Summary
Dit artikel beschrijft de basis laboratoriumomstandigheden en protocollen voor een incrementeel temperatuurregime om maximale spawning te stimuleren in de Mexicaanse tetra Astyanax mexicanus, een opkomend model voor ontwikkelings- en evolutionaire studies.
Abstract
De Mexicaanse tetra, Astyanax mexicanus,is een opkomend modelsysteem voor studies in ontwikkeling en evolutie. Het bestaan van eyed surface (oppervlaktevissen) en blinde grot (grotvissen) morphs in deze soort biedt een kans om de mechanismen die ten grondslag liggen aan morfologische en gedragsevolutie te ondervragen. Grotvissen hebben nieuwe constructieve en regressieve eigenschappen ontwikkeld. De constructieve veranderingen omvatten verhogingen van smaakpapillen en kaken, laterale lijn zintuiglijke organen en lichaamsvet. De regressieve veranderingen omvatten verlies of vermindering van de ogen. melaninepigmentatie, schoolgedrag, agressie en slaap. Om deze veranderingen experimenteel te ondervragen, is het cruciaal om grote aantallen voortgebrachte embryo's te verkrijgen. Sinds de oorspronkelijke A. mexicanus oppervlaktevissen en grotvissen in de jaren 1990 in Texas en Mexico werden verzameld, zijn hun nakomelingen routinematig gestimuleerd om tweemaandelijks grote aantallen embryo's te fokken en te spawnen in het Jeffery-laboratorium. Hoewel fokken wordt gecontroleerd door voedselrijkdom en kwaliteit, licht-donkercycli en temperatuur, hebben we ontdekt dat incrementele temperatuurveranderingen een sleutelrol spelen bij het stimuleren van maximale spawning. De geleidelijke temperatuurstijging van 72 °F tot 78 °F in de eerste drie dagen van een broedweek biedt twee-drie opeenvolgende paaidagen met maximale aantallen embryo's van hoge kwaliteit, die vervolgens wordt gevolgd door een geleidelijke daling van de temperatuur van 78 °F tot 72 °F tijdens de laatste drie dagen van de paaiweek. De procedures in deze video schetsen de workflow voor en tijdens een laboratoriumkweek voor incrementeel stimulerend paaien.
Introduction
Teleost Astyanax mexicanus heeft een eyed oppervlakte-woning (oppervlaktevissen) vorm en vele verschillende blinde hol-woning (holvissen) vormen1,2. Grotvissen zijn geëvolueerd in eeuwige duisternis en onder voedselbeperkingen, wat resulteert in het verschijnen van nieuwe constructieve en regressieve eigenschappen3. De constructieve eigenschappen omvatten verhogingen van smaakpapillen en kaakgrootte, sensorische organen van de laterale lijn en vetreserves. De regressieve eigenschappen omvatten het verlies of de vermindering van melaninepigmentatie, ogen en gedrag, zoals slaap, scholing en agressie. Een attribuut van het Astyanax-systeem is volledige vruchtbaarheid tussen de twee vormen, waardoor het gebruik van kwantitatieve eigenschap loci (QTL) mapping om de genomische regio(s) te bepalen die verband houden met constructieve en regressieve evolutie4,5,6,7. A. mexicanus biedt een voordelig systeem om ontwikkeling te bestuderen omdat het kan worden geïnduceerd om vaak in het laboratorium te spawnen. De embryo's van A. mexicanus zijn doorschijnend, iets groter dan die van zebravissen, geproduceerd in grote hoeveelheden, en ontwikkelen zich tot geslachtsrijpe volwassenen in ongeveer 8-12 maanden. Hun maximale paaicapaciteit is ongeveer 5 jaar. Dit protocol beschrijft de workflow die nodig is in een A. mexicanus kweekfaciliteit tijdens een typische broedweek en bevat de details van het onderhoud van het vissysteem en het temperatuurregelingsregime voor maximaal paaien.
A. mexicanus is een tropische vis die leeft in rivieren afkomstig uit kalksteenplateaus (oppervlaktevissen) en in poelen in kalksteengrotten (grotvissen)8. Kalksteen lost op om hard water te produceren en A. mexicanus gedijt goed in hard water. Vissen die zijn aangepast aan harde wateromstandigheden kunnen een reeks zoute omstandigheden verdragen, maar broeden over het algemeen in specifiekeomstandigheden 9. Inductie van paaigedrag wordt bereikt door een combinatie van factoren. Omdat vissen koudbloedig zijn en afhankelijk zijn van hun omgeving om homeostase te behouden, is hun metabolisme gevoelig voor veranderingen in de omgeving en reageren ze sneller op stressoren10. A. mexicanus moet worden gekweekt in aquatische systemen onder zorgvuldig gereguleerde omstandigheden van waterstroom, pH, geleidbaarheid, osmotische druk, verlichting en watertemperaturen.
In het Jeffery-laboratorium worden vissen onderhouden in twee stromende watersystemen: (1) een "babysysteem" voor jongvolwassen vissen vóór geslachtsrijpheid en (2) een volwassen (of hoofd)systeem voor seksueel volwassen, fokkende volwassenen. Het "babysysteem" bestaat uit tanks van 8 L en 15 L die van stromend water worden voorzien. Het "babysysteem" wordt gezaaid door jongen en jonge gemetamorfiseerde juvenielen gekweekt uit larven in kleinere (1-10 L) tanks, waarin wekelijks water wordt uitgewisseld. Larven, jongen en juvenielen zijn extreem voedselafhankelijk en moeten eenmaal per dag levend voedsel (pekelgarnalen) krijgen om een hoge overlevingskans te garanderen. Jonge jongeren uit het "babysysteem" worden na ongeveer 1-1,5 jaar in het volwassen systeem geplaatst. In het begin worden ze verpulverde tetravlokken gevoerd en na verdere groei worden ze overgebracht naar het reguliere voedingsregime voor volwassenen. Seksuele rijpheid kan worden beoordeeld aan de hand van het abdominale volume bij vrouwen, en methoden voor het bepalen van het geslacht zijn beschreven11. In het volwassen systeem wordt water automatisch uitgewisseld in tanks van 42 L 3 keer per periode van 24 uur. Het volwassen systeem wordt dagelijks bewaakt door visuele inspectie en automatische temperatuur-, pH- en geleidbaarheidsmetingen van sondes. De optimale pH ligt rond de 7,4 en kan variëren tussen 6,8-7,5, de basistemperatuur van het systeem is 72/73 °F en de ideale geleidbaarheid varieert tussen 600-800 mS. Automatische metingen worden weergegeven op een controllerscherm en visuele controles van de waterdruk worden afgelezen op stromingsmeters verdeeld over het systeem. Onafhankelijke controles op de waterkwaliteit worden wekelijks uitgevoerd door de temperatuur te testen en waterkwaliteitsparameters voor pH, ammoniak en nitraat te meten met behulp van een colorimetrische test. Ammoniak- en nitraatgehalten worden op of dicht bij nul gehouden door nuttige bacteriën (bijv. Nutafin Cycle) aan het systeem toe te voegen. De kamerverlichting wordt geregeld door een timer die is ingesteld op 14-uurs licht en 10-uurs donkere perioden. Naast de hierboven genoemde algemene waterkwaliteitsparameters hebben de volgende overwegingen speciale aandacht nodig tijdens een broedweek.
De eerste overweging is fotoperiode, omdat vissen (zelfs grotvissen in het laboratorium) afhankelijk zijn van lichtcycli om hun circadiane klok in te stellen. Circadiaanse ritmes kunnen van invloed zijn op alles, van fokken en voeden tot de gezondheid van het immuunsysteem12,13 en moeten consistent zijn voor maximale gezondheidsvoordelen. Vissen worden onderhouden in een stromend watersysteem op een 14-uurs lichte en 10-uur donkere fotoperiode. De oppervlaktevissen beginnen over het algemeen een uur nadat het systeem is verduisterd te paaien en licht dat tijdens deze periode wordt geïntroduceerd, kan het paaien verstoren en beëindigen. Het paaien van blinde grotvissen wordt minder verstoord door licht. In vergelijking met het paaien van oppervlaktevissen wordt het paaien van grotvissen vertraagd, meestal vier tot vijf uur nadat het systeem is verduisterd.
De tweede overweging is voeding. Volwassen vissen krijgen normaal gesproken eenmaal per dag een dieet van tetravlokken. Voorafgaand aan het paaien krijgen vissen een eiwitrijk dieet, aangevuld met extra hoeveelheden tetravlokken en ander voedsel: eigeelvlokken en af en toe levende Californische zwartwormen(Lumbriculus variegatus)om eiwitverlies als gevolg van eierproductie tijdens de vorige paaicyclus te compenseren. Tijdens de broedweek worden vissen twee keer per dag gevoerd, eenmaal 's ochtends en opnieuw in de middag/avond. Visvoeding slechts één keer per dag, maar met een enkele zeer grote portie voedsel moet worden vermeden, omdat dit ondervoeding kan veroorzaken14.
De derde overweging is ruimte. De ruimtevereisten zijn gebaseerd op de gemiddelde lichaamsmassa van een volwassene en gedragsoverwegingen, zoals of de vissen scholingsgedrag of agressief gedrag hebben. Over- of onderbemengende tanks kunnen leiden tot verhoogde agressie en constante stress, waardoor vissen kwetsbaar zijn voor verwondingen van hun tankmaten en terughoudend zijn om deel te nemen aan het paaien15. We huisvesten meestal 10-20 vissen per 42 L tank.
De vierde overweging is temperatuur. Zoals hierboven vermeld, zijn vissen koudbloedige dieren en vertrouwen ze op de omgeving om de lichaamstemperatuur te handhaven. Omdat temperatuur een direct effect heeft op metabolische processen, kunnen temperatuurveranderingen gedragsveranderingen bij vissen veroorzaken16. Dit fokprogramma bestaat uit cycli van twee weken in temperatuur: de eerste week introduceert een temperatuurpiek tot 78 °F en de volgende week handhaaft een statische temperatuur van 72 °F. Tijdens de eerste (kweek)week worden er elke avond plastic-edged foknetten op de bodem van de tanks geplaatst. De broednetten dienen als een barrière tussen de vissen in de tanks en de gebroede eieren, die anders zouden worden geconsumeerd. De temperatuur wordt verhoogd met 2 °F per dag tot een maximum van 78 °F tegen het midden van de week, en paaien wordt geïnduceerd volgens de lichtcyclus in de eerste 2-3 avonden van deze week. De temperatuur wordt vervolgens tijdens de resterende dagen van de week met stappen van 2 °F verlaagd tot 72 °F en de basistemperatuur wordt gehandhaafd tot het begin van de volgende broedweek. Fokken wordt meestal niet meer dan twee keer per maand gestimuleerd om de vis de tijd te geven om te herstellen.
Over het algemeen maakt deze methode het mogelijk om grote hoeveelheden embryo's van de hoogste kwaliteit over een langere periode te paaien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze procedure is goedgekeurd door institutional animal care richtlijnen van de Universiteit van Maryland, College Park (momenteel IACUC 469 #R-NOV-18-59; Project 1241065-1).
Figuur 1. Kalenders tijdens een kweekweek en een niet-broedweek. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
1. Maandag
- Voer om 9-10 uur watertests en stappen 1.1.1-4 hieronder uit.
- Noteer de temperatuur van de ruimte, het reservoir en het reservoir met behulp van een thermometer.
- Noteer de ammoniak-, nitraat- en nitraatniveaus met een colorimetrische testkit.
- Noteer de pH van het bewakingssysteem en de colorimetrische testkit.
- Registreer de geleidbaarheid van de carboymonitor en de hoofdsysteemmonitor.
- Vanaf 10.00 uur alle vissen voeren.
- Voed alle vissen in het volwassen systeem met tetravlokken en verpletter de vlokken in de tanks met jonge vissen. Voer slechts zoveel vlokken als een tank vis volledig kan consumeren in 3-5 minuten, ongeveer een "vingerknijpen".
- Controleer de incubator die wordt gebruikt om vingerbowls van zich ontwikkelende embryo's te huisvesten en verander het water indien nodig.
- Open de embryo-incubator en controleer de waterstanden in alle reservoirs. Als ze bijna geen water meer hebben, voeg dan systeemwater toe. Controleer de instellingen voor de incubatortemperatuur. Breng embryo's groot bij 23-25 °C.
- Schoon levend voer.
- Om de zwarte wormen schoon te maken, verwijdert u de onbedekte Tupperware-bassins met hun culturen uit de live feed-koelkast en giet u het overtollige water boven de wormclusters in de gootsteen. Gebruik gedestilleerd water en hang de wormen herhaaldelijk op en spoel ze af totdat het afgietwater helder is.
- Voeg voldoende schoon water toe zodat de wormclusters ongeveer half bedekt zijn. Vervang de resterende wormen in de koelkast met levend voer, onbedekt.
- Voer vis.
- Voer ten minste 30 minuten na de eerste voeding vis in de tanks waarin fokken gewenst is met eigeelvlokken, zwarte wormen of beide. Voeg een "fingerpinch" van dooiervlokken per tank toe. Voeg voldoende zwartwormclusters toe zodat elke vis in de tank ongeveer 5-10 wormen kan consumeren.
- Stel om 10.00 uur - 13.00 uur de watertemperatuur in op 74 °F.
- Schrob de kweektanks indien nodig en stel de foknetten in.
- Reinig de tanks en plaats de netten ten minste één uur na de laatste voeding. Reinig alle tanks waarin netten worden geplaatst. Stel foknetten zorgvuldig in om de luchttoevoer naar de tank niet te verstoren.
2. Dinsdag
- Verzamel de embryo's en was alle foknetten.
- Verwijder om 9-10 uur de foknetten van de bodem van tanks voor volwassen systeem. Spoel de embryo's voorzichtig af in een handnet met behulp van de slang die aan de carboy is bevestigd en keer het handnet om in een vingerkom schoon systeemwater om de embryo's te verdrijven.
- Verzamel en was elke set embryo's en plaats ze vervolgens in een vingerkom met schoon systeemwater dat 0,00003% methyleenblauw (blauw water) bevat. Als er een uitzonderlijk groot aantal embryo's uit één tank komt, scheid ze dan in meerdere kommen. De concentratie levende embryo's moet ongeveer 100 per 200 ml blauw water in elke vingerkom zijn.
- Schat de tijd van bevruchting door de embryo's onder een microscoop te ensceneren met behulp van het gepubliceerde A. mexicanus ontwikkelingstijdtabel17.
- Controleer de vingerbowls die embryo's bevatten regelmatig. Verwijder dode of misvormde embryo's en vuil, zoals niet opgegeten voedsel of uitwerpselen, met een Pasteur pipet. Verander het blauwe water in vingerbowls regelmatig.
- Plaats de vingerbowls 5-7 dagen in een incubator. Op dit moment is de dooier opgebruikt en is het voeren van culturen met levende pekelgarnalen noodzakelijk voor verdere ontwikkeling.
- Neem paaigegevens.
- Voor elke tank die embryo's laat vallen, noteer de volgende informatie.
- Noteer de datum en het tanknummer.
- Noteer het geschatte aantal gedropte embryo's (figuur 2):
Hoog (500+)
Gemiddeld (200-500)
Laag (<200) - Noteer de kwaliteit van de gedropte embryo's (figuur 2):
Hoog (>75% levend)
Medium (25-50% levend)
Laag (<25% levend) - Schat de oorspronkelijke paaitijd door de Astyanax mexicanus ensceneringstabel17te raadplegen.
- Noteer de temperatuur waarop het systeem was ingesteld toen de vis spawnde.
- Voor elke tank die embryo's laat vallen, noteer de volgende informatie.
- Voer alle vissen.
- Stel de watertemperatuur in op 76 °F.
- Bereid live voer voor.
- Voer vis #2.
- Schep overtollig voedsel en vuil uit tanks en schrob voordat u de netten opnieuw instelt.
3. Woensdag
- Herhaal stap 2.1-2.2. Verzamel embryo's en was alle foknetten.
- Neem spawning-gegevens zoals voorheen.
- Voer watertests uit zoals voorheen.
- Voer alle vissen.
- Stel de watertemperatuur in op 78 °F.
- Bereid de live feed voor.
- Controleer embryo's in de couveuse.
- Reinig en verander het water van de embryo's in vingerbowls die uiteindelijk zullen worden gebruikt om het algemene volwassen fokbestand aan te vullen. Gebruik met methyleen blauw behandeld systeemwater.
- Voer de vis weer.
- Reinig tanks indien nodig en reset netten.
4. Donderdag
- Herhaal stap 2.1-2.2. Verzamel embryo's en was en bewaar kweeknetten.
- Neem spawning-gegevens zoals voorheen.
- Stel de watertemperatuur in op 76°F.
- Maak de live feed schoon.
- Reinig alle afzonderlijke tanks.
- Controleer embryo's in de couveuse.
- Voer vis #2.
5. Vrijdag
- Voer alle vissen.
- Stel de watertemperatuur in op 74 °F.
- Maak de live feed schoon.
- Controleer embryo's in de couveuse.
6. Zaterdag
- Voer vis.
7. Zondag
- Voer vis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We fokken en spawnen over het algemeen de afstammelingen van oppervlaktevissen die oorspronkelijk werden verzameld in Nacimiento del Rio Choy in San Luis Potosi, Mexico (Rio Choy-oppervlaktevissen) en San Solomon Springs in Balmorhea State Park, Texas (Texas surface fish) en grotvissen afgeleid van Cueva de El Pachón (Pachón-grotvis) in Tamaulipas, Mexico, en Cueva de los Sabinos (Los Sabinos-grotvis) en Sotano de la Tinaja (Tinaja-grot) in Tamaulipas, Mexico, en Cueva de los Sabinos (Los Sabinos-grotvis) en Sotano de la Tinaja (Tinaja-grot) Mexico.
Gedurende een broedweek worden gegevens verzameld voor verschillende tanks. De gebroede embryo's in elke tank worden waargenomen voor kwantiteit en kwaliteit. De hoeveelheid wordt geregistreerd als hoog, gemiddeld of laag. Een hoeveelheid hoog wordt geregistreerd als het aantal gedropte embryo's meer dan 500 bedraagt, een hoeveelheid medium wordt geregistreerd als het aantal gedropte embryo's tussen 200 en 500 ligt en een hoeveelheid laag wordt geregistreerd als het aantal gedropte embryo's minder dan 200 is. De kwaliteit wordt op dezelfde manier geregistreerd als hoog, gemiddeld of laag. Een hoge kwaliteit wordt geregistreerd als meer dan 75% van de embryo's in de kom in leven is, een kwaliteit van het medium wordt geregistreerd als ongeveer 25% tot 75% van de embryo's in de kom in leven is en een kwaliteit van laag wordt geregistreerd als minder dan 25% van de embryo's in leven is. Deze indicaties van kwantiteit en kwaliteit krijgen vervolgens een getal toegewezen met een hoog getal van 3, gemiddeld is 2 en laag is 1. Als er geen embryo's zijn voortgebracht of geen levende embryo's in de spawning, wordt een aantal 0 toegewezen.
De fokgegevens van juli 2017 tot maart 2020 voor de oppervlaktevissen van Rio Choy en Texas en de grotvissen Los Sabinos, Tinaja en Pachón zijn weergegeven in figuur 2. De gegevens werden geanalyseerd per broedweek en door middeling van de aantallen die het gevolg zijn van elke dag van het verzamelen van embryo's tijdens één broedweek. De gegevens geven aan dat de kweek het hele jaar door aaneengesloten was in rio choy en texas oppervlaktevissen en in Pachón grotvissen. De kwantiteit en kwaliteit van de meeste Rio Choy oppervlaktevissen was tussen laag en hoog, terwijl de kwantiteit en kwaliteit van de meeste Texas oppervlaktevissen en Pachón grotvissen tussen laag en gemiddeld was. Het voorkomen van paaien was niet continu in Tinaja of Los Sabinos grotvissen: paaien was laag of niet aanwezig tijdens de late zomer (juli) tot de herfst (oktober). Hoewel de laagste niveaus van paaien werden geregistreerd voor Los Sabinos grotvissen, was de kwaliteit van embryo's de beste. Over het algemeen vertonen oppervlaktevissen een betere paaihoeveelheid en -kwaliteit dan grotvissen.
Figuur 2. Fokgegevens voor verschillende oppervlaktevissen en grotvispopulaties van juli 2017 tot maart 2020. Van boven naar beneden is Rio Choy oppervlakte vis, Texas oppervlakte vis, Pachón grot vis, Tinaja grot vis, en Los Sabinos grot vis. Ononderbroken lijnen: kwaliteit van spawn. Gebroken lijnen: hoeveelheid spawn. Weken zonder lijnen vertegenwoordigen perioden waarin niet werd geprobeerd te paaien. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Astyanax mexicanus is een nieuw biologisch model dat vaak spawnt en gemakkelijk kan worden gefokt in het laboratorium1,2. Omdat we geïnteresseerd zijn in de ontwikkelingsmechanismen die ten grondslag liggen aan evolutionaire veranderingen in A. mexicanus grotvissen, is de productie en het gebruik van embryo's van vitaal belang voor onze onderzoeksdoelen. Het primaire doel van het behoud van een volwassen visbestand is de productie van embryo's en jonge jongen voor gebruik in ontwikkelingsexperimenten en voor de aanvulling van volwassen fokbestanden. Af en toe kunnen volwassenen ook worden gebruikt voor fysiologie, gedrags- of genetische experimenten. Genetische experimenten vereisen gepaarde paring of in-vitrofertilisatie18. Voor in-vitrofertilisatie kunnen dieren met paaigedrag19 uit tanks worden verwijderd en worden gebruikt voor kruisingen tijdens het door de temperatuur geïnduceerde fokregime.
Om de kwaliteit en kwantiteit van embryo's voor onderzoek te maximaliseren, zijn er operationele details die aandacht vereisen voorafgaand aan de fokweek. Gebruik bij het manipuleren van vissen in de tanks alleen aangewezen handnetten, dompel ze tussen elk gebruik onder in een netweekoplossing en spoel ze tussen het gebruik door af met heet leidingwater om verontreiniging tussen de tanks te voorkomen. Was en desinfecteer zorgvuldig alle instrumenten die worden gebruikt om voor de vis te zorgen. Verwijder en reinig de kweeknetten in systeemwater voordat u ze in de tanks vervangt. Aan het einde van de week worden alle kweeknetten droog opgeslagen op planken in de viskamer. Controleer tijdens een broedweek elke tank op embryo's in de foknetten of op vissen die paaigedrag vertonen (d.w.z. rondzwemmen in cirkels die tegen elkaar zijn gekoppeld), omdat de vrouwtjes in die tanks waarschijnlijk klaar zijn om te spawnen. Dit moet worden gedaan met rood licht tijdens de donkere uren van de fotoperiode. A. mexicanus spawnen in het donker door eieren en sperma in wolken te verspreiden. Een tank met een populatie van ongeveer 10-20 vissen en een man-vrouwverhouding van ongeveer 1:1 kan tot 500 bevruchte embryo's produceren in één spawning per tank, en elke tank vis kan twee of drie keer spawnen in de loop van een enkele broedweek. In een goede spawn zullen de meeste embryo's overleven door uit te broeden, een kritieke fase. Culturen moeten regelmatig worden gecontroleerd en onbevruchte eieren, dode of misvormde embryo's of puin, met inbegrip van voedselresten of parasieten, moeten worden verwijderd. Culturen met meestal levende embryo's moeten om de paar uur worden "gereinigd" tijdens de embryonale en vroege larvale periodes door handmatig dode of abnormale embryo's (die uiteindelijk zullen sterven) en puin te verwijderen met behulp van een Pasteur pipet. Culturen met een groot deel van de dode embryo's kunnen nog steeds worden gebruikt door de normaal ontwikkelende embryo's over te brengen naar nieuwe vingerbowls met vers blauw water. Meestal moet dit proces meerdere keren worden herhaald om de zuiverste culturen van levende embryo's te verkrijgen. In beide gevallen is een uiteindelijke concentratie van ongeveer 100 embryo's per 200 ml ideaal omdat verdringing van embryo's de ontwikkeling kan beïnvloeden, vooral voor grotvissen. Culturen moeten in de loop van de tijd verder worden "gereinigd" door periodiek het grootste deel van het water uit vingerbowls te verwijderen en er vers blauw water door te vervangen. Culturen die vaak worden "gereinigd" bieden meestal de hoogste kwaliteit embryo's.
Naast natuurlijke fokkerij is hormonalestimulatie 20 of in-vitrofertilisatie18 ook potentieel nuttig bij het verkrijgen van embryo's. Voor deze doeleinden moeten vissen echter gezond en klaar zijn voor natuurlijk paaien (paaiend gedrag vertonen), en een veel kleinere opbrengst van embryo's dan verkregen onder de temperatuurgeïnduceerde paaiomstandigheden moet worden verwacht.
Een beperking van temperatuurgeïnduceerde fokkerij onder de hierboven beschreven omstandigheden is dat oppervlaktevissen en grotvissen op verschillende tijdstippen spawnen, de eerste tijdens de vroege avond en de laatste van na middernacht tot vroeg in de ochtend. Deze situatie kan niet worden vermeden door de fotoperiode te verschuiven, omdat regelmatig onderhoud van het voer- en vissysteem meestal moet worden uitgevoerd tijdens de lichte (dag-tijd) periode van de cyclus. In principe kunnen schema's echter worden aangepast zodat vissen op vergelijkbare tijdstippen spawnen door de twee morphs op verschillende licht-donkere cycli (en in verschillende visopfoksystemen) te behouden voor dicht bij gelijktijdige spawning. Bovendien, als er twee temperatuurregelingssystemen beschikbaar zijn, kunnen vissen in verschillende systemen worden gekweekt, en door wekelijkse temperatuurstijgingen af te wisselen, kan het paaien worden gedaan op een wekelijks in plaats van tweemaandelijks schema, waardoor de capaciteit voor het verkrijgen van embryo's wordt verdubbeld.
Of het nu wordt gebruikt voor wetenschappelijk onderzoek, onderwijs of biotechnologie, A. mexicanus is een uitstekend modelsysteem voor het verkennen van de fascinerende vragen rond de evolutie van ontwikkeling. Voor wetenschappelijk onderzoek is dit systeem nuttig voor het onderzoeken van moleculaire, genetische en evolutionaire mechanismen van oogontwikkeling en -ziekte. Het oog is een buitengewoon orgaan in termen van structuur, functie en ontwikkeling. Visie wordt verkregen tijdens de embryonale ontwikkeling als gevolg van de gecoördineerde vorming en groei van verschillende oogweefsels. De precieze mechanismen waarmee dit gebeurt zijn nog grotendeels onbekend. De structuur van zoogdier- en visogen is vergelijkbaar. De natuurlijke oogfenotypes van A. mexicanus is een uitstekend modelsysteem om de moleculaire en cellulaire mechanismen en genetische paden te verkennen die betrokken zijn bij oogontwikkeling en degeneratie21,22. Deze kennis kan worden gebruikt om preventiestrategieën en behandelingen voor erfelijke oogziekten te ontwikkelen. Pigmentatiestudies is een ander gebied waarop A. mexicanus een waardevolle bijdragelevert 23. In het onderwijs kunnen A. mexicanus-embryo's worden gebruikt om de algemene principes van embryonale ontwikkeling en in instructie-experimenten voor beginnende studenten te illustreren. In de biotechnologie, met de recente ontwikkeling van genomische DNA-bewerking24 en vooral CRISPR/Cas-9 genomische engineeringtechnologie25, zijn A. mexicanus-embryo's een waardevolle bron om genfuncties te verkennen. Elk van deze toepassingen wordt ondersteund door het paaien van grote hoeveelheden embryo's van hoge kwaliteit, wat kan worden bereikt door het incrementele temperatuurveredelingsregime dat in deze mededeling wordt beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
We danken David Martasian, Diedre Heyser, Amy Parkhurst, Craig Foote en Mandy Ng voor waardevolle bijdragen aan de Jeffery laboratorium A. mexicanus cultuur faciliteit. Het onderzoek in het Jeffery laboratorium wordt momenteel ondersteund door NIH subsidie EY024941.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blackworms | Eastern Aquatics, Lancaster, PA | None | |
| Breeding Nets | Custom made | ||
| Brine shrimp eggs | AquaCave Lake Forest, IL. | None | |
| Colorimetric test kit | Petco | SKU:11916 | API Freshwater pH Test Kit |
| Egg yolk flakes | Pentair, Minneapolis, MN | None | |
| Fingerbowls | Carolina Biological Supply | 741004 | Culture dishes, 4.5 in, 250 mL |
| Hand held nets | Any Pet Store | ||
| Incubator for embryos | Fisher Scientific | 51-029-321HPM | 405 L |
| Instant Ocean sea salts | Spectrum Brands, Blacksburg, VA | None | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M9140 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20 | 5.75 in. |
| Net soaking solution | Any Pet Store | ||
| Nutrafin Cycle | Amazon | None | Bacterial boost |
| Refrigerator for live feed | Any source | ||
| Stereomicroscope | Any source | ||
| Thermometer | Any source | ||
| Tetra Tropical Crisps | Spectrum Brands, Blacksburg, VA | None |
References
- Jeffery, W. R. Cavefish as a model system in evolutionary developmental biology. Developmental Biology. 231, 1-12 (2001).
- Jeffery, W. R. Emerging model systems in evo-devo: cavefish and mechanisms of microevolution. Evolution & Development. 10, 265-272 (2008).
- Jeffery, W. R. Evolution and development in the cavefish Astyanax. Current Topics in Developmental Biology. 86, 191-221 (2009).
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature Genetics. 38, 107-111 (2006).
- Protas, M., Conrad, M., Gross, J. B., Tabin, C. J., Borowsky, R. Regressive evolution in the Mexican cave tetra, Astyanax mexicanus. Current Biology. 17, 452-454 (2007).
- O'Quin, K. E., Yoshizawa, M., Doshi, P., Jeffery, W. R. Quantitative genetic analysis of retinal degeneration in the blind cavefish. PLoS ONE. 8 (2), 57281 (2013).
- Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13, 15 (2015).
- Elliot, W. R. The Astyanax caves of Mexico. Cavefishes of Tamaulipas, San Luis Potosi, and Guerrero. Association for Mexican Cave Studies Bulletin. 26, 1 (2018).
- Luo, S., Wu, B., Xiong, X., Wang, J. Effects of total hardness and calcium:magnesium ratio of water during early stages of rare minnows (Gobiocypris rarus). Comparative Medicine. 66, 181-187 (2016).
- Balasch, J. C., Tort, L. Netting the stress responses in fish. Frontiers in Endocrinology. 10, 62 (2019).
- Borowsky, R. Determining the sex of adult Astyanax mexicanus. , Cold Spring Harbor Protocols. (2008).
- Paschos, G. Circadian clocks, feeding time, and metabolic homeostasis. Frontiers in Pharmacology. 6, 112 (2015).
- Scheiermann, C., Kunisaki, Y., Frenette, P. S. Circadian control of the immune system. Nature Reviews Immunology. 13, 190-198 (2013).
- Williams, M. B., Watts, S. A. Current basis and future directions of zebrafish nutrigenomics. Genes & Nutrition. 14, 34 (2009).
- Harper, C., Wolf, J. C. Morphologic effects of the stress response in fish. ILAR Journal. 50, 387-396 (2009).
- Neubauer, P., Andersen, K. H. Thermal performance in fish is explained by an interplay between physiology, behavior and ecology. Conservation Physiology. 7 (1), 025 (2019).
- Hinaux, H., et al. Developmental staging table for Astyanax mexicanus. Zebrafish. 8 (4), (2011).
- Borowsky, R. In vitro fertilization of Astyanax mexicanus. , Cold Spring Harbor Protocols. (2008).
- Simon, V., Hyacinthe, C., Rétaux, S. Breeding behavior in the blind Mexican cavefish and its river-dwelling conspecific. PLoS One. 14 (2), 0212591 (2019).
- Harvey, B. J., Carolsfield, J. Induced Breeding in Tropical Fish Culture. International Development Research Centre. , (1993).
- Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. R. The role of a lens survival pathway including sox2 and aA-crystallin in the evolution of cavefish eye degeneration. EvoDevo. 5, 28 (2014).
- Krishnan, J., Rohner, N. Cavefish and the basis for eye loss. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 5 (372), 20150487 (2017).
- Bilandžija, H., Abraham, L., Ma, L., Renner, K., Jeffery, W. R. Behavioral changes controlled by catecholaminergic systems explain recurrent loss of pigmentation in cavefish. Proceedings of the Royal Society. 285, (2018).
- Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican cavefish. PLoS ONE. 1093, 0119370 (2015).
- Klaassen, H., Wang, Y., Adamski, K., Rohner, N., Kowalko, J. E. CRISPR mutagenesis confirms the role of oca2 in melanin pigmentation in Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441, 313-318 (2018).
