जा सकता है।

फॉस्फेटे अवरोधकों (जैसे, फॉसस्टॉप) की वाणिज्यिक गोलियों का उपयोग करते समय कई प्रारंभिक परीक्षण विफल हो गए। जब गोलियों का उपयोग निष्कर्षण बफर में किया गया था तो चरण 3.1.6 में सुपरनैंट तीव्र हरे रंग के दिखाई दिए। अंतिम अर्क में पहचाने गए हिटोन की कम संख्या दिखाई गई । हमें संदेह है कि गोलियों में मालिकाना तत्वों ने चरण 3.4 से पहले नाभिक लाइसिस का कारण बन सकता है, जिससे समग्र हिस्टोन उपज कम हो सकती है। विफलता का एक और संभावित कारण आयन एक्सचेंज राल (चरण 3.4) के साथ हिस्टोन शुद्धिकरण चरण में अवयवों की असंगति है। हमने इस प्रोटोकॉल का उपयोग 150 नमूनों पर बाद में एलसी-एमएस के लिए उच्च शुद्धता हिटोन निकालने के लिए किया है। औसतन, हम "अतिरिक्त अवरोधकों" (अप्रकाशित डेटा) का उपयोग किए बिना उच्च उपज प्राप्त करने में सक्षम थे। इसलिए, अन्य उद्देश्यों के लिए इस प्रोटोकॉल को संशोधित या अनुकूल बनाते समय नए अवरोधकों का सावधानी से परीक्षण करने की सलाह दी जाती है। यदि फॉस्फोरिलेशन रुचि का नहीं है, तो फास्फेटे अवरोधकों को निष्कर्षण बफ़र्स में छोड़ा जा सकता है।

3.4 में कदम 3-4 घंटे या उससे अधिक ले जा सकते हैं। 2 दिनों में प्रोटोकॉल को तोड़ने की सिफारिश की जाती है- नाभिक गोली को चरण 3.3 से फ्रीज करें और 2 दिन (या बाद में) शुद्धि करें। फ्रीज-गल चक्र आंशिक रूप से नाभिक लाइसिस में मदद कर सकता है। MWCO फिल्टर कदम (3.4.7) बहुत समय लेने वाली हो सकती है लेकिन समानांतर में कई नमूने तैयार करके आसानी से बढ़ाया जा सकता है। चरण 3.4 में प्रोटीज अवरोधक गोलियां न जोड़ें। कई वाणिज्यिक गोलियों में भराव के रूप में पॉलीमर (जैसे, पॉलीथीन ग्लाइकोल) होते हैं, जो एलसी-एमएस विश्लेषण में हस्तक्षेप करेंगे। इस चरण में, अधिकांश अन्य प्रोटीन को हटा दिया जाना चाहिए था या विकृत किया जाना चाहिए था, इसलिए एंजाइम अवरोधक महत्वपूर्ण नहीं हैं। हालांकि, गिरावट को कम करने के लिए नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस या जमे हुए रखना अभी भी आवश्यक है।

इस प्रोटोकॉल के बाद, हिटोन को ज्वार के पत्तों से सफलतापूर्वक निकाला जा सकता है। हिस्टोन पीटीएम को एलसी-एमएस के साथ चित्रित किया जा सकता है। इस विधि को विभिन्न जैविक नमूनों (उदाहरण के लिए विभिन्न जीनोटाइप, विभिन्न परिस्थितियों में उगाए गए पौधों, विभिन्न परिस्थितियों आदि) के बीच हिस्टोन पीटीएम की तुलना करने के लिए बड़े पैमाने पर अध्ययनों पर लागू किया जा सकता है,जैसा कि चित्र 3 में उदाहरण डेटा द्वारा दिखाया गया है। हालांकि, डेटा प्रोसेसिंग के लिए अभी भी आत्मविश्वास से प्रोटियोफॉर्म असाइन करने के लिए व्यापक मैनुअल विश्लेषण की आवश्यकता होती है, खासकर अप्रत्याशित (या उपन्यास) पीटीएमएस के लिए। बायोइन्फॉर्मेटिक्स टूल्स में नए विकास से कार्यप्रवाह को स्वचालित करने और बड़े पैमाने पर अध्ययनों के लिए थ्रूपुट में काफी वृद्धि होने का अनुमान है। एक और सीमा यह है कि शीर्ष-नीचे एमएस विधि, वर्तमान में, आसानी से हाइपर-संशोधित H3 (जैसे, मोनो/di/tri-metlylation और acetylation के कई साइटों) के कई प्रोटेओफॉर्म में अंतर नहीं कर सकते । सिंगल डायमेंशन रिवर्स-फेज एलसी अलग-अलग एच3 प्रोटेओफॉर्म को पूरी तरह से अलग नहीं कर सकता। इसलिए, H3 के MS2 स्पेक्ट्रा में आम तौर पर कई प्रोटियोफॉर्म से टुकड़े होंगे और आसानी से और आत्मविश्वास से अवगत नहीं हो सकते हैं। नीचे-ऊपर या मध्य-नीचे विधियों के साथ ऊपर-नीचे संयोजन30,32,33 हिस्टोन एच 3 के लक्षण वर्णन के लिए विशेष रूप से फायदेमंद हो सकता है। वैकल्पिक रूप से, बहु-आयामी पृथक्करण कोऊपर-नीचे एमएस 34,35, 36की गहराई में सुधार करने के लिए माना जासकताहै।

एलसी-एमएस द्वारा हिस्टोन पीटीएम प्रोफाइलिंग क्रोमेटिन संशोधक डिजाइन करने और गंभीर पर्यावरणीय स्थितियों के लिए पौधों के लचीलेपन में सुधार करने के लिए उपन्यास एपिजेनेटिक मार्कर की खोज में सक्षम बनाता है। दो खेती से ज्वार का उपयोग करने वाले और क्षेत्र में सूखे की स्थिति में उगाए गए एक प्रायोगिक अध्ययन से पता चला है कि पत्ती में चुनिंदा हिस्टोन टर्मिनल क्लिपिंग सूखे की वृद्धि और पौधों के विकाससे संबंधितहो सकती है । पहचाने गए हिस्टोन मार्कर पूरक तकनीकों जैसे चिप-एसईक्यू द्वारा लक्ष्य के रूप में काम कर सकते हैं। इन पूरक तकनीकों से प्राप्त एपिजेनेटिक कारकों की व्यापक समझ पर्यावरणीय परिवर्तनों के प्रत्युत्तर में फसलों के अभिनव समाधानों को इंजीनियरिंग के लिए अपरिहार्य होगी ।

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Disclosures

कोई नहीं।

Acknowledgments

हम बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री प्रयोगों के साथ मदद करने के लिए रोनाल्ड मूर और थॉमस फिलमोर को धन्यवाद देते हैं, और डेटा जमाव के लिए मैथ्यू मुनरो। इस शोध को अमेरिकी कृषि विभाग (यूएसडीए) से पुरस्कार संख्या DE-SC0014081 के तहत ज्वार (EPICON) परियोजना में सूखे की प्रतिक्रिया के एपिजेनेटिक नियंत्रण के माध्यम से अमेरिकी ऊर्जा विभाग (डीओई) जैविक और पर्यावरण अनुसंधान से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था; CRIS 2030-21430-008-00D), और संयुक्त जैव ऊर्जा संस्थान (जेबीई) के माध्यम से, एक सुविधा डो (अनुबंध DE-AC02-05CH11231) लॉरेंस बर्कले राष्ट्रीय प्रयोगशाला और डो के बीच द्वारा प्रायोजित । अनुसंधान पर्यावरण आणविक विज्ञान प्रयोगशाला (EMSL) (grid.436923.9), विज्ञान उपयोगकर्ता जैविक और पर्यावरण अनुसंधान के कार्यालय द्वारा प्रायोजित सुविधा के एक डीओई कार्यालय का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile Fisher Chemical A955-4L
Dithiothreitol (DTT) Sigma 43815-5G
EDTA, 500mM Solution, pH 8.0 EMD Millipore Corp 324504-500mL
Formic Acid Thermo Scientific 28905
Guanidine Hydrochloride Sigma G3272-100G
MgCl2 Sigma M8266-100G
Potassium phosphate, dibasic Sigma P3786-100G
Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tablets Roche 5892791001
Sodium butyrate Sigma 303410-5G Used for histone deacetylase inhibitor
Sodium Chloride (NaCl) Sigma S1888
Sodium Fluoride Sigma S7020-100G Used for phosphatase inhibitor
Sodium Orthovanadate Sigma 450243-10G Used for phosphatase inhibitor
Sucrose Sigma S7903-5KG
Tris-HCl Fisher Scientific BP153-500 g
Triton X-100 Sigma T9284-100ML
Weak cation exchange resin, mesh 100-200 analytical (BioRex70) Bio-Rad 142-5842
Disposables
Chromatography column (Bio-Spin) BIO-RAD 732-6008
Mesh 100 filter cloth Millipore Sigma NY1H09000 This is part of the Sigma kit (catalog # CELLYTPN1) for plant nuclei extraction. Similar filters with the same mesh size can be used.
Micropipette tips (P20, P200, P1000) Sigma
Tube, 50mL/15mL, Centrifuge, Conical Genesee Scientific 28-103
Tube, Microcentrifuge, 1.5/2 mL Sigma
Equipment
Analytical Balance Fisher Scientific 01-912-401
Beakers (50mL – 2L)
Microcentrifuge with cooling Fisher Scientific 13-690-006
Micropipettes
Swinging-bucket centrifuge with cooling Fisher Scientific
Vortex Fisher Scientific 50-728-002
Water bath Sonicator Fisher Scientific 15-336-120

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References

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बायोकेमिस्ट्री अंक 169 सूखा एपिजेनेटिक हिस्टोन क्लिपिंग पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन प्रोटेओमिक्स ज्वार ऊपर नीचे मास स्पेक्ट्रोमेट्री
संभावित एपिजेनेटिक मार्कर के टॉप डाउन मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोफाइलिंग के लिए ज्वार लीफ टिश्यू से हिस्टोन का अलगाव
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Zhou, M., Abdali, S. H., Dilworth,… More

Zhou, M., Abdali, S. H., Dilworth, D., Liu, L., Cole, B., Malhan, N., Ahkami, A. H., Winkler, T. E., Hollingsworth, J., Sievert, J., Dahlberg, J., Hutmacher, R., Madera, M., Owiti, J. A., Hixson, K. K., Lemaux, P. G., Jansson, C., Paša-Tolić, L. Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers. J. Vis. Exp. (169), e61707, doi:10.3791/61707 (2021).

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