Summary
O protocolo foi desenvolvido para extrair efetivamente histonas intactas de materiais de folhas de sorgo para o perfil de modificações pós-translacionais de histona que podem servir como potenciais marcadores epigenéticos para ajudar as culturas resistentes à seca de engenharia.
Abstract
Histones pertencem a uma família de proteínas altamente conservadas em eucariotes. Eles embalam DNA em nucleosósmos como unidades funcionais de cromatina. Modificações pós-translacionais (PTMs) de histones, que são altamente dinâmicas e podem ser adicionadas ou removidas por enzimas, desempenham papéis críticos na regulação da expressão genética. Nas plantas, fatores epigenéticos, incluindo PTMs histonas, estão relacionados às suas respostas adaptativas ao meio ambiente. Compreender os mecanismos moleculares do controle epigenético pode trazer oportunidades sem precedentes para soluções inovadoras de bioengenharia. Aqui, descrevemos um protocolo para isolar os núcleos e purificar histones do tecido da folha de sorgo. As histonas extraídas podem ser analisadas em suas formas intactas por espectrometria de massa superior para baixo (MS) juntamente com cromatografia líquida de fase invertida on-line (RP) (LC). Combinações e estequiometria de múltiplos PTMs na mesma histona proteoforma podem ser facilmente identificadas. Além disso, o recorte da cauda de histone pode ser detectado usando o fluxo de trabalho LC-MS de cima para baixo, produzindo assim o perfil global PTM de histones centrais (H4, H2A, H2B, H3). Aplicamos este protocolo anteriormente para traçar o perfil de PTMs histítonos a partir de tecido de folha de sorgo coletados de um estudo de campo em larga escala, com o objetivo de identificar marcadores epigenéticos de resistência à seca. O protocolo poderia potencialmente ser adaptado e otimizado para sequenciamento de imunoprecipitação de cromatina (ChIP-seq), ou para estudar PTMs de histona em plantas semelhantes.
Introduction
Espera-se que a gravidade e a frequência crescentes da seca afetem a produtividade das culturas cereais1,2. O sorgo é uma cultura de alimentos e energia de cereais conhecida por sua excepcional capacidade de suportar condições limitantes da água3,4. Estamos buscando a compreensão mecanicista da interação entre o estresse da seca, o desenvolvimento das plantas e a epigenética das plantas desorgo bicolor (L.) Moench). Nosso trabalho anterior demonstrou fortes conexões entre microbioma vegetal e rizosfera na aclimatação da seca e respostas no nível molecular5,6,7. Esta pesquisa abrirá caminho para a utilização da engenharia epigenética na adaptação das culturas aos cenários climáticos futuros. Como parte dos esforços na compreensão da epigenética, pretendemos estudar marcadores proteicos que impactam a expressão genética dentro do organismo vegetal.
Histones pertencem a uma família altamente conservada de proteínas em eucariotes que embalam DNA em nucleosósmos como unidades fundamentais de cromatina. Modificações pós-translacionais (PTMs) de histones são dinamicamente reguladas para controlar a estrutura da cromatina e influenciar a expressão genética. Como outros fatores epigenéticos, incluindo a metilação do DNA, os PTMs histonas desempenham papéis importantes em muitos processos biológicos8,9. Ensaios baseados em anticorpos, como manchas ocidentais, têm sido amplamente usados para identificar e quantificar PTMs histonas. Além disso, a interação de PTMs histonas e DNA pode ser efetivamente sondada pela imunoprecipitação chromatina – sequenciamento (ChIP-seq)10. Em ChIP-seq, cromatina com histone PTM específico é enriquecida por anticorpos contra esse PTM específico. Então, os fragmentos de DNA podem ser liberados da cromatina enriquecida e sequenciados. Regiões de genes que interagem com o ptm histona-alvo são reveladas. No entanto, todos esses experimentos dependem fortemente de anticorpos de alta qualidade. Para algumas variantes/homólogos de histona ou combinações de PTMs, o desenvolvimento de anticorpos robustos pode ser extremamente desafiador (especialmente para vários PTMs). Além disso, anticorpos só podem ser desenvolvidos se o PTM de histona-alvo for conhecido. 11 Portanto, são necessários métodos alternativos para perfis não-alvos globais de PTMs histonas.
A espectrometria de massa (MS) é um método complementar para caracterizar PTMs histonas, incluindo PTMs desconhecidos para os quais os anticorpos não estão disponíveis11,12. O bem estabelecido fluxo de trabalho "bottom-up" usa proteases para digerir proteínas em pequenos peptídeos antes da separação da cromatografia líquida (LC) e da detecção de ESM. Como as histonas têm um grande número de resíduos básicos (lise e arginina), a digestão de trippsina (protease específica para lysina e arginina) no fluxo de trabalho padrão de baixo para cima corta as proteínas em peptídeos muito curtos. Os peptídeos curtos são tecnicamente difíceis de analisar pela LC-MS padrão, e não preservam as informações sobre a conectividade e estequiometria de múltiplos PTMs. O uso de outras enzimas ou rotulagem química para bloquear a lises gera peptídeos mais longos que são mais adequados para caracterização de PTMs histone13,14.
Alternativamente, o passo de digestão pode ser completamente omitido. Nesta abordagem "de cima para baixo", íons proteicos intactos são introduzidos no MS por ionização eletrospray (ESI) após a separação on-line da LC, produzindo íons dos proteoformes de histona intactos. Além disso, íons (ou seja, proteoforms) de interesse podem ser isolados e fragmentados no espectrômetro de massa para produzir os íons sequenciais para identificação e localização de PTM. Assim, a MS de cima para baixo tem a vantagem de preservar as informações de nível proteoforme capturar a conectividade de múltiplos PTMs e truncações terminais na mesma proteoforme15,16. Experimentos de cima para baixo também podem fornecer informações quantitativas e oferecer insights de biomarcadores no nível de proteína intactanível 17. Aqui, descrevemos um protocolo para extrair histona da folha de sorgo e analisar as histonas intactas por LC-MS de cima para baixo.
Os dados de exemplo mostrados na Figura 1 e Figura 2 são da folha de sorgo coletada na semana 2 após o plantio. Embora a variação de rendimento seja esperada, este protocolo é geralmente agnóstico para condições amostrais específicas. O mesmo protocolo tem sido usado com sucesso para tecido de folha de plantas de sorgo coletados de 2, 3, 5, 8, 9 e 10 semanas após o plantio.
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Protocol
1. Preparando material de folha de sorgo
NOTA: As plantas de sorgo foram cultivadas em solo no campo em Parlier, CA.
- Colete folhas de sorgo das plantas em tubos de centrífugas de 50 mL e congele imediatamente o tubo em nitrogênio líquido. Coletar tecido de folha arrancando a terceira e quarta folha totalmente emergida do leme primário.
NOTA: Mais detalhes sobre condição de campo, crescimento amostral e coleta podem ser encontrados no relatório publicado18. - Moer folhas com nitrogênio líquido e transferir imediatamente para um tubo de centrífuga.
- Armazene a folha de terra a -80 °C até usar. Tome cerca de 4 g de pó de folha moída crio-moída para análise de histona de cada amostra.
2. Preparação de tampões e materiais (3-4 h)
NOTA: As soluções de estoque de alta concentração podem ser feitas com antecedência e armazenadas até o uso. Mas todos os buffers de trabalho devem ser fabricados frescos no dia da extração (por diluição do estoque e mistura com outros conteúdos) e para serem colocados no gelo durante o processo. Todo o experimento deve ser realizado a 4 °C, a menos que seja recomendado o contrário.
- Prepare 2,5 M de sacarose dissolvendo 42,8 g de sacarose (342,30 g/mol) em 15 mL de água estéril na placa de calor em um recipiente de vidro com agitação contínua. Elere o volume para 50 mL uma vez que a sacarose tenha dissolvido completamente. Guarde a sacarose em 4 °C até usar.
- Prepare 1 M Tris pH 8 dissolvendo 1,576 g de Tris HCl em 10 mL de H2O em um tubo centrífuga de 15 mL. Ajuste o pH com NaOH para 8 e verifique com papel pH. Armazene-o a 4 °C até o uso.
- Prepare 1 M Dithiothreitol (DTT) pesando 231 mg de DTT (154,25 g/mol) e dissolvendo-o em água estéril de 1,5 mL. O DTT deve ser feito fresco ou usar alíquotas congeladas armazenadas.
- (Opcional) Prepare os inibidores adicionais misturando três sais diferentes. Prepare 18,38 mg de ortovanadato de sódio (183,91 g/mol) em 1 mL de água estéril e prepare separadamente butirato de sódio adicionando 11.008 mg de butirato de sódio (110,09 g/mol) em 1 mL de água estéril. Prepare o sal final adicionando 4.199 mg de flúor de sódio (41,99 g/mol) em 1 mL de água. Misture as três soluções de sal em volume igual como solução de estoque para "inibidores adicionais" (33 mM de cada um dos três produtos químicos).
NOTA: O vanadato de sódio polimeriza em concentrações superiores a 0,1 mM sob pH neutro. Aconselhável ativar vanadate de sódio para despolimerizá-lo para máxima eficácia após os protocolos publicados19. Alternativamente, o vanadate de sódio ativado está comercialmente disponível. Aqui, o vanadato de sódio não foi ativado intencionalmente, de modo que a eficácia não é reduzida. Vanadate de sódio ativado ainda não foi testado para este protocolo. - Prepare 1 M de MgCl2 dissolvendo 0,952 g de cloreto de magnésio anidro (95,2 g/mol) em 10 mL de H2O em um tubo centrífuga de 15 mL. Armazene 1 M MgCl2 a 4 °C até usar.
- Prepare 10% (v/v) Triton X-100 misturando 53,5 g de Triton X-100 com 35 mL de água estéril, leve até 50 mL com água e armazene-o à temperatura ambiente.
- Prepare 5% de tampão de guanidina pH7 (conhecido como "tampão Gdn") que será usado para condicionar a resina pelo menos durante a noite – prepare 0,1 M de fosfato de hidrogênio de potássio dibasic (K2HPO4) pesando 870 mg de K2HPO4 e dissolvendo em 50 mL de água estéril e armazenar a 4 °C.
- Pesar 0,7 g de cloridrato de guanidina e dissolver em 0,1 M K2HPO4 para um volume final de 14 mL. Ajuste o pH para 7 verificando com papel pH.
- Mergulhe a resina de câmbio de cation fraca seca (WCX) em 5% de tampão de guanidina pH 7 durante a noite. Remova o supernascimento e refil com tampão fresco de 5% de Gdn e mergulhe-o novamente durante a noite para deixar a resina totalmente equilibrada (até que o supernatante tenha o mesmo pH do buffer original).
- Antes de iniciar o experimento na próxima seção, misture os reagentes para fazer o buffer EB1, EB2A e EB2B com base na Tabela 1. Adicione todos os inibidores e DTT frescos pouco antes do uso.
| Reagentes | Concentração de estoque | EB1 | EB2A | EB2B |
| Volume (mL) | Volume (mL) | Volume (mL) | ||
| Sacarose | 2,5 M | 4.4 | 1.25 | 0.5 |
| Tris HCl pH8 | 1M | 0.25 | 0.125 | 0.05 |
| Tdt | 1M | 0.125 | 0.0625 | 0.025 |
| H2O | 20.225 | 9.6875 | 4.375 | |
| comprimido inibidor de protease (PI) | 0,5 pílula | 0,5 pílula | 0,5 pílula | |
| Inibidores adicionais (Opcional) | 33mM | 0.25 | 0.125 | 0.05 |
| MgCl2 | 1M | 0.125 | 0.05 | |
| Tritão X100 | 10% | 1.25 | ||
| Volume geral | 25 mL | 12,5 mL | 5 mL | |
Tabela 1: Composição para buffers de extração (EBs).
- Faça o Buffer de Lise Nucleísis (NLB) com base na Tabela 2. Prepare o NLB com antecedência e armazene a 4 °C até usar. Adicione comprimidos PI frescos pouco antes de usar em 1x (0,5 comprimidos por 5 mL). Consulte a Tabela 2 para obter volumes específicos.
| Nlb | Concentração de estoque | Volume (mL) |
| Nacl | 5M | 0.4 |
| Tris HCl pH8 | 1M | 0.05 |
| Tritão X100 | 10% | 0.5 |
| Edta | 0,5M | 0.2 |
| H2O | 3.85 | |
| Comprimidos PI | 0,5 pílula | |
| Inibidores adicionais (opcional) | 33mM | 0.05 |
| Volume geral | 5 mL |
Tabela 2: Composição para o tampão de lise dos núcleos (NLB).
3. Procedimento de isolamento dos núcleos
NOTA: Recomenda-se realizar as etapas 3.1-3.3 do primeiro dia (2-3 h), salvar os núcleos no tampão NLB a -80 °C e retomar no dia seguinte (ou posterior) para purificação de proteínas (4h). As etapas de isolamento dos núcleos neste protocolo foram adaptadas a partir de um protocolo de sorgo ChIP-seq que está sendo usado no Instituto de Genoma Conjunto. Lavagens adicionais e separação de gradiente de sacarose podem ser necessárias para garantir a pureza dos núcleos para aplicações chip-seq.
- Filtragem de detritos (~0,5 h)
- Pese o pó da folha moída ~4 g, garantindo que ele permaneça congelado colocando gelo seco ou nitrogênio líquido até estar pronto para uso.
- Adicione comprimidos inibidores de protease ao EB1 a uma concentração final de 0,2x (0,5 comprimidos para 25 mL por amostra). Use um pilão plástico em miniatura ou uma ponta de pipeta para pré-esmagar comprimidos em um tubo de microcentrifuuge antes de adicionar aos buffers para ajudar na dissolução do comprimido no buffer. Para evitar a perda de material, adicione o tablet PI e sonicate o buffer para dissolver o tablet.
- Adicione 20 mL de EB1 ao pó de folha moída congelado, suavemente vórtice e misture-os até que o pó esteja completamente suspenso. Continue misturando suavemente por ~10 min.
- Filtre através da malha 100, enxaguando o material filtrado duas vezes com 2 mL de EB1 cada vez.
NOTA: Tanto o filtrado quanto os detritos filtrados devem ser verdes. Se o rastreamento usando um microscópio, deve-se ser capaz de ver núcleos intactos e cloroplastos intactos no filtrado neste momento. A maioria dos detritos grandes deve estar ausente/esgotado. Misture corantes como azul metileno com amostra. Os núcleos são facilmente observáveis como ~3-5 μm de diâmetro escuro azul/aquamarina esferas quando visualizados usando um objetivo de 20x, 40x e/ou 100x. Em relação aos núcleos, os cloroplastos são semelhantes em tamanho, mas esverdeados em cores e muitas vezes mais ovais em forma. Os vacuoles também são semelhantes aos núcleos em tamanho e forma, mas eles não vão prontamente assumir o corante azul de metileno. - Centrifugar o filtrado combinado a 3.000 x g por 10 min a 4 °C em um rotor de balde balançando para detritos de pelotas e grandes organelas subcelulares, incluindo núcleos e cloroplastos.
NOTA: Recomenda-se preparar eB2A durante esta rodada (ver etapa 3.2.1). - Decante o supernatante, tomando cuidado para não perturbar a pelota.
NOTA: Como nenhum detergente ainda foi adicionado, a pelota deve permanecer verde intensa e o supernante deve ser, no máximo, verde/amarelo pálido.
- Lise de organelas não-alvo (~0,5 h)
- Prepare o EB2A adicionando inibidores de protease a uma concentração final de 0,4x (0,5 comprimido por 12,5 mL EB2A).
- Resuspenha a pelota do passo 3.1.6 em 5 mL de EB2A e incubar no gelo por 10 minutos com mistura suave.
NOTA: A concentração de detergente precisa ser otimizada para células intactas e cloroplastos preferencialmente, mas não núcleos. A quantidade necessária pode variar entre os organismos. Recomenda-se verificar se há lise de cloroplastos e retenção de núcleos intactos sob microscópio. - Centrífuga a 2.100 x g por 15 min a 4 °C em um rotor de balde balançando para detritos e núcleos de pelotas.
NOTA: Nesta fase, o supernasce deve ser intensamente verde, e a pelota deve ser muito menos verde do que observada nos estágios anteriores devido à lise de cloroplastos e liberação de clorofila no citosol. - Decante o supernatante, tomando cuidado para não perturbar a pelota.
- Isolamento dos núcleos de contaminantes citoplasmados remanescentes (~0,5 h)
- Prepare o EB2B adicionando inibidores de protease a uma concentração final de 1x (0,5 comprimido por 5 mL EB2B).
- Resuspend pelota nuclear bruta a partir do passo 3.2.3 em 2 mL de EB2B.
NOTA: O EB2B não contém Triton X-100, portanto, nenhuma lise adicional deve ocorrer neste momento. - Centrífuga a 2.100 x g por 15 min a 4 °C em um rotor de balde balançando para detritos e núcleos de pelotas.
NOTA: Pequenas organelas e componentes citoplasmados não devem ser pelotas, por isso devem permanecer no sobrenante. - Decante o supernatante, tomando cuidado para não perturbar a pelota.
- Resuspend a pelota usando 250 μL de NLB (adicione 0,5 comprimido inibidor de protease fresco para 5 mL).
NOTA: O objetivo é resuspensar os núcleos em uma quantidade mínima de NLB sem perda material significativa. Como o NLB é muito viscoso e as pelotas contêm uma grande quantidade de detritos insolúveis, é muito difícil de pipeta e tende a se agarrar ao interior das pontas da pipeta. Por essa razão, recomenda-se reutilizar a mesma ponta de pipeta sempre que possível. Se estiver preocupado com o material residual em uma ponta de pipeta, basta pendurar a pipeta de uma prateleira ou rack por ~1 min para permitir que a gravidade colete material na abertura da ponta. Não pipeta agressivamente para resuspensar as pelotas. Em vez disso, use a ponta da pipeta como uma haste de mexida até que o material de pelotas possa ser aspirado na ponta da pipeta. ou seja, é perfeitamente bom para grandes aglomerados de pelotas para ficar nesta fase, desde que possa ser atraído para uma ponta de pipeta. - Vórtice 15 s ao máximo para homogeneizar e resususpensar parcialmente o material. Sonicate por 5 min a 4 °C, em seguida, armazenar a -80 °C.
NOTA: Para etapas subsequentes, tenha em mente que a quantidade total de NLB adicionada é de 250 μL, mas o volume total aparente da amostra pode ser até o dobro devido a detritos insolúveis. A amostra é congelada e descongelada para auxiliar na lise dos núcleos.
- Extração de lise nuclei e histona (~4 h)
- Adicione 750 μL de 5% de gdn tampão à amostra descongelada. Sonicate por 15 min a 4 °C.
- Transfira a amostra para um único tubo de 2 mL e gire 10.000 x g por 10 min a 4 °C.
NOTA: O supernatante provavelmente parecerá verde. As seguintes etapas de cromatografia devem remover a maioria dos pigmentos da proteína. - Enquanto aguarda a etapa 3.4.1 e 3.4.2, prepare a coluna para a limpeza da cromatografia de troca de íons. Enxágüe a coluna de cromatografia com 2 mL de acetonitrilo e 4 mL de água para minimizar a contaminação na superfície.
- Carregar 200~300 μL de resina WCX (pré-condicionado com tampão de 5% Gdn) na coluna cromatografia. Deixe a resina resolver. Lave quatro vezes com 1 mL de tampão de 5% Gdn. Mantenha o tubo e a coluna no gelo para o resto das etapas de purificação.
- Coloque a coluna de cromatografia em um tubo de coleta de 2 mL. Carregue o supernasce da etapa 3.4.2 lentamente na cama de resina sem interromper a resina (tente cair lentamente do lado dos tubos). Deixe a solução fluir pela gravidade. À medida que a solução está fluindo, carregue o eluent de volta para a parte superior da coluna 6-8 vezes para permitir a ligação máxima à resina. Então, descarte o eluente.
- Carregue 2 mL de tampão de 5% Gdn para lavar proteínas não histonas da coluna. Descarte o eluente.
- Histones eluto com 1 mL 20% tampão Gdn. Colete o eluente, que contém proteínas histonas.
- Use filtro de giro de corte de peso molecular de 3 kDa (MWCO) (0,5 mL) para desalar o eluente da etapa 3.4.6. Antes de usar, carregue 500 μL de solvente de lavagem (0,2% ácido fórmico em 3% ACN) e gire-o duas vezes para limpar o filtro.
NOTA: Recomenda-se começar a lavar o filtro MWCO enquanto executa as etapas de cromatografia de resina para economizar tempo. As seguintes etapas do filtro de giro levam ~3-4 h. - Primeira carga 500 μL de amostra de histona, gire a 14.000 x g por ~25 min para reduzir o volume até ~100 μL. Em seguida, carregue outros 400 μL de amostra e gire a 14.000 x g novamente por ~25 min. Carregue os 100 μL finais da amostra, enxágue o tubo de amostra com solvente de lavagem de 300 μL e carregue o solvente no filtro. Gire a 14.000 x g novamente por ~25 min.
- Carregue 400 μL solvente de lavagem, gire a 14.000 x g por ~25 min para reduzir o volume para ~100 μL ou menos. Cada ciclo reduz a concentração de sal em um quinto. Repita por mais três ciclos para levar a concentração de guanidina a ~0,01%. Inverta o filtro em um tubo de coleta limpo e gire a 1.000 x g por 2 min. Guarde a amostra de histona purificada a -20 °C ou -80 °C para análise.
NOTA: Recomenda-se girar mais (30-40 min) na última etapa para minimizar o volume amostral para obter maior concentração. O volume deve ser capaz de descer para 50-70 μL.
4. Espectrometria em massa de histones purificados
- Aquisição de dados de espectrometria de massa cromatografia líquida (LC-MS)
- Estimar a concentração proteica pelo ensaio de ácido bicinchonínico (BCA) seguindo o protocolo do fabricante.
NOTA: O BCA só pode fornecer uma estimativa da concentração total de proteínas, mas não a qualidade da purificação da histona. Se a instrumentação ms não estiver prontamente disponível para verificar a qualidade da purificação de histona, a mancha ocidental pode ser usada. LC de fase invertida juntamente com a detecção de absorvância ultravioleta de 210 nm, conforme descrito em nosso relatório anterior, também pode ser usado20. O cromatógrafo pode ser comparado com um padrão conhecido para verificar a qualidade da amostra. No entanto, diferentes organismos podem ter diferentes perfis de elução. Portanto, o uso de padrões de histona de organismos semelhantes é altamente recomendado. - Conecte uma coluna analítica de fase invertida C18 (RP) (por exemplo, 3 μm 300 Å, coluna interior diâmetro 75 μm, diâmetro externo 360 μm, comprimento 70 cm) e uma coluna armadilha C18 (por exemplo, 3,6 μm, diâmetro interno da coluna 150 μm, diâmetro externo 360 μm, comprimento 5cm) para um sistema de cromatografia líquida nanoflua de bomba dupla (por exemplo, NanoAcquity de Águas). Os solventes binários são A: 0,1% ácido fórmico na água, e B: 0,1% ácido fórmico em acetonitrilo.
NOTA: A LC da bomba dupla inclui uma bomba de lavagem e uma bomba de gradiente. Ambas as bombas passam por duas etapas em cada análise — uma fase de trapping seguida do estágio analítico. No estágio de captura, a bomba de lavagem flui para a coluna da armadilha e a bomba gradiente flui para a coluna analítica. No estágio analítico, a coluna armadilha é acoplado à coluna analítica, e a bomba gradiente flui para ambas as colunas. A bomba de lavagem então vai para o lixo. - Estágio de captura: Configure o método LC para primeiro carregar 1-2 μg de amostra de histona na coluna armadilha. Desalar a amostra pela bomba de lavagem a 3 μL/min 5% solvente B por 10 min. Coloque a bomba analítica em 0,3 μL/min 5% solvente B para equilíbrio.
- Estágio analítico: Coloque a bomba de gradiente (0,3 μL/min) para começar a partir de 5% B e rampa para 30% a 15 min. Em seguida, aumente para 41% B a 100 min antes de uma lavagem orgânica alta até 95% B no final.
NOTA: O gradiente pode ser otimizado dependendo dos diferentes perfis de retenção em colunas individuais. Normalmente, as tônus de comprimento total elute em torno de 30%-40% B nas condições de LC especificadas. Gradientes mais longos podem ser usados para aumentar o número de espectros MS2 para capturar mais proteoformes histonas. - Configure o método de aquisição dependente de dados em um MS de alta resolução (por exemplo, Thermo Orbitrap Fusion Lumos ou similar) com capacidade de dissociação de transferência de elétrons (ETD). Use o modo proteína intacta e realize todas as calibrações necessárias, conforme sugerido pelo fabricante. Parâmetros críticos são descritos abaixo. Estes serão específicos do instrumento utilizado.
- MS1: intervalo de varredura de 600 a 2.000 m/z, resolução 120k (a m/z 200), 4 microscans, alvo AGC 1E6, injeção máxima de 50 ms.
- MS2: resolução 120k; 1 microscana; Alvo AGC 1E6; MS/MS dependente de dados: ETD alternado (tempo de reação de 25 ms, tempo máximo de injeção de 500 ms) e dissociação colisal de maior energia (HCD, 28% energia de colisão normalizada com energia ±5% escalonada, tempo máximo de injeção de 100 ms); janela de isolamento de 0,6 Da; prioridade nos estados de maior carga.
- Exclusão dinâmica: janela de tempo de 120 s, janela de massa ±0.7 Da. Exclua estados de cobrança inferiores a 5 e estados de cobrança indeterminados.
- Execute algumas injeções de peptídeos ou padrões de histona em novas colunas para equilibrar e verificar o sistema, antes de executar as amostras reais. Para executar um grande número de amostras, adicione espaços curtos ou lavagens entre as amostras para minimizar o transporte. Deixe as colunas equilibrarem por 15-20 min na condição inicial (5% de solvente B) antes da próxima amostra.
NOTA: Gradientes de LC mais longos e maior tempo máximo de injeção para MS2 podem melhorar a qualidade espectral para identificar mais proteoformes histonas.
- Estimar a concentração proteica pelo ensaio de ácido bicinchonínico (BCA) seguindo o protocolo do fabricante.
- Processamento de dados LC-MS e identificação proteoforme
- Obtenha a sequência de proteína (sorgo) no formato FASTA a partir de JGI (https://genome.jgi.doe.gov) ou UniProt (https://www.uniprot.org/).
- Use o MSConvert21 (http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtml) para converter os arquivos de dados brutos do instrumento (*.raw) em formato mzML.
- Baixe o pacote TopPIC22 (http://proteomics.informatics.iupui.edu/software/toppic/) para processamento de dados. O programa pode ser executado em linha de comando ou através da interface gráfica.
- Use o TopFD na suíte TopPIC para desconvoluir o espectro do arquivo mzML da etapa 4.2.2. Os parâmetros padrão podem ser usados. Mas a "janela precursora" (-w) precisa ser reduzida para 1 m/z porque uma janela de isolamento estreita é usada.
- Use TopPIC na suíte TopPIC para identificar proteoforms. A maioria dos parâmetros padrão pode ser usada. Defina o tipo de corte de espectro e proteoforme para FDR (taxa de detecção falsa) e defina o valor de corte para 0,01 (1% FDR) ou conforme desejado. Defina a "tolerância ao erro proteoform" para 5 (Dalton). Carregue o arquivo FASTA da etapa 4.2.1 e o arquivo "*_ms2.msalign" da etapa 4.2.4. Então comece a busca.
NOTA: A configuração "tolerância a erros proteoformes" combinará proteoformes com massas semelhantes (± 5 Da) como uma. Isso ajuda a reduzir a redundância nas contagens de proteoformes. No entanto, deve ser usado com cautela, pois a grande tolerância irá mesclar proteoforms com pequenas ou sem diferenças de massa. Este parâmetro só está disponível na versão TopPIC 1.3 ou posterior. - Os proteoforms identificados podem ser examinados no arquivo "*_proteoform.csv" ou visualizados usando o módulo Topview na pasta "*_html" da saída.
- A lista de proteoforms gerada a partir dos passos acima usando TopPIC anota os PTMs histonas como mudanças de massa. Para localização de PTMs individuais, uma lista de modificações deve ser incluída. A descrição detalhada pode ser encontrada no manual TopPIC. Alternativamente, prossiga para a próxima etapa para realizar uma análise complementar de dados utilizando o pacote Informação-Proteômica23 (https://github.com/PNNL-Comp-Mass-Spec/Informed-Proteomics).
- Siga as instruções e use o módulo PbfGen para converter os dados brutos do instrumento em um arquivo PBF. Em seguida, desconvoluir os dados MS1 usando o módulo ProMex para produzir um arquivo MS1ft (lista de recursos, cada recurso representa uma combinação única de massa e tempo de retenção).
- Crie um FASTA focado para Proteômica Informada usando a lista de proteínas identificadas da TopPIC na etapa 4.2.6.
NOTA: Pesquisar todo o genoma usando Proteômica Informada com grande número de PTMs variáveis pode ser extremamente lento e pode causar acidentes. Portanto, recomenda-se reduzir o tamanho do FASTA apenas incluindo as proteínas-alvo. - Crie uma lista de modificações direcionada para procurar PTMs histone seguindo o formato no arquivo de exemplo. Os PTMs comuns a incluir são: acetilação de lysina, mono-metilação de lise, di-metilação de lisesina, tri-metilação de lysina, serina/threonina/fosforilação de tyrosina, acetilação n-terminal proteica, oxidação de metionina/cissteína. Para o sorgo, deve-se adicionar mono-metilação n-terminal de proteínas, dietetilação e trimetilação.
NOTA: A Proteômica Informada só procura por PTMs especificados na lista. Se os PTMs não especificados estiverem presentes, o proteoforme pode não ser identificado ou pode ser mal identificado com outros proteoforms. No entanto, a lista ptm deve ser mantida o mais curto possível para minimizar o tempo de pesquisa. - Execute o módulo MSPathFinder para identificar proteoforms usando os arquivos da etapa 4.2.8, o FASTA focado da etapa 4.2.9 e a lista de modificações da etapa 4.2.10. Os parâmetros padrão podem ser usados.
- Os resultados podem ser visualizados em LcMsSpectator carregando todos os arquivos de resultado.
NOTA: Outras ferramentas de bioinformática estão disponíveis para processamento e visualização de dados de cima para baixo, cada uma com seus próprios pontos fortes24,25,26,27,28. O sorgo e muitos outros organismos têm informações conhecidas limitadas sobre PTMs histone no banco de dados. Use o TopPIC primeiro para identificar mudanças em massa de PTMs. Esta análise pode facilmente descobrir tanto PTMs conhecidos quanto desconhecidos. Em seguida, os PTMs detectados podem ser pesquisados de forma direcionada, seja especificando uma lista de PTM no TopPIC, ou com outras ferramentas complementares.
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Representative Results
Seguindo o protocolo, as histonas podem ser extraídas e identificadas por meio da análise LC-MS. Os dados brutos e os resultados processados estão disponíveis no MassIVE (https://massive.ucsd.edu/) via adesão: MSV000085770. Com base nos resultados toppic da amostra representativa (disponível também no MassIVE), identificamos 303 proteoformes histona (106 H2A, 72 H2B, 103 H3 e 22 proteoforms H4). Proteoformes ribossômicos co-purificados também foram detectados, tipicamente elundo no início da LC. Eles geralmente consistem em ~20% dos proteoforms identificados, mas não se sobrepõem com os proteoforms histonas que eluiam no estágio posterior do gradiente lc. Os resultados podem ser facilmente visualizados com os pacotes TopPIC ou Informed-Proteomics mais recentes. Para demonstração, focaremos na visualização de dados usando o pacote Informed-Proteomics, que pode ser usado para carregar diretamente arquivos MS brutos e examinar manualmente as identificações proteoformes. Por favor, note que ambos os pacotes de software usam algoritmos e parâmetros diferentes. Os números relatados de proteoforms não serão idênticos. Recomendamos relatar as contagens de proteoformes do TopPIC porque é mais conservadora, e considera PTMs desconhecidas. Pacote de Proteômica Informada tem processamento e visualização de dados integrados para fácil validação manual. Para organismos com PTMs bem anotados, recomendamos o ProSightPC24 para melhor localização do local. A combinação dos resultados usando múltiplas ferramentas pode aumentar o número e a confiança das identificações proteoformes.
Depois de processar os dados com Proteômica Informada, o mapa de recursos LC-MS pode ser visualizado em LcMsSpectator, que exibe as massas proteicas desconvoluturas contra o tempo de retenção de LC. Ao clicar nos proteoforms identificados no software, o recurso associado será destacado com um pequeno retângulo verde no mapa de recursos. As principais proteínas histonas devem ser vistas em regiões específicas do mapa, o que indica o sucesso do experimento. A Figura 1a mostra um mapa representativo do LC-MS de histones intactos. As proteoformas de histona completa são destacadas nas caixas tracejadas. A maioria dos proteoformes detectados pode ser identificada com confiança usando dados ms2.
A Figura 1b mostra o zoom da região com proteoforms H2A e H2B. A maioria deles tem modificações n-terminal de 42 Da. Esta massa nominal corresponde tanto à trimetilação (42,05 Da) quanto à acetilação (42,01 Da), que são comumente vistas para as histonas. Suas massas precisas diferem apenas por 0,04 Da e são difíceis de diferenciar no nível de proteína intacta (~2 ppm). No espectro MS2 de alta resolução, os PTMs podem ser facilmente diferenciados e confirmados por causa da menor massa dos fragmentos29. Além disso, as histonas H2A e H2B têm vários homólogos com sequências muito semelhantes, como observado pelos diferentes números de adesão UniProt na Figura 1b. Mais uma vez, a análise LC-MS de alta resolução pode facilmente identificá-los e diferenciá-los. Dois tipos de H2As foram identificados para histonas de sorgo. Os histones H2A de 16 kDa na Figura 1b têm caudas terminais estendidas nas regiões não conservadas de histones. Outro grupo de histones H2A sem as caudas estendidas (14 kDa) pode ser visto na Figura 1c.
Para os histones H4, a acetilação n-terminal foi identificada como o maior PTM. Acetilações adicionais de lysina e oxidações de methionina também podem ser observadas simplesmente examinando as diferenças de massa das características na Figura 1d. Observamos também uma modificação desconhecida de 112,9 Da, além da acetilação do terminal N (o recurso acima de "3Ac" na Figura 1d). Este é provavelmente alguns adutos desconhecidos do reagente usado na preparação. Detectamos anteriormente adutos de íon sulfato em H4, que podem ser atribuídos a sais residuais combinados com alta basicidade das proteínas histonas. Para H3, foram identificadas duas sequências proteicas H3.3 e H3.2(Figura 1e). Embora essas duas sequências proteicas diferem em apenas 4 resíduos (32, 42, 88 e 91), elas ainda podem ser facilmente distinguidas em LC-MS com base na separação em ambas as dimensões, massa e tempo de retenção. As proteínas H3 são fortemente modificadas por diferentes graus de metilação e acetilação. O alto grau de modificação pode ser facilmente visualizado pelas linhas densas e paralelas no mapa de características, que são 14 da de distância. No entanto, três grupos de metilação (14*3 Da) têm a massa nominal igual a uma acetilação (42 Da). Como esses PTMs não podem ser facilmente resolvidos a nível de proteína intacta, eles são chamados de "equivalentes de metila" (ou seja, múltiplos de 14 Da; uma acetilação equivale a três equivalentes de metila). Na Figura 1e,os proteoforms H3 são rotulados na forma de equivalentes de metila com base em sua massa intacta. Devido à resolução limitada da separação RPLC, muitos proteoforms H3 diferentes são provavelmente co-eluvando e fragmentados no mesmo espectro. O método aqui apresentado só identificará as combinações mais abundantes de metilação e acetilação como ilustrado na Figura 2. Para uma caracterização mais abrangente do H3, ainda é necessária uma análise mais direcionada30,31.
Figura 1: Mapa de características LC-MS em histonas intactas extraídas de folhas de sorgo. A figura mostra o tempo de retenção de LC (em minutos) vs. a massa molecular para todos os proteoformes detectados. A abundância de troncos é mostrada pela escala de cores ao lado do mapa superior (log 10 abundância). (a) Os principais picos de histona são rotulados pelas caixas tracejadas. A maioria das características fora das caixas são histonas truncadas e proteínas ribossômicas. Vistas de zoom para cada grupo de histones: (b) H2B e 16 kDa H2A, (c) H3, (d) 14 kDa H2A, e(e) H3. Os números de adesão do UniProt são observados ao lado de cada característica, seguidos por PTMs detectados. "Ac", "eu", "+O" indicam acetilação, metilação e oxidação, respectivamente. Em (b), são rotulados dois proteoforms H2A C5YZA9 truncados, que tiveram um ou dois c-terminal alanine cortados (mostrados como -A*, e -AA*). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Um exemplo representativo de identificação proteoforme é mostrado na Figura 2 usando MSPathfinder e visualizado em LcMsSpectator. O espectro de fragmentação na Figura 2a foi gerado utilizando ETD, que produz íons tipo C e Z ao longo da espinha dorsal da proteína. O HCD do mesmo precursor pode ser usado para validar a identificação, mas o HCD geralmente fornece cobertura de sequência limitada20. Os íons precursores nos espectros anterior e seguinte do MS1 são mostrados na Figura 2b,c,com seus picos de isótopos combinados destacados em roxo. O mapa de cobertura de sequência na Figura 2d pode ajudar a localização de possíveis PTMs. Uma identificação de alta confiança deve ter a maioria dos fragmentos combinados, íon precursor combinado e boa cobertura de sequência para ajudar a localização de PTMs. Neste exemplo, um proteoforme H3.2 foi identificado com dois PTMs - diet-metilação em K9 e metilação em K27. Seguindo o mesmo método, outros proteoformes com PTMs diferentes e truncações terminais podem ser validados manualmente.
Figura 2: Exemplo representativo de um proteoforme histona identificado H3.2. H3.2 pré-formato com seu(a) espectro ETD, (b) íon precursor no espectro MS1 anterior, (c) íon precursor no próximo espectro MS1, e(d) mapa de cobertura sequencial. Os íons c do N-terminus são rotulados em ciano, e os íons z do C-terminus estão em rosa. Dois PTMs foram identificados e destacados em amarelo em (d)com seus turnos de massa anotados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A comparação quantitativa dos proteoformas histonas detectadas pode revelar potenciais marcadores epigenéticos. Aplicamos este protocolo anteriormente a 48 amostras de sorgo coletadas no campo ("inibidores adicionais" não foram utilizadas neste estudo)29. Dois genótipos diferentes de sorgo foram comparados em resposta a secas pré-florais ou pós-florais. Comparando a abundância relativa dos proteoformes, descobrimos algumas mudanças interessantes de proteoformas histonas truncadas que são específicas para as condições amostrais, como mostrado na Figura 3. A truncação terminal C de H4 foi observada apenas nas semanas 3 e 9 para algumas das amostras (Figura 3a,b). Para h3.2, os proteoformes truncados n-terminal foram geralmente mais abundantes na semana 10 (Figura 3c,d). Em contrapartida, o terminal C truncado H3.2 tende a ser visto em pontos de tempo anteriores(Figura 3c). Mais importante, os dois genótipos não responderam exatamente da mesma forma. Os proteoformes truncados do terminal H4 C foram significativamente mais abundantes em BTx642 do que em RTx430(Figura 3b). Tais dados revelam potenciais marcadores epigenéticos do desenvolvimento da planta e tolerância ao estresse que podem ser mais testados com outras técnicas.
Figura 3: Comparação quantitativa de proteoformas histonas. aMapa de calor de proteoforms histone H4 em diferentes amostras. Para cada proteoforme, a abundância extraída dos dados de MS de cima para baixo foi normalizada para a soma de todos os proteoforms H4 identificados em cada análise, gerando a "abundância relativa". Os valores foram então dimensionados ao máximo de cada linha para melhor mostrar as mudanças em proteoforms de baixa abundância. A abundância relativa dimensionada é denotada na tecla de cor na parte inferior do mapa de calor. As condições de crescimento são observadas no eixo horizontal (Pré: seca pré-floração, Post: seca pós-floração). Três réplicas são agrupadas e separadas por listras verticais pretas de outras condições. Para amostras rotuladas com asteriscos, foram adquiridas apenas réplicas técnicas. Os proteoformes são representados no eixo vertical, no formato "resíduo inicial – resíduo final: massa; modificação putativa". (b) Parcela de abundância relativa dos proteoforms H4 truncados 2-99 (proteoforms destacados em negrito em (a) são somados) em condições diferentes. A chave dos símbolos é mostrada na legenda no canto superior direito. Os pontos preenchidos no meio das barras de erro são os valores médios. (c) O mapa de calor de proteoforms H3.2 e (d) gráfico de abundância para todos os H3.2 truncados n-terminal identificados são mostrados no mesmo formato que os de H4. Proteoforms menores que 8 kDa in (c) foram omitidos pela simplicidade. Os proteoformes H3.2 truncados N-terminal e C apresentaram respostas diferentes em todas as condições de crescimento. Reimpresso com permissão da ELSEVIER a partir do ref.29. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo apresentado descreve como extrair histonas de amostras de folhas de sorgo (ou mais geralmente folha de plantas). Espera-se que o rendimento médio da histona seja de 2 a 20 μg por material de folha de sorgo de 4 a 5 g. Os materiais são suficientemente puros para a análise de histona a jusante por LC-MS (principalmente histones com ~20% de contaminação por proteína ribossômica). O rendimento mais baixo pode ser obtido devido a variações amostrais ou possíveis falhas/falhas ao longo do protocolo. Manter a integridade dos núcleos antes da etapa de lise dos núcleos é fundamental; portanto, vórtices agressivos e pipetagem devem ser evitados antes de adicionar NLB. Além disso, a perda de núcleos pode ocorrer ao remover os sobrenantes das pelotas. Deve-se tomar cuidado para não interromper as pelotas ao pipetar. A concentração de Tritão X-100 de 1% foi otimizada para lise seletiva das organelas não direcionadas, mas não dos núcleos (etapa 3.2). A concentração ideal de detergente para outros tecidos ou organismos pode ser diferente e precisa ser determinada experimentalmente. A mudança de cor do supernascedor durante o processo de filtragem pode indicar problemas potenciais, como liberação ineficiente de cloroplasto ou moagem insuficiente da folha. Se possível, use um microscópio para verificar a lise de cloroplastos e a retenção de núcleos intactos após cada passo para otimizar ainda mais o protocolo (especialmente se modificar o protocolo para outros tecidos ou plantas). Este protocolo só foi testado com tecido de folha de sorgo. Não funciona para tecido radicular de sorgo provavelmente devido à interferência do solo. A aplicação a outros tecidos de folhas vegetais não foi testada e a aplicação em diferentes plantas pode precisar de otimização adicional. Para a adaptação do protocolo de isolamento dos núcleos para aplicações chIP-seq, uma separação adicional da densidade de gradiente de sacarose após a etapa 3.3.4 (antes de usar NLB) é aconselhada para reduzir a contaminação citoplasmática. Devido aos extensos passos de limpeza, pequenas quantidades de materiais não-nuclei residuais não devem causar interferência significativa para a análise de histona em LC-MS e podem ser deixadas com a pelota.
Vários ensaios iniciais falharam ao usar comprimidos comerciais de inibidores de fosfatas (por exemplo, PhosSTOP). O supernascimento na etapa 3.1.6 parecia ser verde intenso quando as pastilhas foram usadas no tampão de extração. O extrato final mostrou baixo número de histones identificados. Suspeitamos que os ingredientes proprietários nos comprimidos podem ter causado lise nuclei antes do passo 3.4, reduzindo o rendimento geral da histona. Outra possível razão para o fracasso é a incompatibilidade dos ingredientes na etapa de purificação de histona com a resina de troca de íons (passo 3.4). Usamos este protocolo para extrair consistentemente histones de alta pureza para lc-MS subsequentes mais de 150 amostras. Em média, conseguimos obter maior rendimento sem o uso dos "inibidores adicionais" (dados inéditos). Portanto, é aconselhável testar cautelosamente novos inibidores ao modificar ou adaptar este protocolo para outros fins. Se a fosforilação não for de interesse, os inibidores de fosfatase podem ser omitidos nos buffers de extração.
Os passos em 3.4 podem levar de 3 a 4 h ou mais. Recomenda-se quebrar o protocolo em 2 dias — congelar a pelota dos núcleos a partir da etapa 3.3 e realizar a purificação no dia 2 (ou posterior). O ciclo de congelamento pode ajudar parcialmente a lise dos núcleos. As etapas do filtro MWCO (3.4.7) podem ser muito demoradas, mas podem ser facilmente dimensionadas preparando várias amostras em paralelo. Não adicione os comprimidos inibidores de protease na etapa 3.4. Muitas pastilhas comerciais contêm polímeros (por exemplo, polietileno glicol) como enchimentos, o que interferirá na análise de LC-MS. Nesta etapa, a maioria das outras proteínas deveria ter sido removida ou desnaturada, de modo que os inibidores de enzimas não são críticos. No entanto, ainda é necessário manter as amostras a 4 °C ou congeladas para minimizar a degradação.
Seguindo este protocolo, as histonas podem ser extraídas com sucesso de folhas de sorgo. PtMs histone podem ser caracterizados com LC-MS. O método pode ser potencialmente aplicado a estudos de grande escala para comparar PTMs histonas entre diferentes amostras biológicas (por exemplo, genótipos diferentes, plantas cultivadas em diferentes condições, etc.) como mostram os dados de exemplo na Figura 3. No entanto, o processamento de dados ainda requer uma análise manual extensiva para atribuir proteoforms com confiança, especialmente para PTMs inesperados (ou novos). Novos desenvolvimentos em ferramentas de bioinformática são esperados para automatizar o fluxo de trabalho e aumentar significativamente o throughput para estudos em larga escala. Outra limitação é que o método de MS de cima para baixo, atualmente, não pode facilmente diferenciar muitos proteoformes de H3 hiper-modificado (por exemplo, vários locais de mono/di/tri-metlylation e acetilação). A LC de fase inversa de dimensão única não pode separar totalmente os diferentes proteoformes H3. Portanto, os espectros MS2 de H3 normalmente contêm fragmentos de múltiplos proteoforms e não podem ser desconvolucidos de forma fácil e confiante. Combinar de cima para baixo com métodos de baixo para cima ou para baixo30,32,33 pode ser especialmente benéfico para a caracterização da histona H3. Alternativamente, a separação multidimensional pode ser considerada para melhorar a profundidade do MS34,35,36.
O perfil histone PTM da LC-MS permite a descoberta de novos marcadores epigenéticos para projetar modificadores de cromatina e melhorar a resiliência das plantas a condições ambientais severas. Um estudo piloto utilizando sorgo de duas cultivares e cultivado em condições de seca no campo indicou que o recorte seletivo do terminal de histona na folha pode estar relacionado à aclimatação da seca e ao desenvolvimento da planta29. Os marcadores de histona identificados podem servir como alvos por técnicas complementares, como chip-seq. A compreensão abrangente dos fatores epigenéticos adquiridos a partir dessas técnicas complementares seria indispensável para a engenharia de soluções inovadoras para as culturas em resposta às mudanças ambientais.
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Disclosures
Nenhum.
Acknowledgments
Agradecemos a Ronald Moore e Thomas Fillmore por ajudarem em experimentos de espectrometria em massa, e Matthew Monroe pela deposição de dados. Esta pesquisa foi financiada por subsídios do Departamento de Energia dos EUA (DOE) Pesquisa Biológica e Ambiental através do projeto Controle Epigenético da Resposta à Seca em Sorgo (EPICON) sob o número de premiação DE-SC0014081, do Departamento de Agricultura dos EUA (USDA; CRIS 2030-21430-008-00D), e através do Joint BioEnergy Institute (JBEI), uma instalação patrocinada pelo DOE (Contrato DE-AC02-05CH11231) entre o Lawrence Berkeley National Laboratory e o DOE. A pesquisa foi realizada utilizando-se o Laboratório de Ciências Moleculares Ambientais (EMSL) (grid.436923.9), um DoE Office of Science User Facility patrocinado pelo Escritório de Pesquisa Biológica e Ambiental.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Fisher Chemical | A955-4L | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-5G | |
| EDTA, 500mM Solution, pH 8.0 | EMD Millipore Corp | 324504-500mL | |
| Formic Acid | Thermo Scientific | 28905 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma | G3272-100G | |
| MgCl2 | Sigma | M8266-100G | |
| Potassium phosphate, dibasic | Sigma | P3786-100G | |
| Protease Inhibitor Cocktail, cOmplete tablets | Roche | 5892791001 | |
| Sodium butyrate | Sigma | 303410-5G | Used for histone deacetylase inhibitor |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma | S1888 | |
| Sodium Fluoride | Sigma | S7020-100G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 450243-10G | Used for phosphatase inhibitor |
| Sucrose | Sigma | S7903-5KG | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-500 g | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-100ML | |
| Weak cation exchange resin, mesh 100-200 analytical (BioRex70) | Bio-Rad | 142-5842 | |
| Disposables | |||
| Chromatography column (Bio-Spin) | BIO-RAD | 732-6008 | |
| Mesh 100 filter cloth | Millipore Sigma | NY1H09000 | This is part of the Sigma kit (catalog # CELLYTPN1) for plant nuclei extraction. Similar filters with the same mesh size can be used. |
| Micropipette tips (P20, P200, P1000) | Sigma | ||
| Tube, 50mL/15mL, Centrifuge, Conical | Genesee Scientific | 28-103 | |
| Tube, Microcentrifuge, 1.5/2 mL | Sigma | ||
| Equipment | |||
| Analytical Balance | Fisher Scientific | 01-912-401 | |
| Beakers (50mL – 2L) | |||
| Microcentrifuge with cooling | Fisher Scientific | 13-690-006 | |
| Micropipettes | |||
| Swinging-bucket centrifuge with cooling | Fisher Scientific | ||
| Vortex | Fisher Scientific | 50-728-002 | |
| Water bath Sonicator | Fisher Scientific | 15-336-120 |
References
- Farooq, M., Wahid, A., Kobayashi, N., Fujita, D., Basra, S. M. A. Plant drought stress: Effects, mechanisms and management. Agronomy for Sustainable Development. , 153-188 (2009).
- Dai, A. Drought under global warming: a review. Wiley Interdisciplinary Reviews: Climate Change. 2 (1), 45-65 (2011).
- Rooney, W. L., Blumenthal, J., Bean, B., Mullet, J. E. Designing sorghum as a dedicated bioenergy feedstock. Biofuels, Bioproducts and Biorefining. 1 (2), 147-157 (2007).
- Mullet, J. E., Klein, R. R., Klein, P. E. Sorghum bicolor - an important species for comparative grass genomics and a source of beneficial genes for agriculture. Current Opinion in Plant Biology. 5 (2), 118-121 (2002).
- Xu, L., et al. Drought delays development of the sorghum root microbiome and enriches for monoderm bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4284-4293 (2018).
- Gao, C., et al. Strong succession in arbuscular mycorrhizal fungal communities. ISME Journal. 13 (1), 214-226 (2019).
- Gao, C., et al. Fungal community assembly in drought-stressed sorghum shows stochasticity, selection, and universal ecological dynamics. Nature Communications. 11 (1), (2020).
- Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
- Yuan, L., Liu, X., Luo, M., Yang, S., Wu, K. Involvement of histone modifications in plant abiotic stress responses. Journal of Integrative Plant Biology. 55 (10), 892-901 (2013).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews. Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
- Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. Quantitative proteomic analysis of histone modifications. Chemical Reviews. 115 (6), 2376-2418 (2015).
- Moradian, A., Kalli, A., Sweredoski, M. J., Hess, S. The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).
- Sidoli, S., Garcia, B. A. Characterization of individual histone posttranslational modifications and their combinatorial patterns by mass spectrometry-based proteomics strategies. Methods in Molecular Biology. 1528, Clifton, N.J. 121-148 (2017).
- Maile, T. M., et al. Mass spectrometric quantification of histone post-translational modifications by a hybrid chemical labeling method. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (4), 1148-1158 (2015).
- Dang, X., et al. The first pilot project of the consortium for top-down proteomics: a status report. Proteomics. 14 (10), 1130-1140 (2014).
- Schaffer, L. V., et al. Identification and quantification of proteoforms by mass spectrometry. Proteomics. 19 (10), 1800361 (2019).
- Cupp-Sutton, K. A., Wu, S. High-throughput quantitative top-down proteomics. Molecular Omics. , (2020).
- Varoquaux, N., et al. Transcriptomic analysis of field-droughted sorghum from seedling to maturity reveals biotic and metabolic responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (52), 27124 (2019).
- Gordon, J. A. Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor. Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).
- Zhou, M., et al. Profiling changes in histone post-translational modifications by top-down mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1507, Clifton, N.J. 153-168 (2017).
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- Kou, Q., Xun, L., Liu, X. TopPIC: a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization. Bioinformatics (Ocford, England). 32 (22), (2016).
- Park, J., et al. Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics. Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).
- LeDuc, R. D., et al. The C-Score: a bayesian framework to sharply improve proteoform scoring in high-throughput top down proteomics. Journal of Proteome Research. 13 (7), 3231-3240 (2014).
- Fornelli, L., et al. Advancing top-down analysis of the human proteome using a benchtop quadrupole-orbitrap mass spectrometer. Journal of Proteome Research. 16 (2), 609-618 (2017).
- Sun, R. X., et al. pTop 1.0: A high-accuracy and high-efficiency search engine for intact protein identification. Analytical Chemistry. 88 (6), 3082-3090 (2016).
- Xiao, K., Yu, F., Tian, Z. Top-down protein identification using isotopic envelope fingerprinting. Journal of Proteomics. 152, 41-47 (2017).
- Cai, W., et al. MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (2), 703-714 (2016).
- Zhou, M., et al. Top-down mass spectrometry of histone modifications in sorghum reveals potential epigenetic markers for drought acclimation. Methods. , San Diego, Calif. (2019).
- Garcia, B. A., Pesavento, J. J., Mizzen, C. A., Kelleher, N. L. Pervasive combinatorial modification of histone H3 in human cells. Nature Methods. 4 (6), 487-489 (2007).
- Zheng, Y., et al. Unabridged analysis of human histone H3 by differential top-down mass spectrometry reveals hypermethylated proteoforms from MMSET/NSD2 overexpression. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (3), 776-790 (2016).
- Garcia, B. A., et al. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).
- Holt, M. V., Wang, T., Young, N. L. One-pot quantitative top- and middle-down analysis of GluC-digested histone H4. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 30 (12), 2514-2525 (2019).
- Tian, Z., et al. Enhanced top-down characterization of histone post-translational modifications. Genome Biology. 13 (10), (2012).
- Wang, Z., Ma, H., Smith, K., Wu, S. Two-dimensional separation using high-pH and low-pH reversed phase liquid chromatography for top-down proteomics. International Journal of Mass Spectrometry. 427, 43-51 (2018).
- Gargano, A. F. G., et al. Increasing the separation capacity of intact histone proteoforms chromatography coupling online weak cation exchange-HILIC to reversed phase LC UVPD-HRMS. Journal of Proteome Research. 17 (11), 3791-3800 (2018).
