Summary
Denne artikel skitserer de grundlæggende laboratoriebetingelser og protokoller for et trinvist temperaturregime for at stimulere maksimal gydning i den mexicanske tetra Astyanax mexicanus, som er en ny model for udviklingsmæssige og evolutionære undersøgelser.
Abstract
Den mexicanske tetra, Astyanax mexicanus, er et spirende modelsystem til undersøgelser i udvikling og udvikling. Eksistensen af eyed overflade (overflade fisk) og blind hule (hule fisk) morphs i denne art giver mulighed for at afhøre de mekanismer, der ligger til grund for morfologiske og adfærdsmæssige udvikling. Cave fisk har udviklet nye konstruktive og regressive træk. De konstruktive ændringer omfatter stigninger i smagsløg og kæber, lateral linje sensoriske organer, og kropsfedt. De regressive ændringer omfatter tab eller reduktion af øjne. melanin pigmentering, skolegang adfærd, aggression og søvn. For eksperimentelt at afhøre disse ændringer er det afgørende at opnå et stort antal gydede embryoner. Siden den oprindelige A. mexicanus overflade fisk og hule fisk blev indsamlet i Texas og Mexico i 1990'erne, har deres efterkommere rutinemæssigt blevet stimuleret til at opdrætte og gyde et stort antal embryoner hver anden måned i Jeffery laboratoriet. Selvom avl styres af fødevaretæthed og kvalitet, lyse mørke cyklusser og temperatur, har vi konstateret, at trinvise temperaturændringer spiller en central rolle i at stimulere maksimal gydning. Den gradvise temperaturstigning fra 72 °F til 78 °F i de første tre dage af en yngleuge giver to-tre på hinanden følgende gydedage med maksimalt antal embryoner af høj kvalitet, som derefter efterfølges af et gradvist fald i temperaturen fra 78 ° F til 72 ° F i løbet af de sidste tre dage af gydeugen. De procedurer, der er vist i denne video, skitserer arbejdsgangen før og under en laboratorieavlsuge for trinvis temperatur stimuleret gydning.
Introduction
Den teleost Astyanax mexicanus har en eyed overflade-bolig (overflade fisk) form og mange forskellige blinde hule-bolig (hule fisk) danner1,2. Cave fisk har udviklet sig i evig mørke og under fødevarebegrænsninger, hvilket resulterer i fremkomsten af nye konstruktive og regressive træk3. De konstruktive træk omfatter stigninger i smagsløg og kæbe størrelse, sensoriske organer af lateral linje, og fedt reserver. De regressive træk omfatter tab eller reduktion af melaninpigmentering, øjne og adfærd, såsom søvn, skolegang og aggression. En egenskab ved Astyanax-systemet er fuldstændig frugtbarhed mellem de to former, hvilket gør det muligt at bruge kvantitativ egenskabs loci (QTL) kortlægning til at bestemme den eller de genomiske regioner, der er forbundet med konstruktiv og regressiv evolution4,5,6,7. A. mexicanus tilbyder en fordelagtig system til at studere udvikling, fordi det kan induceres til at gyde ofte i laboratoriet. Embryonerne af A. mexicanus er gennemskinnelige, lidt større end zebrafisk, produceret i store mængder, og udvikler sig til seksuelt modne voksne i ca 8-12 måneder. Deres periode med maksimal gydekapacitet er omkring 5 år. Denne protokol beskriver den arbejdsgang, der er nødvendig i en A. mexicanus kulturfacilitet i løbet af en typisk avlsuge og indeholder detaljer om vedligeholdelse af fiskesystemet og temperaturkontrolregimet for maksimal gydning.
A. mexicanus er en tropisk fisk, der lever i floder med oprindelse i kalksten plateauer (overflade fisk) og i puljer i kalksten huler (hule fisk)8. Kalksten opløses for at producere hårdt vand, og A. mexicanus trives i hårdt vand. Fisk tilpasset hårde vandforhold kan tolerere en række salte forhold, men opdrætter generelt i specifikke9. Induktion af gydningsadfærd opnås ved en kombination af faktorer. Fordi fisk er koldblodede og er afhængige af deres miljø for at opretholde homøostase, er deres stofskifte følsomt over for miljømæssige ændringer, og de reagerer hurtigere på stressorer10. A. mexicanus bør dyrkes i vandsystemer under omhyggeligt regulerede betingelser for vandgennemstrømning, pH, ledningsevne, osmotisk tryk, belysning og vandtemperaturer.
I Jeffery-laboratoriet opretholdes fisk i to rindende vandsystemer: (1) et "babysystem" for unge voksne fisk før seksuel modenhed og (2) et voksent (eller hoved) system til seksuelt modne, avls voksne. "Babysystemet" består af 8 L- og 15 L-tanke, der leveres med rindende vand. "Babysystemet" er seedet af yngel og unge metamorfoserede unge dyrket fra larver i mindre (1-10 L) tanke, hvor vand udveksles ugentligt. Larver, yngel og unge fugle er ekstremt fødevareafhængige og skal fodres med levende mad (saltlage rejer) en gang om dagen for at sikre en høj overlevelsesrate. Unge unge fra "babysystemet" placeres i voksensystemet efter ca. 1-1,5 år. I første omgang fodres de pulveriserede tetraflager, og efter yderligere vækst overføres de til det almindelige voksenfodringsregime. Seksuel modenhed kan vurderes ved abdominal volumen hos kvinder, og metoder til bestemmelse af køn er blevet beskrevet11. I voksensystemet udskiftes vand automatisk i 42 L-tanke 3 gange pr. 24-timers periode. Voksensystemet overvåges dagligt ved visuel inspektion og automatisk temperatur, pH og ledningsevneaflæsninger fra sonder. Den optimale pH-luft er omkring 7,4 og kan ligge mellem 6,8-7,5, systemets grundtemperatur er 72/73 °F, og de ideelle ledningsevneområder mellem 600-800 mS. Automatiske aflæsninger vises på en controllerskærm, og visuel kontrol af vandtrykket aflæses ved strømningsmålere fordelt over hele systemet. Uafhængig kontrol af vandkvaliteten foretages ugentligt ved at teste temperatur og måle vandkvalitetsparametre for pH, ammoniak og nitrat ved hjælp af en kolorimetrisk test. Ammoniak- og nitratniveauet holdes på eller tæt på nul ved at tilsætte gavnlige bakterier (f.eks. Nutafin-cyklus) til systemet. Rumbelysning styres af en timer justeret til 14-timers lys og 10-timers mørke perioder. Ud over de overordnede vandkvalitetsparametre, der er nævnt ovenfor, kræver følgende overvejelser særlig opmærksomhed i løbet af en avlsuge.
Den første overvejelse er fotoperiod, da fisk (selv hulefisk i laboratoriet) er afhængige af lyscyklusser for at indstille deres døgnrytmeur. Døgnrytmen kan påvirke alt fra avl og fodring til immunsystemet sundhed12,13 og skal være konsekvent for maksimal sundhedsmæssige fordele. Fisk opretholdes i et rindende vandsystem på en 14-timers lys og 10-timers mørk fotoperiod. Overfladefisken begynder generelt at gyde en time efter, at systemet er blevet formørket, og lys, der introduceres i denne periode, kan forstyrre og afslutte gydning. Gydningen af blinde hulefisk forstyrres mindre af lys. Sammenlignet med overfladefisk gydning, hule fisk gydning er forsinket, normalt begynder fire til fem timer efter, at systemet er blevet formørket.
Den anden overvejelse er ernæring. Voksne fisk fodres normalt med en diæt af tetraflager en gang om dagen. Før gydning fodres fisk med en proteinrig kost suppleret med ekstra mængder tetraflager og anden mad: æggeblommeflager og lejlighedsvis levende californiske blackworms (Lumbriculus sortgatus) for at kompensere for proteintab på grund af ægproduktion i den foregående gydecyklus. I yngleugen fodres fisk to gange om dagen, en gang om morgenen og igen om eftermiddagen / aftenen. Fiskefodring kun en gang om dagen, men med en enkelt meget stor del af mad bør undgås, da dette kan forårsage underernæring14.
Den tredje overvejelse er plads. Pladskravene er baseret på den gennemsnitlige kropsmasse af en voksen samt adfærdsmæssige overvejelser, såsom om fisken har skoleadfærd eller aggressiv adfærd. Over eller under-crowding tanke kan føre til øget aggression og konstant stress, hvilket gør fisk sårbare over for skade fra deres tank kammerater og tilbageholdende med at deltage i gydning15. Vi huser typisk 10-20 fisk pr. 42 L tank.
Den fjerde overvejelse er temperatur. Som nævnt ovenfor er fisk koldblodede dyr og er afhængige af miljøet for at opretholde kropstemperaturen. Fordi temperaturen har en direkte effekt på metaboliske processer, kan temperaturændringer udløse adfærdsmæssige ændringer i fisk16. Dette avlsprogram består af to ugers cyklusser i temperatur: Den første uge introducerer en temperaturstigning til 78 ° F, og den næste uge opretholder en statisk temperatur på 72 ° F. I løbet af den første (avls) uge placeres plastkantede avlsnet i bunden af tankene hver aften. Avlsnettene tjener som en barriere mellem fisken i tankene og de gydede æg, som ellers ville blive forbrugt. Temperaturen hæves med 2 °F om dagen til maksimalt 78 °F midt på ugen, og gydning induceres i henhold til lyscyklussen i de første 2-3 aftener i denne uge. Temperaturen sænkes derefter med 2 °F trin til 72 °F i løbet af de resterende dage i ugen, og basistemperaturen opretholdes indtil begyndelsen af den næste avlsuge. Avl stimuleres normalt ikke mere end to gange om måneden for at give fisken tid til at komme sig.
Samlet set giver denne metode mulighed for gydning af store mængder embryoner af højeste kvalitet over en længere periode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne procedure er blevet godkendt af Institutional Animal Care retningslinjer fra University of Maryland, College Park (I øjeblikket IACUC 469 #R-NOV-18-59; Projekt 1241065-1).
Figur 1. Kalendere i løbet af en avlsuge og en ikke-avlsuge. Klik her for at se en større version af dette tal.
1. Mandag
- Kl. 9-10 skal du udføre vandprøver og trin 1.1.1-4 nedenfor.
- Registrer rum-, tank- og reservoirtemperaturerne ved hjælp af et termometer.
- Registrer ammoniak-, nitrat- og nitratniveauerne med et kolorimetrisk testkit.
- Registrer pH-vinduet fra overvågningssystemet samt det kolorimetriske testkit.
- Optag ledningsevnen fra carboy-skærmen og hovedsystemmonitoren.
- Fra kl. 10, fodrer alle fisk.
- Foder alle fisk i voksensystemet med tetraflager, knus flagerne i tankene med ung fisk. Foder kun så mange flager som en tank fisk kan forbruge helt på 3-5 minutter, om en "finger knivspids".
- Kontroller inkubatoren, der bruges til at huse fingerbowls for at udvikle embryoner og ændre vandet, hvis det er nødvendigt.
- Åbn embryoinkubatoren og kontroller vandstanden i alle reservoirer. Hvis de er ved at løbe tør for vand, tilsæt systemvand. Kontroller indstillingerne for inkubatortemperatur. Embryonerne hæves ved 23-25 °C.
- Rent live feed.
- For at rense blackworms skal du fjerne de udækkede Tupperware-bassiner, der indeholder deres kulturer, fra det levende foderkøleskab og hælde det overskydende vand over ormeklyngerne i vasken. Brug destilleret vand, suspendere og skylle ormene gentagne gange, indtil pour-off vand er klart.
- Tilsæt nok rent vand, så ormeklyngerne er omkring halvt dækket. Udskift de resterende orme i det levende foderkøleskab, afdækket.
- Foder fisk.
- Mindst 30 minutter efter den første fodring fodres fisk i de tanke, hvor avl ønskes med æggeblommeflager, blackworms eller begge dele. Tilsæt en "fingerpinch" af æggeblomme flager pr tank. Tilsæt nok blackworm klynger til at tillade hver fisk i tanken at forbruge omkring 5-10 orme.
- Ved 10.00-13.00 skal vandtemperaturen indstilles til 74 °F.
- Skrub avlstankene efter behov og sæt avlsnettene.
- Rengør tankene og læg nettene mindst en time efter den sidste fodring. Rengør alle tanke, som net er placeret i på forhånd. Sæt avlsnet omhyggeligt for ikke at forstyrre lufttilførslen til tanken.
2. Tirsdag
- Saml embryonerne og vask alle avlsnet.
- Kl. 9-10 fjernes avlsnettene fra bunden af voksne systemtanke. Skyl forsigtigt embryonerne i et håndholdt net ved hjælp af slangen fastgjort til carboyen, og vend det håndholdte net ind i en fingerbowl af rent systemvand for at udvise embryonerne.
- Opsamle og vaske hvert sæt embryoner, og derefter placere i en fingerbowl af rent system vand, der indeholder 0,00003% methylenblåt (blåt vand). Hvis der er et usædvanligt stort antal embryoner fra en enkelt tank, adskille dem i flere skåle. Koncentrationen af levende embryoner bør være ca. 100 pr. 200 mL blåt vand i hver fingerbowl.
- Anslå tidspunktet for befrugtning ved iscenesættelse af embryoner under et mikroskop ved hjælp af den offentliggjorte A. mexicanus udviklingsmæssige tidsplan17.
- Overvåg ofte de fingerbowls, der indeholder embryoner. Fjern døde eller deforme embryoner og snavs, såsom ufortyndet mad eller afføring, med en Pasteur pipette. Skift det blå vand i fingerbowls ofte.
- Placer fingerbowls i en inkubator i 5-7 dage. På dette tidspunkt er æggeblommen blevet brugt op, og fodring af kulturer med levende saltlage rejer er nødvendig for yderligere udvikling.
- Tag gydedata.
- For hver tank, der taber embryoner, skal du registrere følgende oplysninger.
- Registrer datoen og tanknummeret.
- Registrere det omtrentlige antal embryoner, der er faldet (figur 2):
Høj (500+)
Mellem (200-500)
Lav(<200) - Registrere kvaliteten af de frafaldne embryoner (figur 2):
Høj (>75% i live)
Medium (25-50% i live)
Lav (<25% i live) - Anslå den oprindelige gydetid ved at konsultere Astyanax mexicanus iscenesættelse tabel17.
- Registrer den temperatur, som systemet blev indstillet til, da fisken gydede.
- For hver tank, der taber embryoner, skal du registrere følgende oplysninger.
- Foder alle fisk.
- Indstil vandtemperaturen til 76 °F.
- Forbered live-feed.
- Foder fisk #2.
- Scoop overskydende mad og snavs fra tanke og krat før nulstilling af net.
3. Onsdag
- Gentag trin 2.1-2.2. Indsamle embryoner og vaske alle avlsnet.
- Tag gydedata som før.
- Udfør vandtest som før.
- Foder alle fisk.
- Indstil vandtemperaturen til 78 °F.
- Gør live-feedet klar.
- Tjek embryoner i inkubatoren.
- Rens og skift vandet i embryonerne i fingerbowls, der i sidste ende vil blive brugt til at genopbygge den generelle voksne avlsbestand. Brug methylenblåt behandlet systemvand.
- Foder fisk igen.
- Rengør tanke efter behov og nulstil net.
4. Torsdag
- Gentag trin 2.1-2.2. Indsamle embryoner og vaske og opbevare avlsnet.
- Tag gydedata som før.
- Indstil vandtemperaturen til 76 °F.
- Rengør det levende foder.
- Rengør alle individuelle tanke.
- Tjek embryoner i inkubatoren.
- Foder fisk #2.
5. Fredag
- Foder alle fisk.
- Indstil vandtemperaturen til 74 °F.
- Rengør det levende foder.
- Tjek embryoner i inkubatoren.
6. Lørdag
- Foder fisk.
7. Søndag
- Foder fisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi opdrætter og gyder generelt efterkommere af overfladefisk, der oprindeligt blev indsamlet på Nacimiento del Rio Choy i San Luis Potosi, Mexico (Rio Choy overflade fisk) og San Solomon Springs i Balmorhea State Park, Texas (Texas overflade fisk) og hule fisk stammer fra Cueva de El Pachón (Pachón hule fisk) i Tamaulipas, Mexico, og Cueva de los Sabinos (Los Sabinos hule fisk) og Sotano de la Tinaja (Tinaja hule fisk) i San Luis Potosi Mexico.
I løbet af en avlsuge indsamles data for forskellige tanke. De gydede embryoner i hver tank observeres for mængde og kvalitet. Antallet registreres som højt, mellem eller lavt. Der registreres en mængde høj, hvis antallet af udkastede embryoner er over 500, der registreres en mængde medium, hvis antallet af udkastede embryoner ligger mellem 200 og 500, og der registreres en lav mængde, hvis antallet af udkastede embryoner er mindre end 200. Kvaliteten registreres ligeledes som høj, medium eller lav. En høj kvalitet registreres, hvis mere end 75% af embryonerne i skålen er i live, registreres en mediumkvalitet, hvis ca. 25-75% af embryonerne i skålen er i live, og der registreres en lav kvalitet, hvis mindre end 25% af embryonerne er i live. Disse angivelser af kvantitet og kvalitet tildeles derefter et tal, hvor høj er 3, medium er 2 og lav er 1. Hvis der ikke var embryoner opfostret eller ingen levende embryoner i gydningen, tildeles et antal på 0.
Avlsdataene fra juli 2017 til marts 2020 for overfladefisken i Rio Choy og Texas og Los Sabinos-, Tinaja- og Pachón-hulefisken er vist i figur 2. Dataene blev analyseret ved avlsuge og ved at beregne gennemsnittet af antallet af personer, der stammer fra hver dag med indsamling af embryoner i løbet af en enkelt avlsuge. Dataene viser, at avlen var kontinuerlig hele året i Rio Choy og Texas overfladefisk og i Pachón hulefisk. Mængden og kvaliteten af de fleste Rio Choy overflade fisk var mellem lav og høj, mens mængden og kvaliteten af de fleste Texas overflade fisk og Pachón hule fisk var mellem lav og medium. Forekomsten af gydning var ikke kontinuerlig i Tinaja eller Los Sabinos hulefisk: gydning var lav eller ikke-eksisterende i sensommeren (juli) til efteråret (oktober). Selv om de laveste niveauer af gydning blev registreret for Los Sabinos hulefisk, var kvaliteten af embryoner den bedste. Generelt viser overfladefisk bedre gydemængde og kvalitet end hulefisk.
Figur 2. Avlsdata for forskellige overfladefisk og hulefiskepopulationer fra juli 2017 til marts 2020. Fra top til bund er Rio Choy overflade fisk, Texas overflade fisk, Pachón hule fisk, Tinaja hule fisk, og Los Sabinos hule fisk. Ubrudte linjer: kvaliteten af gyde. Brudte linjer: mængden af gyde. Uger uden linjer repræsenterer perioder, hvor gydning ikke blev forsøgt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Astyanax mexicanus er en ny biologisk model, der gyder ofte og kan opdrættes let i laboratoriet1,2. Fordi vi er interesseret i de udviklingsmæssige mekanismer, der ligger til grund for evolutionære ændringer i A. mexicanus hulefisk, er produktion og brug af embryoner afgørende for vores forskningsmål. Hovedformålet med at opretholde en voksen bestand af fisk er produktion af embryoner og ungyngel til brug i udviklingsforsøg og til genopfyldning af voksne avlsbestande. Lejlighedsvis, voksne kan også bruges til fysiologi, adfærdsmæssige, eller genetiske eksperimenter. Genetiske eksperimenter kræver parret parring eller in vitro-befrugtning18. For in vitro-befrugtningsdyr, der udviser gydeadfærd19, kan fjernes fra tanke og anvendes til kors under det temperaturinducerede avlsregime.
For at maksimere kvaliteten og mængden af embryoner til forskning er der operationelle detaljer, der kræver opmærksomhed forud for avlsugen. Når du manipulerer fisk i tankene, skal du kun bruge udpegede håndholdte net, nedsænke dem i en netblødningsopløsning mellem hver brug og skylle dem med varmt postevand mellem anvendelser for at forhindre forurening mellem tankene. Vask og desinficer omhyggeligt alle instrumenter, der bruges til at passe på fisken. Fjern og rengør avlsnettene i systemvand, før du udskifter dem i tankene. I slutningen af ugen opbevares alle avlsnet tørre på hylderne i fiskerummet. I løbet af en avlsuge skal du kontrollere hver tank for embryoner i avlsnettene eller for fisk, der udviser gydeadfærd (dvs. svømme rundt i cirkler parret mod hinanden), da hunnerne i disse tanke sandsynligvis er klar til at gyde. Dette skal gøres ved hjælp af rødt lys i de mørke timer af fotoperiod. A. mexicanus gyder i mørket ved at sprede æg og sædceller i skyer. En tank med en befolkning på omkring 10-20 fisk og en mandlig til kvindelig ratio på omkring 1:1 kan producere op til 500 befrugtede embryoner i en gydning per tank, og hver tank af fisk kan gyde to eller tre gange i løbet af en enkelt avl uge. I en god gyde vil de fleste embryoner overleve gennem udklækning, en kritisk fase. Kulturer bør kontrolleres hyppigt, og ubefrugtede æg, døde eller deforme embryoner eller affald, herunder eventuelle madrester eller parasitter, bør fjernes. Kulturer med for det meste levende embryoner bør "rengøres" med få timers mellemrum i de embryonale og tidlige larveperioder ved manuelt at fjerne døde eller unormale embryoner (som i sidste ende vil dø) og snavs ved hjælp af en Pasteur pipette. Kulturer med en stor andel af døde embryoner kan stadig bruges ved at overføre de normalt udviklende embryoner til nye fingerbowls med frisk blåt vand. Normalt skal denne proces gentages flere gange for at opnå de reneste kulturer af levende embryoner. I begge tilfælde er en endelig koncentration på ca. 100 embryoner pr. 200 mL ideel, fordi fortrængning af embryoner kan påvirke udviklingen, især for hulefisk. Kulturer bør "rengøres" yderligere over tid ved regelmæssigt at fjerne det meste af vandet fra fingerbowls og erstatte med det med frisk blåt vand. Kulturer "rengøres" ofte normalt giver den højeste kvalitet af embryoner.
Ud over naturlig avl er hormonel stimulation20 eller in vitro-befrugtning18 også potentielt nyttig til at opnå embryoner. Til disse formål skal fisk imidlertid være sunde og klar til naturlig gydning (udviser gydeadfærd), og der kan forventes et meget mindre udbytte af embryoner end opnået under de temperaturinducerede gydeforhold.
En begrænsning af temperaturinduceret avl under de ovenfor beskrevne betingelser er, at overfladefisk og hulefisk gyder på forskellige tidspunkter, førstnævnte i den tidlige aften og sidstnævnte fra efter midnat til tidlig morgen. Denne situation kan ikke undgås ved at flytte fotoperioden, fordi regelmæssig fodring og vedligeholdelse af fiskesystemet normalt skal udføres i løbet af cyklussens lys (dagtid). I princippet kan tidsplaner dog justeres, så fisk gyder på lignende tidspunkter ved at opretholde de to morphs på forskellige lyse-mørke cyklusser (og i forskellige fiskeopdrætssystemer) til tæt på samtidig gydning. Hvis der findes to temperaturkontrolsystemer, kan fisk desuden dyrkes i forskellige systemer, og ved at skifte ugentlige temperaturstigninger kan gydning ske på en ugentlig snarere end hver anden månedsplan, hvilket fordobler kapaciteten til at opnå embryoner.
Uanset om det bruges til videnskabelig forskning, undervisning eller bioteknologi, er A. mexicanus et fremragende modelsystem til at udforske de fascinerende spørgsmål omkring udviklingen af udvikling. Til videnskabelig forskning er dette system nyttigt til undersøgelse af molekylære, genetiske og evolutionelle mekanismer til øjenudvikling og sygdom. Øjet er et ekstraordinært organ med hensyn til dets struktur, funktion og udvikling. Vision erhverves under embryonal udvikling som følge af koordineret dannelse og vækst af flere forskellige øjenvæv. De præcise mekanismer, hvormed dette sker, er stadig stort set ukendte. Strukturen af pattedyr og fiskeøjne er ens. Den naturlige øje fænotyper af A. mexicanus er en fremragende model system til at udforske de molekylære og cellulære mekanismer og genetiske veje, der er involveret i øjenudvikling og degeneration21,22. Denne viden kan bruges til at udvikle forebyggelsesstrategier og behandlinger for arvelige øjensygdomme. Pigmentering undersøgelser er et andet område, hvor A. mexicanus gør et værdifuldt bidrag23. I undervisningen kan A. mexicanus embryoner bruges til at illustrere de generelle principper for embryonal udvikling og i instruktionseksperimenter for begyndende studerende. Inden for bioteknologi, med den seneste udvikling af genomisk DNA-redigering24 og især CRISPR/Cas-9 genomisk ingeniørteknologi25, A. mexicanus embryoner er en værdifuld ressource til at udforske genfunktioner. Hver af disse anvendelser støttes af gydning af store mængder embryoner af høj kvalitet, hvilket kan opnås ved det trinvise temperaturavlsregime, der er beskrevet i denne meddelelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker David Martasian, Diedre Heyser, Amy Parkhurst, Craig Foote og Mandy Ng for værdifulde bidrag til Jeffery laboratoriet A. mexicanus kulturfacilitet. Forskningen i Jeffery laboratoriet er i øjeblikket støttet af NIH tilskud EY024941.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blackworms | Eastern Aquatics, Lancaster, PA | None | |
| Breeding Nets | Custom made | ||
| Brine shrimp eggs | AquaCave Lake Forest, IL. | None | |
| Colorimetric test kit | Petco | SKU:11916 | API Freshwater pH Test Kit |
| Egg yolk flakes | Pentair, Minneapolis, MN | None | |
| Fingerbowls | Carolina Biological Supply | 741004 | Culture dishes, 4.5 in, 250 mL |
| Hand held nets | Any Pet Store | ||
| Incubator for embryos | Fisher Scientific | 51-029-321HPM | 405 L |
| Instant Ocean sea salts | Spectrum Brands, Blacksburg, VA | None | |
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | M9140 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20 | 5.75 in. |
| Net soaking solution | Any Pet Store | ||
| Nutrafin Cycle | Amazon | None | Bacterial boost |
| Refrigerator for live feed | Any source | ||
| Stereomicroscope | Any source | ||
| Thermometer | Any source | ||
| Tetra Tropical Crisps | Spectrum Brands, Blacksburg, VA | None |
References
- Jeffery, W. R. Cavefish as a model system in evolutionary developmental biology. Developmental Biology. 231, 1-12 (2001).
- Jeffery, W. R. Emerging model systems in evo-devo: cavefish and mechanisms of microevolution. Evolution & Development. 10, 265-272 (2008).
- Jeffery, W. R. Evolution and development in the cavefish Astyanax. Current Topics in Developmental Biology. 86, 191-221 (2009).
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature Genetics. 38, 107-111 (2006).
- Protas, M., Conrad, M., Gross, J. B., Tabin, C. J., Borowsky, R. Regressive evolution in the Mexican cave tetra, Astyanax mexicanus. Current Biology. 17, 452-454 (2007).
- O'Quin, K. E., Yoshizawa, M., Doshi, P., Jeffery, W. R. Quantitative genetic analysis of retinal degeneration in the blind cavefish. PLoS ONE. 8 (2), 57281 (2013).
- Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13, 15 (2015).
- Elliot, W. R. The Astyanax caves of Mexico. Cavefishes of Tamaulipas, San Luis Potosi, and Guerrero. Association for Mexican Cave Studies Bulletin. 26, 1 (2018).
- Luo, S., Wu, B., Xiong, X., Wang, J. Effects of total hardness and calcium:magnesium ratio of water during early stages of rare minnows (Gobiocypris rarus). Comparative Medicine. 66, 181-187 (2016).
- Balasch, J. C., Tort, L. Netting the stress responses in fish. Frontiers in Endocrinology. 10, 62 (2019).
- Borowsky, R. Determining the sex of adult Astyanax mexicanus. , Cold Spring Harbor Protocols. (2008).
- Paschos, G. Circadian clocks, feeding time, and metabolic homeostasis. Frontiers in Pharmacology. 6, 112 (2015).
- Scheiermann, C., Kunisaki, Y., Frenette, P. S. Circadian control of the immune system. Nature Reviews Immunology. 13, 190-198 (2013).
- Williams, M. B., Watts, S. A. Current basis and future directions of zebrafish nutrigenomics. Genes & Nutrition. 14, 34 (2009).
- Harper, C., Wolf, J. C. Morphologic effects of the stress response in fish. ILAR Journal. 50, 387-396 (2009).
- Neubauer, P., Andersen, K. H. Thermal performance in fish is explained by an interplay between physiology, behavior and ecology. Conservation Physiology. 7 (1), 025 (2019).
- Hinaux, H., et al. Developmental staging table for Astyanax mexicanus. Zebrafish. 8 (4), (2011).
- Borowsky, R. In vitro fertilization of Astyanax mexicanus. , Cold Spring Harbor Protocols. (2008).
- Simon, V., Hyacinthe, C., Rétaux, S. Breeding behavior in the blind Mexican cavefish and its river-dwelling conspecific. PLoS One. 14 (2), 0212591 (2019).
- Harvey, B. J., Carolsfield, J. Induced Breeding in Tropical Fish Culture. International Development Research Centre. , (1993).
- Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. R. The role of a lens survival pathway including sox2 and aA-crystallin in the evolution of cavefish eye degeneration. EvoDevo. 5, 28 (2014).
- Krishnan, J., Rohner, N. Cavefish and the basis for eye loss. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 5 (372), 20150487 (2017).
- Bilandžija, H., Abraham, L., Ma, L., Renner, K., Jeffery, W. R. Behavioral changes controlled by catecholaminergic systems explain recurrent loss of pigmentation in cavefish. Proceedings of the Royal Society. 285, (2018).
- Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican cavefish. PLoS ONE. 1093, 0119370 (2015).
- Klaassen, H., Wang, Y., Adamski, K., Rohner, N., Kowalko, J. E. CRISPR mutagenesis confirms the role of oca2 in melanin pigmentation in Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441, 313-318 (2018).
