Inkrementelle Temperaturänderungen für maximale Brut und Laichzeit bei Astyanax mexicanus

Summary

Dieser Artikel beschreibt die grundlegenden Laborbedingungen und Protokolle für ein inkrementelles Temperaturregime zur Stimulierung des maximalen Laichens beim mexikanischen Salmler Astyanax mexicanus, einem aufstrebenden Modell für Entwicklungs- und Evolutionsstudien.

Abstract

Der mexikanische Salmler Astyanax mexicanusist ein aufstrebendes Modellsystem für Entwicklungs- und Evolutionsstudien. Die Existenz von Augenoberflächen- (Oberflächenfischen) und blinden Höhlenmorphen (Höhlenfische) in dieser Art bietet die Möglichkeit, die Mechanismen zu hinterfragen, die der morphologischen und Verhaltensevolution zugrunde liegen. Höhlenfische haben neuartige konstruktive und regressive Eigenschaften entwickelt. Zu den konstruktiven Veränderungen gehören Eine Zunahme der Geschmacksknospen und Kiefer, der Sinnesorgane der Seitenlinie und des Körperfetts. Die regressiven Veränderungen umfassen den Verlust oder die Verringerung der Augen. Melaninpigmentierung, Schulverhalten, Aggression und Schlaf. Um diese Veränderungen experimentell zu untersuchen, ist es entscheidend, eine große Anzahl von erzeugten Embryonen zu erhalten. Seit die ursprünglichen A. mexicanus Oberflächenfische und Höhlenfische in den 1990er Jahren in Texas und Mexiko gesammelt wurden, wurden ihre Nachkommen routinemäßig dazu angeregt, zweimonatlich im Jeffery-Labor eine große Anzahl von Embryonen zu züchten und zu laichen. Obwohl die Zucht durch Nahrungsfülle und -qualität, Hell-Dunkel-Zyklen und Temperatur gesteuert wird, haben wir festgestellt, dass inkrementelle Temperaturänderungen eine Schlüsselrolle bei der Stimulierung des maximalen Laichens spielen. Der allmähliche Temperaturanstieg von 72 ° F auf 78 ° F in den ersten drei Tagen einer Brutwoche bietet zwei bis drei aufeinanderfolgende Laichtage mit einer maximalen Anzahl hochwertiger Embryonen, gefolgt von einem allmählichen Temperaturabfall von 78 ° F auf 72 ° F während der letzten drei Tage der Laichwoche. Die in diesem Video gezeigten Verfahren beschreiben den Arbeitsablauf vor und während einer Laborzuchtwoche für ein inkrementelles temperaturstimuliertes Laichen.

Introduction

Der Teleost Astyanax mexicanus hat eine augenbewohnende (Oberflächenfische) Form und viele verschiedene blinde Höhlenbewohner (Höhlenfische) Formen^1,2. Höhlenfische haben sich in ständiger Dunkelheit und unter Nahrungsbeschränkungen entwickelt, was zum Auftreten neuartiger konstruktiver und regressiver Merkmale führt³. Zu den konstruktiven Merkmalen gehören eine Zunahme der Geschmacksknospen und der Kiefergröße, Sinnesorgane der Seitenlinie und Fettreserven. Zu den regressiven Merkmalen gehören der Verlust oder die Verringerung von Melaninpigmentierung, Augen und Verhaltensweisen wie Schlaf, Schulbildung und Aggression. Ein Attribut des Astyanax-Systems ist die vollständige Fruchtbarkeit zwischen den beiden Formen, die die Verwendung von quantitativen Trait Loci (QTL) ermöglicht, um die genomischen Regionen zu bestimmen, die mit der konstruktiven und regressiven Evolution verbunden sind^4,5,6,7. A. mexicanus bietet ein vorteilhaftes System zur Untersuchung der Entwicklung, da es dazu gebracht werden kann, häufig im Labor zu laichen. Die Embryonen von A. mexicanus sind durchscheinend, etwas größer als die von Zebrafischen, werden in großen Mengen produziert und entwickeln sich in etwa 8-12 Monaten zu geschlechtsreifen Erwachsenen. Ihre Maximale Laichkapazität beträgt etwa 5 Jahre. Dieses Protokoll beschreibt den Arbeitsablauf, der in einer A. mexicanus-Kulturanlage während einer typischen Brutwoche benötigt wird, und enthält die Details der Wartung des Fischsystems und des Temperaturkontrollregimes für maximales Laichen.

A. mexicanus ist ein tropischer Fisch, der in Flüssen lebt, die in Kalksteinplateaus (Oberflächenfische) und in Pools in Kalksteinhöhlen (Höhlenfische)^{entstehen 8}. Kalkstein löst sich auf, um hartes Wasser zu produzieren, und A. mexicanus gedeiht in hartem Wasser. Fische, die an harte Wasserbedingungen angepasst sind, können eine Reihe von salzigen Bedingungen tolerieren, brüten aber im Allgemeinen in bestimmten⁹. Die Induktion des Laichverhaltens wird durch eine Kombination von Faktoren erreicht. Da Fische kaltblütig sind und auf ihre Umgebung angewiesen sind, um die Homöostase aufrechtzuerhalten, reagiert ihr Stoffwechsel empfindlich auf Umweltveränderungen und sie reagieren schneller auf Stressoren¹⁰. A. mexicanus sollte in aquatischen Systemen unter sorgfältig regulierten Bedingungen von Wasserfluss, pH-Wert, Leitfähigkeit, osmotischem Druck, Beleuchtung und Wassertemperaturen kultiviert werden.

Im Jeffery-Labor werden Fische in zwei fließenden Wassersystemen gehalten: (1) einem "Babysystem" für junge erwachsene Fische vor der Geschlechtsreife und (2) einem erwachsenen (oder Haupt-) System für geschlechtsreife, brütende Erwachsene. Das "Babysystem" besteht aus 8 L und 15 L Tanks, die mit fließendem Wasser versorgt werden. Das "Babysystem" wird von Jungfischen und jungen metamorphosisierten Jungtieren ausgesät, die aus Larven in kleineren (1-10 L) Tanks gezüchtet werden, in denen wöchentlich Wasser ausgetauscht wird. Larven, Jungtiere und Jungtiere sind extrem nahrungsabhängig und müssen einmal täglich mit Lebendfutter (Solegarnelen) gefüttert werden, um eine hohe Überlebensrate zu gewährleisten. Junge Jungtiere aus dem "Babysystem" werden nach etwa 1-1,5 Jahren in das Erwachsenensystem eingeordnet. Zuerst werden sie mit pulverisierten Tetraflocken gefüttert und nach weiterem Wachstum in das reguläre Fütterungsregime für Erwachsene überführt. Die Geschlechtsreife kann durch das Bauchvolumen bei Frauen beurteilt werden, und Methoden zur Bestimmung des Geschlechts wurden beschrieben¹¹. Im Erwachsenensystem wird das Wasser automatisch in 42-L-Tanks 3 Mal pro 24-Stunden-Zeitraum ausgetauscht. Das Erwachsenensystem wird täglich durch visuelle Inspektion und automatische Temperatur-, pH- und Leitfähigkeitswerte von Sonden überwacht. Der optimale pH-Wert liegt bei etwa 7,4 und kann zwischen 6,8 und 7,5 liegen, die Basistemperatur des Systems beträgt 72/73 ° F und die ideale Leitfähigkeit liegt zwischen 600 und 800 mS. Automatische Messwerte werden auf einem Controller-Bildschirm angezeigt, und visuelle Überprüfungen des Wasserdrucks werden an Imgühlungsmessern abgelesen, die im gesamten System verteilt sind. Unabhängige Überprüfungen der Wasserqualität werden wöchentlich durchgeführt, indem die Temperatur getestet und die Wasserqualitätsparameter für pH-Wert, Ammoniak und Nitrat mit einem kolorimetrischen Test gemessen werden. Der Ammoniak- und Nitratgehalt wird auf oder nahe Null gehalten, indem dem System nützliche Bakterien (z. B. Nutafin Cycle) hinzugefügt werden. Die Raumbeleuchtung wird über einen Timer gesteuert, der auf 14-Stunden-Licht und 10-Stunden-Dunkelzeiten eingestellt ist. Zusätzlich zu den oben genannten allgemeinen Wasserqualitätsparametern müssen die folgenden Überlegungen während einer Brutwoche besonders beachtet werden.

Die erste Überlegung ist die Photoperiode, da Fische (sogar Höhlenfische im Labor) auf Lichtzyklen angewiesen sind, um ihre zirkadiane Uhr einzustellen. Circadiane Rhythmen können alles von der Zucht und Fütterung bis hin zur Gesundheit des Immunsystems^{beeinflussen 12,13} und müssen für maximale gesundheitliche Vorteile konsistent sein. Fische werden in einem Flaufwassersystem auf einer 14-stündigen hellen und 10-stündigen dunklen Fotoperiode gehalten. Die Oberflächenfische beginnen im Allgemeinen eine Stunde nach der Verdunkelung des Systems mit dem Laichen, und das während dieser Zeit eingebrachte Licht kann das Laichen stören und beenden. Das Laichen blinder Höhlenfische wird weniger durch Licht gestört. Im Vergleich zum Laichen von Oberflächenfischen verzögert sich das Laichen von Höhlenfischen und beginnt in der Regel vier bis fünf Stunden nach der Verdunkelung des Systems.

Die zweite Überlegung ist die Ernährung. Erwachsene Fische werden normalerweise einmal täglich mit Tetraflocken gefüttert. Vor dem Laichen werden Fische mit einer proteinreichen Diät gefüttert, die mit zusätzlichen Mengen an Tetraflocken und anderen Lebensmitteln ergänzt wird: Eigelbflocken und gelegentlich lebende kalifornische Schwarzwürmer (Lumbriculus variegatus), um den Proteinverlust aufgrund der Eierproduktion während des vorherigen Laichzyklus auszugleichen. Während der Brutwoche werden die Fische zweimal täglich gefüttert, einmal morgens und wieder nachmittags/abends. Fischfütterung nur einmal täglich, aber mit einer einzigen sehr großen Portion Futter sollte vermieden werden, da dies zu Unterernährung führen kann¹⁴.

Die dritte Überlegung ist der Raum. Der Platzbedarf basiert auf der durchschnittlichen Körpermasse eines Erwachsenen sowie Verhaltensüberlegungen, z. B. ob die Fische Schwarmverhalten oder aggressives Verhalten haben. Über- oder unterfüllte Tanks können zu erhöhter Aggression und ständigem Stress führen, was Fische anfällig für Verletzungen durch ihre Tankkameraden macht und nur ungern am Laichen teilnimmt¹⁵. Wir beherbergen normalerweise 10-20 Fische pro 42 L Tank.

Die vierte Überlegung ist die Temperatur. Wie oben erwähnt, sind Fische kaltblütige Tiere und auf die Umwelt angewiesen, um die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten. Da die Temperatur einen direkten Einfluss auf Stoffwechselprozesse hat, können Temperaturänderungen Verhaltensänderungen bei Fischen auslösen¹⁶. Dieses Zuchtprogramm besteht aus zweiwöchigen Temperaturzyklen: Die erste Woche führt zu einem Temperaturanstieg von 78 ° F und die nächste Woche zu einer statischen Temperatur von 72 ° F. Während der ersten (Brut-)Woche werden jeden Abend kunststoffumrandige Zuchtnetze am Boden der Becken platziert. Die Brutnetze dienen als Barriere zwischen den Fischen in den Becken und den laichen Eiern, die sonst verzehrt würden. Die Temperatur wird bis Mitte der Woche um 2 ° F pro Tag auf maximal 78 ° F erhöht, und das Laichen wird entsprechend dem Lichtzyklus in den ersten 2-3 Abenden dieser Woche induziert. Die Temperatur wird dann an den verbleibenden Tagen der Woche um 2 ° F auf 72 ° F gesenkt, und die Basistemperatur wird bis zum Beginn der nächsten Brutwoche beibehalten. Die Zucht wird in der Regel nicht mehr als zweimal im Monat stimuliert, damit sich die Fische erholen können.

Insgesamt ermöglicht diese Methode das Laichen großer Mengen hochwertigster Embryonen über einen längeren Zeitraum.

Protocol

Dieses Verfahren wurde von den Institutional Animal Care Guidelines der University of Maryland, College Park (derzeit IACUC 469 #R-NOV-18-59; Projekt 1241065-1).

Abbildung 1. Kalender während einer Brutwoche und einer Nichtbrutwoche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

1. Montag

1. Führen Sie um 9-10 Uhr Wassertests und die Schritte 1.1.1-4 unten durch.
   1. Zeichnen Sie die Raum-, Tank- und Behältertemperaturen mit einem Thermometer auf.
   2. Zeichnen Sie die Ammoniak-, Nitrat- und Nitratwerte mit einem kolorimetrischen Testkit auf.
   3. Erfassen Sie den pH-Wert aus dem Überwachungssystem sowie dem kolorimetrischen Testkit.
   4. Zeichnen Sie die Leitfähigkeit vom Carboy-Monitor und dem Hauptsystemmonitor auf.
2. Ab 10 Uhr alle Fische füttern.
   1. Füttern Sie alle Fische im Erwachsenensystem mit Tetraflocken und zerkleinern Sie die Flocken in den Tanks mit jungen Fischen. Füttern Sie nur so viele Flocken, wie ein Fischbecken in 3-5 Minuten vollständig verbrauchen kann, etwa eine "Fingerklemme".
3. Überprüfen Sie den Inkubator, in dem Fingerschüsseln von sich entwickelnden Embryonen untergebracht sind, und wechseln Sie bei Bedarf das Wasser.
   1. Öffnen Sie den Embryo-Inkubator und überprüfen Sie den Wasserstand in allen Reservoirs. Wenn ihnen das Wasser ausgeht, fügen Sie Systemwasser hinzu. Überprüfen Sie die Einstellungen für die Inkubatortemperatur. Heben Sie die Embryonen bei 73-77 ° F (23-25 ° C) an.
4. Sauberes Lebendfutter.
   1. Um die Schwarzwürmer zu reinigen, entfernen Sie die unbedeckten Tupperware-Becken mit ihren Kulturen aus dem Lebendfutterkühlschrank und gießen Sie das überschüssige Wasser über den Wurmhaufen in die Spüle. Suspendieren und spülen Sie die Würmer mit destilliertem Wasser wiederholt aus, bis das abgießende Wasser klar ist.
   2. Fügen Sie genügend sauberes Wasser hinzu, so dass die Wurmhaufen etwa zur Hälfte bedeckt sind. Ersetzen Sie die verbleibenden Würmer im Lebendfutterkühlschrank, unbedeckt.
5. Fische füttern.
   1. Füttern Sie mindestens 30 Minuten nach der ersten Fütterung Fische in den Becken, in denen die Zucht gewünscht wird, mit Eigelbflocken, Schwarzwürmern oder beidem. Fügen Sie einen "Fingerstift" von Eigelbflocken pro Tank hinzu. Fügen Sie genügend Schwarzwurmcluster hinzu, damit jeder Fisch im Aquarium etwa 5-10 Würmer verbrauchen kann.
6. Stellen Sie bei 10 am- 1 pm die Wassertemperatur auf 74 ° F ein.
7. Schrubben Sie die Zuchtbecken nach Bedarf und stellen Sie die Zuchtnetze ein.
8. Reinigen Sie die Tanks und legen Sie die Netze mindestens eine Stunde nach der letzten Fütterung auf. Reinigen Sie alle Tanks, in die die Netze gelegt werden, vorher. Stellen Sie die Zuchtnetze vorsichtig ein, um die Luftzufuhr zum Tank nicht zu stören.

2. Dienstag

1. Sammeln Sie die Embryonen und waschen Sie alle Zuchtnetze.
   1. Entfernen Sie um 9-10 Uhr die Zuchtnetze vom Boden der Tanks des erwachsenen Systems. Spülen Sie die Embryonen vorsichtig mit dem am Carboy befestigten Schlauch in ein Handnetz und kehren Sie das Handnetz in eine Fingerschale mit sauberem Systemwasser um, um die Embryonen auszustoßen.
   2. Sammeln und waschen Sie jeden Satz Embryonen und legen Sie sie dann in eine Fingerschüssel mit sauberem Systemwasser mit 0,00003% Methylenblau (blaues Wasser). Wenn es eine außergewöhnlich große Anzahl von Embryonen aus einem einzigen Tank gibt, trennen Sie sie in mehrere Schüsseln. Die Konzentration lebender Embryonen sollte etwa 100 pro 200 ml blaues Wasser in jeder Fingerschüssel betragen.
   3. Schätzen Sie den Zeitpunkt der Befruchtung, indem Sie die Embryonen unter einem Mikroskop unter Verwendung des veröffentlichten A. mexicanus-Entwicklungszeittabellen¹⁷inszenieren.
   4. Überwachen Sie häufig die Fingerbowls, die Embryonen enthalten. Entfernen Sie tote oder deformierte Embryonen und Trümmer, wie nicht gesöhnte Lebensmittel oder Kot, mit einer Pasteur-Pipette. Wechseln Sie das blaue Wasser in Fingerbowls häufig.
   5. Legen Sie die Fingerbowls für 5-7 Tage in einen Inkubator. Zu diesem Zeitpunkt ist das Eigelb aufgebraucht und die Fütterung von Kulturen mit lebenden Solegarnelen ist für die weitere Entwicklung notwendig.
2. Nehmen Sie Spawning-Daten.
   1. Notieren Sie für jeden Tank, der Embryonen fallen lässt, die folgenden Informationen.
      1. Notieren Sie das Datum und die Tanknummer.
      2. Notieren Sie die ungefähre Anzahl der abgeworfenen Embryonen (Abbildung 2):
         Hoch (500+)
         Mittel (200-500)
         Niedrig(<200)
      3. Aufzeichnung der Qualität der abgefallenen Embryonen (Abbildung 2):
         Hoch (>75% lebend)
         Mittel (25-50% lebend)
         Niedrig (<25% lebend)
      4. Schätzen Sie die ursprüngliche Laichzeit, indem Sie die Astyanax mexicanus Staging-Tabelle^{17 konsultieren.}
      5. Notieren Sie die Temperatur, auf die das System eingestellt wurde, als der Fisch laichte.
3. Füttern Sie alle Fische.
4. Stellen Sie die Wassertemperatur auf 76 ° F ein.
5. Bereiten Sie Live-Feed vor.
6. Füttern Sie Fische #2.
7. Überschüssige Nahrung und Schmutz aus Tanks schaufeln und vor dem Zurücksetzen der Netze schrubben.

3. Mittwoch

1. Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.2. Sammeln Sie Embryonen und waschen Sie alle Zuchtnetze.
2. Nehmen Sie spawnende Daten wie zuvor.
3. Führen Sie wie zuvor Wassertests durch.
4. Füttern Sie alle Fische.
5. Stellen Sie die Wassertemperatur auf 78 ° F ein.
6. Bereiten Sie den Live-Feed vor.
7. Überprüfen Sie die Embryonen im Inkubator.
   1. Reinigen und wechseln Sie das Wasser der Embryonen in Fingerbowls, die schließlich verwendet werden, um den allgemeinen erwachsenen Zuchtbestand aufzufüllen. Verwenden Sie methylenblau behandeltes Systemwasser.
8. Füttern Sie Fische wieder.
9. Reinigen Sie die Tanks nach Bedarf und setzen Sie die Netze zurück.

4. Donnerstag

1. Wiederholen Sie die Schritte 2.1-2.2. Sammeln Sie Embryonen und waschen und lagern Sie Zuchtnetze.
2. Nehmen Sie spawnende Daten wie zuvor.
3. Stellen Sie die Wassertemperatur auf 76 ° F ein.
4. Reinigen Sie den Live-Feed.
5. Reinigen Sie alle einzelnen Tanks.
6. Überprüfen Sie die Embryonen im Inkubator.
7. Füttern Sie Fische #2.

5. Freitag

1. Füttern Sie alle Fische.
2. Stellen Sie die Wassertemperatur auf 74 ° F ein.
3. Reinigen Sie den Live-Feed.
4. Überprüfen Sie die Embryonen im Inkubator.

6. Samstag

1. Fische füttern.

7. Sonntag

1. Fische füttern.

Representative Results

Wir züchten und laichen im Allgemeinen die Nachkommen von Oberflächenfischen, die ursprünglich im Nacimiento del Rio Choy in San Luis Potosi, Mexiko (Rio Choy Oberflächenfisch) und San Solomon Springs im Balmorhea State Park, Texas (Texas Oberflächenfisch) und Höhlenfischen aus Cueva de El Pachón (Pachón Höhlenfisch) in Tamaulipas, Mexiko, und Cueva de los Sabinos (Los Sabinos Höhlenfisch) und Sotano de la Tinaja (Tinaja Höhlenfisch) in San Luis Potosi gesammelt wurden Mexiko.

Während einer Brutwoche werden Daten für verschiedene Becken gesammelt. Die erzeugten Embryonen in jedem Tank werden auf Quantität und Qualität beobachtet. Die Menge wird als hoch, mittel oder niedrig erfasst. Eine hohe Menge wird aufgezeichnet, wenn die Anzahl der abgeworfenen Embryonen über 500 liegt, eine Menge medium wird aufgezeichnet, wenn die Anzahl der abgeworfenen Embryonen zwischen 200-500 liegt, und eine Menge von niedrig wird aufgezeichnet, wenn die Anzahl der abgefallenen Embryonen weniger als 200 beträgt. Die Qualität wird in ähnlicher Weise als hoch, mittel oder niedrig aufgezeichnet. Eine hohe Qualität wird aufgezeichnet, wenn mehr als 75% der Embryonen in der Schüssel am Leben sind, eine Qualität des Mediums wird aufgezeichnet, wenn etwa 25% bis 75% der Embryonen in der Schüssel am Leben sind, und eine Qualität von niedrig wird aufgezeichnet, wenn weniger als 25% der Embryonen am Leben sind. Diesen Angaben für Quantität und Qualität wird dann eine Zahl zugewiesen, wobei hoch 3, mittel 2 und niedrig 1 ist. Wenn beim Laichen keine Embryonen oder keine lebenden Embryonen laichen, wird eine Zahl von 0 zugewiesen.

Die Brutdaten von Juli 2017 bis März 2020 für die Oberflächenfische Rio Choy und Texas sowie die Höhlenfische Los Sabinos, Tinaja und Pachón sind in Abbildung 2 dargestellt. Die Daten wurden nach Brutwoche und durch Mittelung der Zahlen analysiert, die sich aus jedem Tag der Embryonenentnahme während einer einzigen Brutwoche ergeben. Die Daten deuten darauf hin, dass die Zucht das ganze Jahr über bei Rio Choy und Texas Oberflächenfischen sowie bei Pachón Höhlenfischen kontinuierlich war. Die Quantität und Qualität der meisten Rio Choy-Oberflächenfische lag zwischen niedrig und hoch, während die Quantität und Qualität der meisten texanischen Oberflächenfische und Pachón-Höhlenfische zwischen niedrig und mittel lag. Das Laichen war bei Tinaja- oder Los Sabinos-Höhlenfischen nicht kontinuierlich: Das Laichen war im Spätsommer (Juli) bis Herbst (Oktober) niedrig oder nicht vorhanden. Obwohl die niedrigsten Laichraten für Höhlenfische von Los Sabinos verzeichnet wurden, war die Qualität der Embryonen die beste. Im Allgemeinen zeigen Oberflächenfische eine bessere Laichmenge und -qualität als Höhlenfische.

Abbildung 2. Zuchtdaten für verschiedene Oberflächenfisch- und Höhlenfischpopulationen von Juli 2017 bis März 2020. Von oben nach unten sind Rio Choy Oberflächenfische, Texas Oberflächenfische, Pachón Höhlenfische, Tinaja Höhlenfische und Los Sabinos Höhlenfische. Ununterbrochene Linien: Qualität des Spawns. Unterbrochene Linien: Menge des Spawns. Wochen ohne Linien stellen Perioden dar, in denen kein Laichversuch unternommen wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Astyanax mexicanus ist ein neuartiges biologisches Modell, das häufig laicht und leicht im Labor gezüchtet werden kann^1,2. Da wir uns für die Entwicklungsmechanismen interessieren, die evolutionären Veränderungen bei A. mexicanus-Höhlenfischen zugrunde liegen, ist die Produktion und Verwendung von Embryonen für unsere Forschungsziele von entscheidender Bedeutung. Der Hauptzweck der Erhaltung eines erwachsenen Fischbestandes ist die Produktion von Embryonen und Jungbrut zur Verwendung in Entwicklungsexperimenten und zur Auffüllung der erwachsenen Zuchtbestände. Gelegentlich können Erwachsene auch für physiologische, verhaltensbezogene oder genetische Experimente verwendet werden. Genetische Experimente erfordern gepaarte Paarung oder In-vitro-Fertilisation¹⁸. Für die In-vitro-Fertilisation können Tiere, die ein Laichverhalten^{zeigen, 19} aus Tanks entfernt und für Kreuzungen während des temperaturinduzierten Zuchtregimes verwendet werden.

Um die Qualität und Quantität der Embryonen für die Forschung zu maximieren, gibt es operative Details, die vor der Brutwoche beachtet werden müssen. Wenn Sie Fische in den Tanks manipulieren, verwenden Sie nur ausgewiesene Handnetze, tauchen Sie sie zwischen jedem Gebrauch in eine Netzeinweichlösung und spülen Sie sie zwischen den Anwendungen mit heißem Leitungswasser ab, um eine Kontamination zwischen den Tanks zu verhindern. Waschen und desinfizieren Sie sorgfältig alle Instrumente, die zur Pflege der Fische verwendet werden. Entfernen und reinigen Sie die Zuchtnetze im Systemwasser, bevor Sie sie in den Tanks ersetzen. Am Ende der Woche werden alle Zuchtnetze trocken in Regalen im Fischzimmer gelagert. Überprüfen Sie während einer Brutwoche jeden Tank auf Embryonen in den Brutnetzen oder auf Fische, die Laichverhalten zeigen (d. H. Schwimmen in Kreisen, die gegeneinander gepaart sind), da die Weibchen in diesen Becken wahrscheinlich bereit sind zu laichen. Dies sollte mit rotem Licht während der dunklen Stunden der Fotoperiode erfolgen. A. mexicanus laichen im Dunkeln, indem sie Eier und Spermien in Wolken streuen. Ein Becken mit einer Population von etwa 10-20 Fischen und einem Verhältnis von Männchen zu Weibchen von etwa 1:1 kann bis zu 500 befruchtete Embryonen in einem Laichen pro Becken produzieren, und jedes Becken mit Fischen kann im Laufe einer einzigen Brutwoche zwei- oder dreimal laichen. In einem guten Spawn überleben die meisten Embryonen durch das Schlüpfen, ein kritisches Stadium. Kulturen sollten häufig überprüft und unbefruchtete Eier, tote oder deformierte Embryonen oder Trümmer, einschließlich Essensreste oder Parasiten, entfernt werden. Kulturen mit meist lebenden Embryonen sollten während der embryonalen und frühen Larvenperiode alle paar Stunden "gereinigt" werden, indem tote oder abnormale Embryonen (die schließlich absterben) und Trümmer mit einer Pasteur-Pipette manuell entfernt werden. Kulturen mit einem großen Anteil toter Embryonen können weiterhin verwendet werden, indem die sich normalerweise entwickelnden Embryonen mit frischem blauem Wasser auf neue Fingerschalen übertragen werden. Normalerweise muss dieser Prozess mehrmals wiederholt werden, um die reinsten Kulturen lebender Embryonen zu erhalten. In beiden Fällen ist eine Endkonzentration von etwa 100 Embryonen pro 200 ml ideal, da das Überlagern von Embryonen die Entwicklung beeinträchtigen kann, insbesondere bei Höhlenfischen. Kulturen sollten im Laufe der Zeit weiter "gereinigt" werden, indem regelmäßig das meiste Wasser aus den Fingerschalen entfernt und durch frisches blaues Wasser ersetzt wird. Kulturen, die häufig "gereinigt" werden, liefern in der Regel die höchste Qualität der Embryonen.

Neben der natürlichen Züchtung ist auch die hormonelle Stimulation²⁰ oder die In-vitro-Fertilisation¹⁸ potenziell nützlich, um Embryonen zu erhalten. Zu diesem Zweck müssen Fische jedoch gesund und bereit für das natürliche Laichen sein (Laichverhalten zeigen), und es ist mit einem viel geringeren Ertrag an Embryonen zu rechnen, als unter den temperaturbedingten Laichbedingungen.

Eine Einschränkung der temperaturinduzierten Zucht unter den oben beschriebenen Bedingungen besteht darin, dass Oberflächenfische und Höhlenfische zu unterschiedlichen Zeiten laichen, erstere am frühen Abend und letztere von nach Mitternacht bis zum frühen Morgen. Diese Situation kann nicht durch eine Verschiebung der Photoperiode vermieden werden, da regelmäßige Fütterungs- und Fischsystemwartung in der Regel während der Lichtperiode (tagsüber) des Zyklus durchgeführt werden muss. Prinzipiell können die Zeitpläne jedoch so angepasst werden, dass Fische zu ähnlichen Zeiten laichen, indem die beiden Morphs in verschiedenen Hell-Dunkel-Zyklen (und in verschiedenen Fischzuchtsystemen) für ein nahezu gleichzeitiges Laichen beibehalten werden. Wenn zwei Temperaturkontrollsysteme zur Verfügung stehen, könnten Fische in verschiedenen Systemen kultiviert werden, und durch abwechselnde wöchentliche Temperaturanstiege könnte das Laichen wöchentlich und nicht zweimonatlich erfolgen, wodurch die Kapazität für die Gewinnung von Embryonen verdoppelt wird.

Ob für wissenschaftliche Forschung, Lehre oder Biotechnologie, A. mexicanus ist ein hervorragendes Modellsystem, um die faszinierenden Fragen rund um die Evolution der Entwicklung zu erforschen. Für die wissenschaftliche Forschung ist dieses System nützlich, um molekulare, genetische und evolutionäre Mechanismen der Augenentwicklung und -krankheit zu untersuchen. Das Auge ist ein außergewöhnliches Organ in Bezug auf seine Struktur, Funktion und Entwicklung. Das Sehvermögen wird während der Embryonalentwicklung durch die koordinierte Bildung und das Wachstum mehrerer verschiedener Augengewebe erworben. Die genauen Mechanismen, durch die dies geschieht, sind noch weitgehend unbekannt. Die Struktur von Säugetier- und Fischaugen ist ähnlich. Die natürlichen Augenphänotypen von A. mexicanus sind ein ausgezeichnetes Modellsystem, um die molekularen und zellulären Mechanismen und genetischen Wege zu erforschen, die an der Entwicklung und Degeneration des Auges beteiligt sind^21,22. Dieses Wissen könnte genutzt werden, um Präventionsstrategien und Behandlungen für erbliche Augenerkrankungen zu entwickeln. Pigmentierungsstudien sind ein weiterer Bereich, in dem A. mexicanus einen wertvollen Beitrag leistet²³. Im Unterricht können A. mexicanus Embryonen verwendet werden, um die allgemeinen Prinzipien der Embryonalentwicklung zu veranschaulichen und in Lehrexperimenten für Anfänger. In der Biotechnologie, mit der jüngsten Entwicklung der genomischen DNA-Editierung²⁴ und insbesondere der CRISPR / Cas-9-Genomtechnologie^25,sind A. mexicanus-Embryonen eine wertvolle Ressource, um Genfunktionen zu erforschen. Jede dieser Anwendungen wird durch das Laichen großer Mengen hochwertiger Embryonen unterstützt, was durch das in dieser Mitteilung beschriebene inkrementelle Temperaturzuchtregime erreicht werden kann.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blackworms	Eastern Aquatics, Lancaster, PA	None
Breeding Nets	Custom made
Brine shrimp eggs	AquaCave Lake Forest, IL.	None
Colorimetric test kit	Petco	SKU:11916	API Freshwater pH Test Kit
Egg yolk flakes	Pentair, Minneapolis, MN	None
Fingerbowls	Carolina Biological Supply	741004	Culture dishes, 4.5 in, 250 mL
Hand held nets	Any Pet Store
Incubator for embryos	Fisher Scientific	51-029-321HPM	405 L
Instant Ocean sea salts	Spectrum Brands, Blacksburg, VA	None
Methylene Blue	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M9140
Pasteur Pipettes	Fisher Scientific	13-678-20	5.75 in.
Net soaking solution	Any Pet Store
Nutrafin Cycle	Amazon	None	Bacterial boost
Refrigerator for live feed	Any source
Stereomicroscope	Any source
Thermometer	Any source
Tetra Tropical Crisps	Spectrum Brands, Blacksburg, VA	None