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Biology

4-आयामी (एक्स, वाई, जेड और λ) हाइपरस्पेक्ट्रल FRET इमेजिंग और विश्लेषण का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं में 3-आयामी सीएएमपी वितरण का मापन

Published: October 27, 2020 doi: 10.3791/61720

Summary

Fӧrster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) आधारित सेंसरों के अंतर्निहित कम सिग्नल-टू-शोर अनुपात (एसएनआर) के कारण, विशेष रूप से तीन स्थानिक आयामों में, सीएएमपी संकेतों का मापन चुनौतीपूर्ण रहा है। यहां, हम एक हाइपरस्पेक्ट्रल वीआरटी इमेजिंग और विश्लेषण पद्धति का वर्णन करते हैं जो तीन स्थानिक आयामों में सीएएमपी वितरण की माप की अनुमति देता है।

Abstract

चक्रीय एएमपी एक दूसरा दूत है जो सेलुलर और शारीरिक गतिविधियों की एक विस्तृत श्रृंखला में शामिल है। कई अध्ययनों से पता चलता है कि सीएएएमपी संकेतों को विभाजित किया जाता है, और यह विभाजन सीएएमपी सिग्नलिंग मार्ग के भीतर विशिष्टता का संकेत देने में योगदान देता है। Fӧrster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) आधारित बायोसेंसर के विकास ने कोशिकाओं में सीएएमपी संकेतों को मापने और कल्पना करने की क्षमता को आगे बढ़ाया है। हालांकि, ये माप अक्सर दो स्थानिक आयामों तक सीमित होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप डेटा की गलत व्याख्या हो सकती है। आज तक, तीन स्थानिक आयामों (एक्स, वाई और जेड) में सीएएएमपी संकेतों के केवल बहुत सीमित माप हुए हैं, जो वीआरटी सेंसर का उपयोग करने में तकनीकी सीमाओं के कारण हैं जो स्वाभाविक रूप से शोर अनुपात (एसएनआर) के लिए कम सिग्नल प्रदर्शित करते हैं। इसके अलावा, पारंपरिक फ़िल्टर-आधारित इमेजिंग दृष्टिकोण अक्सर स्थानीयकृत उपकोशिकीय क्षेत्रों में सीएएमपी संकेतों के सटीक माप के लिए अप्रभावी होते हैं, जिसमें स्पेक्ट्रल क्रॉसटॉक, सीमित सिग्नल ताकत और ऑटोफ्लोरेसेंस सहित कई कारक शामिल होते हैं। इन सीमाओं को दूर करने और FRET आधारित बायोसेंसर को कई फ्लोरोफोरस के साथ उपयोग करने की अनुमति देने के लिए, हमने हाइपरस्पेक्ट्रल एफर्ट इमेजिंग और विश्लेषण दृष्टिकोण विकसित किए हैं जो FRET क्षमता की गणना के लिए स्पेक्ट्रल विशिष्टता प्रदान करते हैं और अतिरिक्त फ्लोरोसेंसेंस और/या अतिरिक्त फ्लोरोसेंट लेबल से संकेतों को confounding से स्पेक्ट्रल अलग करने की क्षमता प्रदान करते हैं । यहां, हम हाइपरस्पेक्ट्रल वीआरटी इमेजिंग को लागू करने के साथ-साथ एक उपयुक्त स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी के निर्माण की आवश्यकता के लिए कार्यप्रणाली प्रस्तुत करते हैं जो न तो कम है और न ही स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग करने के लिए ओवरसैंप किया गया है। जब हम पल्मोनरी माइक्रोवेस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (पीएमवीईसी) में त्रि-आयामी सीएएमपी वितरणों की माप के लिए इस पद्धति को प्रस्तुत करते हैं, तो इस पद्धति का उपयोग कोशिका प्रकारों की एक श्रृंखला में सीएएमपी के स्थानिक वितरण का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

साइक्लिक एडेनोसिन मोनोफॉस्फेट (सीएएमपी) एक दूसरा मैसेंजर है जिसमें सेल डिवीजन, कैल्शियम आमद, जीन ट्रांसक्रिप्शन और सिग्नल ट्रांसडक्शन सहित प्रमुख सेलुलर और शारीरिक प्रक्रियाओं में शामिल है। साक्ष्यों का बढ़ता हुआ शरीर कोशिका में सीएएमपी डिब्बों के अस्तित्व को सुझाता है जिसके माध्यम से संकेत देने की विशिष्टता 1 ,2,3,4,5,6,7प्राप्त की जाती है । हाल ही में जब तक, विभिन्न जी-युग्मित रिसेप्टर एगोनिस्ट8,9,10, 11द्वारा प्रेरित अलग-अलग शारीरिक या सेलुलर प्रभावों के आधार पर सीएएएमपी कंपार्टमेंटलाइजेशन अनुमानितथा। हाल ही में, FRET आधारित फ्लोरेसेंस इमेजिंग जांच ने सेल12, 13,14में सीएएमपी संकेतों के प्रत्यक्ष माप और अवलोकन के लिए नए दृष्टिकोण प्रदान किए हैं।

फैस्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (FRET) एक भौतिक घटना है जिसमें ऊर्जा हस्तांतरण दाता और स्वीकार्य अणुओं के बीच एक गैर-रेडिएटिव फैशन में होता है जब अणु15,16के करीब निकटता में होते हैं। FRET आधारित फ्लोरोसेंट संकेतकों के विकास के साथ, इस भौतिक घटना का उपयोग जैविक अनुप्रयोगों में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन17,प्रोटीन सह-स्थानीयकरण18, सीए +2सिग्नलिंग19,जीन अभिव्यक्ति20,सेल डिवीजन21 और चक्रीय न्यूक्लियोटाइड सिग्नलिंग का अध्ययन करने के लिए किया गया है। FRET आधारित cAMP संकेतकों में आम तौर पर एक सीएएमपी बाध्यकारी डोमेन, एक दाता फ्लोरोफोर और एक स्वीकार्य फ्लोरोफोर22शामिल होते हैं। उदाहरण के लिए, इस पद्धति में उपयोग किए जाने वाले एच 188 सीएएमपी सेंसर12,22 में एफीओसी से प्राप्त एक सीएएमपी बाध्यकारी डोमेन होता है, जो फ़िरोज़ा (दाता) और वीनस (स्वीकारकर्ता) फ्लोरोफोरस के बीच सैंडविच होता है। बेसल स्थितियों (अनबाउंड) में, फ़िरोज़ा और वीनस एक अभिविन्यास में हैं जैसे कि फ्लूरोफोरस के बीच FRET होता है। बाध्यकारी डोमेन के लिए cAMP के बाध्यकारी होने पर, एक अनुरूप परिवर्तन ऐसा होता है कि फ़िरोज़ा और शुक्र अलग हो जाते हैं जिसके परिणामस्वरूप FRET में कमी आती है।

FRET आधारित इमेजिंग दृष्टिकोण एक सेल के भीतर सीएएएमपी संकेतों की जांच और कल्पना करने के लिए एक आशाजनक उपकरण प्रदान करते हैं। हालांकि, वर्तमान FRET आधारित सूक्ष्म इमेजिंग तकनीक अक्सर केवल आंशिक रूप से पर्याप्त संकेत शक्ति को प्राप्त करने के लिए उपकोशिक स्थानिक स्पष्टता के साथ FRET को मापने में सफल रहे हैं । यह कई कारकों के कारण है, जिसमें कई FRET रिपोर्टर्स की सीमित सिग्नल ताकत, FRET दक्षता में परिवर्तनों को सही ढंग से निर्धारित करने के लिए आवश्यक परिशुद्धता का उच्च स्तर, और सेलुलर ऑटोफ्लोरेसेंस23, 24जैसे जटिल कारकों की उपस्थिति शामिल है। परिणाम अक्सर एक FRET छवि है जो कमजोर एसएनआर से ग्रस्त होती है, जिससे FRET में उपकोशिकीय परिवर्तनों का दृश्य बहुत मुश्किल हो जाता है। इसके अलावा, स्थानिक रूप से स्थानीयकृत सीएएमपी संकेतों की जांच लगभग विशेष रूप से केवल दो स्थानिक आयामों में की गई है और अक्षीय सीएएमपी वितरण को शायद हीकभी 25माना जाता है। यह संभावना है क्योंकि कम एसएनआर ने तीन स्थानिक आयामों में सीएएमपी ग्रेडिएंट को मापने और कल्पना करने की क्षमता में बाधा डाली। कम एसएनआर के साथ FRET सेंसर का उपयोग करने की सीमाओं को दूर करने के लिए,हमने एकल कोशिकाओं25, 26,27में FRET को मापने के लिए हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग और विश्लेषण दृष्टिकोण लागू किए हैं।

नासा द्वारा उपग्रह चित्रों में मौजूद स्थलीय वस्तुओं में अंतर करने के लिए हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग दृष्टिकोण विकसित किए गए थे28,29. इन तकनीकों के बाद से फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी फील्ड30में अनुवाद किया गया है, जिसमें कई वाणिज्यिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सिस्टम स्पेक्ट्रल डिटेक्टर ों की पेशकश करते हैं। पारंपरिक (गैर-स्पेक्ट्रल) फ्लोरेसेंस इमेजिंग में, नमूना बैंड-पास फिल्टर या लेजर लाइन का उपयोग करके उत्साहित होता है, और उत्सर्जन को दूसरे बैंड-पास फिल्टर का उपयोग करके एकत्र किया जाता है, जिसे अक्सर फ्लोरोफोर (एस) के चरम उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य से मेल खाने के लिए चुना जाता है। इसके विपरीत, हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग दृष्टिकोण विशिष्ट तरंगदैर्ध्य अंतराल पर फ्लोरेसेंस उत्सर्जन26,31,32 या एक्सट्रेशन33,34 के पूर्ण स्पेक्ट्रल प्रोफाइल का नमूना लेना चाहते हैं। हमारे पिछले अध्ययनों में, हमने दिखाया कि हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग और विश्लेषण दृष्टिकोण पारंपरिक फ़िल्टर-आधारित FRET इमेजिंग तकनीक26की तुलना में कोशिकाओं में FRET संकेतों के बेहतर मात्राकरण की पेशकश कर सकते हैं। यहां, हम तीन स्थानिक आयामों में सीएएमपी वितरण को मापने और कल्पना करने के लिए 4-आयामी (एक्स, वाई, जेड और λ) हाइपरस्पेक्ट्रल वीआरटी इमेजिंग और विश्लेषण करने के लिए एक पद्धति प्रस्तुत करते हैं। इन दृष्टिकोणों ने एकल कोशिकाओं25में एगोनिस्ट-प्रेरित सीएएमपी स्थानिक ढाल के दृश्य की अनुमति दी है। दिलचस्प बात यह है कि एगॉनिस्ट के आधार पर, सीएएमपी ग्रेडिएंट कोशिकाओं में स्पष्ट हो सकते हैं। यहां प्रस्तुत पद्धति FRET माप की सटीकता में सुधार करने के लिए गैर-वर्दी पृष्ठभूमि और सेलुलर ऑटोफ्लोरेसेंस के स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग का उपयोग करती है। हालांकि इस पद्धति को पल्मोनरी माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (पीएमवीईसी) में एक सीएएमपी वीआरटी बायोसेंसर का उपयोग करके प्रदर्शित किया जाता है, वैकल्पिक FRET संवाददाताओं या वैकल्पिक सेल लाइनों के साथ उपयोग के लिए कार्यप्रणाली को आसानी से संशोधित किया जा सकता है।

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Protocol

यह प्रोटोकॉल दक्षिण अलबामा विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रक्रियाओं का पालन करता है ।

1. इमेजिंग के लिए सेल, नमूना, और अभिकर् ता तैयार करना

  1. चूहा पल्मोनरी माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (पीएमवीईसी) को अलग करें जैसा कि पहले35वर्णित है।
    नोट: कोशिकाओं को अलग और दक्षिण अलबामा, मोबाइल, १०० मिमी सेल संस्कृति व्यंजन पर अल विश्वविद्यालय में सेल संस्कृति कोर द्वारा सुसंस्कृत थे ।
  2. बीज 25 मिमी गोल ग्लास कवरलिप पर पीएमवीसी को अलग करता है और उन्हें इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ने दें जब तक कि कोशिकाएं कम से कम 80% पूर्णता (कम से कम 24 घंटे) प्राप्त न कर दें।
    नोट: कोशिकाओं और कोशिका प्रकार के अध्ययन से अध्ययन करने के लिए भिंन हो सकते है और इसलिए सेल विशिष्ट सेल संस्कृति प्रक्रियाओं बीज और कोशिकाओं को विकसित करने के लिए पालन किया जाना चाहिए । इन अध्ययनों में उपयोग किए जाने वाले सेल सीडिंग और संस्कृति प्रोटोकॉल "पूरक File_Cell संस्कृति और ट्रांसफैक्शन" नामक फ़ाइल में पूरक जानकारी के रूप में उपलब्ध है।
  3. एक FRET बायोसेंसर के साथ PMVECs ट्रांसफेक्ट और 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
    नोट: पीएमवीसी को स्थानांतरित करने के लिए प्रोटोकॉल को पूरक सूचना फ़ाइल में भी वर्णित किया गया है जिसका नाम है "पूरक File_Cell संस्कृति और ट्रांसफैक्शन"।
  4. इमेजिंग के दिन, गर्म टायरोड का बफर पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस तक।
    नोट: टायरोड के बफर में 145 एमएमएल एनएसीएल, 4 एमएमएम केसीएल, 10 एमएम एचईपीई, 10 एमएम ग्लूकोज, 1 एमएमएम एमजीसीएल2 और 1 एमएमएम सीसीएल2 शामिल हैं।
  5. एक सेल कक्ष में संक्रमित कोशिकाओं युक्त एक कवरस्लिप माउंट और लीक को रोकने के लिए एक बढ़ते गैसकेट के साथ शीर्ष सुरक्षित ।
  6. किसी भी अतिरिक्त मीडिया या अनुयायी कोशिकाओं को साफ करने के लिए एक नाजुक कार्य पोंछ का उपयोग कर कवरस्लिप के नीचे पोंछें।
  7. सेल चैंबर में 800 माइक्रोन काम करने वाले बफर और 5 एमएम न्यूक्लियर लेबल के 4 माइक्रोन जोड़ें और धीरे-धीरे 5 - 10 सेकंड के लिए रॉक करें।
    नोट: सेल कक्ष में घुड़सवार कवरस्लिप के लिए बफर या रिएजेंट समाधान जोड़ते समय, समाधान को धीरे-धीरे और सेल कक्ष के किनारे जोड़ना सुनिश्चित करें ताकि अनुयायी कोशिकाओं को उखाड़ न फेंका जा सके। बफर के 800 माइक्रोन में 5 एमएम न्यूक्लियर लेबल का 4 माइक्रोन जोड़ना न्यूक्लियर लेबल की 25 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता बनाता है। HEK293 कोशिकाओं जैसे शिथिल अनुयायी कोशिकाओं के लिए, पहले एक शीशी में परमाणु लेबल और बफर मिलाएं और फिर सेल कक्ष में घुड़सवार कवर्लिप्स में जोड़ें। यह कवरस्लिप से कोशिकाओं को उठाने से रोकेगा।
  8. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए प्रकाश और इनक्यूबेट से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ सेल कक्ष को कवर करें।
  9. रीएजेंट तैयारी: बफर के 199 माइक्रोन में 50 एमएम फोर्सकोल के 1 माइक्रोन जोड़ें। यह 50 माइक्रोन के फोर्सकोलिन की अंतिम एकाग्रता का उत्पादन करेगा जब उन कोशिकाओं में जोड़ा जाएगा जो 800 माइक्रोन बफर के साथ तैयार किए गए थे। 199 में डीएमएसओ के 1 माइक्रोन बफर को भी वाहन नियंत्रण के रूप में उपयोग करने के लिए तैयार किया जाना चाहिए।
    नोट: इन अध्ययनों में, फोर्स्कोलिन का उपयोग सीएएमपी उत्पादन को प्रोत्साहित करने के लिए एडेनिलिल साइक्लेज़ एक्टिवेटर के रूप में किया जाता है। यदि वांछित है, तो इस पद्धति को आसानी से संशोधित किया जा सकता है ताकि एडेनील साइक्लेज़, फॉस्फोडिस्टेरेस आदि को उत्तेजित या बाधित करने के लिए वैकल्पिक अभिकर्मकों के साथ उपचार की अनुमति दी जा सके।

2. छवि अधिग्रहण

  1. स्पेक्ट्रल डिटेक्टर से लैस कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
    नोट: यहां उल्लिखित सभी छवि अधिग्रहण कदम एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Nikon A1R माइक्रोस्कोप प्रणाली का उपयोग कर विकसित किए गए थे । यदि वैकल्पिक स्पेक्ट्रल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके इन चरणों को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। सुनिश्चित करें कि सभी उपकरण प्रयोग शुरू होने से कम से कम 30 मिनट पहले चालू हैं ताकि स्थिर परिचालन स्थितियों तक पहुंच सके।
  2. 60x पानी विसर्जन उद्देश्य का चयन करें और उद्देश्य के लिए पानी की एक बूंद जोड़ें।
    नोट: उच्च-रिज़ॉल्यूशन लाइव-सेल इमेजिंग के लिए, उच्च संख्यात्मक अपर्चर उद्देश्य का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। कृपया इन अध्ययनों में उपयोग किए जाने वाले उद्देश्य के बारे में जानकारी के लिए सामग्रियों की सूची का उल्लेख करें।
  3. लोडेड सेल चैंबर (चरण 1.7 से) माइक्रोस्कोप चरण पर रखें।
  4. माइक्रोस्कोप के दाईं ओर फिल्टर घुंडी ट्यूनिंग द्वारा सेट डीएफटी (DAPI/FITC/TRITC) फिल्टर का चयन करें ।
  5. सीएएमपी वीआरटी सेंसर को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं वाले क्षेत्र का चयन करने के लिए आईपीस का उपयोग करके फ्लोरेसेंस वाइडफील्ड मोड में माइक्रोस्कोप को संचालित करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि चयनित सेल में दाता या स्वीकार्य उत्सर्जन पीक तरंगदैर्ध्य पर FRET संकेत की औसत तीव्रता कम से कम 100 तीव्रता इकाइयों (एयू) या कम से कम 4X किसी क्षेत्र का आधारभूत संकेत है जिसमें कोई व्यक्त कोशिकाएं नहीं हैं। एनआईएस एलिमेंट्स सॉफ्टवेयर में उपलब्ध स्पेक्ट्रम प्रोफाइल व्यूअर का इस्तेमाल कर इसकी पुष्टि की जा सकती है । अच्छे संकेत वाले सेल की तलाश करते समय, जरूरत से ज्यादा उज्ज्वल कोशिकाओं को त्यागने की सलाह दी जाती है (उनसे समझौता किया जा सकता है)।
  6. एनआईएस सॉफ्टवेयर खोलें, कॉन्फोकल मोड पर स्विच करें, लेजर इंटरलॉक बटन अनलॉक करें और लाइवपर क्लिक करें।
  7. स्क्रीन पर पूर्वावलोकन को देखकर कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करने के लिए फोकस घुंडी का उपयोग करें।
  8. नीचे वर्णित सॉफ्टवेयर में कॉन्फ़िगर डिवाइस, अधिग्रहण और जेड-स्टैक सेटिंग्स।
  9. अधिग्रहण सेटिंग्स:
    नोट: कैमरा और डिवाइस अधिग्रहण सेटिंग्स पहले से अधिग्रहीत छवि का उपयोग करके लागू की जा सकती हैं। इमेज खोलें, सही क्लिक करें और रीयूज कैमरा सेटिंग्सका चयन करें ।
    1. A1 सेटिंग्स मेनू खोलें, 405 एनएम और 561 एनएम लेजर लाइनों के अनुरूप बक्से की जांच करें, स्पेक्ट्रल डिटेक्टर के लिए एसडी का चयन करें, संकल्प के लिए 10 और चैनलों के लिए 31 का चयन करें।
      नोट: A1 सेटिंग्स मेनू A1 प्लस सेटिंग्स विंडो के शीर्ष बाएं कोने पर एक छोटे गियर आइकन के रूप में दिखाया गया है । 405 एनएम लेजर का इस्तेमाल डोनर एक्सटिटेशन के लिए किया जाता है और न्यूक्लियर लेबल एक्सटिटेशन के लिए 561 एनएम लेजर का इस्तेमाल किया जाता है।
    2. प्रारंभ और अंत तरंगदैर्ध्य मूल्यों का चयन करके तरंगदैर्ध्य सीमा (410 - 730 एनएम) निर्धारित करें।
    3. A1 सेटिंग्स मेन्यू में बिनिंग/स्किप आइकन पर क्लिक करें और 15 गिने जाने वाले बॉक्स का चयन करें, फिर A1 सेटिंग्स मेन्यू पर ओके पर क्लिक करें ।
      नोट: यह तरंगदैर्ध्य चैनल को हटाने के लिए है जो 561 एनएम उत्तेजन लेजर से मेल खाता है (यह आमतौर पर 15वें तरंगदैर्ध्य चैनल है)। कृत्रिम रूप से कम संकेत से बचने के लिए इस तरंगदैर्ध्य बैंड का उपयोग नहीं करना महत्वपूर्ण है, जो एक स्पेक्ट्रल विरूपण साक्ष्य बना सकता है। सिग्नल यांत्रिक उंगली की वजह से इस बैंड में कम है कि डिटेक्टर तत्व को कवर करने के लिए यह लेजर क्षति से बचाने के लिए ।
    4. लेजर तीव्रता को 405 एनएम और 561 एनएम लेजर के लिए क्रमशः 8% और 2% तक सेट करें, एसआई एचवी (डिटेक्टर गेन) 149 पर, और 2.4 हवादार डिस्क इकाइयों (एयू) के पिनहोल त्रिज्या।
      नोट: लेजर तीव्रता उपकरण और लेजर की स्थिति की उम्र के आधार पर समायोजित किया जा सकता है। यदि विभिन्न नमूनों या प्रयोगात्मक समूहों के बीच लेजर तीव्रता को समायोजित करना है, तो लेजर तीव्रता (जैसे, 8:2) के समान अनुपात को बनाए रखना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, एक लेजर तीव्रता का चयन करना महत्वपूर्ण है जो तेजी से फोटोब्लैचिंग बनाने के लिए इतना उज्ज्वल नहीं है। डिटेक्टर लाभ को सिग्नल तीव्रता को अधिकतम करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए, जबकि डिटेक्टर शोर को कम करना चाहिए। इन अध्ययनों के लिए 149 का लाभ इस्तेमाल किया गया। 2.4 AU के एक पिनहोल आकार को पर्याप्त सिग्नल टू शोर अनुपात (एसएनआर) के साथ छवियों को प्राप्त करने और ऑप्टिकल सेक्शनिंग (कॉन्मोसिटी) को बनाए रखने के बीच संतुलन के रूप में चुना गया था। पिनहोल के आकार में वृद्धि एसएनआर को बढ़ाती है लेकिन कॉन्फ़्रोजिटी कम हो जाती है।
    5. स्कैन गति को प्रति सेकंड 0.25 स्पेक्ट्रल फ्रेम में सेट करें, स्कैन दिशा के लिए एकदिशात्मक के अनुरूप आइकन का चयन करें, गिनती के लिए 4 दर्ज करें, और स्कैन आकार के लिए 1024 x 1024 सेट करें।
      नोट: FRET सिग्नल कमजोर होते हैं, और अक्सर एक धीमी स्कैन गति की आवश्यकता होती है। 0.25 की स्कैन गति का उपयोग करना, एक स्पेक्ट्रल जेड-स्टैक का अधिग्रहण ~ 3 मिनट में पूरा हो गया है। उपयोग किए गए फ्लोरोफोरस के आधार पर स्कैन गति को बढ़ाया या कम किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, eGFP जैसे उज्जवल फ्लोरोफोरस के लिए, तेज स्कैन गति (2 फ्रेम/सेकंड) का उपयोग किया जा सकता है। गिनती के तहत दर्ज की गई संख्या 4 के औसत मूल्य से मेल खाती है, जो छवि अधिग्रहण के दौरान शोर में कमी में मदद करता है। बहुत स्थिर नमूनों के लिए और जहां समय एक बाधा नहीं है, उच्च औसत मूल्यों (16 तक) बेहतर एसएनआर के साथ छवियों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  10. जेड-स्टैक अधिग्रहण मापदंडों को परिभाषित करें:
    नोट: चरण 2.10 में दर्ज किए गए मानों को फ्लोरोसेंट लेबल बाध्यकारी या एकाग्रता, लेबल के प्रकार, उपयोग किए गए लेबलों की संख्या, सेल लाइन और नमूना तैयारी में अन्य परिवर्तनों में परिवर्तन को समायोजित करने के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है जो सेल लेबलिंग घनत्व और/या सेलुलर ऑटोफ्लोरेसेंस को प्रभावित कर सकते हैं । अधिग्रहण मापदंडों को समायोजित करते समय, फोटोब्लैचिंग को कम करते हुए पर्याप्त एसएनआर प्राप्त करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। इसके अलावा, एक स्पेक्ट्रल FRET परख को कॉन्फ़िगर करते समय, यह सुनिश्चित करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए कि पैरामीटर सभी उपचार समूहों में अच्छी तरह से काम करते हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए कि एसएनआर पर्याप्त है और फोटोब्लैचिंग को कम किया गया है, प्रस्तावित पैरामीटर सेटिंग्स के साथ प्रत्येक उपचार समूह का परीक्षण चलाने की सलाह दी जाती है।
    1. एनडी अधिग्रहण के → अधिग्रहण नियंत्रणदृश्य पर क्लिक करके ND अधिग्रहण विंडो खोलें
    2. पॉपअप विंडो पर एनडी फाइल को सेव करने के लिए पाथ/डेस्टिनेशन और फाइल का नाम दर्ज करें ।
    3. जेड-सीरीजके अनुरूप बॉक्स की जांच करें ।
    4. A1 प्लस सेटिंग्स विंडो में लाइव पर क्लिक करें। इससे लाइव देखने की खिड़की खुल जाएगी।
    5. कोशिका के शीर्ष का चयन करने के लिए माइक्रोस्कोप पर फोकस घुंडी समायोजित करें और शीर्ष के रूप में वर्तमान स्थिति निर्धारित करने के लिए एनडी अधिग्रहण विंडो में शीर्ष पर क्लिक करें।
      नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी सेल जेड श्रृंखला में नमूना है, सेल के शीर्ष से थोड़ा ऊपर ध्यान केंद्रित करने का सुझाव दिया है।
    6. कोशिका के नीचे का चयन करने के लिए माइक्रोस्कोप पर फोकस घुंडी को समायोजित करें और वर्तमान स्थिति को नीचे के रूप में सेट करने के लिए एनडी अधिग्रहण विंडो में नीचे पर क्लिक करें।
      नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कि सभी सेल का नमूना लिया गया है, सेल के नीचे थोड़ा नीचे ध्यान केंद्रित करें।
    7. स्टेप साइज के लिए 1 माइक्रोन दर्ज करें, जेड-स्कैन दिशा के लिए टॉप-बॉटम चुनें और जेड-स्टैक हासिल करने के लिए एनडी एक्विजिशन विंडो पर रन पर क्लिक करें ।
      नोट: चरण का आकार जेड-स्लाइस की संख्या निर्धारित करता है जो ऊपर और नीचे के स्थानों के आधार पर अधिग्रहीत किया जाएगा (यानी, दूरी की यात्रा)। इमेजिंग गति, जेड-एक्सिस सैंपलिंग और फोटोब्लैचिंग के बीच समझौते के रूप में 1 माइक्रोन चरण आकार का चयन किया गया था। 2.4 AU के कॉन्फोकल पिनहोल व्यास और 60x पानी विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करके 1.73 माइक्रोन की ऑप्टिकल सेक्शन मोटाई हुई। इसलिए, एक 1 माइक्रोन चरण का आकार Nyquist नमूना मापदंड से थोड़ा नीचे है, लेकिन यह एक समझौता है जो जेड-स्टैक प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय को कम करने के लिए किया गया था। बहुत स्थिर नमूनों के लिए, जिसके लिए गति महत्वपूर्ण नहीं है, जेड-एक्सिस चरण और संभवतः जेड-एक्सिस रिज़ॉल्यूशन को बढ़ाने के लिए एक छोटे कॉन्फोकल पिनहोल व्यास का उपयोग किया जा सकता है। बॉटम-टॉप को समान परिणाम देने चाहिए और इसका उपयोग जेड स्कैन के दौरान होने वाले फोटोब्लेचिंग के किसी भी प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है।
  11. उपलब्ध होने पर परफेक्ट फोकस सिस्टम (पीएफएस) सेट करें:
    नोट: पीएफएस सिस्टम को छवि अधिग्रहण के दौरान फोकल गहराई में उतार-चढ़ाव की भरपाई करने की अनुमति देता है। पीएफएस स्थापित करने के लिए निम्नलिखित चरणों का उपयोग किया जा सकता है, और ये चरण निकॉन A1R के संस्करण और उपयोग किए गए एनआईएस तत्वों के संस्करण के आधार पर थोड़ा भिन्न हो सकते हैं।
    1. एनडी अधिग्रहण विंडो में रेंज आइकन द्वारा परिभाषित सममित मोड को हाइलाइट करें।
    2. माइक्रोस्कोप के सामने वाले चेहरे पर पीएफएस बटन चालू करें (सुनिश्चित करें कि नमूना चरण के नीचे अनुभाग पर स्थित डिक्रोइक मिरर नॉब 'इन' है)।
    3. पीएफएस ऑफसेट कंट्रोलर के सामने वाले चेहरे पर घुंडी का उपयोग करके शीर्ष (घूमते हुए वामावर्त) और नीचे (दक्षिणावर्त घुमाएं) को फिर से परिभाषित करें।
    4. ND अधिग्रहण विंडो पर 'रिश्तेदार' पर क्लिक करके एक रिश्तेदार जेड-स्थिति/z-गहराई को परिभाषित करें।
    5. माइक्रोस्कोप के सामने वाले चेहरे पर मेमोरी पर क्लिक करें ताकि सॉफ्टवेयर रिश्तेदार जेड-डेप्थ को याद करे।
  12. जेड-स्टैक अधिग्रहण पूरा होने के बाद, धीरे-धीरे एक पिपेट का उपयोग करके वांछित अभिकर्षक (फोरस्कोलिन या वाहन नियंत्रण) जोड़ें और 10 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
    नोट: अभिवार्जेंट को बहुत धीरे से जोड़ें ताकि कोशिकाओं को परेशान न किया जा सके या माइक्रोस्कोप XY चरण के भीतर सेल चैंबर की स्थिति को स्थानांतरित न किया जा सके; बाद के लाइव व्यू या इमेज में यह सत्यापित करना उपयोगी है कि देखने का क्षेत्र रिएजेंट अतिरिक्त के दौरान स्थानांतरित नहीं हुआ है। 10 मिनट का प्रतीक्षा समय फोर्स्कोलिन उपचार के प्रभावी होने के लिए है। यदि वैकल्पिक उपचार का उपयोग किया जाता है, तो प्रतीक्षा समय को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।
  13. 10 मिनट के बाद फाइलनेम बदलें और एनडी एक्विजिशन विंडो में रन पर क्लिक करें।
  14. कम से कम 5 कवरस्लिप के लिए ऊपर उल्लिखित चरण 2.11 - 2.13 दोहराएं ताकि सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए पर्याप्त परिणाम प्राप्त किए जा सकें (प्रत्येक उपचार समूह के लिए एन = 5 - फोरस्कोलिन और वाहन नियंत्रण)।
  15. स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी का निर्माण करने के लिए नमूने और नमूना रिक्त स्थान तैयार करें और चरण 2.9 और 2.10 में उल्लिखित समान अधिग्रहण सेटिंग्स का उपयोग करके स्पेक्ट्रल छवियों का अधिग्रहण करें।

3. छवि विश्लेषण

नोट: इन छवियों का उपयोग एक स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी का निर्माण करने के लिए किया जाएगा जिसमें अध्ययन में मौजूद सभी व्यक्तिगत एंडमेंबर्स का शुद्ध स्पेक्ट्रा होगा। यदि विभिन्न फ्लोरोफोरस का उपयोग किया जाता है तो स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी में एंडमेंबर्स अध्ययन से अध्ययन करने के लिए भिन्न हो सकते हैं। स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी के निर्माण के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया "पूरक File_Spectral लाइब्रेरी" नामक पूरक जानकारी फ़ाइल में प्रदान की गई है। यहां, हम .tiff फाइलों, रैखिक स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग, एफवाईआरटी दक्षता माप, त्रि-आयामी पुनर्निर्माण और सीएएमपी स्तर अनुमान के लिए डेटा निर्यात का वर्णन करते हैं। छवि विश्लेषण विभिन्न छवि विश्लेषण और प्रोग्रामिंग प्लेटफार्मों जैसे इमेजजे, पायथन, मैटलैब या सेलप्रोफिलर का उपयोग करके किया जा सकता है। इन अध्ययनों में मैटलैब स्क्रिप्ट का इस्तेमाल किया गया।

  1. निर्यात छवि डेटा:
    1. चरण 2.13 और 2.14 में अधिग्रहीत स्पेक्ट्रल जेड-स्टैक छवियों के अनुरूप एक ही फाइलनेम के साथ नए फ़ोल्डर बनाएं।
      नोट: डेटा निर्यात करने के लिए उल्लिखित निम्नलिखित कदम एनआईएस एलिमेंट्स एआर संस्करण 4.30.01 के लिए विशिष्ट हैं। सॉफ्टवेयर के संस्करण के आधार पर ये चरण थोड़े भिन्न हो सकते हैं।
    2. फ़ाइलपर क्लिक करें, जो एक फ़ाइल विंडो खोलेगा। चरण 2.12 में अधिग्रहीत स्पेक्ट्रल इमेज फाइल ब्राउज़ करें और ओपनपर क्लिक करें।
    3. एक बार फाइल लोड होने के बाद फाइलआयात/निर्यातनिर्यात ND दस्तावेज़पर क्लिक करें ।
    4. पॉपअप विंडो पर: चरण 3.1.1 में बनाए गए फ़ोल्डर को ब्राउज़ करें और चुनें, फ़ाइल प्रकार के लिए टैग किए गए इमेज फॉर्मेट (टीआईएफ) का चयन करें, फिर प्रत्येक चैनल के लिए मोनो छवि का चयन करें और थोड़ी गहराई रखें।
      नोट: फ़ाइल उपसर्ग पूर्व जनित हो जाएगा; सुविधा के लिए इस मूल्य को बदलें। इंडेक्स ऑर्डर चुने गए चैनलों के आधार पर बदल जाएगा, और जेड-स्लाइस स्थान के अनुसार इंडेक्सिंग के लिए "जेड, सी" प्रदर्शित करना चाहिए और तरंगदैर्ध्य बैंड नंबर दूसरा। सुनिश्चित करें कि LUTs लागू करने या ओवरले डालें या प्वाइंट नामों का उपयोग करने के लिए संबंधित बक्से अचयनित हैं।
    5. अलग-अलग टि्वटर फाइलों के रूप में एक गंतव्य फ़ोल्डर के लिए झगड़ा फ़ाइलों को निर्यात करने के लिए निर्यात पर क्लिक करें।
    6. चरण 2.13 में अधिग्रहीत स्पेक्ट्रल इमेज फाइलों को निर्यात करने के लिए चरण 3.1.2 - 3.1.5 दोहराएं।
  2. रैखिक स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग:
    1. प्रोग्रामिंग सॉफ्टवेयर खोलें।
      नोट: कस्टम विकसित प्रोग्रामिंग स्क्रिप्ट अनमिक्स कच्चे स्पेक्ट्रल छवियों को अनमिक्स करने के लिए दक्षिण अलबामा बायोइमेजिंग और बायोसिस्टम वेबसाइट विश्वविद्यालय पर प्रदान की जाती है, संसाधन टैब (https://www.southalabama.edu/centers/bioimaging/resources.html) के तहत ।
    2. "रैखिक अनमिक्सिंग.m" लेबल वाली फ़ाइल खोलें और संपादक टूलबार में रन बटन पर क्लिक करें।
    3. एनआईएस एलिमेंट्स सॉफ्टवेयर द्वारा उत्पन्न निर्यात * .tif फाइल अनुक्रम वाले फ़ोल्डर को ब्राउज़ करें और चुनें।
    4. जारी रखने के लिए ठीक क्लिक करें, जो वेवलेंथ और जेड-स्लाइसनामक एक नई खिड़की खोलेगा ।
    5. चरण 3.2.4 में चयनित फ़ोल्डर में पहली फ़ाइल (जेड-स्लाइस और चैनल नंबर के बिना) के फाइलनेम को कॉपी करें और इसे "इमेज नेम दर्ज करें" लेबल वाले संवाद बॉक्स के पहले चरण में चिपका दें।
    6. "तरंगदैर्ध्य बैंड की संख्या दर्ज करें", तीसरे चरण में जेड-स्लाइस की संख्या "जेड-स्लाइस की संख्या दर्ज करें" और ठीक क्लिककरें।
      नोट: यदि अधिग्रहण सेटिंग्स में परिवर्तन किए जाते हैं, जैसे तरंगदैर्ध्य सीमा या तरंगदैर्ध्य चरण आकार को समायोजित करने के लिए तरंगदैर्ध्य बैंड की संख्या बदल सकती है। कोशिका की ऊंचाई के आधार पर जेड-स्लाइस की संख्या भी बदल सकती है।
    7. "तरंगदैर्ध्य जानकारी फ़ाइल का चयन करें" और खुलेक्लिक करें" लेबल पॉपअप विंडो में "Wavelength.mat" नामक तरंगदैर्ध्य फ़ाइल ब्राउज़ करें और चुनें।
    8. "स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी फ़ाइल का चयन करें" लेबल वाली नई पॉपअप विंडो में "Library.mat" फ़ाइल ब्राउज़ करें और चुनें, स्लाइस की अनमिक्सिंग समाप्त होने तक खुला और प्रतीक्षा करें।
      नोट: Library.mat फ़ाइल सेल ऑटोफ्लोरेसेंस और पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रल हस्ताक्षर के साथ प्रत्येक एंडमेंबर फ्लोरोफोर के लिए शुद्ध स्पेक्ट्रा युक्त एक फ़ाइल है। इस मामले में, एंडमेंबर फ्लोरोफोरस में फ़िरोज़ा, वीनस और DRAQ5 शामिल हैं। पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रल हस्ताक्षरों में सेलुलर या मैट्रिक्स ऑटोफ्लोरेसेंस, कवरलिप फ्लोरेसेंस और कवरलिप विवर्तन शामिल हैं। Wavelength.mat फ़ाइल एक फ़ाइल है जिसमें तरंगदैर्ध्य चैनल जानकारी होती है जो स्पेक्ट्रल इमेज प्राप्त करने के लिए उपयोग की जाती है। बायोइमेजिंग और बायोसिस्टम्स वेबसाइट पर एक उदाहरण लाइब्रेरी फाइल और तरंगदैर्ध्य फ़ाइल उपलब्ध है (नोट को 3.2.1 के तहत देखें)। स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी और तरंगदैर्ध्य फ़ाइलों को उत्पन्न करने के तरीके के बारे में अधिक जानकारी के लिए, पूरक File_Spectral लाइब्रेरी नामक पूरक जानकारी फ़ाइल का उल्लेख करें। प्रत्येक जेड-स्लाइस के अनुरूप अनमिक्स्ड छवियों को चरण 3.2.3 में चुने गए फ़ोल्डर के भीतर अनमिक्सिंग प्रक्रिया के दौरान बनाए गए "अनमिक्स्ड" नामक फ़ोल्डर में सहेजा जाएगा।
  3. FRET दक्षता गणना:
    1. "मल्टीफ्र एनआरसीएफ.m" नामक प्रोग्रामिंग स्क्रिप्ट खोलें और रनपर क्लिक करें।
      नोट: यह प्रोग्रामिंग फ़ाइल दक्षिण अलबामा बायोइमेजिंग और बायोसिस्टम्स वेबसाइट विश्वविद्यालय से उपलब्ध है (चरण 3.2.1 के तहत नोट देखें)।
    2. पॉपअप डायलॉग बॉक्स में विश्लेषण करने के लिए प्रयोगात्मक परीक्षणों की संख्या दर्ज करें "कितने फ़ोल्डर रिसाल करने के लिए" और ठीक क्लिककरें।
      नोट: प्रत्येक प्रयोग से छवि डेटा एक अलग अनमिक्स छवि फ़ोल्डर में सहेजा जाना चाहिए। यह कदम बस विश्लेषण कोड को समय की बचत के चरण के रूप में कई फ़ोल्डरों पर लूप करने की अनुमति देता है।
    3. अमिशक्स्ड फ़ोल्डर (एस) ब्राउज़ करें और ओकेपर क्लिक करें।
      नोट: "फ़ोल्डर के लिए ब्राउज़" विंडो खुलने की संख्या पिछले चरण में "कितने फ़ोल्डर को रीसाइसर करने के लिए" संवाद बॉक्स में दर्ज की गई संख्या पर निर्भर करती है। एक के बाद एक फ़ोल्डर ब्राउज़ करें और चुनें।
    4. नई पॉपअप विंडो पर, निम्नलिखित जानकारी को संबंधित बक्से में दर्ज करें: स्केलिंग फैक्टर 12.4 है, थ्रेसहोल्ड 5.6 है, एक्स, वाई और जेड फ्रीक्वेंसी क्रमशः 5, 5 और 1 हैं, और चौरसाई एल्गोरिदम गॉसियन है।
      नोट: स्केलिंग फैक्टर पिक्सल/माइक्रोन में एक मूल्य है और XY दिशा के लिए जेड दिशा नमूना पैमाने पर इस्तेमाल किया जाएगा । स्केलिंग कारक छवि पिक्सेल आकार से प्राप्त किया जाता है, जिसे आमतौर पर अधिकांश कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सिस्टम के लिए छवि में मेटाडेटा के रूप में प्रदान किया जाता है। उदाहरण के लिए, यदि छवि 0.08 माइक्रोन/पिक्सेल अंतर के साथ अधिग्रहीत की जाती है, तो स्केलिंग कारक 12.5 पिक्सल/माइक्रोन होना चाहिए। थ्रेसहोल्ड वैल्यू का इस्तेमाल छवियों को दहलीज करने और सेल का बाइनरी मास्क जेनरेट करने के लिए किया जाएगा। हमने छवि दाता + स्वीकारकर्ता तीव्रता के आधार पर इष्टतम मूल्यों की एक सूची बनाई। यदि छवि में उज्ज्वल दाता + स्वीकार्य तीव्रता और कम पृष्ठभूमि है, तो 4.5 का उपयोग करें, केवल मध्यम दाता + स्वीकारकर्ता तीव्रता और/या उच्च पृष्ठभूमि वाले चित्रों के लिए ५.६ से ६.५ के बीच एक मूल्य, और एक दाता + स्वीकार्य तीव्रता वाले चित्रों के लिए ७.५ और उससे अधिक का मूल्य जो पृष्ठभूमि से कम है । आवृत्ति मूल्य पिक्सल की संख्या में अंतराल से मेल खाती है, जिस पर टुकड़ा करने की क्रिया बाद के चरणों में किया जाता है। उदाहरण के लिए, यदि कोशिका की जेड-गहराई 1 माइक्रोन चरण आकार के साथ 17 माइक्रोन है और XY दिशा में 12.5 पिक्सल/माइक्रोन का स्केलिंग कारक उपयोग किया जाता है, तो 3-आयामी छवि डेटासेट की गहराई 212 पिक्सल (जेड दिशा) पर फिर से तैयार की जाएगी। जेड फ्रीक्वेंसी वैल्यू दर्ज (उदाहरण के लिए, 1 पिक्सेल) के आधार पर, 3-आयामी छवि डेटा सेट को इमेज डेटा सेट के शीर्ष पर फिर से कटा दिया जाएगा और फिर 1 पिक्सेल की वेतन वृद्धि में नीचे की ओर बढ़ेगा। इसके परिणामस्वरूप 212 पुन: प्राप्त छवियां हैं। यदि जेड फ्रीक्वेंसी के लिए एक बड़ा आवृत्ति मूल्य अंतराल दर्ज किया गया था, तो कम पुन: प्राप्त छवियां उत्पन्न होंगी। बाद के चरणों में पुनः प्राप्त छवियों को सहेजा जाता है।
    5. रन पर क्लिक करें और तब तक प्रतीक्षा करें जब तक कि सभी FRET माप और रिस स्लाइसिंग नहीं हो जाती।
      नोट: मूल निर्देशिका के भीतर एक अलग फ़ोल्डर बनाया जाता है जिसके लिए ग्रेस्केल FRET दक्षता छवियों और रंगीन (एक कलरमैप लागू) FRET दक्षता छवियों को सहेजा जाता है। उदाहरण के लिए, एक्स दिशा (वाईजेड विमान) में फिर से पाए गए सभी ग्रेस्केल और कलरमैप FRET छवियों को "Resliced_XFRET" नामक फ़ोल्डर में सहेजा जाता है।
    6. सभी प्रयोगों के लिए समान सेटिंग्स के साथ विश्लेषण दोहराएं - पहले और बाद में forskolin उपचार और वाहन नियंत्रण।
      नोट: धारा 3.3 में उल्लिखित चरण 3-आयामी FRET छवि डेटा उत्पन्न करने के लिए कस्टम FRET विश्लेषण प्रोग्रामिंग स्क्रिप्ट के लिए प्रवेश करने के लिए मूल्यों का वर्णन करते हैं। हालांकि, यह स्क्रिप्ट चलते समय कई कार्यों को निष्पादित करती है, जिनमें शामिल हैं: छवि डेटा लोड करना, छवि स्टैक बनाना, चौरसाई करना, एफवाईआरटी दक्षता गणनाएं करना, सेल बॉर्डर मास्क बनाना और लागू करना, 3-आयामी छवि पुनर्निर्माण, निर्दिष्ट अंतराल (आवृत्तियों) पर 3-आयामी छवियों को फिर से शुरू करना, FRET परिवर्तनों की कल्पना के लिए एक रंगमैप लागू करना, और एक ही निर्देशक को अवशेष डेटा को बचाना। अतिरिक्त विवरण कार्यक्रम स्क्रिप्ट में टिप्पणी के रूप में शामिल किया गया है ।

4. सीएएमपी स्तर तक प्रोट दक्षता मानचित्रण

  1. 'Mapping_FRET Efficiency_to_cAMP_concentration.m' नाम की प्रोग्रामिंग फाइल खोलें और मुख्य विंडो पर क्लिक करें।
    नोट: फ़ाइल बायोइमेजिंग और बायोसिस्टम वेबसाइट पर उपलब्ध है (3.2.1 के तहत नोट देखें)। यह फ़ाइल ग्रेस्केल एफआरटी दक्षता छवियों को पढ़ती है और उन्हें एक विशिष्ट वक्र के आधार पर सीएएमपी स्तरों में परिवर्तित करती है। यह विशेषता वक्र साहित्य15,36 में प्रलेखित एक सीएएमपी-टू-FRET संबंध का उपयोग करता है जिसे पहाड़ी समीकरण (नीचे दिखाया गया तीसरा समीकरण) द्वारा वर्णित किया गया है। हालांकि, अक्षुण्ण कोशिकाओं में जांच के KD का अनुमान लगाना मुश्किल है और हमने इसे अपनी गणना में 1 माइक्रोनएम मान लिया है। इसलिए, परिणाम के डी के एक समारोह के रूप में दिखायागया है। (यानी, [cAMP] = x * Kd)। FRET दक्षता को मापने और सीएएएमपी स्तर तक FRET मानचित्रण करने के लिए उपयोग किए जाने वाले समीकरण नीचे दिखाए गए हैं:
    Equation 1
    जहां ई FRET दक्षता है, और एकस्पष्ट और डीस्पष्ट क्रमशः स्वीकारकर्ता और दाता छवियों की पिक्सेल तीव्रता, क्रमशः कर रहे हैं ।
    क्यू और क्यूडी स्वीकारकर्ता और दाता की क्वांटम पैदावार हैं। ध्यान दें कि क्यू और क्यूडी को रद्द करें जब केλ के लिए समीकरण को FRET दक्षता समीकरण में शामिल किया जाताहै, कश्मीरλ एक सुधार कारक है:
    Equation 2
    Equation 3 और Equation 4 दाता उत्तेजन तरंगदैर्ध्य, मैं (405nm) में दाता और स्वीकारकर्ता के विलुप्त गुणांक हैं।
    Equation 5
    ई FRET दक्षता और कश्मीरडी = विच्छेदन स्थिर = 1 μM है।
  2. नेविगेट करें और पहले ग्रे स्केल FRET छवि (चरण 3.3.5 में सहेजा गया) चुनें और ओके पर क्लिक करें।
  3. तीन आयामों में cAMP संकेतों के वितरण का निरीक्षण करने के लिए FRET/cAMP छवियों को खोलें ।

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Representative Results

यह प्रोटोकॉल जीवित कोशिकाओं में तीन स्थानिक आयामों में सीएएमपी ग्रेडिएंट को मापने के लिए हाइपरस्पेक्ट्रल FRET इमेजिंग और विश्लेषण दृष्टिकोणों के उपयोग का वर्णन करता है। इन परिणामों को उत्पन्न करने में कई महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं, जिनके लिए डेटा का विश्लेषण और मात्रा निर्धारित करते समय सावधानीपूर्वक ध्यान देने की आवश्यकता होती है। इन प्रमुख चरणों में एक उपयुक्त स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी का निर्माण, पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग, सेल सीमाओं की पहचान करने के लिए थ्रेसहोल्डिंग, और FRET दक्षता गणना शामिल हैं। चित्रा 1 जीवित कोशिकाओं में FRET दक्षता और cAMP स्तर को मापने में शामिल सभी चरणों के योजनाबद्ध प्रवाह को दिखाता है। जब ठीक से प्रदर्शन किया जाता है, तो ये इमेजिंग और विश्लेषण कदम यूआरटी दक्षता और एक सेल में 3 आयामों में सीएएमपी स्थानिक ढाल के अनुमान की माप की अनुमति देंगे, जबकि गैर-समान पृष्ठभूमि संकेतों के लिए लेखांकन करते हैं।

चित्रा 2 में बेसलाइन स्थितियों(चित्रा 2A)पर निकॉन ए1आर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके अधिग्रहीत झूठे रंग के कच्चे हाइपरस्पेक्ट्रल इमेज डेटा के 3-आयामी विचारों को दर्शाया गया है और 10 मिनट बाद(चित्रा 2B)फोरस्कोलिन उपचार। ध्यान दें कि इसी तरह के डिटेक्टर और सिस्टम मापदंडों का उपयोग मात्रात्मक विश्लेषण के लिए निरंतरता बनाए रखने के लिए उपचार छवि ढेर से पहले और बाद में प्राप्त करने के लिए किया गया था। यह भी ध्यान दें कि FRET में परिवर्तन इस छवि में स्पष्ट नहीं हैं, क्योंकि यह पूरी तरह से कच्चे डेटा का एक दृश्य है, FRET दक्षता की गणना करने से पहले।

कच्चे स्पेक्ट्रल छवि डेटा का विश्लेषण करने के लिए सभी अंत सदस्यों के शुद्ध स्पेक्ट्रा के साथ एक स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी की आवश्यकता होती है। एक उपयुक्त स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी का निर्माण FRET दक्षता के उचित माप सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण चरणों में से एक है। चित्रा 3 एंडमेंबर्स के शुद्ध स्पेक्ट्रा वाले स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी के निर्माण को दर्शाता है (इन वर्तमान अध्ययनों में, एंडमेंबर्स फ़िरोज़ा, वीनस और डीआरएक्यू 5 हैं)। FRET दक्षता को मापने के लिए, 1:1 स्टोइचियोमेट्री के साथ एक नमूने का उपयोग करके फ़िरोज़ा और वीनस का स्पेक्ट्रा प्राप्त करना महत्वपूर्ण है। यहां, हमने एक दृष्टिकोण प्रदान किया है जहां स्वीकार्य फ्लोरोफोर पूरी तरह से फोटो-विनाशित होता है, जिससे दाता और स्वीकारकर्ता के स्पेक्ट्रल हस्ताक्षर 1:1 स्टोइचिओमेट्री प्राप्त किए जासकते हैं (चित्रा 3ए-एफ)। इसके अलावा, लेजर के बीच रैखिक शक्ति संबंधों(पूरक चित्रा 1)को एक तीव्रता के साथ स्वीकार्य स्पेक्ट्रम की गणना करने के लिए लागू किया गया था, जिसकी उम्मीद की जाएगी यदि यह दाता उत्तेजन लेजर का उपयोग करके उत्साहित था, इस मामले में फ़िरोज़ा(चित्रा 3जी)के लिए 405 एनएम। यह सुनिश्चित करता है कि जब FRET एक 405 एनएम लेजर लाइन के साथ उत्साहित होता है तो अनमिक्स्ड डोनर और स्वीकार्य संकेत पूर्ण तीव्रता में तुलनीय होते हैं। परमाणु डाई के साथ लेबल गैर-संक्रमित कोशिकाओं, DRAQ5(चित्रा 3H)का उपयोग DRAQ5(चित्रा 3I)के शुद्ध स्पेक्ट्रम प्राप्त करने के लिए किया गया था। दाता के स्पेक्ट्रा का संयोजन, फ़िरोज़ा(चित्रा 3F),स्वीकारकर्ता, वीनस(चित्रा 3जी),और DRAQ5(चित्रा 3I),एक 3 घटक पुस्तकालय(चित्रा 3J) बनायागया था ।

फ्लोरोसेंट लेबल के अलावा अन्य स्रोतों से संकेत भी एक नमूने में मौजूद हो सकते हैं। इन बातों का लेखा-जोखा करने के लिए, 424 एनएम, 504 एनएम और 574 एनएम पर होने वाली चोटियों के साथ तीन अलग-अलग स्पेक्ट्रल हस्ताक्षरों की पहचान अवेलेबल सेलुलर नमूनों के भीतर की गई थी। हमारा मानना है कि ये स्पेक्ट्रल हस्ताक्षर कवरलिप रिफ्लेक्स और सेल मैट्रिक्स या सेलुलर ऑटोफ्लोरेसेंस के अनुरूप हैं। चित्रा 4 इन तीन पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रल हस्ताक्षर के स्रोतों को दर्शाया गया है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इन संकेतों को नमूने के भीतर गैर-समान रूप से वितरित किया जाता है और इसलिए इसे घटाया नहीं जा सकता है। हालांकि, स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी में इन संकेतों के स्पेक्ट्रल हस्ताक्षर जोड़ना और संकेतों को अलग करने के लिए रैखिक अनमिक्सिंग का उपयोग करना FRET क्षमता की गणना करने से पहले दाता और स्वीकार्य संकेतों से इन भ्रामक संकेतों को हटाने के लिए एक दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है। इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, तीन पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रल हस्ताक्षर 3-घटक स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी में जोड़े गए थे, जिसमें दाता (फ़िरोज़ा), स्वीकारकर्ता (वीनस), DRAQ5 और तीन पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रल हस्ताक्षर शामिल एक नए 6-घटक पुस्तकालय का गठन किया गया था।

एक कस्टम प्रोग्रामिंग स्क्रिप्ट को स्पेक्ट्रल इमेज डेटा को व्यक्तिगत एंडमेंबर्स में अनमिक्स करने के लिए लिखा गया था, और बाद में FRET दक्षता गणना करने के लिए एक अलग स्क्रिप्ट लिखी गई थी। 6-घटक स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी का उपयोग करके रैखिक स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग (चित्र 5में सचित्र) किया गया था। अक्षीय छवि स्टैक में प्रत्येक स्लाइस के लिए अनमिक्सिंग किया गया था, जिसे जेड-स्टैक के रूप में भी जाना जाता है (चित्र 5 एमें कच्चे स्पेक्ट्रल इमेज डेटा के 3-आयामी दृश्य को देखें)। इसके परिणामस्वरूप प्रत्येक एंडमेंबर के लिए अलग-अलग अनमिक्स छवियां हुईं, क्योंकि जेड-स्टैक में प्रत्येक जेड-स्लाइस(चित्रा 5सी-ई,पृष्ठभूमि अनमिक्स्ड छवियां नहीं दिखाई जाती हैं)। यदि वांछित है, तो प्रत्येक अमिशक्स संकेत(चित्रा 5एफ-एच)को सौंपे गए एक अलग रंग के साथ दृश्य के लिए अमिश्नित संकेत झूठे रंग के हो सकते हैं।

चित्रा 6 FRET दक्षता गणना में शामिल कदमों को दिखाता है, साथ ही सीएएमपी स्तर तक FRET दक्षता मानचित्रण के लिए कदम भी दिखाता है। एक FRET दक्षता छवि चिकनी अनमिक्स दाता और स्वीकारकर्ता छवियों का उपयोग करके उत्पन्न की गई थी। एक बाइनरी मास्क छवि को अमिशक्स दाता, स्वीकारकर्ता और परमाणु छवियों का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। मुखौटा सेल के बाहर पिक्सल से योगदान को दूर करने के लिए FRET दक्षता छवि के लिए लागू किया गया था । हालांकि एकल जेड-स्लाइस से अनमिक्स छवियों का उपयोग FRET दक्षता माप के सचित्र प्रदर्शन के लिए किया गया था, इन गणनाओं को 3-आयामी छवि स्टैक के भीतर प्रत्येक स्लाइस पर किया गया था। 3-आयामी FRET छवि डेटा सेट को फिर से तीन ऑर्थोगोनल विमानों में फिर से स्लाइस किया गया ताकि विभिन्न दिशाओं में सीएएमपी संकेतों के स्थानिक ढाल की कल्पना की जा सके।

FRET दक्षता और सीएएमपी स्तरों में अगोनिस्ट-प्रेरित परिवर्तनों की कल्पना करना
ऊपर वर्णित कदम तीन स्थानिक आयामों में हाइपरस्पेक्ट्रल इमेज डेटा से FRET दक्षता और सीएएएमपी स्तरों की गणना के लिए एक विधि प्रदान करते हैं। इन चरणों को यौगिकों के साथ उपचार से पहले और बाद में सेलुलर तैयारी पर लागू किया जा सकता है जो एक सीएएमपी प्रतिक्रिया प्राप्त करते हैं, जैसे फोरस्कोलिन। यहां, हम 50 माइक्रोन एफएसकोलिन के साथ उपचार के बाद पीएमवीईसी में FRET और cAMP वितरण में परिवर्तन का निरीक्षण करने के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग करने का एक उदाहरण प्रदान करते हैं। चित्रा 7 विभिन्न XY विमान स्लाइस (जेड स्लाइस) में FRET दक्षता और cAMP स्तरों में परिवर्तन दिखाता है, एपिकल से बेसल तक, बेसलाइन स्थितियों (फोर्स्कोलिन उपचार से पहले) और उपचार के बाद 10 मिनट की तुलना की अनुमति देता है। इस उदाहरण उदाहरण में, एफईआरटी दक्षता में कमी आई (कॉलम 1 और 3 अंक 7में) फोर्स्कोलिन उपचार पर, सीएएमपी के स्तर में वृद्धि से संबंधित (कॉलम 2 और 4 अंक 7में)। एक ही XY विमान के भीतर cAMP के न्यूनतम स्थानिक भिन्नता देखा गया था। हालांकि, अक्षीय (एपिकल-टू-बेसल) सीएएमपी स्थानिक ढाल देखा गया, जैसा कि यह देखकर किया जा सकता है कि एपिकल स्लाइस में एक गहरा लाल रंग है (रंग लुकअप टेबल के माध्यम से उच्च सीएएमपी स्तर का संकेत है जो लागू किया गया था) फोरस्कोलिन उपचार के बाद बेसल स्लाइस (चित्रा 7में कॉलम 4) की तुलना में। एक्सियल एफवाईआरटी या सीएएमपी वितरण अक्सर दो ऑर्थोगोनल स्थानिक विमानों से प्राप्त छवियों का उपयोग करके बेहतर कल्पना की जा सकती है: चित्रा 8 बेसलाइन (कॉलम 1 और 2) पर वाईजेड विमान में FRET दक्षता और सीएएमपी स्तर को दर्शाता है और फोरस्कोलिन उपचार (कॉलम 3 और 4) के 10 मिनट बाद, जबकि पूरक चित्रा 2 में FRET दक्षता और cAMP स्तर को दर्शाया गया है। ये परिणाम FRET को मापने और 3-आयामी हाइपरस्पेक्ट्रल छवि डेटा से सीएएमपी के स्तर का आकलन करने की व्यवहार्यता को प्रदर्शित करते हैं और FRET या cAMP के अक्षीय वितरण की कल्पना के महत्व को भी प्रदर्शित करते हैं। जबकि इस पद्धतित्मक कागज के दायरे से परे, यह हो सकता है कि चक्रीय न्यूक्लियोटाइड के अक्षीय स्थानिक वितरण चक्रीय न्यूक्लियोटाइड सिग्नलिंग रास्तों के भीतर विशिष्टता में योगदान देते हैं।

ऊपर वर्णित तरीकों का प्रदर्शन करते समय, चरणों की सटीकता की सावधानीपूर्वक जांच करना और यह सुनिश्चित करने के लिए उचित प्रयोगात्मक और वाहन नियंत्रण चलाना महत्वपूर्ण है कि FRET (और इसी cAMP) में परिवर्तन दाता और स्वीकार्य संकेतों में वास्तविक परिवर्तन के कारण हैं और कलाकृतियों की इमेजिंग नहीं कर रहे हैं। उदाहरण के लिए, विचार करने के लिए महत्वपूर्ण कदमों में शामिल हैं:

एक उपयुक्त स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी का उपयोग करना जिसमें सभी आवश्यक स्पेक्ट्रल घटक शामिल हैं
जैसा कि उल्लेख किया गया है, सेलुलर ऑटोफ्लोरेसेंस, जमा मैट्रिक्स, या कवरस्लिप (उत्तेजन-उत्सर्जन के माध्यम से खून) से प्रतिबिंबित प्रकाश से पृष्ठभूमि संकेतों का महत्वपूर्ण योगदान हो सकता है। चित्रा 9 एक उदाहरण डेटा सेट का प्रतिनिधित्व करता है जिसमें यह दर्शाया गया है कि पृष्ठभूमि संकेत छवियों के भीतर बनाए रखा गया था जब स्पेक्ट्रल डेटा को अनमिक्स करने के लिए 3-घटक (फ़िरोज़ा, वीनस और DRAQ5) पुस्तकालय का उपयोग किया गया था। इसके विपरीत, पृष्ठभूमि संकेत को प्रभावी ढंग से हटा दिया गया था जब एक अधिक पूर्ण (और उपयुक्त) 6-घटक स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी का उपयोग किया गया था।

सेल मास्क उत्पन्न करने के लिए इष्टतम सीमा मूल्य का उपयोग करना
हमने जो प्रयोग किए हैं, उनमें से कई में पृष्ठभूमि संकेत तीव्रता FRET सिग्नल तीव्रता का लगभग 50-60% है जो कच्चे स्पेक्ट्रल इमेज डेटा के भीतर मौजूद है (यानी, जब असंसाधित स्पेक्ट्रल इमेज डेटा की कल्पना करना होगा तो FRET सिग्नल का शिखर आसपास के पृष्ठभूमि सिग्नल की तुलना में केवल ~ 2X अधिक है)। इस प्रकार, बाइनरी मास्क प्राप्त करने के लिए थ्रेसहोल्ड वैल्यू का उपयोग करके अग्रभूमि संकेत से पृष्ठभूमि संकेत का पृथक्करण एक संवेदनशील कदम है और विश्लेषण कलाकृतियों से बचने के लिए सावधानीपूर्वक किया जाना चाहिए। चित्रा 10 सेल के बाइनरी मास्क बनाने के लिए सेल सेगमेंटेशन के लिए लागू विभिन्न दहलीज मूल्यों के प्रभाव को दर्शाता है। कम सीमा वाले मूल्य में एक्सप्रेसिंग सेल के हिस्से के रूप में पृष्ठभूमि संकेत शामिल हो सकते हैं। दूसरी ओर, एक अत्यधिक उच्च सीमा मूल्य कम व्यक्त करने वाली कोशिकाओं या कम दाता + स्वीकार्य संकेत वाले सेल के क्षेत्रों में FRET की माप को रोक सकता है (या तो सेल के बहुत पतले हिस्से या उन हिस्सों जिनमें FRET जांच की कम क्षेत्रीय एकाग्रता हो सकती है)।

दाता + स्वीकारकर्ता संकेत तीव्रता ≥ पृष्ठभूमि संकेत के साथ एक संक्रमित सेल का चयन
चित्रा 11 एक उदाहरण डेटा सेट दिखाता है जहां रेखीय स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग के लिए 6-घटक स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी का उपयोग करके प्राप्त अनमिक्स्ड छवियों से FRET क्षमता और संबंधित स्तरों को मापा गया था। स्पेक्ट्रल छवि डेटा को अनमिक्स करने और सेल सीमा और परमाणु मास्क बनाने के लिए एक उच्च सीमा का चयन करने के लिए 6-घटक पुस्तकालय का उपयोग करने के बावजूद, FRET दक्षता छवियां अभी भी सेल के बेसल पक्ष के पास उच्च पृष्ठभूमि शोर संकेत से ग्रस्त थीं। इस मामले में, पृष्ठभूमि शोर की उपस्थिति एक सेल के चयन के कारण थी जो केवल कमजोर रूप से FRET जांच व्यक्त कर रहा था, और दाता + स्वीकारकर्ता संकेत शक्ति लगभग पृष्ठभूमि संकेत शक्ति के बराबर थी, यहां तक कि अनमिक्सिंग के बाद। इस प्रकार, ऊपर वर्णित परिष्कृत विश्लेषण चरणों को लागू करने के अलावा, उच्च गुणवत्ता वाले परिणाम सुनिश्चित करने के लिए अधिग्रहण के दौरान FRET जांच और तदनुसार पर्याप्त FRET संकेत (दाता और स्वीकार्य संकेत कम से कम बराबर या शोर संकेत से ऊपर) की पर्याप्त अभिव्यक्ति के साथ एक सेल का चयन करना भी महत्वपूर्ण है।

Figure 1
चित्र 1: हाइपरस्पेक्ट्रल एफईआरटी इमेजिंग और विश्लेषण का उपयोग करके तीन स्थानिक आयामों में FRET दक्षता और स्तर माप में शामिल चरणों को दर्शाते हुए फ्लोचार्ट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एक कोशिका का 3-आयामी दृश्य जो कोशिका से सीएएमपी FRET रिपोर्टर (हरा) और नाभिक और आसपास के गैर-व्यक्त कोशिकाओं (लाल) को व्यक्त करता है। निकॉन A1R स्पेक्ट्रल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राप्त कच्चे स्पेक्ट्रल इमेज डेटा को एनवलेंगथ के अनुसार झूठा रंग दिया गया है और एनआईएस एलिमेंट्स सॉफ्टवेयर का उपयोग करके 3 आयामों में कल्पना की गई है। A) बेसलाइन और बी पर 3-आयामी छवि डेटा) 50 माइक्रोन फोरस्कोलिन उपचार के 10 मिनट बाद। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: अध्ययन में फ्लोरोसेंट लेबल के शुद्ध स्पेक्ट्रा वाले स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी का निर्माण (रिमोट सेंसिंग फील्ड द्वारा एंडमेंबर्स के रूप में संदर्भित)। ए) 405 एनएम एक्सिटेशन (दाता उत्तेजन) पर अधिग्रहीत FRET बायोसेंसर को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की एक झूठी रंग की छवि। ख) FRET संकेत के अनुरूप स्पेक्ट्रम: ब्याज के 4 विभिन्न क्षेत्रों (ROIs) छवि एक लाल, पीले, पीले और हरे आयतों द्वारा दिखाया गया पर तैयार किए गए थे । चयनित प्रत्येक आरओआई के लिए प्रत्येक तरंगदैर्ध्य पर औसत तीव्रता का निर्यात किया गया था। इन 4 आरओआई से औसत तीव्रता प्रत्येक उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य पर प्लॉट किया गया था। स्पेक्ट्रम की उत्सर्जन चोटियां दाता (फ़िरोज़ा) और स्वीकारकर्ता (वीनस) फ्लोरोफोरस दोनों के अनुरूप हैं। ग) 488 एनएम एक्सिटेशन (स्वीकार्यता) पर अधिग्रहीत FRET बायोसेंसर को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की एक झूठी रंग की छवि। घ) औसत स्पेक्ट्रम का अनुमान बी में सी में कई आरओआई (ए में समान क्षेत्रों) से बताया गया था, जिसमें केवल स्वीकारकर्ता के कारण उत्सर्जन शिखर था । ई) 514 एनएम विकिरण द्वारा स्वीकारकर्ता फ्लोरोफोर के फोटो-विनाश के बाद 405 एनएम उत्तेजन पर अधिग्रहीत FRET बायोसेंसर व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की एक झूठी रंग की छवि। एफ) औसत स्पेक्ट्रम का अनुमान बी में ई में कई आरओआई (ए के समान क्षेत्र) से बताया गया था, जिसमें केवल दाता के कारण उत्सर्जन शिखर था । ध्यान दें कि मूल FRET संकेत की तुलना में एफ में दाता तीव्रता में वृद्धि हुई है, यह दर्शाता है कि स्वीकारकर्ता के फोटोब्लैचिंग के बाद, दाता उत्तेजन प्रत्यक्ष दाता उत्सर्जन के लिए अग्रणी है । जी) 405 एनएम उत्तेजन का उपयोग करके प्राप्त किए जाने पर स्वीकार्य स्पेक्ट्रम की उम्मीद की जाएगी। यह तथ्यों का उपयोग करके अनुमान लगाया गया था कि 405 एनएम और 488 एनएम उत्तेजन लेजर में एक रैखिक प्रतिक्रिया होती है जिसे स्पेक्ट्रोमीटर और एकीकृत क्षेत्र(पूरक चित्रा 1)और शुक्र के तरंगदैर्ध्य-निर्भर विलुप्त होने के गुणांक का उपयोग करके विशेषता हो सकती है। इसलिए, 488 एनएम उत्तेजन पर प्राप्त वीनस स्पेक्ट्रम को वीनस स्पेक्ट्रम में परिवर्तित किया जा सकता है जिसे 405 एनएम उत्तेजन एच पर प्राप्त होने पर उम्मीद की जाएगी) परमाणु लेबल, DRAQ5 के साथ लेबल की कोशिकाओं की एक झूठी रंग की छवि। I) एच जे में ब्याज के कई क्षेत्रों से औसत स्पेक्ट्रम) परिणामी स्पेक्ट्रल पुस्तकालय जिसमें दाता और DRAQ5 के सामान्यीकृत शुद्ध स्पेक्ट्रा और स्वीकार्यकर्ता के उत्तेजन तरंगदैर्ध्य-सही स्पेक्ट्रम शामिल हैं । ध्यान दें कि फ़िरोज़ा और वीनस स्पेक्ट्रा को संयुक्त फ़िरोज़ा + वीनस स्पेक्ट्रल डेटा के अधिकतम मूल्य के लिए सामान्यीकृत किया गया था जबकि DRAQ5 को केवल शिखर उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के मूल्य पर एकता के लिए सामान्यीकृत किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रल हस्ताक्षरों की पहचान की गई थी और उन्हें स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी में शामिल किया गया था ताकि अनमिक्सिंग प्रक्रिया के दौरान पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस संकेतों का लेखा-जोखा किया जा सके। ए, बी) एक नमूना खाली (अवेलेबल कवर्लिप) की विशेषता के दौरान दो पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस स्पेक्ट्रल हस्ताक्षर देखे गए। इन स्पेक्ट्रल हस्ताक्षरों को उनके चरम तरंगदैर्ध्य के आधार पर नामित किया गया था - एक 424 एनएम (कवरलिप फ्लोरेसेंस से) और दूसरा 504 एनएम (परावर्तन या पीछे बिखरने से होने की संभावना) पर। ग) एक तीसरी पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रल हस्ताक्षर ५७४ एनएम की एक चोटी उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ मनाया गया था जब गैर लेबल कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया, संभवतः सेलुलर ऑटोफ्लोरेसेंस या अंतर्निहित मैट्रिक्स के फ्लोरेसेंस से । घ) ए, बी और सी छवियों से निकाली गई पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रा। इन तीन पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रा को 6-घटक स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी विकसित करने के लिएमौजूदा 3-घटक पुस्तकालय (चित्रा 3J)में जोड़ा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्र 5: 6-घटक स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी का उपयोग करके रैखिक स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग जो पृष्ठभूमि संकेतों के लिए खाते हैं। ए) कच्चे स्पेक्ट्रल छवि डेटा एक अक्षीय जेड-स्टैक के रूप में अधिग्रहीत । B) 6-घटक स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी का उपयोग कच्चे स्पेक्ट्रल डेटा को अनमिक्स करने के लिए किया जाता है। सी, डी और ई) क्रमशः DRAQ5, फ़िरोज़ा और वीनस की ग्रे स्केल अनमिक्स्ड छवियां, रैखिक स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग से हुईं। एफ, जी, और एच) क्रमशः DRAQ5, फ़िरोज़ा और वीनस की झूठी रंगीन अनमिक्स छवियां। पृष्ठभूमि संकेतों की अमिश्रित छवियों की भी गणना की गई थी (डेटा यहां नहीं दिखाया गया है क्योंकि केवल फ्लोरोसेंट लेबल इस पद्धति के लिए रुचि रखते हैं - अनमिक्स किए गए पृष्ठभूमि संकेतों25के उदाहरणों के लिए एनामदेवुला, एट अल में चित्रा 4 का उल्लेख करते हैं)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6: फ्लोचार्ट जो अनमिक्स्ड स्पेक्ट्रल इमेज डेटा से FRET और cAMP स्तरों की गणना में शामिल चरणों को दर्शाता है। ए) दाता, फ़िरोज़ा की प्रतिनिधि अनमिक्स छवि । ख) स्वीकारकर्ता, शुक्र की प्रतिनिधि अनमिक्स छवि । ग) नाभिक, DRAQ5 की प्रतिनिधि अनमिक्स छवि । घ) बाइनरी सेल मास्क अनमिक्स्ड दाता + स्वीकारकर्ता अभिव्यक्त छवि को थ्रेसहोल्ड करके उत्पन्न होता है। ई) नाभिक का बाइनरी मास्क बनाने के लिए परमाणु छवि पर एक सीमा लागू की जाती है। एफ) पिक्सेल वार FRET दक्षता की गणना अनमिक्स्ड डोनर और स्वीकार्य छवियों से की गई थी। जी) सेल बॉर्डर और न्यूक्लियर मास्क से कंपोजिट बाइनरी मास्क बनाया गया था । एच) नकाबपोश FRET दक्षता छवि: समग्र सेल मास्क को कोशिका के बाहर और नाभिक के भीतर गैर-विशिष्ट FRET संकेतों को बाहर करने के लिए FRET दक्षता छवि पर लागू किया गया था। I) FRET में स्थानिक परिवर्तनों की बेहतर कल्पना करने के लिए नकाबपोश FRET दक्षता छवि पर एक रंगीनमैप लागू किया गया था। जम्मू) सीएएएमपी स्तर की छवि जो FRET दक्षता छवि से अनुमानित थी। K) कोलोरमैप को सीएएमपी में स्थानिक परिवर्तनों की बेहतर कल्पना करने के लिए लागू किया गया था। दाईं ओर दिखाए गए कलरबार का उपयोग FRET दक्षता (शीर्ष पैनल) और सीएएमपी स्तर (नीचे पैनल) की कल्पना करने के लिए किया जाता था। इस आंकड़े में दिखाई गई छवियां एक एकल अक्षीय जेड-स्लाइस के प्रतिनिधि हैं, लेकिन इस आंकड़े में वर्णित विश्लेषण ऑपरेशन पूरे अक्षीय जेड-स्टैक पर किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: फोर्सकोलिन-प्रेरित FRET दक्षता और पीएमवीईसी में कल्पना करने वाले सीएएमपी स्थानिक ढाल। XY विमान छवियों को सेल के बेसल पक्ष के लिए एपीिकल से अक्षीय (जेड) दिशा में 3-आयामी पुनर्निर्माण FRET और cAMP छवि डेटा को रीसालिस करके उत्पन्न किया गया था। पांच समीपस्थ XY स्लाइस दिखाए गए हैं। कॉलम 1 और 3 बेसलाइन पर FRET दक्षता का प्रतिनिधित्व करते हैं और क्रमशः 50 माइक्रोन फोरस्कोलिन के साथ उपचार के 10 मिनट बाद। कॉलम 2 और 4 बेसलाइन पर स्तर और फोरस्कोलिन उपचार के 10 मिनट बाद इंगित करते हैं। कलरबार का उपयोग कलरमैप में परिवर्तन को FRET दक्षता (शीर्ष) और सीएएमपी स्तर (नीचे) से संबंधित करने के लिए किया गया था। कॉलम 2 और कॉलम 4 में छवियों पर दिखाई गई सफेद लाइनों का उपयोग इस चयनित लाइन में सीएएमपी संकेतों की तीव्रता प्रोफ़ाइल (लाइन स्कैन प्रोफाइल) उत्पन्न करने के लिए किया जाता है। बेसलाइन (ब्लू प्रोफाइल) पर सेल के मध्य टुकड़ा से प्राप्त तीव्रता प्रोफ़ाइल प्लॉट और फोर्स्कोलिन उपचार (ग्रीन प्रोफाइल) के बाद लाइन स्कैन में सीएएमपी संकेतों के स्थानिक वितरण को दर्शाता है। स्केल बार 20 माइक्रोन इंगित करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8: फोर्स्कोलिन-प्रेरित FRET दक्षता और cAMP स्थानिक ढाल अक्षीय दिशा में कल्पना की। वाईजेड विमान छवियों को पार्श्व (एक्स) दिशा (कोशिका के बाएं से दाईं ओर) में 3-आयामी पुनर्निर्मित FRET और cAMP छवि डेटा को रीसालिस करके उत्पन्न किया गया था। कॉलम 1 और 3 बेसलाइन पर FRET दक्षता का प्रतिनिधित्व करते हैं और क्रमशः 50 माइक्रोन फोरस्कोलिन उपचार के बाद 10 मिनट पर। कॉलम 2 और 4 बेसलाइन पर और फोर्स्कोलिन उपचार के 10 मिनट बाद सीएएमपी स्तर का प्रतिनिधित्व करते हैं। दाईं ओर कलरबार का उपयोग कलरमैप में परिवर्तन को FRET दक्षता (शीर्ष) और सीएएमपी स्तर (नीचे) से संबंधित करने के लिए किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 9
चित्रा 9: FRET और cAMP स्तर छवियों की गणना के लिए या तो एक 3 घटक या एक 6 घटक स्पेक्ट्रल पुस्तकालय का उपयोग करने की प्रभावशीलता की तुलना । 3-घटक पुस्तकालय का उपयोग करके गणना की गई छवियों में गैर-विशिष्ट पृष्ठभूमि संकेतों को देखा गया था, जो पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रल हस्ताक्षरों के लिए खाता नहीं था। यह 50 माइक्रोन फोरस्कोलिन उपचार (कॉलम 2) के बाद सेल के बेसल पक्ष के पास छवियों के लिए विशेष रूप से सच था। इसके विपरीत, पृष्ठभूमि सिग्नल कलाकृतियों को प्रभावी ढंग से हटा दिया गया था जब एक 6 घटक पुस्तकालय का उपयोग करते हुए जिसमें पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रल हस्ताक्षर शामिल थे, सेल को सेगमेंट करने और FRET और cAMP संकेतों का विश्लेषण करने की क्षमता में सुधार करते थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 10
चित्रा 10: छवि विश्लेषण कलाकृतियों को पेश किया जा सकता है यदि सेल और परमाणु सीमाओं को चित्रित करने के लिए उचित सीमा मूल्य का चयन नहीं किया जाता है। तीन अलग-अलग सीमा मानों के साथ एक मुखौटा बनाने के लिए अनमिक्स किए गए दाता और स्वीकारकर्ता छवियों का उपयोग किया गया था: 0.35 (कॉलम 1 2), 0.65 (कॉलम 3 और 4) और 0.9 (कॉलम 5 और 6)। कॉलम 1, 3 और 5 बेसलाइन पर FRET दक्षता प्रदर्शित करते हैं। कॉलम 2, 4, और 6 50 माइक्रोन फोरस्कोलिन उपचार के 10 मिनट बाद FRET दक्षता प्रदर्शित करते हैं। एक सीमा का चयन करना जो बहुत कम था, पृष्ठभूमि के कुछ हिस्सों में, या बाह्राश क्षेत्र, विश्लेषण के लिए सेल के साथ शामिल किया जा रहा है, जबकि एक सीमा का चयन करना जो बहुत अधिक है, सेल के हिस्से के नुकसान के परिणामस्वरूप (कॉलम 3-4 की तुलना में कॉलम 4-5 में एपिकल स्लाइस देखें)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 11
चित्रा 11: पृष्ठभूमि सिग्नल कलाकृतियों अभी भी पृष्ठभूमि unmixing और एक बाइनरी मास्क के निर्माण के दौरान एक उपयुक्त सीमा का चयन करने के बाद भी जारी रख सकते हैं । कॉलम 1 बेसलाइन और कॉलम 2 पर प्रतिनिधि एपिकल, मिडिल और बेसल स्लाइस दिखाता है, जो 50 माइक्रोन फोरस्कोलिन उपचार के बाद 10 मिनट में समान दिखाता है। पृष्ठभूमि संकेतों के लिए हिसाब और बाइनरी मास्क पीढ़ी के लिए 0.85 की उच्च सीमा का उपयोग करने वाले अनमिक्सिंग के लिए 6-घटक पुस्तकालय का उपयोग करने के बावजूद, पृष्ठभूमि क्षेत्रों को अभी भी सेल का हिस्सा होने के रूप में पहचाना गया था, विशेष रूप से फोर्स्कोलिन के साथ उपचार के बाद। यदि ऐसा होता है, तो एक संभावित स्पष्टीकरण हो सकता है कि FRET रिपोर्टर की कमजोर अभिव्यक्ति वाले सेल को इमेजिंग के लिए चुना गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 1: सॉफ्टवेयर में लेजर सेटिंग के एक समारोह के रूप में लेजर लाइन तीव्रता के माप। एक फाइबर युग्मित स्पेक्ट्रोमीटर और एकीकृत क्षेत्र दोनों ४०५ एनएम लेजर लाइन और ४८८ एनएम लेजर लाइन के लिए लेजर तीव्रता को मापने के लिए एक NIST-ट्रेस करने योग्य दीपक को अंशांकित किया गया । ए) माइक्रोस्कोप चरण में मापा फोटॉनों की कुल संख्या ४०५ एनएम लेजर की विभिन्न लेजर तीव्रता के अनुरूप । ख) माइक्रोस्कोप चरण में मापा फोटॉन की कुल संख्या ४८८ एनएम लेजर की विभिन्न लेजर तीव्रता के अनुरूप । लेजर तीव्रता में रैखिक प्रतिक्रिया दोनों लेजर के लिए देखी गई थी जैसा कि माइक्रोस्कोप चरण में मापा जाता है। एक रैखिक ट्रेंडलाइन फिट था और प्रत्येक लेजर लाइन के लिए ट्रेंडलाइन समीकरण का उपयोग स्वीकार्य स्पेक्ट्रम की गणना करने के लिए किया गया था जो 405एनएम लेजर लाइन (दाता उत्तेजन) के साथ उत्साहित होने की उम्मीद होगी। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 2: फोर्स्कोलिन-प्रेरित FRET दक्षता और एक्सियल दिशा में कल्पना करने वाले सीएएमपी स्थानिक ढाल। एक्सजेड विमान छवियों को पार्श्व (वाई) दिशा (सेल के सामने से पीछे) में 3-आयामी पुनर्निर्मित FRET और cAMP छवि डेटा को रीसालिस करके उत्पन्न किया गया था। कॉलम 1 और 3 बेसलाइन पर FRET दक्षता का प्रतिनिधित्व करते हैं और क्रमशः 50 माइक्रोन फोरस्कोलिन उपचार के बाद 10 मिनट पर। कॉलम 2 और 4 बेसलाइन पर और फोर्स्कोलिन उपचार के 10 मिनट बाद सीएएमपी स्तर का प्रतिनिधित्व करते हैं। दाईं ओर रंग सलाखों का उपयोग कलरमैप में परिवर्तन को FRET दक्षता (शीर्ष) और सीएएमपी स्तर (नीचे) से संबंधित करने के लिए किया गया था। वाईजेड विमानों(चित्रा 8)के लिए दिखाए गए परिणामों के समान, FRET दक्षता और सीएएमपी स्तरों में बेसल स्थानिक ग्रेडिएंट के लिए एपीिकल को एक वाईजेड स्लाइस के ऊपर से नीचे तक रंग में परिवर्तन के रूप में कल्पना की जा सकती है, दोनों बेसलाइन स्थितियों (कॉलम 1-2 में किसी भी टुकड़े) और 50 एम फोर्स्कोलिन उपचार (कॉलम 3-4) के बाद। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक फाइलें। इन फाइलों को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

FRET बायोसेंसर के विकास ने एकल कोशिकाओं में चक्रीय न्यूक्लियोटाइड संकेतों के माप और दृश्य की अनुमति दी है, और उपकोशिक संकेत घटनाओं13, 22,37,38की कल्पना करने के लिए बहुत बड़ा वादा है। हालांकि, FRET बायोसेंसर का उपयोग कई सीमाएं प्रस्तुत करता है, जिसमें कई फ्लोरोसेंट प्रोटीन-आधारित FRET रिपोर्टर्स की कम सिग्नल-टू-शोर विशेषताएं और FRET रिपोर्टर्स की कमजोर ट्रांसफैक्शन या अभिव्यक्ति क्षमता शामिल है (यह विशेष रूप से कुछ सेल लाइनों में चुनौतीपूर्ण हो सकता है, जैसे पीएमवीईसी)23,24। कमजोर व्यक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन की इमेजिंग, अनुपातमेदित FRET गणना के साथ संयुक्त, अक्सर अनिश्चितता या गणना FRET दक्षता में उतार चढ़ाव के एक उच्च डिग्री में परिणाम है । FRET मापों की विश्वसनीयता में सुधार करने के प्रयास में, हमने और अन्य लोगों ने पहले वीआईएफटी संकेतों को मापने और फ्लोरोसेंट लेबल और ऑटोफ्लोरेसेंसप्रभाव26, 31, 32,39के बीच फ्लोरेसेंस संकेतों के माध्यम से क्रॉसटॉक या खून को कम करने के लिए हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग और विश्लेषण के उपयोग का प्रदर्शन किया है। संकेत शक्ति में सीमाओं के कारण, ये स्पेक्ट्रल FRET अध्ययन हाल ही में दो (एक्स और वाई) स्थानिक आयामों तक सीमित थे। इसलिए, उन्होंने एक सेल के भीतर FRET परिवर्तनों का एक टुकड़ा दृश्य प्रदान किया।

हाल के अध्ययनों में, हमने कहा कि FRET (और इसी cAMP स्तर) को न सिर्फ XY विमान में, बल्कि XZ और YZ विमानों में भी25वितरित किया गया । यहां वर्णित हाइपरस्पेक्ट्रल FRET इमेजिंग दृष्टिकोण तीन स्थानिक आयामों में परिवर्तन FRET और चक्रीय न्यूक्लियोटाइड (सीएएमपी) परिवर्तनों की कल्पना और उपाय करने की हमारी क्षमता को बढ़ाता है, जो सिग्नल कंपार्टमेंटलाइजेशन का आकलन करने के लिए नई संभावनाएं खोलता है। यह 4-आयामी (एक्स, वाई, जेड और λ) हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग और विश्लेषण दृष्टिकोण गैर-समान पृष्ठभूमि संकेतों के लिए लेखांकन करते हुए तीन स्थानिक आयामों में सीएएमपी ग्रेडिएंट्स के माप और दृश्य की अनुमति देता है। यहां, हमने प्रदर्शन किया है कि फोरस्कोलिन-प्रेरित cAMP स्थानिक ढाल के उदाहरण के माध्यम से इस दृष्टिकोण को कैसे लागू किया जाए। उपचार के बाद के छवि डेटा में, सीएएमपी स्थानिक ढाल को एपिकल से सेल के बेसल साइड(चित्र 7 और चित्रा 8)तक देखा जा सकता है। फोरस्कोलिन के साथ उपचार पर उत्पादित सीएएमपी सेल-सेल जंक्शनों(चित्र 7 और चित्रा 8)तक पहुंचने के लिए प्रकट नहीं हुआ।

यहां वर्णित पद्धति का उपयोग करने में, FRET क्षमता के सटीक अनुमान की अनुमति देने के लिए पृष्ठभूमि और ऑटोफ्लोरेसेंस संकेतों के विभिन्न स्रोतों का हिसाब करना महत्वपूर्ण था। रैखिक अनमिक्सिंग अद्वितीय पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रा के लिए लेखांकन के लिए एक संभावित अवसर प्रदान करता है, यदि उनके हस्ताक्षर ब्याज की फ्लोरोसेंट जांच से अलग हैं। विशेष रूप से, रैखिक अनमिक्सिंग मानक पृष्ठभूमि घटाव की तुलना में पृष्ठभूमि और ऑटोफ्लोरेसेंस संकेतों को अलग करने के लिए बेहतर अनुकूल है। 40,41,42 यहाँ दिखाए गए उदाहरण में, तीन अलग-अलग स्पेक्ट्रल हस्ताक्षरों को मापा गया और हस्ताक्षर की चरम उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के आधार पर एक नाम सौंपा गया: 424 एनएम पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रम (संभवतः कवरलिप फ्लोरेसेंस से), 504 एनएम पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रम (परावर्तित या पीछे बिखरे हुए प्रकाश के कारण होने की संभावना), और 574 एनएम पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रम (संभवतः सेल या सेलुलर मैट्रिक्स ऑटोफ्लोसेसेंस के कारण)। इन हस्ताक्षरों के लिए खाते में विफल रहने के प्रभाव को समझाने के लिए, दो स्पेक्ट्रल पुस्तकालयों का निर्माण किया गया था, और तुलना में अमिश्रित छवियां। सबसे पहले, एक स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी जिसमें नमूने में फ्लोरोसेंट लेबल, फ़िरोज़ा, वीनस और DRAQ5 शामिल हैं, को 3-घटक पुस्तकालय बनाया गया था और लेबल किया गया था। दूसरा, एक स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी जिसमें अतिरिक्त रूप से तीन पृष्ठभूमि स्पेक्ट्रल हस्ताक्षर शामिल थे, बनाया गया था और 6-घटक पुस्तकालय को लेबल किया गया था। जैसा कि ऊपर दिखाया गया है, 6-घटक पुस्तकालय (पृष्ठभूमि अनमिक्सिंग) के साथ अनमिक्सिंग ने पृष्ठभूमि संकेतों को हटाने की अनुमति दी, जबकि 3-घटक पुस्तकालय के साथ अनमिक्सिंग(चित्रा 9)नहीं था। पिछले काम में, हमने दिखाया है कि एक स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी का उपयोग करते समय रैखिक अनमिक्सिंग से जुड़े रूट का मतलब चुकता त्रुटि (आरएमएसई) कम हो जाता है जो फ्लोरोसेंट लेबल और पृष्ठभूमि हस्ताक्षर दोनों के लिए खाते हैं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस का अक्षीय वितरण अक्सर गैर-समान होता है और इसलिए, एक साधारण पृष्ठभूमि घटाव छवि डेटा को सही करने के लिए काम नहीं करेगा। इस प्रकार, सटीक पृष्ठभूमि हटाने और विश्वसनीय FRET माप प्रदान करने के लिए स्पेक्ट्रल अनमिक्सिंग दृष्टिकोण की आवश्यकता है।

स्पेक्ट्रल इमेज प्राप्त करते समय सर्वोत्तम संभव सिस्टम और कैमरा सेटिंग्स का चयन करने के लिए सिस्टम मापदंडों को अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है। कुल लक्ष्य अधिग्रहण समय को कम करते हुए और फोटोब्लैचिंग को रोकने के लिए एसएनआर को अनुकूलित करना होना चाहिए। 43 इमेजिंग सिस्टम को ऑप्टिमाइज़ करते समय, स्थानिक, लौकिक और स्पेक्ट्रल संकल्पों के बीच समझौता अक्सर चाहिए। इन अध्ययनों में, सिस्टम और कैमरा सेटिंग्स के लिए इष्टतम मूल्यों का चयन किया गया था जिसमें पिनहोल आकार, लेजर पावर, स्कैन गति, स्कैन आकार और प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित फ्रेम औसत शामिल हैं। इन सेटिंग्स का उपयोग करते हुए, 80 एनएम/पिक्सेल का स्थानिक नमूना, ~ 3 मिनट प्रति स्पेक्ट्रल जेड-स्टैक (~ 10 सेकंड/XY छवि) का अस्थायी नमूना और 10 एनएम अंतराल का स्पेक्ट्रल नमूना नगण्य या न्यूनतम फोटोब्लैचिंग के साथ प्राप्त किया जाता है।

FRET दक्षता के सटीक अनुमानों को सुनिश्चित करने के लिए, दाता और स्वीकारकर्ता स्पेक्ट्रा को मापना आवश्यक है क्योंकि 1:1 स्टोइचिओमेट्री और समान एक्सटिटेशन वेवलेंग(चित्रा 3)के साथ उनकी उम्मीद की जाएगी। फ़िरोज़ा और शुक्र स्पेक्ट्रा फ़िरोज़ा पीक उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के संबंध में सामान्यीकृत थे। इस स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी का उपयोग करके अनुमानित एफईआरटी दक्षता ने साहित्य में सूचित मूल्यों के समान मूल्यों का उत्पादन किया12,22. आमतौर पर, पुस्तकालय में एंडमेंबर स्पेक्ट्रा को एकता के लिए सामान्यीकृत किया जाता है। हालांकि, FRET दक्षता की सटीक गणना करने के लिए, स्वीकारकर्ता स्पेक्ट्रम दाता स्पेक्ट्रम (यानी, समानता एकाग्रता या 1:1 stoichiometry पर और एक ही उत्तेजन तरंग दैर्ध्य के संदर्भ में) के संबंध में प्राप्त किया जाना चाहिए। एक ठीक से निर्मित पुस्तकालय के उपयोग के अलावा, कई कदम FRET दक्षता और विश्लेषण कलाकृतियों के परिहार के उचित आकलन में शामिल हैं । इनमें पर्याप्त सिग्नल तीव्रता(चित्रा 11)के साथ एक एक्सप्रेसिंग सेल का चयन करना, FRET दक्षता का आकलन करने से पहले अनमिक्स्ड छवियों को चौरसाई करना (गॉसियन धुंधला इस उदाहरण में लागू किया गया था),मुखौटा (चित्रा 10)बनाने के लिए एक उपयुक्त सीमा मूल्य का उपयोग करके, और दाता और स्वीकारकर्ता (पूरक File_Spectral लाइब्रेरी) के विलुप्त होने वाले गुणांकों का उपयोग करके एक सुधार कारक का अनुमान शामिल है। जब इन चरणों का पालन किया जाता है, तो FRET दक्षता और अंतर्निहित सीएएमपी स्तरों के 3-आयामी वितरण को एकल कोशिकाओं में सटीक रूप से कल्पना की जा सकती है।

लक्षित वीआरटी बायोसेंसर13, 37का उपयोग करके 2-स्थानिक आयामों में स्थानीयकृत सीएएमपी संकेतों का अनुमान लगाया गया है। हालांकि, विशिष्ट उपकोशिकीय डिब्बों (उदाहरण के लिए, प्लाज्मा झिल्ली या लिपिड राफ्ट) के लिए FRET जांच को लक्षित करने से आम तौर पर जांच की स्थानीय एकाग्रता में वृद्धि होती है। इसके परिणामस्वरूप इंटरमॉलिकुलर या द्विमीय रूप से FRET के कारण शुरू की गई माप कलाकृतियों में परिणाम हो सकता है। इसके अलावा, यहां और एनामदेवुला et.al, 2018 में प्रस्तुत परिणाम, साइटोमेट्री ए25 घुलनशील या लक्षित जांच से FRET के 3-आयामी माप के महत्व को प्रदर्शित करता है।

तीन स्थानिक आयामों में cAMP संकेतों को मापने के महत्व के बावजूद, इस दृष्टिकोण की सीमाएं भी हैं। सबसे प्रतिबंधात्मक सीमा लंबे अधिग्रहण का समय आवश्यक है - लगभग 3 मिनट प्रति स्पेक्ट्रल जेड-स्टैक। यह अधिग्रहण दर अर्ध के अलावा किसी अन्य चीज का पता लगाने के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग करने में रोकती है - कोशिकाओं में स्थिर राज्य सीएएमपी वितरण। उस ने कहा, प्रस्तुत परिणाम अर्ध सहित के महत्व को प्रदर्शित करते हैं - स्थिर राज्य 3-आयामी (एक्स, वाई, जेड) सीएएएमपी माप मानक 2-आयामी (एक्स, वाई) माप के लिए महत्वपूर्ण पूरक के रूप में। भविष्य में यह प्रयोगात्मक डिजाइन में लेबल प्रोटीन और सेलुलर संरचनाओं को शामिल करने के लिए दिलचस्प होगा । प्रोटीन (और/या संरचनाओं) लेबल करने के लिए इस्तेमाल फ्लोरोफोरस के सावधान विकल्प अधिग्रहण की गति के अतिरिक्त नुकसान के बिना लेबल प्रोटीन और FRET के 3 आयामी वितरण के आकलन की अनुमति होगी । यह बदले में तीन स्थानिक आयामों में लेबल प्रोटीन के पास स्थानीयकृत सीएएएमपी संकेतों और सीएएमपी संकेतों के माप की अनुमति देगा, इस प्रकार लक्षित सीएएमपी जांच के लिए एक महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक पूरक की पेशकश करेगा और जीवित कोशिकाओं में 3-आयामी सीएएमपी वितरण के हाइपरस्पेक्ट्रल माप की उपयोगिता को और विस्तारित करेगा।

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Disclosures

डीआरएस लीस्ले और रिच एक स्टार्ट-अप कंपनी, स्पेक्ट्रासाइट, एलएलसी में वित्तीय हित का खुलासा करते हैं, जिसका गठन स्पेक्ट्रल इमेजिंग प्रौद्योगिकियों के व्यावसायीकरण के लिए किया गया था। हालांकि, इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी प्रक्रियाओं को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उत्पादों का उपयोग करके आयोजित किया गया था जो स्पेक्ट्रासाइट, एलएलसी से जुड़े नहीं थे।

Acknowledgments

लेखक ों को स्वीकार करना चाहते है डॉ Kees Jalink (नीदरलैंड कैंसर संस्थान और वैन Leeuwenhoek केंद्र उंनत माइक्रोस्कोपी, एम्स्टर्डम, नीदरलैंड) के लिए हमें H188 cAMP FRET बायोसेंसर और केनी Trinh (इंजीनियरिंग के कॉलेज, दक्षिण अलबामा विश्वविद्यालय) के साथ उपलब्ध कराने के लिए हमारे कस्टम विकसित स्क्रिप्ट प्रोग्रामिंग चलाने के लिए लिया समय को कम करने में तकनीकी मदद के लिए ।

लेखकों को धन स्रोतों को स्वीकार करना चाहते हैं: अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (16PRE27130004), राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Attofluor Cell Chamber Invitrogen A7816 Attofluor contains steel cell chambers and a rubber O-ring. Cell chamber holds the coverslip and O-ring provides a lock in mechanism to hold the buffer in cell chamber with out leakage
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific BP231-100 Solvent used to prepare stock solution forskolin.
DRAQ5 Fluoroscent Probe Solution Thermo Scientific 62252 Nuclear label
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965-092 Contains nutrients and growth factors for the cells to grow and divide in the culture dishes.
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F6178 Growth factor suppliment that is added to culture medium, DMEM
Forskolin Sigma F3917 Adenyly cyclase activator.
H188 Cyclic AMP FRET biosensor Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink Gift Plasmid encoding Turquoise (donor fluorophore), Venus (acceptor fluorophore), and binding domain obtained from Epac.
Image J image.net Free download Another image processing platform used to extact spectral information and image processing.
Integrating Sphere Ocean Optics FOIS-1 Used to measure illumination intensity of the laser line at different laser intensities (?).
Laminin Mouse Protein, Natural Invitrogen 23017-015 Coverslips are coated with laminin and this helps in cell attachment, growth and motility of the cell.
Lipofectamine 3000 Transfection Kit Invitrogen L3000-015 Transfection reagent used to transfect cells with H188 FRET biosensor
MATLAB Mathworks R2019a Image processing operations (linear unmixing and FRET efficiency calculations) are performed by writing custom programs in MATLAB programming environment
Nikon A1R confocal microscope Nikon Instruments Nikon A1R Spectral image acquisition is performed using confocal microscope.
Nikon Elements Software Nikon Instruments Software dongle used to export and handle nd2 image files (multidimensional image files) that are aquired using Nikon A1R
NIST-Traceable Calibration Lamp Ocean Optics LS-1-CAL-INT A lamp with a known spectrum for use as a standard
PBS pH 7.4 (1X) Gibco 10010-023 coomonly used buffer suring cell culture
Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs) In house - Cell culture core, Univeristy of South Alabama Isolated from Rat pulmonary microvasculature PMVECs form inner lining of a blood vessel.
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Gibco 15140-122 antibiotics are added to culture medum to prevent contamination of the cells.
Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides Clay Adams 3010 Microscope slides used for cell fixation
ProLong Diamond Antifade Mounting Media Invitrogen P36961 If samples are fixed using antifade mountant, then the later protects fluoroscent dyes and chromophores from fading.
Spectrometer Ocean Optics QE65000 Used to measure spectral response of the light source (?)
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200-056 Digests the protein-protein bond between the cell and cell matrix and helps to disscociate and lift the cells during cell plating.
Tyrodes Buffer Made in-house Made in-house Tyrodes buffer is used to make working solutions and to maintain cells in aqueous solution during image acquisition.
6 Well Cell Culture Plate Corning 3506 Laminin coated coverslips are placed in 6-well culture dish (one coverlisps/well). Cells along with medium is added into each well.
25 mm Round Microscope Cover Slips Fisher Scientific 12545102 Cells were grown on round glass coverslips
60X Ojective Nikon Instruments Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 water immersion and commonly used objective for cells

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References

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4-आयामी (एक्स, वाई, जेड और λ) हाइपरस्पेक्ट्रल FRET इमेजिंग और विश्लेषण का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं में 3-आयामी सीएएमपी वितरण का मापन
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Annamdevula, N. S., Sweat, R., Gunn, More

Annamdevula, N. S., Sweat, R., Gunn, H., Griswold, J. R., Britain, A. L., Rich, T. C., Leavesley, S. J. Measurement of 3-Dimensional cAMP Distributions in Living Cells using 4-Dimensional (x, y, z, and λ) Hyperspectral FRET Imaging and Analysis. J. Vis. Exp. (164), e61720, doi:10.3791/61720 (2020).

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