Summary
Bu makale, gelişimsel ve evrimsel çalışmalar için ortaya çıkan bir model olan Meksika tetra Astyanax mexicanus'tamaksimum yumurtlamayı teşvik etmek için artımlı bir sıcaklık rejimi için temel laboratuvar koşullarını ve protokollerini özetlemektedir.
Abstract
Meksika tetrası, Astyanax mexicanus, gelişim ve evrim çalışmaları için gelişmekte olan bir model sistemidir. Bu türdeki göz yüzeyi (yüzey balıkları) ve kör mağara (mağara balıkları) morflarının varlığı, morfolojik ve davranışsal evrimin altında kalan mekanizmaları sorgulamak için bir fırsat sunun. Mağara balıkları yeni yapıcı ve gerici özellikler geliştirmişler. Yapıcı değişiklikler arasında tat tomurcukları ve çenelerdeki artışlar, yanal çizgi duyu organları ve vücut yağları bulunur. Gerileyen değişiklikler arasında gözlerin kaybı veya azalması yer almaktadır. melanin pigmentasyonu, okul davranışı, saldırganlık ve uyku. Bu değişiklikleri deneysel olarak sorgulamak için, çok sayıda yumurtlanmış embriyo elde etmek çok önemlidir. Orijinal A. mexicanus yüzey balıkları ve mağara balıkları 1990'larda Teksas ve Meksika'da toplandığından beri, torunları Jeffery laboratuvarında iki ayda bir çok sayıda embriyo yetiştirmeleri ve doğurmaları için rutin olarak uyarıldı. Üreme gıda bolluğu ve kalitesi, açık-karanlık döngüler ve sıcaklık tarafından kontrol edilmesine rağmen, artımlı sıcaklık değişikliklerinin maksimum yumurtlamayı teşvik etmede önemli bir rol oynadığını bulduk. Bir üreme haftasının ilk üç gününde sıcaklığın 72 ° F'den 78 ° F'ye kademeli olarak artması, maksimum sayıda yüksek kaliteli embriyo ile art arda iki-üç yumurtlama günü sağlar ve ardından yumurtlama haftasının son üç gününde sıcaklığın kademeli olarak 78 ° F'den 72 ° F'ye düşmesi takip edilir. Bu videoda gösterilen prosedürler, artımlı sıcaklık uyarılmış yumurtlama için bir laboratuvar üreme haftasından önce ve sırasında iş akışını özetler.
Introduction
Teleost Astyanax mexicanus, yüzeyde yaşayan (yüzey balığı) bir forma sahiptir ve birçok farklı kör mağarada yaşayan (mağara balığı)form 1,2. Mağara balıkları sürekli karanlıkta ve yiyecek sınırlamaları altında evrimleşmiştir, bu da yeni yapıcı ve gerileyen özelliklerin ortaya çıkmasına neden3. Yapıcı özellikler arasında tat tomurcukları ve çene büyüklüğündeki artışlar, yanal çizginin duyu organları ve yağ rezervleri bulunur. Regresif özellikler melanin pigmentasyonunun, gözlerin ve uyku, okul ve saldırganlık gibi davranışların kaybını veya azaltılmasını içerir. Astyanax sisteminin bir özelliği, yapıcı ve gerici evrim4,5,6,7ile ilişkili genomik bölgeleri belirlemek için nicel özellik loci (QTL) eşlemesinin kullanılmasına izin vererek iki form arasındaki tam doğurganlıktır. A. mexicanus, laboratuvarda sık sık yumurtlamaya indüklenebildiğinden, gelişimi incelemek için avantajlı bir sistem sunar. A. mexicanus embriyoları yarı saydamdır, zebra balıklarından biraz daha büyüktür, büyük miktarlarda üretilir ve yaklaşık 8-12 ay içinde cinsel olarak olgun yetişkinlere dönüşür. Maksimum yumurtlama kapasiteleri yaklaşık 5 yıldır. Bu protokol, tipik bir üreme haftasında bir A. mexicanus kültür tesisinde ihtiyaç duyulan iş akışını açıklar ve balık sistemi bakımı ve maksimum yumurtlama için sıcaklık kontrol rejiminin ayrıntılarını içerir.
A. mexicanus kireçtaşı platolarından (yüzey balıkları) kaynaklanan nehirlerde ve kireçtaşı mağaralarındaki havuzlarda (mağara balıkları) yaşayan tropikal bir balıktır8. Kireçtaşı sert su üretmek için çözünür ve A. mexicanus sert suda gelişir. Sert su koşullarına uyarlanmış balıklar bir dizi tuzlu durumu tolere edebilir, ancak genellikle belirli olanlarda ürer9. Yumurtlama davranışının indüksiyonu faktörlerin bir kombinasyonu ile gerçekleştirilir. Balıklar soğukkanlı olduklarından ve homeostazlarını korumak için çevrelerine güvendikleri için, metabolizmaları çevresel değişikliklere duyarlıdır ve stresörlere daha hızlı tepki verirler10. A. mexicanus, su akışı, pH, iletkenlik, ozmotik basınç, aydınlatma ve su sıcaklıklarının özenle düzenlenmiş koşulları altında su sistemlerinde kültürlenmelidir.
Jeffery laboratuvarında, balıklar iki akan su sisteminde tutulur: (1) cinsel olgunluluk öncesinde genç yetişkin balıklar için bir "bebek sistemi" ve (2) cinsel olarak olgun, üreme yetişkinleri için yetişkin (veya ana) bir sistem. "Bebek sistemi", akan su ile birlikte verilen 8 L ve 15 L tanklardan oluşur. "Bebek sistemi", larvalardan yetiştirilen yavru ve genç metamorfozize yavrular tarafından daha küçük (1-10 L) tanklarda tohumlanır ve bu tanklarda haftalık olarak su alışverişi yapılır. Larvalar, yavrular ve gençler son derece gıdaya bağımlıdır ve yüksek oranda hayatta kalma sağlamak için günde bir kez canlı yiyeceklerle (salamura karides) beslenmelidir. "Bebek sisteminden" genç gençler yaklaşık 1-1,5 yıl sonra yetişkin sistemine yerleştirilir. İlk başta, toz haline getirilmiş tetra pulları ile beslenirler ve daha fazla büyümeden sonra normal yetişkin beslenme rejimine aktarılırlar. Cinsel olgunluk kadınlarda karın hacmi ile değerlendirilebilir ve cinsiyet belirleme yöntemleritanımlanmıştır 11. Yetişkin sisteminde, su 24 saatlik periyotta 3 kez 42 L tankta otomatik olarak değiştirilir. Yetişkin sistemi her gün görsel muayene ve problardan gelen otomatik sıcaklık, pH ve iletkenlik okumaları ile izlenir. Optimum pH yaklaşık 7,4'tür ve 6,8-7,5 arasında değişebilir, sistemin taban sıcaklığı 72/73 °F ve ideal iletkenlik 600-800 mS arasında değişir. Su kalitesi üzerinde bağımsız kontroller, renk ölçümü testi kullanılarak pH, amonyak ve nitrat için sıcaklık ve ölçüm suyu kalite parametrelerinin ölçülmesi ile haftalık olarak yapılır. Amonyak ve nitrat seviyeleri, sisteme yararlı bakteriler (örneğin Nutafin Döngüsü) eklenerek sıfıra yakın veya sıfıra yakın tutulur. Oda aydınlatması, 14 saatlik ışığa ve 10 saatlik karanlık periyotlara göre ayarlanmış bir zamanlayıcı ile kontrol edilir. Yukarıda belirtilen genel su kalitesi parametrelerine ek olarak, aşağıdaki hususların bir üreme haftasında özel dikkat edilmesi gerekir.
Balıklar (laboratuvardaki mağara balıkları bile) sirkadiyen saatlerini ayarlamak için ışık döngülerine bağlı olduğundan, ilk dikkat edilmesi gereken fotoperiyoddur. Sirkadiyen ritimler üreme ve beslenmeden bağışıklık sistemi sağlığına kadar her şeyi etkileyebilir12,13 ve maksimum sağlık yararları için tutarlı olmalıdır. Balıklar 14 saatlik ışık ve 10 saatlik karanlık fotoperiyod üzerinde akan su sisteminde tutulur. Yüzey balıkları genellikle sistem karardıktan bir saat sonra yumurtlamaya başlar ve bu süre zarfında tanıtılan ışık yumurtlamaya müdahale edebilir ve sonlandırabilir. Kör mağara balıklarının yumurtlaması ışıktan daha az rahatsızdır. Yüzey balıklarının yumurtlamasıyla karşılaştırıldığında, mağara balıklarının yumurtlaması gecikir, genellikle sistem karardıktan dört ila beş saat sonra başlar.
İkinci husus beslenmedir. Yetişkin balıklar normalde günde bir kez tetra gevreği diyeti ile beslenir. Yumurtlamadan önce, balıklar ekstra miktarlarda tetra gevreği ve diğer yiyeceklerle desteklenmiş protein bakımından zengin bir diyetle beslenir: yumurta sarısı gevreği ve bazen yaşayan Kaliforniya kara kurtları (Lumbriculus variegatus) önceki yumurtlama döngüsü sırasında yumurta üretimi nedeniyle protein kaybını telafi etmek için. Üreme haftasında, balıklar günde iki kez, sabah bir kez ve öğleden sonra / akşam tekrar beslenir. Günde sadece bir kez beslenen balıklar, ancak yiyeceklerin çok büyük bir kısmı ile kaçınılmalıdır, çünkü bu yetersiz beslenmeye neden olabilir14.
Üçüncü husus uzaydır. Alan gereksinimleri, bir yetişkinin ortalama vücut kütlesinin yanı sıra balıkların okul davranışına veya agresif davranışlara sahip olup olmadığı gibi davranışsal hususlara dayanmaktadır. Aşırı veya az kalabalık tanklar, artan saldırganlık ve sürekli strese yol açabilir, balıkları tank arkadaşlarının yaralanmasına karşı savunmasız hale getirir ve yumurtlamaya katılmak için isteksiz15. Genellikle 42 L tank başına 10-20 balık barındırıyoruz.
Dördüncü husus sıcaklıktır. Yukarıda belirtildiği gibi, balıklar soğukkanlı hayvanlardır ve vücut sıcaklığını korumak için çevreye güvenirler. Sıcaklığın metabolik süreçler üzerinde doğrudan bir etkisi olduğundan, sıcaklıktaki değişiklikler balıklarda davranış değişikliklerini tetikleyebilir16. Bu üreme programı sıcaklıkta iki haftalık döngülerden oluşur: ilk hafta 78 ° F'ye bir sıcaklık artışı sağlar ve ertesi hafta 72 ° F statik sıcaklığı korur. İlk (üreme) hafta boyunca, her akşam tankların dibine plastik kenarlı üreme ağları yerleştirilir. Üreme ağları, tanklardaki balıklar ile yumurtlanan yumurtalar arasında bir bariyer görevi görer, aksi takdirde tüketilir. Sıcaklık hafta ortasına kadar günde 2 ° F ile maksimum 78 ° F'ye yükseltilir ve yumurtlama bu haftanın ilk 2-3 akşamındaki ışık döngüsüne göre indüklendi. Sıcaklık daha sonra haftanın kalan günlerinde 2 ° F artışla 72 ° F'ye düşürülür ve baz sıcaklık bir sonraki üreme haftasının başına kadar korunur. Üreme genellikle balık zamanının iyileşmesine izin vermek için ayda en fazla iki kez uyarılır.
Genel olarak, bu yöntem daha uzun bir süre boyunca en yüksek kaliteli embriyoların büyük miktarlarda yumurtlasını sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu prosedür Maryland Üniversitesi, College Park Kurumsal Hayvan Bakımı yönergeleri tarafından onaylanmıştır (Şu anda IACUC 469 #R-NOV-18-59; Proje 1241065-1).
Şekil 1. Bir üreme haftası ve üreme dışı bir hafta boyunca takvimler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
1. Pazartesi
- Sabah 9-10'da su testleri yapın ve aşağıdaki 1.1.1-4.
- Bir termometre kullanarak oda, tank ve rezervuar sıcaklıklarını kaydedin.
- Amonyak, nitrat ve nitrat seviyelerini kolorimetrik test kiti ile kaydedin.
- pH'ı izleme sisteminden ve kolorimetrik test kitinden kaydedin.
- Kary çocuk monitöründen ve ana sistem monitöründen iletkenliği kaydedin.
- Sabah 10'dan itibaren tüm balıkları besleyin.
- Yetişkin sistemindeki tüm balıkları tetra pulları ile besleyin, tanklardaki pulları genç balıklarla ezin. Sadece bir balık tankı kadar pul besleyin, yaklaşık bir "parmak sıkışması" hakkında 3-5 dakika içinde tamamen tüketebilir.
- Gelişmekte olan embriyoların parmak tozlarını barındırmak için kullanılan inkübatörü kontrol edin ve gerekirse suyu değiştirin.
- Embriyo inkübatörü açın ve tüm rezervuarlardaki su seviyelerini kontrol edin. Suları azalıyorsa, sistem suyu ekleyin. İnkübatör sıcaklık ayarlarını kontrol edin. Embriyoları 73-77 °F (23-25 °C) arasında yükseltin.
- Canlı yayını temizleyin.
- Kara kurtları temizlemek için, kültürlerini içeren açığa çıkarılmış Tupperware havzalarını canlı yem buzdolabından çıkarın ve solucan kümelerinin üzerindeki fazla suyu lavaboya dökün. Damıtılmış su kullanarak, dökülen su temizlenene kadar solucanları tekrar tekrar askıya alın ve durulayın.
- Solucan kümelerinin yaklaşık yarısını kaplar şekilde yeterli temiz su ekleyin. Kalan solucanları, ortaya çıkarılan canlı yem buzdolabında değiştirin.
- Balıkları besle.
- İlk beslemeden en az 30 dakika sonra, yumurta sarısı gevreği, kara kurtlar veya her ikisi ile üremenin istendiği tanklarda balık besleyin. Tank başına bir "fingerpinch" yumurta sarısı gevreği ekleyin. Tanktaki her balığın yaklaşık 5-10 solucan tüketmesine izin vermek için yeterli kara kurt kümesi ekleyin.
- Saat 10:00-13:00'te su sıcaklığını 74 °F olarak ayarlayın.
- Üreme tanklarını gerektiği gibi ovalayın ve üreme ağlarını ayarlayın.
- Tankları temizleyin ve ağları son beslemeden en az bir saat sonra yerleştirin. Ağların önceden yerleştirilecek tüm tankları temizleyin. Tanka hava beslemesini engellememek için üreme ağlarını dikkatlice ayarlayın.
2. Salı
- Embriyoları toplayın ve tüm üreme ağlarını yıkayın.
- Sabah 9-10'da, üreme ağlarını yetişkin sistem tanklarının dibinden çıkarın. Karyobeze bağlı hortumu kullanarak embriyoları hafifçe el ağlarına durulayın ve embriyoları dışarı çıkarmak için elde tutulan ağı temiz sistem suyunun bir parmak tonuna çevirin.
- Her embriyo setini toplayıp yıkayın ve ardından% 0.00003 metilen mavisi (mavi su) içeren temiz sistem suyunun bir parmak tokasına yerleştirin. Tek bir tanktan son derece fazla sayıda embriyo varsa, bunları birden fazla kaseye ayırın. Canlı embriyoların konsantrasyonu, her bir parmak ırağında 200 mL mavi su başına yaklaşık 100 olmalıdır.
- Yayınlanan A. mexicanus gelişimsel zaman tablosu17kullanarak embriyoları mikroskop altında evreleyerek döllenme zamanını tahmin edin.
- Embriyo içeren parmaklıkları sık sık izleyin. Ölü veya deforme olmuş embriyoları ve yenmemiş yiyecekler veya dışkı gibi döküntüleri pastör pipetle çıkarın. Mavi suyu sık sık parmaklıklarda değiştirin.
- Parmaklıkları 5-7 gün boyunca bir inkübatöre yerleştirin. Şu anda, yumurta sarısı kullanılmıştır ve daha fazla gelişme için canlı salamura karides ile beslenme kültürleri gereklidir.
- Yumurtlama verilerini alın.
- Embriyoları düşüren her tank için aşağıdaki bilgileri kaydedin.
- Tarihi ve tank numarasını kaydedin.
- Düşen yaklaşık embriyo sayısını kaydedin (Şekil 2):
Yüksek (500+)
Orta (200-500)
Düşük(<200) - Düşen embriyoların kalitesini kaydedin (Şekil 2):
Yüksek (%>75 canlı)
Orta (%25-50 canlı)
Düşük (%<25 canlı) - Astyanax mexicanus hazırlama tablosu17'yedanışarak orijinal yumurtlama süresini tahmin edin.
- Balıklar yumurtladığında sistemin ayarlanan sıcaklığı kaydedin.
- Embriyoları düşüren her tank için aşağıdaki bilgileri kaydedin.
- Bütün balıkları besle.
- Su sıcaklığını 76 °F olarak ayarlayın.
- Canlı yayın hazırlayın.
- Balık #2 besleyin.
- Tanklardan fazla yiyecek ve döküntüleri kepçeyle temizleyin ve ağları sıfırlamadan önce ovalayın.
3. Çarşamba
- 2.1-2.2 arası adımları yineleyin. Embriyoları toplayın ve tüm üreme ağlarını yıkayın.
- Spawning verilerini daha önce olduğu gibi alın.
- Daha önce olduğu gibi su testleri yapın.
- Bütün balıkları besle.
- Su sıcaklığını 78 °F olarak ayarlayın.
- Canlı yayını hazırlayın.
- Kuluçka makinesindeki embriyoları kontrol et.
- Embriyoların suyunu, sonunda genel yetişkin üreme stoğunu yenilemek için kullanılacak olan parmaklıklarda temizleyin ve değiştirin. Metilen mavi arıtlı sistem suyu kullanın.
- Balıkları tekrar besle.
- Tankları gerektiği gibi temizleyin ve ağları sıfırlayın.
4. Perşembe
- 2.1-2.2 arası adımları yineleyin. Embriyoları toplayın ve üreme ağlarını yıkayın ve saklayın.
- Spawning verilerini daha önce olduğu gibi alın.
- Su sıcaklığını 76°F olarak ayarlayın.
- Canlı yayını temizleyin.
- Tüm tankları tek tek temizleyin.
- Kuluçka makinesindeki embriyoları kontrol et.
- Balık #2 besleyin.
5. Cuma
- Bütün balıkları besle.
- Su sıcaklığını 74 °F olarak ayarlayın.
- Canlı yayını temizleyin.
- Kuluçka makinesindeki embriyoları kontrol et.
6. Cumartesi
- Balıkları besle.
7. Pazar
- Balıkları besle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genellikle San Luis Potosi'deki Nacimiento del Rio Choy'da toplanan yüzey balıklarının torunlarını yetiştirir ve yumurtlarız. Meksika (Rio Choy yüzey balığı) ve San Solomon Springs Balmorhea Eyalet Parkı, Teksas (Teksas yüzey balıkları) ve Cueva de El Pachón (Pachón mağara balığı) Tamaulipas, Meksika'da türetilen mağara balıkları ve San Luis Potosi'deki Cueva de los Sabinos (Los Sabinos mağara balığı) ve Sotano de la Tinaja (Tinaja mağara balığı) Meksika.
Bir üreme haftası boyunca, çeşitli tanklar için veriler toplanır. Her tankta yumurtlanan embriyolar miktar ve kalite için gözlenir. Miktar yüksek, orta veya düşük olarak kaydedilir. Düşen embriyo sayısı 500'ün üzerindeyse yüksek bir miktar kaydedilir, düşen embriyo sayısı 200-500 arasındaysa bir miktar orta, düşen embriyo sayısı 200'den az ise düşük bir miktar kaydedilir. Kalite benzer şekilde yüksek, orta veya düşük olarak kaydedilir. Kasedeki embriyoların %75'inden fazlası canlıysa yüksek bir kalite kaydedilir, kasedeki embriyoların yaklaşık % 25 ila% 75'i canlıysa orta derece kaydedilir ve embriyoların% 25'inden azı yaşıyorsa düşük bir kalite kaydedilir. Bu miktar ve kalite göstergeleri daha sonra yüksek 3, orta 2 ve düşük 1 olan bir sayı atanır. Yumurtlamada embriyo veya canlı embriyo yoksa, 0 sayısı atanır.
Rio Choy ve Teksas yüzey balıkları ile Los Sabinos, Tinaja ve Pachón mağara balıkları için Temmuz 2017'den Mart 2020'ye kadar olan üreme verileri Şekil 2'degösterilmiştir. Veriler üreme haftası ile ve tek bir üreme haftasında embriyo toplamanın her gününden kaynaklanan sayıların ortalaması ile analiz edildi. Veriler, Rio Choy ve Teksas yüzey balıklarında ve Pachón mağara balıklarında üremenin yıl boyunca sürekli olduğunu göstermektedir. Çoğu Rio Choy yüzey balığının miktarı ve kalitesi düşük ve yüksek arasında, çoğu Teksas yüzey balığının ve Pachón mağara balıklarının miktarı ve kalitesi düşük ve orta arasındaydı. Yumurtlama oluşumu Tinaja veya Los Sabinos mağara balıklarında sürekli değildi: yumurtlama yaz sonunda (Temmuz) sonbahara (Ekim) kadar düşük veya yoktu. Los Sabinos mağara balıkları için en düşük yumurtlama seviyeleri kaydedilmiş olsa da, embriyoların kalitesi en iyisiydi. Genel olarak, yüzey balıkları mağara balıklarınınkinden daha iyi yumurtlama miktarı ve kalitesi gösterir.
Şekil 2. Temmuz 2017'den Mart 2020'ye kadar farklı yüzey balıkları ve mağara balığı popülasyonları için üreme verileri. Yukarıdan aşağıya Rio Choy yüzey balıkları, Teksas yüzey balıkları, Pachón mağara balıkları, Tinaja mağara balıkları ve Los Sabinos mağara balıkları vardır. Kırılmamış çizgiler: yumurtlama kalitesi. Kırık çizgiler: yumurtlama miktarı. Çizgi olmayan haftalar, yumurtlamanın denenmediği dönemleri temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Astyanax mexicanus, sık sık yumurtlayan ve laboratuvarda kolayca yetiştirilebilen yeni bir biyolojik modeldir1,2. A. mexicanus mağara balıklarındaki evrimsel değişimlerin altında yatan gelişimsel mekanizmalarla ilgilendiğimiz için embriyo üretimi ve kullanımı araştırma hedeflerimiz için hayati önem taşımaktadır. Yetişkin bir balık stoğunun korunmasının birincil amacı, gelişim deneylerinde kullanılmak ve yetişkin üreme stoklarının yenilenmesi için embriyoların ve genç yavruların üretimidir. Bazen yetişkinler fizyoloji, davranışsal veya genetik deneyler için de kullanılabilir. Genetik deneyler eşleştirilmiş çiftleşme veya in vitro fertilizasyon gerektirir18. Yumurtlama davranışı sergileyen in vitro döllenme hayvanları için19, sıcaklık kaynaklı üreme rejimi sırasında tanklardan çıkarılabilir ve haçlar için kullanılabilir.
Araştırma için embriyoların kalitesini ve miktarını en üst düzeye çıkarmak için, üreme haftasından önce dikkat gerektiren operasyonel detaylar vardır. Tanklardaki balıkları manipüle ederken, yalnızca belirlenmiş el ağlarını kullanın, her kullanım arasında bir ağ ıslatma çözeltisine daldırin ve tanklar arasındaki kirlenmeyi önlemek için kullanımlar arasında sıcak musluk suyu ile durulayın. Balık bakımı için kullanılan tüm aletleri dikkatlice yıkayın ve dezenfekte edin. Damızlık ağları tanklarda değiştirmeden önce sistem suyunda çıkarın ve temizleyin. Hafta sonunda, tüm üreme ağları balık odasındaki raflarda kuru olarak saklanır. Bir üreme haftasında, her tankın üreme ağlarındaki embriyolar veya yumurtlama davranışı sergileyen balıklar (yani, birbirleriyle eşleştirilmiş daireler halinde yüzme) için kontrol edin, çünkü bu tanklardaki dişiler muhtemelen yumurtlamaya hazırdır. Bu, fotoperiyod'un karanlık saatlerinde kırmızı ışık kullanılarak yapılmalıdır. A. mexicanus karanlıkta yumurta ve spermleri bulutlara saçarak doğar. Yaklaşık 10-20 balık popülasyonuna ve yaklaşık 1:1 erkek-dişi oranına sahip bir tank, tank başına bir yumurtlamada 500'e kadar döllenmiş embriyo üretebilir ve her balık tankı tek bir üreme haftası boyunca iki veya üç kez yumurtlayabilir. İyi bir yumurtlamada, çoğu embriyo kuluçka yoluyla hayatta kalacaktır, kritik bir aşama. Kültürler sık sık kontrol edilmeli ve kısırlaştırılmamış yumurtalar, ölü veya deforme olmuş embriyolar veya yiyecek kalıntıları veya parazitler de dahil olmak üzere döküntüler çıkarılmalıdır. Çoğunlukla canlı embriyolara sahip kültürler, embriyonik ve erken larva dönemlerinde birkaç saatte bir, ölü veya anormal embriyolar (sonunda ölecek) ve bir Pasteur pipeti kullanılarak döküntüler elle çıkarılarak "temizlenmelidir". Ölü embriyoların büyük bir oranına sahip kültürler, normalde gelişmekte olan embriyoların taze mavi su ile yeni parmaklıklara aktarılmasıyla hala kullanılabilir. Genellikle, canlı embriyoların en saf kültürlerini elde etmek için bu işlem birkaç kez tekrarlanmalıdır. Her iki durumda da, 200 mL başına yaklaşık 100 embriyonun son konsantrasyonu idealdir, çünkü embriyoların kalabalıklaşması özellikle mağara balıkları için gelişimi etkileyebilir. Kültürler, suyun çoğunu periyodik olarak parmaklıklardan çıkararak ve tatlı mavi suyla değiştirerek zamanla daha fazla "temizlenmelidir". Sık sık "temizlenen" kültürler genellikle en yüksek kalitede embriyo sağlar.
Doğal üremeye ek olarak, hormonal stimülasyon20 veya in vitro fertilizasyon18 de embriyo elde etmede potansiyel olarak yararlıdır. Bununla birlikte, bu amaçlar için, balıklar sağlıklı ve doğal yumurtlamaya hazır olmalıdır (yumurtlama davranışı sergilemek) ve sıcaklık kaynaklı yumurtlama koşullarında elde edilenden çok daha küçük bir embriyo verimi beklenmelidir.
Yukarıda açıklanan koşullar altında sıcaklığa bağlı üremenin bir sınırlaması, yüzey balıklarının ve mağara balıklarının farklı zamanlarda, birincisi akşamın erken saatlerinde ve ikincisi gece yarısından sabahın erken saatine kadar yumurtlamasıdır. Bu durum fotoperiyodun kaydırılmasıyla önlenemez, çünkü düzenli beslenme ve balık sistemi bakımının genellikle döngünün ışık (gündüz) döneminde yapılması gerekir. Bununla birlikte, prensip olarak, programlar, eşzamanlıya yakın yumurtlama için farklı açık-karanlık döngülerde (ve farklı balık yetiştirme sistemlerinde) iki morf koruyarak balıkların benzer zamanlarda yumurtlaması için ayarlanabilir. Ayrıca, iki sıcaklık kontrol sistemi mevcutsa, balıklar farklı sistemlerde kültürlenebilir ve haftalık sıcaklık artışlarını değiştirerek, yumurtlama iki aylık bir program yerine haftalık olarak yapılabilir ve embriyo elde etme kapasitesini iki katına çıkarabilirsiniz.
İster bilimsel araştırma, öğretim veya biyoteknoloji için kullanılın, A. mexicanus gelişimin evrimini çevreleyen büyüleyici soruları keşfetmek için mükemmel bir model sistemidir. Bilimsel araştırmalar için, bu sistem göz gelişimi ve hastalığın moleküler, genetik ve evrimsel mekanizmalarını araştırmak için yararlıdır. Göz yapısı, işlevi ve gelişimi açısından olağanüstü bir organdır. Görme, embriyonik gelişim sırasında birkaç farklı göz dokusunun koordineli oluşumu ve büyümesi sonucu elde edilir. Bunun gerçekleştiği kesin mekanizmalar hala büyük ölçüde bilinmemektedir. Memeli ve balık gözlerinin yapısı benzerdir. A. mexicanus'un doğal göz fenotipleri, göz gelişimi ve dejenerasyonunda rol oynayan moleküler ve hücresel mekanizmaları ve genetik yolları keşfetmek için mükemmel bir model sistemidir21,22. Bu bilgi kalıtsal göz hastalıkları için korunma stratejileri ve tedavileri geliştirmek için kullanılabilir. Pigmentasyon çalışmaları, A. mexicanu'nundeğerli bir katkı yaptığı başka bir alandır23. Öğretimde, A. mexicanus embriyoları embriyonik gelişimin genel ilkelerini göstermek ve yeni başlayan öğrenciler için öğretimsel deneylerde kullanılabilir. Biyoteknolojide, genomik DNA düzenleme24 ve özellikle CRISPR/Cas-9 genomik mühendislik teknolojisi25'in yakın zamanda gelişmesiyle, A. mexicanus embriyoları gen fonksiyonlarını keşfetmek için değerli bir kaynaktır. Bu uygulamaların her biri, bu iletişimde açıklanan artımlı sıcaklık ıslah rejimi ile elde edilebilen büyük miktarlarda yüksek kaliteli embriyoların yumurtlanmasıyla yardımcı olur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Jeffery laboratuvarı A. mexicanus kültür tesisine değerli katkılarından dolayı David Martasian, Diedre Heyser, Amy Parkhurst, Craig Foote ve Mandy Ng'ye teşekkür ederiz. Jeffery laboratuvarındaki araştırma şu anda NIH hibe EY024941 tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blackworms | Eastern Aquatics, Lancaster, PA | None | |
| Breeding Nets | Custom made | ||
| Brine shrimp eggs | AquaCave Lake Forest, IL. | None | |
| Colorimetric test kit | Petco | SKU:11916 | API Freshwater pH Test Kit |
| Egg yolk flakes | Pentair, Minneapolis, MN | None | |
| Fingerbowls | Carolina Biological Supply | 741004 | Culture dishes, 4.5 in, 250 mL |
| Hand held nets | Any Pet Store | ||
| Incubator for embryos | Fisher Scientific | 51-029-321HPM | 405 L |
| Instant Ocean sea salts | Spectrum Brands, Blacksburg, VA | None | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M9140 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20 | 5.75 in. |
| Net soaking solution | Any Pet Store | ||
| Nutrafin Cycle | Amazon | None | Bacterial boost |
| Refrigerator for live feed | Any source | ||
| Stereomicroscope | Any source | ||
| Thermometer | Any source | ||
| Tetra Tropical Crisps | Spectrum Brands, Blacksburg, VA | None |
References
- Jeffery, W. R. Cavefish as a model system in evolutionary developmental biology. Developmental Biology. 231, 1-12 (2001).
- Jeffery, W. R. Emerging model systems in evo-devo: cavefish and mechanisms of microevolution. Evolution & Development. 10, 265-272 (2008).
- Jeffery, W. R. Evolution and development in the cavefish Astyanax. Current Topics in Developmental Biology. 86, 191-221 (2009).
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature Genetics. 38, 107-111 (2006).
- Protas, M., Conrad, M., Gross, J. B., Tabin, C. J., Borowsky, R. Regressive evolution in the Mexican cave tetra, Astyanax mexicanus. Current Biology. 17, 452-454 (2007).
- O'Quin, K. E., Yoshizawa, M., Doshi, P., Jeffery, W. R. Quantitative genetic analysis of retinal degeneration in the blind cavefish. PLoS ONE. 8 (2), 57281 (2013).
- Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13, 15 (2015).
- Elliot, W. R. The Astyanax caves of Mexico. Cavefishes of Tamaulipas, San Luis Potosi, and Guerrero. Association for Mexican Cave Studies Bulletin. 26, 1 (2018).
- Luo, S., Wu, B., Xiong, X., Wang, J. Effects of total hardness and calcium:magnesium ratio of water during early stages of rare minnows (Gobiocypris rarus). Comparative Medicine. 66, 181-187 (2016).
- Balasch, J. C., Tort, L. Netting the stress responses in fish. Frontiers in Endocrinology. 10, 62 (2019).
- Borowsky, R. Determining the sex of adult Astyanax mexicanus. , Cold Spring Harbor Protocols. (2008).
- Paschos, G. Circadian clocks, feeding time, and metabolic homeostasis. Frontiers in Pharmacology. 6, 112 (2015).
- Scheiermann, C., Kunisaki, Y., Frenette, P. S. Circadian control of the immune system. Nature Reviews Immunology. 13, 190-198 (2013).
- Williams, M. B., Watts, S. A. Current basis and future directions of zebrafish nutrigenomics. Genes & Nutrition. 14, 34 (2009).
- Harper, C., Wolf, J. C. Morphologic effects of the stress response in fish. ILAR Journal. 50, 387-396 (2009).
- Neubauer, P., Andersen, K. H. Thermal performance in fish is explained by an interplay between physiology, behavior and ecology. Conservation Physiology. 7 (1), 025 (2019).
- Hinaux, H., et al. Developmental staging table for Astyanax mexicanus. Zebrafish. 8 (4), (2011).
- Borowsky, R. In vitro fertilization of Astyanax mexicanus. , Cold Spring Harbor Protocols. (2008).
- Simon, V., Hyacinthe, C., Rétaux, S. Breeding behavior in the blind Mexican cavefish and its river-dwelling conspecific. PLoS One. 14 (2), 0212591 (2019).
- Harvey, B. J., Carolsfield, J. Induced Breeding in Tropical Fish Culture. International Development Research Centre. , (1993).
- Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. R. The role of a lens survival pathway including sox2 and aA-crystallin in the evolution of cavefish eye degeneration. EvoDevo. 5, 28 (2014).
- Krishnan, J., Rohner, N. Cavefish and the basis for eye loss. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 5 (372), 20150487 (2017).
- Bilandžija, H., Abraham, L., Ma, L., Renner, K., Jeffery, W. R. Behavioral changes controlled by catecholaminergic systems explain recurrent loss of pigmentation in cavefish. Proceedings of the Royal Society. 285, (2018).
- Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican cavefish. PLoS ONE. 1093, 0119370 (2015).
- Klaassen, H., Wang, Y., Adamski, K., Rohner, N., Kowalko, J. E. CRISPR mutagenesis confirms the role of oca2 in melanin pigmentation in Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441, 313-318 (2018).
