Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Stegvisa temperaturförändringar för maximal avel och gytning i Astyanax mexicanus

Published: February 14, 2021 doi: 10.3791/61708
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biology, University of Maryland

Summary

Denna artikel beskriver de grundläggande laboratorieförhållandena och protokollen för en inkrementell temperaturregim för att stimulera maximal gytning i den mexikanska tetra Astyanax mexicanus, som är en framväxande modell för utvecklings- och evolutionära studier.

Abstract

Den mexikanska tetran Astyanax mexicanusär ett framväxande modellsystem för studier inom utveckling och evolution. Förekomsten av eyed surface (ytfisk) och blind grotta (grottfisk) morfer i denna art utgör en möjlighet att förhöra mekanismerna bakom morfologiska och beteendemässiga evolutioner. Grottfisk har utvecklat nya konstruktiva och regressiva drag. De konstruktiva förändringarna inkluderar ökningar av smaklökar och käkar, laterala linjesensoriska organ och kroppsfett. De regressiva förändringarna inkluderar förlust eller minskning av ögon. melaninpigmentering, skolbeteende, aggression och sömn. För att experimentellt förhöra dessa förändringar är det viktigt att få ett stort antal spawned embryon. Sedan den ursprungliga A. mexicanus ytfisken och grottfisken samlades in i Texas och Mexiko på 1990-talet har deras ättlingar rutinmässigt stimulerats att odla och leka ett stort antal embryon varannanmon i Jeffery-laboratoriet. Även om avel styrs av mat överflöd och kvalitet, ljus-mörka cykler och temperatur, har vi funnit att inkrementella temperaturförändringar spelar en nyckelroll för att stimulera maximal gytning. Den gradvisa temperaturökningen från 72 °F till 78 °F under de tre första dagarna av en häckningsvecka ger två-tre på varandra följande lekdagar med maximalt antal högkvalitativa embryon, som sedan följs av en gradvis temperatursänkning från 78 °F till 72 °F under de sista tre dagarna av lekveckan. De procedurer som visas i denna video beskriver arbetsflödet före och under en laboratorieuppfödningsvecka för inkrementell temperatur stimulerad gytning.

Introduction

Teleosten Astyanax mexicanus har en eyed ytbehandla-bo (ytbehandla fisken) bildar, och många olika blinda grotta-bo (grottafisk) bildar1,2. Grottfisk har utvecklats i evigt mörker och under livsmedelsbegränsningar, vilket resulterar i utseendet på nya konstruktiva och regressiva drag3. De konstruktiva egenskaperna inkluderar ökningar av smaklökar och käkstorlek, sensoriska organ i sidolinjen och fettreserver. De regressiva egenskaperna inkluderar förlust eller minskning av melaninpigmentering, ögon och beteenden, såsom sömn, skolgång och aggression. Ett attribut för Astyanax-systemet är fullständig fertilitet mellan de två formerna, vilket gör det möjligt att använda kvantitativ egenskapslokus (QTL) mappning för att bestämma de genomiska regioner som är associerade med konstruktiv och regressiv utveckling4,5,6,7. A. mexicanus erbjuder ett fördelaktigt system för att studera utveckling eftersom det kan induceras att leka ofta i laboratoriet. Embryona från A. mexicanus är genomskinliga, något större än zebrafiskar, producerade i stora mängder och utvecklas till sexuellt mogna vuxna på cirka 8-12 månader. Deras period av maximal lekkapacitet är ca 5 år. Detta protokoll beskriver arbetsflödet som behövs i en A. mexicanus kulturanläggning under en typisk avelsvecka och innehåller detaljer om fisksystemets underhåll och temperaturkontrollregimen för maximal gytning.

A. mexicanus är en tropisk fisk som lever i floder med ursprung i kalkstensplatåer (ytfisk) och i pooler i kalkstensgrottor(grottfisk) 8. Kalksten löses upp för att producera hårt vatten, och A. mexicanus trivs i hårt vatten. Fisk anpassad till hårda vattenförhållanden kan tolerera en rad salta förhållanden, men odlar i allmänhet i specifika9. Induktion av gytbeteende uppnås genom en kombination av faktorer. Eftersom fisk är kallblodig och förlitar sig på sin miljö för att upprätthålla homeostas, är deras ämnesomsättning känslig för miljöförändringar och de reagerar snabbare påstressfaktorer 10. A. mexicanus bör odlas i vattensystem under noggrant reglerade förhållanden med vattenflöde, pH, konduktivitet, osmotiskt tryck, belysning och vattentemperaturer.

I Jeffery-laboratoriet upprätthålls fisk i två rinnande vattensystem: (1) ett "babysystem" för unga vuxna fiskar före sexuell mognad och (2) ett vuxen (eller huvud) system för sexuellt mogna, avels vuxna. "Babysystemet" består av 8 L och 15 L tankar som levereras med rinnande vatten. "Babysystemet" sås av stek och unga metamorfoserade ungfåglar som odlas från larver i mindre (1-10 L) tankar, där vatten byts ut varje vecka. Larver, stek och ungfisk är extremt matberoende och måste matas levande mat (saltlakeräkor) en gång om dagen för att säkerställa en hög överlevnadsgrad. Unga ungdomar från "babysystemet" placeras i vuxensystemet efter ca 1-1,5 år. Först matas de pulveriserade tetraflingor, och efter ytterligare tillväxt överförs de till den vanliga vuxna utfodringsregimen. Sexuell mognad kan bedömas med bukvolym hos kvinnor, och metoder för att bestämma kön har beskrivits11. I vuxensystemet byts vatten ut automatiskt i 42 L tankar 3 gånger per 24-timmarsperiod. Vuxensystemet övervakas dagligen genom visuell inspektion och automatiska temperatur-, pH- och konduktivitetsavläsningar från sonder. Det optimala pH-talet är cirka 7,4 och kan variera mellan 6,8-7,5, systemets bastemperatur är 72/73 °F och den ideala ledningsförmågan varierar mellan 600-800 mS. Automatiska avläsningar visas på en styrenhetsskärm och visuella kontroller av vattentrycket avläses vid flödesmätare fördelade över hela systemet. Oberoende kontroller av vattenkvaliteten görs varje vecka genom att testa temperaturen och mäta vattenkvalitetsparametrar för pH, ammoniak och nitrat med hjälp av ett kolorimetriskt test. Ammoniak- och nitratnivåerna hålls på eller nära noll genom att tillsätta nyttiga bakterier (t.ex. Nutafin Cycle) till systemet. Rumsbelysningen styrs av en timer som är justerad till 14-timmars ljus och 10 timmars mörka perioder. Förutom de övergripande vattenkvalitetsparametrarna som nämns ovan behöver följande överväganden särskild uppmärksamhet under en avelsvecka.

Det första övervägandet är fotoperiod, eftersom fisk (även grottfisk i laboratoriet) är beroende av ljuscykler för att ställa in sin dygnsrytmklocka. Dygnsrytmen kan påverka allt från avel och utfodring till immunsystemets hälsa12,13 och måste vara konsekvent för maximala hälsofördelar. Fisk hålls i ett rinnande vattensystem på en 14-timmars ljus och 10-timmars mörk fotoperiod. Ytfisken börjar i allmänhet leka en timme efter att systemet har mörkats, och ljus som introduceras under denna period kan störa och avsluta gytning. Gytningen av blind grottfisk störs mindre av ljus. Jämfört med ytfisklekning fördröjs grottfiskens gytning, vanligtvis med början fyra till fem timmar efter att systemet har mörkats.

Det andra övervägandet är näring. Vuxna fiskar matas normalt en diet av tetraflingor en gång om dagen. Före gytning matas fisk en proteinrik kost kompletterad med extra mängder tetraflingor och annan mat: äggulaflingor och ibland levande Kalifornien blackworms (Lumbriculus variegatus) för att kompensera för proteinförlust på grund av äggproduktion under föregående gytcykel. Under uppfödningsveckan matas fisken två gånger per dag, en gång på morgonen och igen på eftermiddagen /kvällen. Fiskfoder endast en gång om dagen men med en enda mycket stor del av maten bör undvikas, eftersom detta kan orsaka undernäring14.

Den tredje faktorn är rymden. Utrymmeskraven baseras på den genomsnittliga kroppsmassan hos en vuxen samt beteendemässiga överväganden, till exempel om fisken har skolbeteende eller aggressivt beteende. Över- eller underträngningstankar kan leda till ökad aggression och konstant stress, vilket gör fisken sårbar för skador från sina tankkamrater och motvillig att delta igytning 15. Vi brukar hysa 10-20 fiskar per 42 L tank.

Det fjärde övervägandet är temperatur. Som nämnts ovan är fisk kallblodiga djur och förlitar sig på miljön för att bibehålla kroppstemperaturen. Eftersom temperaturen har en direkt effekt på metaboliska processer kan temperaturförändringar utlösa beteendeförändringar hos fisk16. Detta avelsprogram består av två veckors temperaturcykler: den första veckan introducerar en temperaturökning till 78 °F, och nästa vecka bibehåller en statisk temperatur på 72 °F. Under den första (avels)veckan placeras plastkantade avelsnät i botten av tankarna varje kväll. Avelsnäten fungerar som en barriär mellan fisken i tankarna och de lekta äggen, som annars skulle konsumeras. Temperaturen höjs med 2 °F per dag till högst 78 °F i mitten av veckan, och gytning induceras enligt ljuscykeln under de första 2-3 kvällarna denna vecka. Temperaturen sänks sedan med 2 °F steg till 72 °F under de återstående dagarna i veckan, och bastemperaturen bibehålls fram till början av nästa avelsvecka. Avel stimuleras vanligtvis inte mer än två gånger i månaden för att ge fisken tid att återhämta sig.

Sammantaget möjliggör denna metod gytning av stora mängder embryon av högsta kvalitet under en längre tid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Detta förfarande har godkänts av riktlinjer för institutionell djurvård vid University of Maryland, College Park (för närvarande IACUC 469 #R-NOV-18-59; Projekt 1241065-1).

Figure 1
Figur 1. Kalendrar under en avelsvecka och en icke-avelsvecka. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

1. Måndag

  1. Vid 9-10,00, utför vattentester och steg 1.1.1-4 nedan.
    1. Registrera rums-, tank- och reservoartemperaturerna med hjälp av en termometer.
    2. Registrera ammoniak-, nitrat- och nitratnivåerna med ett kolorimetriskt testkit.
    3. Spela in pH-systemet från övervakningssystemet samt det kolorimetriska testpaketet.
    4. Spela in konduktiviteten från carboy-monitorn och huvudsystemmonitorn.
  2. Börja klockan 10, mata all fisk.
    1. Mata all fisk i vuxensystemet med tetraflingor och krossa flingorna i tankarna med ung fisk. Mata bara så många flingor som en tank fisk kan konsumera helt på 3-5 minuter, ungefär en "finger nypa".
  3. Kontrollera inkubatorn som används för att hysa fingerbowls av att utveckla embryon och byt vatten om det behövs.
    1. Öppna embryoinkubatorn och kontrollera vattennivåerna i alla reservoarer. Om de börjar få ont om vatten, tillsätt systemvatten. Kontrollera temperaturinställningarna för inkubatorn. Höj embryon vid 73-77 °F (23-25 °C).
  4. Rengör direktsändningen.
    1. För att rengöra blackworms, ta bort de otäckta Tupperware-bassängerna som innehåller deras kulturer från det levande foderkylskåpet och häll av överflödigt vatten ovanför maskklustren i diskbänken. Använd destillerat vatten, suspendera och skölj maskarna upprepade gånger tills hällvattnet är klart.
    2. Tillsätt tillräckligt med rent vatten så att maskklustren är ungefär halvtäckta. Byt ut återstående maskar i det levande foderkylskåpet, otäckt.
  5. Mata fisk.
    1. Minst 30 min efter den första utfodringen matar fisken i tankarna där uppfödning önskas med äggulaflingor, svarta maskar eller båda. Tillsätt en "fingerpinch" av äggulaflingor per tank. Tillsätt tillräckligt med blackworm-kluster för att låta varje fisk i tanken konsumera cirka 5-10 maskar.
  6. Vid 10:00-13:00, ställ in vattentemperaturen på 74 °F.
  7. Skrubba avelstankarna efter behov och ställ in avelsnäten.
  8. Rengör tankarna och placera näten minst en timme efter den sista utfodringen. Rengör alla tankar som nät placeras i i förväg. Ställ försiktigt in avelsnäten för att inte störa lufttillförseln till tanken.

2. Tisdag

  1. Samla embryona och tvätta alla avelsnät.
    1. Vid 9-10 AM, ta bort avelsnäten från botten av vuxna systemtankar. Skölj försiktigt embryona i ett handhållen nät med hjälp av slangen som är fäst vid karboyen och vänd in det handhållna nätet i en fingerbowl av rent systemvatten för att utvisa embryona.
    2. Samla upp och tvätta varje uppsättning embryon och placera sedan i en fingerbowl av rent systemvatten som innehåller 0,00003% metylenblått (blått vatten). Om det finns ett exceptionellt stort antal embryon från en enda tank, separera dem i flera skålar. Koncentrationen av levande embryon bör vara ca 100 per 200 ml blått vatten i varje fingerskål.
    3. Uppskatta befruktningstiden genom att iscensätta embryona under ett mikroskop med hjälp av den publicerade A. mexicanus utvecklingstidtabellen17.
    4. Övervaka fingerbowls som innehåller embryon ofta. Ta bort döda eller deformerade embryon och skräp, såsom oäten mat eller avföring, med en Pasteur-pipett. Byt blått vatten i fingerbowls ofta.
    5. Placera fingerbowls i en inkubator i 5-7 dagar. Vid denna tidpunkt har äggulan förbrukats och utfodringskulturer med levande saltlakeräkor är nödvändiga för vidare utveckling.
  2. Ta gytdata.
    1. För varje tank som tappar embryon, registrera följande information.
      1. Registrera datum och tanknummer.
      2. Registrera det ungefärliga antalet embryon som släppts (figur 2):
        Hög (500+)
        Medel (200-500)
        Låg(<200)
      3. Registrera kvaliteten på de embryon som tappats (figur 2):
        Hög (>75% levande)
        Medium (25-50% levande)
        Låg (<25% vid liv)
      4. Uppskatta den ursprungliga gyttiden genom att konsultera Astyanax mexicanus iscensättningstabell 17.
      5. Registrera temperaturen som systemet sattes vid när fisken lekte.
  3. Mata all fisk.
  4. Ställ in vattentemperaturen på 76 °F.
  5. Förbered direktsändning.
  6. Mata fisk #2.
  7. Skopa överflödig mat och skräp från tankar och skrubba innan du återställer näten.

3. Onsdag

  1. Upprepa steg 2.1-2.2. Samla embryon och tvätta alla avelsnät.
  2. Ta gytdata som tidigare.
  3. Utför vattentester som tidigare.
  4. Mata all fisk.
  5. Ställ in vattentemperaturen på 78 °F.
  6. Förbered direktsändningen.
  7. Kontrollera embryona i inkubatorn.
    1. Rengör och ändra embryots vatten i fingerbowls som så småningom kommer att användas för att fylla på det allmänna vuxna avelsbeståndet. Använd metylenblåbehandlat systemvatten.
  8. Mata fisk igen.
  9. Rengör tankarna efter behov och återställ näten.

4. Torsdag

  1. Upprepa steg 2.1-2.2. Samla embryon och tvätta och lagra avelsnät.
  2. Ta gytdata som tidigare.
  3. Ställ in vattentemperaturen på 76°F.
  4. Rengör direktsändningen.
  5. Rengör alla enskilda tankar.
  6. Kontrollera embryona i inkubatorn.
  7. Mata fisk #2.

5. Fredag

  1. Mata all fisk.
  2. Ställ in vattentemperaturen på 74 °F.
  3. Rengör direktsändningen.
  4. Kontrollera embryona i inkubatorn.

6. Lördag

  1. Mata fisk.

7. Söndag

  1. Mata fisk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi odlar och spawnar i allmänhet ättlingar till ytfisk som ursprungligen samlades in på Nacimiento del Rio Choy i San Luis Potosi, Mexiko (Rio Choy ytfisk) och San Solomon Springs i Balmorhea State Park, Texas (Texas ytfisk) och grottfisk som härrör från Cueva de El Pachón (Pachón grottfisk) i Tamaulipas, Mexiko, och Cueva de los Sabinos (Los Sabinos grottfisk) och Sotano de la Tinaja (Tinaja fiskgrotta) i San Luis Potosi Mexico.

Under en avelsvecka samlas data in för olika tankar. De lekta embryona i varje tank observeras för kvantitet och kvalitet. Kvantiteten registreras som hög, medel eller låg. En mängd hög registreras om antalet embryon som släpps är över 500, en mängd medium registreras om antalet embryon som släpps är mellan 200 och 500, och en mängd låg registreras om antalet embryon som släpps är mindre än 200. Kvaliteten registreras på samma sätt som hög, medel eller låg. En hög kvalitet registreras om mer än 75% av embryona i skålen lever, en kvalitet på mediet registreras om cirka 25% till 75% av embryona i skålen lever, och en kvalitet på låg registreras om mindre än 25% av embryona lever. Dessa indikationer på kvantitet och kvalitet tilldelas sedan ett tal med hög är 3, medium är 2 och låg är 1. Om det inte fanns några embryon som fötts eller inga levande embryon i gytningen tilldelas ett antal 0.

Avelsdata från juli 2017 till mars 2020 för Ytfisken Rio Choy och Texas och grottfisken Los Sabinos, Tinaja och Pachón visas i figur 2. Data analyserades av avelsveckan och genom att i genomsnitt antalet som härrör från varje dag för insamling av embryon under en enda avelsvecka. Uppgifterna tyder på att avel var kontinuerlig under hela året i Rio Choy och Texas ytfisk och i Pachón grottfisk. Kvantiteten och kvaliteten på de flesta Rio Choy ytfiskar var mellan låg och hög, medan kvantiteten och kvaliteten på de flesta Texas ytfisk och Pachón grottfisk var mellan låg och medel. Förekomsten av gytning var inte kontinuerlig i Tinaja eller Los Sabinos grottfisk: gytningen var låg eller obefintlig under sensommaren (juli) till hösten (oktober). Även om de lägsta nivåerna av gytning registrerades för Los Sabinos grottfisk, var kvaliteten på embryon den bästa. I allmänhet visar ytfisk bättre gytmängd och kvalitet än grottfisk.

Figure 2
Figur 2. Avelsdata för olika ytfisk- och grottfiskpopulationer från juli 2017 till mars 2020. Från topp till botten är Rio Choy ytfisk, Texas ytfisk, Pachón grottfisk, Tinaja grottfisk och Los Sabinos grottfisk. Obrutna linjer: kvaliteten på gyten. Brutna linjer: mängd spawn. Veckor utan linjer representerar perioder då gytning inte försöktes. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Astyanax mexicanus är en ny biologisk modell som leker ofta och kan odlas lätt i laboratoriet1,2. Eftersom vi är intresserade av de utvecklingsmekanismer som ligger till grund för evolutionära förändringar i A. mexicanus grottfisk, är produktion och användning av embryon avgörande för våra forskningsmål. Det främsta syftet med att upprätthålla ett vuxenbestånd av fisk är produktion av embryon och ungt stek för användning i utvecklingsförsök och för påfyllning av vuxna avelsbestånd. Ibland kan vuxna också användas för fysiologi, beteendemässiga eller genetiska experiment. Genetiska experiment kräver parat parning eller in vitro-befruktning18. För in vitro-befruktningsdjur som uppvisarlekbeteende kan 19 avlägsnas från tankar och användas för kors under den temperaturinducerade avelssystemet.

För att maximera kvaliteten och mängden embryon för forskning finns det operativa detaljer som kräver uppmärksamhet före uppfödningsveckan. Vid manipulat av fisk i tankarna, använd endast avsedda handhållna nät, doppa dem i en nät blötläggningslösning mellan varje användning och skölj dem med varmt kranvatten mellan användningarna för att förhindra förorening mellan tankarna. Tvätta noggrant och desinficera alla instrument som används för att ta hand om fisken. Ta bort och rengör avelsnäten i systemvatten innan du byter ut dem i tankarna. I slutet av veckan lagras alla avelsnät torra på hyllor i fiskrummet. Under en avelsvecka, kontrollera varje tank för embryon i avelsnäten eller för fisk som uppvisar lekbeteende (dvs. simma runt i cirklar parade mot varandra), eftersom honorna i dessa tankar sannolikt är redo att leka. Detta bör göras med rött ljus under fotograferingens mörka timmar. A. mexicanus spawn i mörkret genom att sprida ägg och spermier i moln. En tank med en population på ca 10-20 fiskar och ett manligt förhållande mellan män och kvinnor på ca 1:1 kan producera upp till 500 befruktade embryon i en gytning per tank, och varje fisktank kan leka två eller tre gånger under en enda avelsvecka. I en bra gyt kommer de flesta embryon att överleva genom kläckning, ett kritiskt stadium. Kulturer bör kontrolleras ofta och obefruktade ägg, döda eller deformerade embryon eller skräp, inklusive eventuella matrester eller parasiter, bör avlägsnas. Kulturer med mestadels levande embryon bör "rengöras" med några timmars ålder under de embryonala och tidiga larvperioderna genom att manuellt avlägsna döda eller onormala embryon (som så småningom kommer att dö) och skräp med hjälp av en Pasteur-pipett. Kulturer med en stor andel döda embryon kan fortfarande användas genom att överföra de normalt utvecklande embryona till nya fingerbowls med färskt blått vatten. Vanligtvis måste denna process upprepas flera gånger för att få de renaste kulturerna hos levande embryon. I båda fallen är en slutlig koncentration på cirka 100 embryon per 200 ml idealisk eftersom trängsel av embryon kan påverka utvecklingen, särskilt för grottfisk. Kulturer bör "rengöras" ytterligare över tiden genom att regelbundet ta bort det mesta av vattnet från fingerbowls och ersätta med det med färskt blått vatten. Kulturer "rengjorda" ger ofta den högsta kvaliteten på embryon.

Förutom naturlig avel är hormonell stimulering20 eller in vitro-befruktning18 också potentiellt användbar för att erhålla embryon. För dessa ändamål måste fisken dock vara frisk och redo för naturlig gytning (uppvisar lekbeteende), och ett mycket mindre utbyte av embryon än som erhålls under de temperaturinducerade gytförhållandena bör förväntas.

En begränsning av temperaturinducerad avel under de förhållanden som beskrivs ovan är att ytfisk och grottfisk leker vid olika tidpunkter, den förra under den tidiga kvällen och den senare från efter midnatt till tidig morgon. Denna situation kan inte undvikas genom att ändra fotoperioden eftersom regelbundet foder- och fisksystemunderhåll vanligtvis måste utföras under cykelns ljusperiod (dagtid). I princip kan dock scheman justeras så att fisken leker vid liknande tidpunkter genom att behålla de två morforna på olika ljus-mörka cykler (och i olika fiskuppfödningssystem) för nära samtidig gytning. Om det finns två temperaturkontrollsystem skulle dessutom fisk kunna odlas i olika system, och genom alternerande temperaturökningar varje vecka skulle leken kunna ske varje vecka i stället för varannan månad, vilket fördubblar kapaciteten att få embryon.

Oavsett om det används för vetenskaplig forskning, undervisning eller bioteknik är A. mexicanus ett utmärkt modellsystem för att utforska de fascinerande frågorna kring utvecklingen av utvecklingen. För vetenskaplig forskning är detta system användbart för att undersöka molekylära, genetiska och evolutionella mekanismer för ögonutveckling och sjukdom. Ögat är ett extraordinärt organ när det gäller dess struktur, funktion och utveckling. Vision förvärvas under embryonal utveckling till följd av samordnad bildning och tillväxt av flera olika ögonvävnader. De exakta mekanismer genom vilka detta sker är fortfarande i stort sett okända. Strukturen hos däggdjur och fiskögon är liknande. De naturliga ögon fenotyperna av A. mexicanus är ett utmärkt modellsystem för att utforska de molekylära och cellulära mekanismerna och genetiska vägarna som är involverade i ögonutveckling och degeneration21,22. Denna kunskap skulle kunna användas för att utveckla förebyggande strategier och behandlingar för ärftliga ögonsjukdomar. Pigmenteringsstudier är ett annat område där A. mexicanus gör ett värdefullt bidrag23. I undervisningen kan A. mexicanus embryon användas för att illustrera de allmänna principerna för embryonal utveckling och i undervisningsexperiment för att börja studera. Inom biotekniken, med den senaste utvecklingen av genomiskDNA-redigering 24 och särskilt CRISPR / Cas-9 genomisk teknik25, är A. mexicanus embryon en värdefull resurs för att utforska genfunktioner. Var och en av dessa tillämpningar underlättas av gytning av stora mängder högkvalitativa embryon, vilket kan uppnås genom det stegvisa temperaturavelssystem som beskrivs i detta meddelande.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar David Martasian, Diedre Heyser, Amy Parkhurst, Craig Foote och Mandy Ng för värdefulla bidrag till Jeffery-laboratoriet A. mexicanus kulturanläggning. Forskningen i Jeffery-laboratoriet stöds för närvarande av NIH-bidraget EY024941.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blackworms Eastern Aquatics, Lancaster, PA None
Breeding Nets Custom made
Brine shrimp eggs AquaCave Lake Forest, IL. None
Colorimetric test kit Petco SKU:11916 API Freshwater pH Test Kit
Egg yolk flakes Pentair, Minneapolis, MN None
Fingerbowls Carolina Biological Supply 741004 Culture dishes, 4.5 in, 250 mL
Hand held nets Any Pet Store
Incubator for embryos Fisher Scientific 51-029-321HPM 405 L
Instant Ocean sea salts Spectrum Brands, Blacksburg, VA None
Methylene Blue Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M9140
Pasteur Pipettes Fisher Scientific 13-678-20 5.75 in.
Net soaking solution Any Pet Store
Nutrafin Cycle Amazon None Bacterial boost
Refrigerator for live feed Any source
Stereomicroscope Any source
Thermometer Any source
Tetra Tropical Crisps Spectrum Brands, Blacksburg, VA None

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jeffery, W. R. Cavefish as a model system in evolutionary developmental biology. Developmental Biology. 231, 1-12 (2001).
  2. Jeffery, W. R. Emerging model systems in evo-devo: cavefish and mechanisms of microevolution. Evolution & Development. 10, 265-272 (2008).
  3. Jeffery, W. R. Evolution and development in the cavefish Astyanax. Current Topics in Developmental Biology. 86, 191-221 (2009).
  4. Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature Genetics. 38, 107-111 (2006).
  5. Protas, M., Conrad, M., Gross, J. B., Tabin, C. J., Borowsky, R. Regressive evolution in the Mexican cave tetra, Astyanax mexicanus. Current Biology. 17, 452-454 (2007).
  6. O'Quin, K. E., Yoshizawa, M., Doshi, P., Jeffery, W. R. Quantitative genetic analysis of retinal degeneration in the blind cavefish. PLoS ONE. 8 (2), 57281 (2013).
  7. Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13, 15 (2015).
  8. Elliot, W. R. The Astyanax caves of Mexico. Cavefishes of Tamaulipas, San Luis Potosi, and Guerrero. Association for Mexican Cave Studies Bulletin. 26, 1 (2018).
  9. Luo, S., Wu, B., Xiong, X., Wang, J. Effects of total hardness and calcium:magnesium ratio of water during early stages of rare minnows (Gobiocypris rarus). Comparative Medicine. 66, 181-187 (2016).
  10. Balasch, J. C., Tort, L. Netting the stress responses in fish. Frontiers in Endocrinology. 10, 62 (2019).
  11. Borowsky, R. Determining the sex of adult Astyanax mexicanus. , Cold Spring Harbor Protocols. (2008).
  12. Paschos, G. Circadian clocks, feeding time, and metabolic homeostasis. Frontiers in Pharmacology. 6, 112 (2015).
  13. Scheiermann, C., Kunisaki, Y., Frenette, P. S. Circadian control of the immune system. Nature Reviews Immunology. 13, 190-198 (2013).
  14. Williams, M. B., Watts, S. A. Current basis and future directions of zebrafish nutrigenomics. Genes & Nutrition. 14, 34 (2009).
  15. Harper, C., Wolf, J. C. Morphologic effects of the stress response in fish. ILAR Journal. 50, 387-396 (2009).
  16. Neubauer, P., Andersen, K. H. Thermal performance in fish is explained by an interplay between physiology, behavior and ecology. Conservation Physiology. 7 (1), 025 (2019).
  17. Hinaux, H., et al. Developmental staging table for Astyanax mexicanus. Zebrafish. 8 (4), (2011).
  18. Borowsky, R. In vitro fertilization of Astyanax mexicanus. , Cold Spring Harbor Protocols. (2008).
  19. Simon, V., Hyacinthe, C., Rétaux, S. Breeding behavior in the blind Mexican cavefish and its river-dwelling conspecific. PLoS One. 14 (2), 0212591 (2019).
  20. Harvey, B. J., Carolsfield, J. Induced Breeding in Tropical Fish Culture. International Development Research Centre. , (1993).
  21. Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. R. The role of a lens survival pathway including sox2 and aA-crystallin in the evolution of cavefish eye degeneration. EvoDevo. 5, 28 (2014).
  22. Krishnan, J., Rohner, N. Cavefish and the basis for eye loss. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 5 (372), 20150487 (2017).
  23. Bilandžija, H., Abraham, L., Ma, L., Renner, K., Jeffery, W. R. Behavioral changes controlled by catecholaminergic systems explain recurrent loss of pigmentation in cavefish. Proceedings of the Royal Society. 285, (2018).
  24. Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican cavefish. PLoS ONE. 1093, 0119370 (2015).
  25. Klaassen, H., Wang, Y., Adamski, K., Rohner, N., Kowalko, J. E. CRISPR mutagenesis confirms the role of oca2 in melanin pigmentation in Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441, 313-318 (2018).

Tags

Återkallelse Utgåva 168 Astyanax mexicanus inkrementell temperatur grottfisk ytfisk avel maximal gytning embryon utvecklingsstudier
Stegvisa temperaturförändringar för maximal avel och gytning i <em>Astyanax mexicanus</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ma, L., Dessiatoun, R., Shi, J.,… More

Ma, L., Dessiatoun, R., Shi, J., Jeffery, W. R. Incremental Temperature Changes for Maximal Breeding and Spawning in Astyanax mexicanus. J. Vis. Exp. (168), e61708, doi:10.3791/61708 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter