Summary
この記事では、発達および進化研究の新たなモデルであるメキシコの四元 アスティアナックス・メキシカンスで最大産卵を刺激するための、インクリメンタル温度体制の基本的な実験室条件とプロトコルを概説する。
Abstract
メキシコのテトラ、 アスティアナックス・メキシカンスは、開発と進化の研究のための新興モデルシステムです。この種における目の表面(表面魚)と盲目の洞窟(洞窟魚)のモーフの存在は、形態学的および行動進化の根底にあるメカニズムを尋問する機会を提供する。洞窟の魚は、新しい建設的で回帰的な形質を進化させてきた。建設的な変化には、味覚芽と顎、横線感覚器官、体脂肪の増加が含まれる。回帰的な変化には、目の喪失または減少が含まれる。メラニン色素沈着,学校教育行動,攻撃性,睡眠これらの変化を実験的に尋問するには、大量の産卵胚を得ることが重要である。元の A.メキシカンス 表面魚と洞窟魚が1990年代にテキサス州とメキシコで収集されて以来、その子孫はジェフリー研究所で毎月2回多くの胚を繁殖させ、産卵するように日常的に刺激されてきました。繁殖は食物の豊富さと品質、明暗サイクル、温度によって制御されていますが、増分温度変化が最大産卵を刺激する上で重要な役割を果たしていることが分かっています。繁殖週の最初の3日間の温度が72°Fから78 °Fに徐々に上昇すると、2〜3回連続で産卵日が最大の高品質胚を提供し、その後、産卵週の最後の3日間に78°Fから72°Fに徐々に温度が低下します。このビデオに示す手順は、増分温度刺激産卵のための実験室の繁殖週の前および間のワークフローを概説する。
Introduction
テレオスト・アスティアナックス・メキシカンスは、目の表面住居(表面魚)の形をしており、多くの異なる盲目の洞窟住居(洞窟魚)が1、2を形成しています。洞窟の魚は永遠の暗闇の中で進化し、食品の限界の下で、新しい建設的で回帰的な形質の出現をもたらしました 3.建設的な特徴は、味覚芽と顎のサイズの増加、横線の感覚器官、および脂肪の埋蔵量を含む。回帰的な特徴には、メラニンの色素沈着、目、睡眠、学校教育、攻撃性などの行動の喪失または減少が含まれます。アスティヤナックス系の属性は、2つの形態間の完全な生殖能力であり、定量的形質遺伝子座(QTL)マッピングを使用して、建設的かつ回帰的な進化4、5、6、7に関連するゲノム領域を決定することを可能にする。A. メキシカンスは、実験室で頻繁に産卵するように誘導することができるので、開発を研究するための有利なシステムを提供しています。A.メキシカンスの胚は半透明で、ゼブラフィッシュよりもわずかに大きく、大量に産生され、約8〜12ヶ月で性的に成熟した成人に発展する。最大産卵能力の期間は約5年です。このプロトコルは、典型的な繁殖週にA.メキシカンス培養施設で必要なワークフローを記述し、魚のシステムのメンテナンスの詳細と最大産卵のための温度制御体制が含まれています。
A. メキシカンス は、石灰岩の高原(表面魚)に由来する川に生息する熱帯魚で、石灰岩の洞窟(洞窟魚)8のプールに生息しています。石灰岩は溶解して硬水を生成し 、A.メキシカンは 硬水で繁栄します。硬水条件に適応した魚は、塩辛い条件の範囲を許容することができますが、一般的に特定のもの9で繁殖します。産卵行動の誘導は、因子の組み合わせによって達成される。魚は冷血で恒常性を維持するために環境に依存しているため、その代謝は環境変化に敏感であり、ストレッサー10に対してより迅速に反応する。 A. メキシカンは 、水流、pH、導電性、浸透圧、照明、水温の厳重に規制された条件下で水生系で培養する必要があります。
ジェフリー研究所では、魚は2つの流水システムで維持されています:(1)性的成熟前の若い成人魚のための「赤ちゃんシステム」と(2)性的に成熟した、繁殖大人のための大人(またはメイン)システム。「ベビーシステム」は、流水を供給する8Lと15Lタンクで構成されています。「ベビーシステム」は、幼虫から成長した稚魚と若い変態の少年が、毎週水を交換する小さな(1-10 L)タンクで播種します。幼虫、稚魚、および少年は非常に食物に依存しており、生存率が高いように、1日1回生きた食物(塩水エビ)を与えなければなりません。「赤ちゃんシステム」の若い少年は、約1〜1.5年後に成人システムに入れられます。最初は、粉砕されたテトラフレークを与えられ、さらなる成長の後、彼らは通常の成人給餌体制に移される。性的成熟度は女性の腹部容積によって評価され、および性を決定するための方法が11に記載されている。大人のシステムでは、水は24時間に3回42 Lタンクで自動的に交換されます。大人のシステムは目視点検および自動温度、pHおよび調査からの伝導率の読書によって毎日監視される。最適なpHは7.4前後で、6.8~7.5、ベース温度は72/73°F、理想的な導電率は600~800mSの範囲で、コントローラ画面に自動読み取り値が表示され、システム全体に分布する流量計で水圧の視覚的なチェックが読み取られます。水質に関する独立したチェックは、温度をテストし、測色試験を用いてpH、アンモニア、硝酸塩の水質パラメータを測定することによって毎週行われます。アンモニアおよび硝酸塩レベルは、有益な細菌(例えば、ヌタフィンサイクル)をシステムに加えることによってゼロに近い状態に保たれます。室内照明は、14時間光と10時間の暗い期間に調整されたタイマーによって制御されます。上記の全体的な水質パラメータに加えて、次の考慮事項は、繁殖週に特別な注意が必要です。
最初の考慮事項は、魚(実験室の洞窟魚でさえ)が概日時計を設定するために光サイクルに依存するので、光周期です。概日リズムは、繁殖や摂食から免疫系の健康12、13に至るまですべてに影響を与えることができ、最大の健康上の利点のために一貫している必要があります。魚は14時間光と10時間の暗い光周期で流水システムで維持されます。表面魚は一般的に、システムが暗くなってから1時間後に産卵を開始し、この期間中に導入された光は産卵を妨げ、終了する可能性があります。盲目の洞窟魚の産卵は光によってあまり邪魔されない。表面魚の産卵と比較して、洞窟魚の産卵は遅れ、通常はシステムが暗くなってから4〜5時間後に始まる。
第二の考慮事項は栄養です。成魚は通常、1日1回テトラフレークの食事を与えられています。産卵前に、魚は余分な量のテトラフレークやその他の食べ物を補ったタンパク質が豊富な食事を与えられる:卵黄フレークと時折生きているカリフォルニアの黒虫(Lumbriculus variegatus)は、前の産卵サイクル中の卵生産によるタンパク質損失を補う。繁殖週には、魚は1日2回、朝に1回、午後/夕方に再び餌を与えられる。魚は1日に1回だけ餌を与えるが、食物の単一の非常に大きな部分で、これは栄養失調を引き起こす可能性がありますので、避けるべきです 14.
3つ目の考慮事項はスペースです。スペース要件は、成人の平均体重に加えて、魚が学校教育行動や攻撃的な行動を持っているかどうかなどの行動上の考慮事項に基づいています。オーバーまたは混雑不足のタンクは、攻撃性の高まりと一定のストレスを引き起こし、魚はタンク仲間からの怪我に対して脆弱になり、産卵15に参加するのを嫌がる可能性があります。私たちは通常、42 Lタンクあたり10〜20匹の魚を収容します。
4つ目の考慮事項は温度です。前述のように、魚は冷血動物であり、体温を維持するために環境に依存しています。温度は代謝過程に直接影響を及ぼすため、温度の変化は魚16の行動変化を引き起こす可能性がある。この繁殖プログラムは、温度の2週間のサイクルで構成されています:最初の週は78 °Fに温度スパイクを導入し、次の週は72 °Fの静電気温度を維持します。 最初の(繁殖)週の間に、プラスチック縁の繁殖網は毎晩タンクの底に置かれます。繁殖網は、タンク内の魚と産卵卵の間の障壁として機能し、そうでなければ消費されるであろう。気温は週の半ばまでに1日あたり2°F上昇して最大78°Fに上昇し、今週の最初の2〜3日の夜に光サイクルに従って産卵が誘発される。その後、週の残りの日に温度を72 °Fに2°Fずつ下げ、次の繁殖週の初めまでベース温度を維持します。繁殖は通常、魚の回復時間を可能にするために月に2回以下に刺激されます。
全体的に、この方法は、より長い期間にわたって最高品質の胚を大量に産出することを可能にする。
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Protocol
この手順は、メリーランド大学の施設動物ケアガイドラインによって承認されています, カレッジパーク (現在 IACUC 469 #R-NOV-18-59;プロジェクト 1241065-1)。
図 1.繁殖週と非繁殖週の間のカレンダー。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
1. 月曜日
- 午前9時から午前10時に、水のテストと手順1.1.1-4を以下に実行します。
- 温度計を使用して、部屋、タンク、およびリザーバの温度を記録します。
- アンモニア、硝酸塩、硝酸塩のレベルを、比色テストキットで記録します。
- モニター・システムからのpHと、色測定テスト・キットを記録します。
- カーボイモニターとメインシステムモニターからの導電率を記録します。
- 午前10時から、すべての魚に餌を与えます。
- 若い魚でタンク内のフレークを粉砕し、テトラフレークで大人のシステム内のすべての魚を養います。魚のタンクと同じくらい多くのフレークを供給するだけで、3〜5分で完全に消費することができます, 約 "指ピンチ".
- 胚を開発するフィンガーボウルを収容し、必要に応じて水を交換するために使用されるインキュベーターをチェックしてください。
- 胚インキュベーターを開き、すべての貯水槽の水位を確認します。水が少ない場合は、システムの水を追加します。インキュベーター温度設定を確認します。胚を73-77 °F(23-25°C)で上げる。
- クリーンライブフィード。
- 黒虫をきれいにするには、生きた飼料冷蔵庫から培養物を含む発見されたタッパーウェア盆地を取り除き、ワームクラスターの上の余分な水を流しに注ぎます。蒸留水を使用して、注ぐ水が透明になるまでワームを繰り返し中断し、すすいでください。
- ワームクラスターが約半分をカバーするように十分なきれいな水を追加します。ライブフィード冷蔵庫の残りのワームを交換します。
- 魚を養う。
- 最初の給餌の少なくとも30分後に、卵黄フレーク、ブラックワーム、またはその両方で繁殖が望まれるタンク内の魚を養う。タンクごとに黄身フレークの「指ピンチ」を追加します。タンク内の各魚が約5〜10ワームを消費できるように十分なブラックワームクラスターを追加します。
- 午前10時から午後1時に、水温を74°Fに設定します。
- 必要に応じて飼育タンクをスクラブし、繁殖網を設定します。
- タンクをきれいにし、最後の給餌の少なくとも1時間後にネットを配置します。ネットが事前に配置されているすべてのタンクをきれいにします。タンクへの空気供給を妨げないように、慎重に飼育網を設定します。
2. 火曜日
- 胚を収集し、すべての繁殖網を洗浄します。
- 9-10 AMで、成体系タンクの底から繁殖網を取り除きます。カーボイに取り付けられたホースを使用して胚を手持ち型のネットにそっと洗い流し、手持ちの網をきれいなシステム水のフィンガーボウルに反転させて胚を追い出します。
- 胚の各セットを収集し、洗浄し、0.00003%メチレンブルー(青水)を含むきれいなシステム水のフィンガーボウルに入れます。1つのタンクから非常に多くの胚がある場合は、それらを複数のボウルに分離します。生きている胚の濃度は、各フィンガーボウルに青い水の200 mLあたり約100でなければなりません。
- 公表された A.メキシコの 発達時間表17を用いて顕微鏡下で胚をステージングすることによって受精の時間を推定する。
- 胚を含むフィンガーボウルを頻繁に監視する。食べられない食べ物やフェースなどの死んだまたは変形した胚や破片をパスツールピペットで取り除きます。指のボウルの青い水を頻繁に交換してください。
- 5~7日間、指のボウルをインキュベーターに入れます。このとき、黄身が使い切られ、さらに発達するためには生きた塩水エビを培養する必要がある。
- スポーンデータを取得します。
- 胚を落とすタンクごとに、以下の情報を記録します。
- 日付とタンク番号を記録します。
- ドロップされた胚のおおよその数を記録します(図2):
高 (500+)
ミディアム (200-500)
低 (<200) - 落とされた胚の品質を記録する (図 2):
高(生きている>75%)
ミディアム(25-50%生きている)
低 (<25% 生きている) - アスティアナックスメキシメサスステージング表17を参照して、元の産卵時間を見積もります。
- 魚が産卵したときのシステムの温度を記録します。
- 胚を落とすタンクごとに、以下の情報を記録します。
- すべての魚を養います。
- 水温を76°Fに設定します。
- ライブフィードを準備します。
- 魚の#2を養う。
- ネットをリセットする前に、タンクやスクラブから余分な食べ物や破片をすくいます。
3. 水曜日
- 手順 2.1 ~ 2.2 を繰り返します。胚を収集し、すべての繁殖網を洗浄します。
- 以前と同じスポーンデータを取る。
- 以前と同様に水のテストを実行します。
- すべての魚を養います。
- 水温を78°Fに設定します。
- ライブフィードを準備します。
- インキュベーターの胚を確認してください。
- 最終的に一般的な大人の繁殖ストックを補充するために使用されるフィンガーボウルで胚の水をきれいにし、変更します。メチレンブルー処理系水を使用してください。
- 再び魚を養う。
- 必要に応じてタンクを清掃し、ネットをリセットします。
4. 木曜日
- 手順 2.1 ~ 2.2 を繰り返します。胚を収集し、繁殖網を洗浄し、保存します。
- 以前と同じスポーンデータを取る。
- 水温を76°Fに設定します。
- ライブフィードをクリーニングします。
- すべての個々のタンクをきれいにします。
- インキュベーターの胚を確認してください。
- 魚の#2を養う。
5. 金曜日
- すべての魚を養います。
- 水温を74°Fに設定します。
- ライブフィードをクリーニングします。
- インキュベーターの胚を確認してください。
6. 土曜日
- 魚を養う。
7. 日曜日
- 魚を養う。
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Representative Results
私たちは一般的に、サンルイスポトシのナシミエント・デル・リオ・チョイでもともと収集された表面魚の子孫を繁殖させ、産卵します。 メキシコ(リオチョイ表面魚)とサンソロモンスプリングスのバルモラ州立公園、テキサス州(テキサス州表面魚)、メキシコのタマウリパス州のクエバ・デ・エル・パチョン(パチョン洞窟魚)、クエバ・デ・ロス・サビノス(ロス・サビノス洞窟魚)とソタノ・デ・ラ・ティナハ(ティナハ洞窟魚)メキシコ。
繁殖週を通して、様々なタンクのデータが収集されます。各タンクで産卵した胚は、量と品質のために観察される。数量は、高、中、または低として記録されます。ドロップされた胚の数が500を超える場合は高い量が記録され、投下された胚の数が200~500の間であれば培地の量が記録され、減少した胚の数が200未満の場合は低い量が記録される。品質は、同様に高、中、または低として記録されます。ボウル内の胚の75%以上が生きている場合は高い品質が記録され、ボウル内の胚の約25%から75%が生きている場合は培地の品質が記録され、胚の25%未満が生きている場合は低い品質が記録される。次に、数量と品質のこれらの表示は、高い 3、中が 2、低い 1 の数値が割り当てられます。産卵中に発生した胚がなかったり、生きている胚がなかったりすると、0の数が割り当てられます。
2017年7月から2020年3月にかけて、リオ・チョイとテキサスの表面魚、ロス・サビノス、ティナジャ、パチョン洞窟の魚の繁殖データを 図2に示す。データは、繁殖週と単一の繁殖週の間に胚を収集した各日から生じる数を平均することによって分析された。データは、繁殖がリオチョイとテキサス表面魚とパチョン洞窟の魚で年間を通じて連続的だったことを示しています。ほとんどのリオチョイ表面魚の量と品質は低いと高い間でした, ほとんどのテキサス表面魚とパチョン洞窟魚の量と品質は、低と中の間にあった間.産卵の発生はティナジャまたはロスサビノス洞窟魚では連続していなかった:産卵は晩夏(7月)から秋(10月)の間に低かったか存在しなかった。産卵の最も低いレベルは、ロスサビノス洞窟の魚のために記録されたが、, 胚の品質は最高でした.一般的に、表面魚は洞窟魚よりも産卵量と質が良いことを示しています。
図 2.2017年7月から2020年3月までの異なる表面魚や洞窟魚の繁殖データ。 上から下までリオチョイ表面魚、テキサス表面魚、パチョン洞窟魚、ティナジャ洞窟魚、ロスサビノス洞窟魚です。切れ目のない線:スポーンの質。破線: スポーンの数量。行のない週は、産卵が試行されなかった期間を表します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
アスティアナックスメキシカンスは、頻繁に発生し、実験室1、2で容易に飼育することができる新しい生物学的モデルです。私たちは、A.メキシカン洞窟魚の進化的変化の根源となる発達メカニズムに興味を持っているので、胚の生産と使用は、私たちの研究目標に不可欠です。魚の成虫ストックを維持する主な目的は、発達実験や成虫飼育ストックの補充のために使用する胚と若い稚魚の生産です。時折、成人は生理学、行動、または遺伝子実験にも使用される。遺伝子実験では、ペアの交配または体外受精18が必要です。産卵行動19を示す体外受精動物については、タンクから除去され、温度誘発性繁殖体制の間に十字架に使用され得る。
研究のための胚の質と量を最大化するために、繁殖週の前に注意を必要とする運用上の詳細があります。タンク内の魚を操作するときは、指定された手持ちネットのみを使用し、各使用の間にネット浸漬溶液に浸し、タンク間の汚染を防ぐために使用間に熱い水道水でリンスします。魚の世話に使用されるすべての器具を慎重に洗浄し、消毒します。タンクに交換する前に、システム水の中の繁殖網を取り除いて清掃してください。週の終わりに、すべての繁殖網は魚の部屋の棚に乾燥して保存されます。繁殖週には、各タンクの繁殖網の胚や産卵行動を示す魚(つまり、互いに対して円の中を泳いでいる)がないか、それらのタンクのメスが産卵する可能性が高いようにチェックします。これは、光周期の暗い時間の間に赤信号を使用して行われるべきです。 A. メキシカンは 、雲の中に卵と精子を散乱させることによって暗闇の中で産卵します。人口が約10~20匹、オスとメスの比率が約1:1のタンクは、1つの産卵で最大500個の受精胚を生成することができ、魚の各タンクは1回の繁殖週に2〜3回産卵する可能性があります。良い産卵では、ほとんどの胚は、重要な段階である孵化によって生き残ります。培養は頻繁に検査され、未受精卵、死んだまたは変形した胚、または食品残骸または寄生虫を含む破片を除去すべきである。主に生きている胚を持つ培養物は、パスツールピペットを使用して死んだまたは異常な胚(最終的に死ぬ)および破片を手動で除去することによって、胚および初期の幼虫期間中に数時間ごとに「洗浄」されるべきである。死んだ胚の大部分を持つ培養は、通常発達している胚を新鮮な青い水で新しいフィンガーボウルに移すことによって使用することができます。通常、このプロセスは、生きている胚の最も純粋な培養物を得るために数回繰り返されなければならない。いずれの場合も、胚の混雑は特に洞窟魚の発達に影響を与える可能性があるため、200mLあたり約100個の胚の最終濃度が理想的です。培養は、定期的にフィンガーボウルから水のほとんどを除去し、新鮮な青い水に置き換えることによって、時間の経過とともにさらに「きれいに」する必要があります。「洗浄」する培養物は、しばしば、しばしば、胚の最高品質を提供する。
自然繁殖に加えて、ホルモン刺激20 または体外受精18 も胚の取得に有用である可能性がある。しかし、これらの目的のために、魚は健康で自然産卵の準備ができている必要があり(産卵行動を示す)、温度誘発産卵条件下で得られるよりも胚の収量ははるかに小さいと予想されるべきである。
上記の条件下での温度誘発性繁殖の制限は、表面魚と洞窟魚が異なる時間に産卵し、前者は夕方の間に、後者は真夜中以降から早朝まで産卵することである。通常、定期的な給餌や魚類のシステムメンテナンスは、サイクルの軽い(昼間)の期間に行う必要があるため、この状況は、光周期をシフトさせることによって回避することはできません。しかし、原則として、2つのモーフを異なる明暗サイクル(および異なる魚の飼育システム)に維持して、近い同時産卵を行うことで、同様の時間に魚が産卵するようにスケジュールを調整することができます。さらに、2つの温度制御システムが利用可能であれば、魚は異なるシステムで培養することができ、毎週の温度上昇を交互に行うことによって、産卵は隔月のスケジュールではなく毎週行うことができ、胚を得るための能力を倍増させる。
科学研究、教育、バイオテクノロジーに使用されるかどうかにかかわらず、A.メキシカンウスは、開発の進化を取り巻く魅力的な質問を探求するための優れたモデルシステムです。科学的研究では、このシステムは、眼の発達と疾患の分子、遺伝的、および進化的メカニズムを調査するのに有用である。目は、その構造、機能、および発達の点で異常な器官です。いくつかの異なる眼組織の協調形成および成長の結果として、胚発生中に視力が獲得される。これが起こる正確なメカニズムはまだほとんど知られていません。哺乳類と魚の目の構造は似ています。A.メキシカンスの自然な眼の現象型は、眼の発達および変性21、22に関与する分子および細胞機構および遺伝的経路を探索するための優れたモデルシステムである。この知識は、遺伝性眼疾患の予防戦略と治療法の開発に使用することができます。色素沈着研究は、A.メキシカンのsが貴重な貢献をしている別の分野です23.教育では、A.メキシカン胚を使用して、胚発生の一般的な原則と初めの学生のための教育実験を説明することができます。バイオテクノロジーでは、ゲノムDNA編集24、特にCRISPR/Cas-9ゲノム工学技術25の開発に伴い、A.メキシカン胚は遺伝子機能を探索する貴重なリソースです。これらのアプリケーションのそれぞれは、この通信で説明された増分温度の繁殖体制によって達成することができる高品質の胚の大量の産卵によって助け.
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
デビッド・マータシアン、ディードレ・ヘイザー、エイミー・パークハースト、クレイグ・フット、マンディ・ンのジェフリー研究所 A.メキシカン文化 施設への貴重な貢献に感謝します。ジェフリー研究所の研究は現在、NIH助成金EY024941によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blackworms | Eastern Aquatics, Lancaster, PA | None | |
| Breeding Nets | Custom made | ||
| Brine shrimp eggs | AquaCave Lake Forest, IL. | None | |
| Colorimetric test kit | Petco | SKU:11916 | API Freshwater pH Test Kit |
| Egg yolk flakes | Pentair, Minneapolis, MN | None | |
| Fingerbowls | Carolina Biological Supply | 741004 | Culture dishes, 4.5 in, 250 mL |
| Hand held nets | Any Pet Store | ||
| Incubator for embryos | Fisher Scientific | 51-029-321HPM | 405 L |
| Instant Ocean sea salts | Spectrum Brands, Blacksburg, VA | None | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M9140 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20 | 5.75 in. |
| Net soaking solution | Any Pet Store | ||
| Nutrafin Cycle | Amazon | None | Bacterial boost |
| Refrigerator for live feed | Any source | ||
| Stereomicroscope | Any source | ||
| Thermometer | Any source | ||
| Tetra Tropical Crisps | Spectrum Brands, Blacksburg, VA | None |
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