Summary
Fӧrster共鳴エネルギー伝達(FRET)ベースのセンサの信号対雑音比(SNR)が低いため、cAMP信号の測定は特に3つの空間次元において困難でした。ここでは、3つの空間次元でcAMP分布を測定できるハイパースペクトルFRETイメージングおよび解析方法論について述べる。
Abstract
サイクリックAMPは、細胞および生理活性の広い範囲に関与している第二のメッセンジャーです。いくつかの研究は、cAMP信号が区画化され、区画化がcAMPシグナル経路内のシグナル特異性に寄与することを示唆している。Fӧrster共鳴エネルギー伝達(FRET)ベースのバイオセンサーの開発は、細胞内のcAMP信号を測定し、可視化する能力を高めています。ただし、これらの測定値は、多くの場合、2 つの空間次元に限定され、データの誤解釈につながる可能性があります。これまで、3空間次元(x、y、z)でのcAMP信号の測定は非常に限られており、本質的に低信号対雑音比(SNR)を示すFRETセンサの使用に関する技術的な制限によりあります。さらに、従来のフィルタベースのイメージング手法は、スペクトルクロストーク、限定的な信号強度、自己蛍光などのさまざまな要因により、局在化した細胞下領域でcAMP信号を正確に測定するのには効果的でないことがよくあります。これらの制限を克服し、FRETベースのバイオセンサーを複数の蛍光ホルで使用できるようにするために、FRET効率を計算するためのスペクトル特異性と、FRET信号を同時交流自発および/または追加の蛍光標識からのシグナルからスペクトル的に分離する能力を提供するハイパースペクトルFRETイメージングおよび分析アプローチを開発しました。ここでは、ハイパースペクトルFRETイメージングを実装するための方法論と、スペクトルアンミックスを行うためにアンダーサンプリングもオーバーサンプリングもしない適切なスペクトルライブラリを構築する必要性を提示する。この方法論は、肺微小血管内皮細胞(PMVEC)における3次元cAMP分布の測定に用いるが、この方法論は、細胞タイプの範囲におけるcAMPの空間分布を研究するために使用することができる。
Introduction
環状アデノシン一リン酸(cAMP)は、細胞分裂、カルシウム流入、遺伝子転写、シグナル伝達を含む主要な細胞および生理学的プロセスに関与する第二のメッセンジャーである。証拠の成長体は、シグナル特異性が達成される細胞内のcAMPコンパートメントの存在を示唆しています1,2,3,4,5,6,7.最近まで、cAMP区画化は、異なるG結合受容体アゴニスト8、9、10、11によって誘発される明確な生理学的または細胞的効果に基づいて推測された。より最近では、FRETベース蛍光イメージングプローブは、細胞12、13、14におけるcAMP信号の直接測定および観察のための新しいアプローチを提供している。
フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)は、分子が近接15,16の場合にドナー分子とアクセプター分子間でエネルギー移動が起こる物理的現象である。FRETベース蛍光指標の開発に伴い、この物理現象は、タンパク質相互作用17、タンパク質共局在18、Ca+2シグナル伝達19、遺伝子発現20、細胞分裂21および環状ヌクレオチドシグナル伝達を研究する生物学的応用において使用されてきた。FRET ベースの cAMP 指標は、通常、cAMP 結合ドメイン、ドナーフルオロフォアおよびアクセプターフルオロフォア22から構成されます。例えば、この方法論で使用されるH188 cAMPセンサ12,22は、Epacから得られたcAMP結合ドメインから成り、ターコイズ(ドナー)と金星(アクセプター)フルオロフォアの間に挟まれる。基礎条件(非結合)では、ターコイズとヴィーナスは、蛍光色素間でFRETが発生するような向きである。結合ドメインにcAMPを結合すると、ターコイズとヴィーナスが離れて移動するような立体構造変化が起こり、FRETが減少する。
FRETベースのイメージングアプローチは、細胞内のcAMP信号を調査し、可視化するための有望なツールを提供します。しかし、現在のFRETベースの顕微鏡イメージング技術は、多くの場合、細胞内空間的明瞭度でFRETを測定するのに十分な信号強度を達成するのに部分的にしか成功していない。これは、多くのFRETレポーターの信号強度の制限、FRET効率の変化を正確に定量するために必要な高い精度、および細胞自家蛍光23、24などの交易因子の存在を含むいくつかの要因によるものである。その結果、多くの場合、弱いSNRに悩まされているFRET画像であり、FRETにおける細胞内変化の視覚化は非常に困難になります。さらに、空間的に局在したcAMP信号の調査は、ほぼ2つの空間次元でほぼ独占的に行われ、軸方向のcAMP分布はめったに25と考えられてはなされていない。これは、SNR が低いために cAMP 勾配を 3 つの空間次元で測定および視覚化する機能が妨げられたためです。低SNRを有するFRETセンサの使用の限界を克服するために、我々は、単一細胞25、26、27でFRETを測定するためのハイパースペクトルイメージングおよび分析アプローチを実施した。
ハイパースペクトルイメージングアプローチは、衛星画像28,29に存在する地上の物体を区別するためにNASAによって開発された。これらの技術は、その後、蛍光顕微鏡観察分野30に翻訳され、いくつかの商業的共焦点顕微鏡システムがスペクトル検出器を提供する。従来の(非スペクトル)蛍光イメージングでは、サンプルはバンドパスフィルタまたはレーザーラインを使用して励起され、発光は2番目のバンドパスフィルタを使用して収集され、フッ素フォロアのピーク発光波長に合わせて選択されることがよくあります。対照的に、ハイパースペクトルイメージングアプローチは、特定の波長間隔で蛍光発光26、31、32または励起33、34のいずれかの完全なスペクトルプロファイルをサンプリングすることを求める。我々のこれまでの研究では、ハイパースペクトルイメージングおよび解析アプローチは、従来のフィルタベースのFRETイメージング技術26と比較して、細胞内のFRET信号の定量化を改善できることを示した。ここでは、4次元(x、y、z、λ)ハイパースペクトルFRETイメージングおよび解析を行い、cAMP分布を3つの空間次元で測定および可視化する方法論を提示する。これらのアプローチは、単一細胞25におけるアゴニスト誘発cAMP空間勾配の可視化を可能にした。興味深いことに、アゴニストによっては、cAMP勾配が細胞内で明らかである可能性がある。ここで提示される方法論は、FRET測定の精度を向上させるために、不均一な背景および細胞自家蛍光のスペクトルの非混合を利用する。この方法論は、cAMP FRETバイオセンサーを用いた肺微小血管内皮細胞(PMVEC)で実証されているが、この方法論は、代替FRETレポーターまたは代替細胞株で使用するために容易に変更することができる。
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Protocol
このプロトコルは、南アラバマ大学の制度的動物の世話と使用委員会によって承認された手順に従います.
1. イメージング用の細胞、サンプル、試薬の準備
- ラット肺微小血管内皮細胞(PMVEC)を先に説明した35を単離する。
注:細胞は、100 mm細胞培養皿上のサウスアラバマ大学モバイル、ALの細胞培養コアによって単離され、培養されました。 - 25 mm丸ガラスカバーリップ上に分離したPMVECをシードし、細胞が少なくとも80%の合流性(少なくとも24時間)になるまで37°Cでインキュベーターで成長させます。
注:細胞と細胞の種類は研究によって異なる可能性があるため、細胞特異的な細胞培養手順は、細胞を播種および成長させるために従う必要があります。これらの研究で使用される細胞の播種および培養プロトコルは、「補足的なFile_Cell培養とトランスフェクション」という名前のファイルの補足情報として利用可能です。 - FRETバイオセンサーを用いたトランスフェクトPMVECを、37°Cで48時間インキュベートします。
注: PMVECs をトランスフェクトするプロトコルは、「補足的なFile_Cell文化とトランスフェクション」という補足情報ファイルにも記載されています。 - イメージングの日には、水浴中の37°Cにタイローデのバッファーを温めます。
注意: タイロードのバッファーは、145 mM NaCl、4 mM KCl、10 mM HEPES、10 mMグルコース、1 mM MgCl2および 1 mM CaCl2 から構成されています。 - トランスフェクションした細胞を含むカバースリップをセルチャンバーに取り付け、漏れを防ぐために取り付けガスケットで上部を固定します。
- 繊細な作業ワイプを使用してカバースリップの底を拭き取り、余分なメディアや接着細胞を洗浄します。
- 800 μL の作業バッファーと 4 μL の 5 mM 核ラベルをセルチャンバーに加え、5 ~ 10 秒間静かに揺れます。
注:細胞室に取り付けられたカバースリップにバッファーまたは試薬溶液を追加する場合は、接着細胞を外さないように、穏やかに細胞室の側面に溶液を追加してください。5 mMの核ラベルを800 μLのバッファに4 μL加えると、25 μM の最終濃度の核ラベルが作成されます。HEK293細胞のような緩やかに付着した細胞の場合、最初にバイアルに核ラベルとバッファを混ぜ、次に細胞室に取り付けられたカバースリップに加えます。これにより、カバースリップから細胞を持ち上げないようにします。 - セルチャンバーをアルミホイルで覆い、光から保護し、室温で10分間インキュベートします。
- 試薬の準備:199 μLのバッファーに50 mMフォルスコリンを1 μL加えます。これは800 μLのバッファーで調製された細胞に加えた場合50 μMのフォルスコリンの最終濃度を生成します。199 μL のバッファで 1 μL の DMSO を車両制御として使用できるように準備する必要があります。
注: これらの研究で, フォルスコリンは、cAMP の生産を刺激するアデニルシクラーゼ活性化剤として使用されます。.必要に応じて、この方法論は、アデニルシクラーゼ、ホスホジエステラーゼなどを刺激または阻害するための代替試薬による治療を容易に変更することができる。
2. 画像取得
- スペクトル検出器を搭載した共焦点顕微鏡を使用してください。
注:ここで概説されているすべての画像取得手順は、市販のニコンA1R顕微鏡システムを使用して開発されました。代替スペクトル顕微鏡を使用する場合、これらのステップを調整する必要があります。安定した動作条件に達するために、実験開始の少なくとも30分前にすべての機器の電源が入っていることを確認してください。 - 60倍の水浸漬目的を選択し、目的に水滴を追加します。
メモ: 高解像度のライブセルイメージングの場合は、高い開口の目的を使用することをお勧めします。これらの研究で使用される目的については、資料一覧を参照してください。 - 積まれた細胞チャンバー(ステップ1.7から)を顕微鏡のステージに置きます。
- 顕微鏡の右側にあるフィルターノブを調整して、DFT(DAPI/FITC/TRITC)フィルタセットを選択します。
- 眼球を使用して蛍光ワイドフィールドモードで顕微鏡を操作し、cAMP FRETセンサーを発現する細胞を含む視野を選択します。
注:選択したセルのドナーまたはアクセプター発光ピーク波長におけるFRET信号の平均強度が、発現細胞のない領域の少なくとも100の強度単位(A.U.)または少なくとも4倍のベースライン信号であることを確認してください。これは、NISエレメントソフトウェアで利用可能なスペクトルプロファイルビューアを使用して確認することができます。シグナルが良いセルを探す場合は、過度に明るいセルを破棄することをお勧めします(危険にさらされる可能性があります)。 - NISソフトウェアを開き、共焦点モードに切り替え、レーザーインターロックボタンのロックを解除し、 ライブをクリックします。
- フォーカスノブを使用して、画面上のプレビューを見てセルに焦点を当てます。
- 以下に説明するとおり、ソフトウェアでデバイス、取得、および Z スタックの設定を構成します。
- 取得設定:
注意:カメラとデバイスの取得設定は、以前に取得した画像を使用して適用することができます。イメージを開き、右クリックして [ カメラ設定を再利用]を選択します。- A1 設定メニューを開き、405 nm および 561 nm レーザーラインに対応するチェックボックスをオンにし、スペクトル検出器の SD を選択し、解像度として 10、チャンネルに 31 を選択します。
注:A1設定メニューは、A1プラス設定ウィンドウの左上隅に小さな歯車アイコンとして表示されます。405 nmレーザーはドナー励起に使用され、561 nmレーザーは核ラベル励起に使用される。 - 始点と終了波長の値を選択して、波長範囲(410~730 nm)を設定します。
- A1 設定メニューのビン分割/スキップアイコンをクリックし、15 の番号が付いたボックスを選択してから、A1 設定メニューで [OK] をクリックします。
注:これは、561 nmの励起レーザに対応する波長チャネルを除去することです(これは通常、15番目 の波長チャネルです)。この波長バンドを使用して、スペクトルアーティファクトを生み出す人工的に低い信号を避けることは重要です。このバンドでは、レーザー損傷から保護するために検出器要素をカバーする機械的な指のために、信号が低くなります。 - 405 nm および 561 nm レーザーのレーザー強度を 8% と 2% に設定し、それぞれ 149 の Si Hv (検出器ゲイン) と 2.4 風通しのディスクユニット (AU) のピンホール半径を設定します。
注:レーザー強度は、機器の年齢とレーザーの状態に応じて調整する必要があります。異なるサンプルまたは実験群間でレーザー強度を調整する場合、レーザー強度の同じ比率(例えば、8:2)を維持することが重要です。さらに、急速な光の漂白を作成するほど明るくないレーザー強度を選択することが重要です。検出器のゲインは、検出器のノイズを最小限に抑えながら信号強度を最大化するように調整する必要があります。これらの研究のために、149の利益が使用された。ピンホールサイズ2.4 AUは、十分な信号対雑音比(SNR)を持つ画像を取得することと、光断面(共焦点性)を維持することとのバランスとして選択されました。ピンホールサイズを大きくするとSNRは増加しますが、共焦点性は低下します。 - スキャン速度を 1 秒あたり 0.25 スペクトル フレームに設定し、スキャン方向の単方向に対応するアイコンを選択し、カウントに 4 と入力し、スキャン サイズに 1024 x 1024 を設定します。
注: FRET 信号は弱く、低速スキャン速度が必要な場合が多いです。0.25のスキャン速度を使用して、スペクトルzスタックの取得は約3分で完了する。スキャン速度は、使用される蛍光器に応じて増加または減少させることができます。例えば、eGFPのような明るい蛍光色素の場合、スキャン速度が速くなる(2フレーム/秒)が使用できます。カウントの下で入力された数は、フレーム平均値 4 に対応し、画像取得時のノイズ低減に役立ちます。非常に安定したサンプルで、時間が制約ではない場合、より高い平均値(最大16)を使用して、SNRが改善された画像を取得できます。
- A1 設定メニューを開き、405 nm および 561 nm レーザーラインに対応するチェックボックスをオンにし、スペクトル検出器の SD を選択し、解像度として 10、チャンネルに 31 を選択します。
- z スタック取得パラメータを定義します。
注:ステップ2.10で入力した値は、蛍光標識の結合または濃度、ラベルの種類、使用するラベルの数、細胞株、および細胞標識密度および/または細胞自家蛍光に影響を与える可能性のあるサンプル調製のその他の変化の変化に対応するために調整する必要があります。取得パラメータを調整する場合は、フォトブリーチを最小限に抑えながら、十分なSNRを達成するように注意する必要があります。さらに、スペクトルFRETアッセイを構成する際には、すべての治療群でパラメータがうまく機能するように注意する必要があります。SNRが十分であり、フォトブリーチが最小限に抑ことを確認するために、提案されたパラメータ設定を用いて各治療グループの試験を実行することをお勧めします。- ND 取得コントロールの 表示 をクリックして ND 取得 ウィンドウ →→開きます。
- パス/宛先とファイル名を入力して、NDファイルをポップアップウィンドウに保存します。
- z 系列に対応するボックスをオンにします。
- A1 Plus設定ウィンドウで ライブ をクリックします。ライブ表示ウィンドウが開きます。
- 顕微鏡のフォーカスノブを調整してセルの上部を選択し、ND取得ウィンドウで [上 ]をクリックして現在位置をトップに設定します。
注: セルの上部に少し焦点を合わせると、すべてのセルが z 系列でサンプリングされるようにすることをお勧めします。 - 顕微鏡のフォーカスノブを調整してセルの底部を選択し、ND取得ウィンドウの [下部 ]をクリックして現在位置を底部に設定します。
注: セルの下部に少し下にフォーカスを設定して、すべてのセルがサンプリングされるようにします。 - ステップサイズに1μmを入力し、z-スキャン方向の上底を選択し、NDアクイジションウィンドウで 実行 をクリックしてZスタックを取得します。
注: ステップサイズは、上と下の位置(つまり、移動距離)に応じて取得されるzスライスの数を決定します。1 μmのステップサイズは、撮像速度、Z軸サンプリング、およびフォトブリーチの間の妥協点として選択されました。2.4 AUの共焦点ピンホール径と60倍の水浸し目的を使用して、光学断面厚は1.73 μmでした。したがって、1 μmのステップサイズはナイキストのサンプリング基準をわずかに下回っていますが、これはZスタックの獲得に必要な時間を短縮するために行われた妥協点です。非常に安定したサンプルでは、速度が重要ではないため、Z軸のステップが小さくなり、場合によっては小さな共焦点ピンホール径を使用して Z 軸の分解能を高める場合があります。ボトムトップは同様の結果を得る必要があり、zスキャン中に発生する可能性のあるフォトブリーチの影響を評価するために使用できます。
- パーフェクト・フォーカス・システム (PFS) をセットアップします (可能な場合)。
注: PFS では、画像取得中に焦点深度の変動を補正することができます。次の手順は PFS のセットアップに使用することができ、これらの手順は、ニコン A1R のバージョンと使用する NIS 要素のバージョンによって若干異なる場合があります。- ND取得ウィンドウの範囲アイコンで定義された対称モードをハイライト表示します。
- 顕微鏡の前面にあるPFSボタンをオンにします(サンプルステージの下のセクションにある二色性ミラーノブが'in'であることを確認してください)。
- PFSオフセットコントローラの前面のノブを使用して、上面(反時計回りに回転)と下面(時計回りに回転)を再定義します。
- ND取得ウィンドウで「相対」をクリックして、相対Z位置/Z深度を定義します。
- ソフトウェアが相対的なZ深さを記憶するように、顕微鏡の前面のメモリをクリックします。
- zスタックの取得が完了したら、ピペットを使用して目的の試薬(フォルスコリンまたは車両制御)を静かに加え、10分間待ちます。
注:細胞を乱したり、顕微鏡XY段階内の細胞チャンバーの位置を移動しないように、試薬を非常に穏やかに追加します。後続のライブビューまたは画像で、試薬の添加中に視野がずれていないことを確認すると便利です。10分の待ち時間は、フォルスコリン治療が有効にすることです。代替治療を使用する場合は、待ち時間を調整する必要があります。 - 10 分後に、ファイル名を変更し、ND 取得ウィンドウで 実行 をクリックします。
- 統計分析に十分な結果を得るために、上記のステップ 2.11 ~ 2.13 を少なくとも 5 つのカバーリップに対して繰り返して、(各処理グループの n =5 - フォルスコリンと車両制御) を実行します。
- サンプルとサンプルブランクを準備してスペクトルライブラリを構築し、手順2.9と2.10で説明した同様の取得設定を使用してスペクトル画像を取得します。
3. 画像解析
注:これらの画像は、研究に存在するすべての個々のエンドメンバーの純粋なスペクトルを含むスペクトルライブラリを構築するために使用されます。スペクトルライブラリのエンドメンバーは、異なる蛍光ホルを使用する場合、研究によって異なる場合があります。スペクトルライブラリを構築するための詳細な手順は、「補足File_Spectralライブラリ」という名前の補足情報ファイルで提供されています。ここでは、.tiffファイルへのデータのエクスポート、線形スペクトル非混合、FRET効率測定、3次元再構成、およびcAMPレベル推定について述べています。画像解析は、ImageJ、Python、MATLAB、CellProfiler などの異なる画像解析およびプログラミング プラットフォームを使用して実行できます。これらの研究では、MATLABスクリプトが使用されました。
- イメージ データをエクスポートする:
- ステップ 2.13 および 2.14 で取得したスペクトル Z スタックイメージに対応する同じファイル名で新しいフォルダを作成します。
注: データをエクスポートする手順は、NIS 要素 AR バージョン 4.30.01 に固有の手順です。これらの手順は、ソフトウェアのバージョンによって若干異なる場合があります。 - [ ファイル] をクリックすると、ファイル ウィンドウが開きます。ステップ 2.12 で取得したスペクトル画像ファイルを参照して選択し、 開くをクリックします。
- ファイルが読み込まれたら、[ ファイル→ インポート/エクスポート→ ND ドキュメントのエクスポート] をクリックします。
- ポップアップウィンドウで、ステップ3.1.1で作成したフォルダを参照して選択し、[ファイルタイプ]にタグ付き画像フォーマット(TIF)を選択し、 各チャンネルのモノラル画像 と ビット深度を保持を選択します。
注: ファイルプレフィックスは事前に生成されます。便宜上、この値を変更します。インデックスの順序は、選択されているチャンネルによって変わり、zスライスの位置が最初に、波長バンド数秒に従ってインデックスを作成する場合は「z,c」と表示されます。[LUTを適用]または[オーバーレイを挿入]または[ポイント名を使用]に対応するボックスが選択解除されていることを確認します。 - [ エクスポート ] をクリックして、tiff ファイルを個別の tiff ファイルとしてエクスポート先フォルダにエクスポートします。
- ステップ 2.1.2 ~ 3.1.5 を繰り返して、ステップ 2.13 で取得したスペクトル画像ファイルをエクスポートします。
- ステップ 2.13 および 2.14 で取得したスペクトル Z スタックイメージに対応する同じファイル名で新しいフォルダを作成します。
- 線形スペクトルの混合解除:
- プログラミング ソフトウェアを開きます。
注:生のスペクトル画像をアンミックスするカスタム開発プログラミングスクリプトは、サウスアラバマ大学BioImagingとBioSystemsのウェブサイトで、リソースタブ(https://www.southalabama.edu/centers/bioimaging/resources.html)の下に提供されています。 - 「リニアアンミックス.m」というラベルの付いたファイルを開き、エディタツールバーの 実行 ボタンをクリックします。
- NIS Elements ソフトウェアによって生成されたエクスポートされた *.tif ファイル シーケンスを含むフォルダーを参照して選択します。
- [OK] をクリックして続行すると、新しいウィンドウが[波長] と [Z スライス]と呼ばれるウィンドウが開きます。
- ステップ 3.2.4 で選択したフォルダの最初のファイル(Z スライスとチャンネル番号を除く)のファイル名をコピーし、ダイアログボックスの最初のステップに「イメージ名を入力してください」と貼り付けます。
- 「波長バンドの数を入力してください」とラベル付けされた2番目のステップのチャンネル数を入力し、「Zスライスの数を入力してください」とラベル付けされた3番目のステップのZスライスの数を入力し 、[OK]をクリックします。
注: 波長範囲や波長ステップサイズの調整など、取得設定を変更すると、波長バンド数が変わることがあります。Z スライスの数もセルの高さに応じて変わる場合があります。 - 「波長情報ファイルを選択」というラベルの付いたポップアップウィンドウで「波長.mat」という波長ファイルを参照して選択し、 開くをクリックします。
- 「スペクトルライブラリファイルを選択」というラベルの付いた新しいポップアップウィンドウで「Library.mat」ファイルを参照して選択し、 開く をクリックしてスライスのアンミックスが完了するまで待ちます。
注:Library.matファイルは、細胞自家蛍光およびバックグラウンドスペクトルシグネチャと一緒に各エンドメンバーフルオロフォアのための純粋なスペクトルを含むファイルです。この場合、エンドメンバーの蛍光色素はターコイズ、ヴィーナス、DRAQ5を含む。背景スペクトルシグネチャには、細胞またはマトリックス自己蛍光、カバースリップ蛍光、カバースリップ回折などがあります。波長.matファイルは、スペクトル画像を取得するために使用される波長チャネル情報を含むファイルです。サンプルライブラリファイルと波長ファイルは、バイオイメージングとバイオシステムズのウェブサイトで入手できます(3.2.1の下のノートを参照)。スペクトルライブラリと波長ファイルの生成方法については、「補足File_Spectralライブラリ」という補足情報ファイルを参照してください。各 z スライスに対応する混合されていないイメージは、ステップ 3.2.3 で選択したフォルダー内の非混合プロセス中に作成された「Unmixed」というフォルダーに保存されます。
- プログラミング ソフトウェアを開きます。
- フレット効率計算:
- "multiFRRCF.m" というプログラム スクリプトを開き、[ 実行] をクリックします。
注:このプログラミングファイルは、サウスアラバマ大学バイオイメージングとバイオシステムズのウェブサイトから入手できます(ステップ3.2.1の下のメモを参照)。 - 「再スライスするフォルダの数」というポップアップダイアログボックスに、分析する実験試験の数を入力し 、[OK]をクリックします。
注: 各実験の画像データは、別の混合されていない画像フォルダに保存する必要があります。この手順では、時間を節約する手順として、分析コードが多数のフォルダをループ処理できます。 - 混在していないフォルダを参照して選択し 、[OK]をクリックします。
注: 「フォルダの参照」ポップアップウィンドウが開く回数は、前の手順で[再スライスするフォルダの数]ダイアログ ボックスに入力した数によって異なります。フォルダを参照して選択します。 - 新しいポップアップウィンドウで、それぞれのボックスに次の情報を入力します:スケーリング係数は12.4、しきい値は5.6、X、Y、Z周波数はそれぞれ5、5、および1であり、平滑化アルゴリズムはガウスです。
注: スケーリング係数はピクセル/μm の値で、Z 方向サンプリングを XY 方向の値にスケーリングするために使用されます。拡大縮小係数は、画像ピクセルサイズから取得され、通常はほとんどの共焦点顕微鏡システムの画像内でメタデータとして提供されます。たとえば、0.08 μm/ピクセル間隔で画像を取得する場合、スケーリング係数は 12.5 ピクセル/μm にする必要があります。しきい値は、画像をしきい値にし、セルのバイナリマスクを生成するために使用されます。画像ドナー+アクサクサの強度に基づいて、最適値のリストを作成しました。画像の明るいドナー+アクセクサ強度と背景が低い場合はしきい値として4.5を使用し、中程度のドナー+アクセクサ強度および/または高い背景を持つ画像の場合は5.6~6.5の値、背景よりも低いドナー+アクセクサ強度を持つ画像の場合は7.5以上の値を使用します。周波数の値は、スライスが後続のステップで実行される間隔 (ピクセル数) に対応します。たとえば、セルの Z 深度が 1 μm のステップ サイズで 17 μm、XY 方向に 12.5 ピクセル/μm のスケーリング係数が使用されている場合、3 次元画像データセットの深さは 212 ピクセル (Z 方向) でリサンプリングされます。入力された Z 周波数値 (1 ピクセルなど) に基づいて、3 次元イメージ データ セットは、イメージ データセットの先頭から再スライスされ、1 ピクセル下に移動します。これにより、212 の再スライスされたイメージが作成されます。[Z 周波数] に周波数値の間隔を大きくする場合は、再スライスされたイメージの数が少なくなります。再スライスされたイメージは、以降の手順で保存されます。 - 実行 を クリックし、すべてのFRET測定と複製が実行されるまで待ちます。
注: 別のフォルダは、グレースケール FRET 効率イメージを再スライスし、色付き (カラーマップが適用) FRET 効率イメージを保存する親ディレクトリ内に作成されます。たとえば、X 方向(YZ 平面)で再スライスされたすべてのグレースケールおよびカラーマップ FRET イメージは、"Resliced_XFRET" というフォルダに保存されます。 - フォルスコリン処理と車両制御の前後のすべての実験に対して、同様の設定で分析を繰り返します。
注: セクション 3.3 で説明するステップでは、3 次元の FRET 画像データを生成するカスタム FRET 解析プログラミング スクリプトに入力する値について説明します。ただし、このスクリプトは、イメージ データの読み込み、イメージ スタックの作成、スムージング、FRET 効率の計算、セルの境界マスクの作成と適用、3 次元イメージの再構築、指定した間隔 (周波数) での 3 次元イメージの再利用、FRET の変更を視覚化するためのカラーマップの適用、再スライスされたイメージ データの同じディレクトリへの保存など、いくつかの操作を実行します。プログラム スクリプトには、コメントとして追加の詳細が含まれています。
- "multiFRRCF.m" というプログラム スクリプトを開き、[ 実行] をクリックします。
4. FRET効率をcAMPレベルにマッピング
- 'Mapping_FRET Efficiency_to_cAMP_concentration.m'という名前のプログラミングファイルを開き、メインウィンドウで 実行 をクリックします。
注:ファイルは、バイオイメージングとバイオシステムのウェブサイトで入手できます(3.2.1の下の注意を参照)。このファイルは、グレースケールのFRET効率画像を読み取り、特性曲線に基づいてcAMPレベルに変換します。この特徴的な曲線は、ヒル方程式(以下に示す第3の式)で記述されている文献15、36に記載されているcAMP-fret関係を使用する。しかし、無傷の細胞内のプローブのKdは推定が難しく、計算では1μMと仮定しています。したがって、結果は Kdの関数として表示されます。(つまり、[cAMP] = x* Kd)。FRET 効率を測定し、FRET を cAMP レベルにマッピングするために使用される式を以下に示します。
ここでEはFRET効率であり、明らかなとdは、それぞれアクセクターとドナー画像の混合ピクセル強度です。
QaおよびQdは、アクサクサおよびドナーの量子収量である。なお、Kλの式がFRET効率式に組み込まれる場合、QaおよびQdはキャンセルされ、kλは補正係数です。
ドナー励起波長でドナーとアクセクサの絶滅係数である、i(405nm)。 
EはFRET効率であり、KD=解離定数=1μMである。 - 最初のグレースケールのFRETイメージ(ステップ3.3.5で保存)をナビゲートして選択し、[OK]をクリックします。
- FRET/cAMP画像を開いて、cAMP信号の分布を3次元で検査します。
ドナー励起波長でドナーとアクセクサの絶滅係数である、i(405nm)。 
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Representative Results
このプロトコルは、ハイパースペクトルFRETイメージングの使用と、生細胞における3つの空間次元におけるcAMP勾配を測定するための分析アプローチについて説明する。これらの結果の生成には、データの分析と定量を行う際に細心の注意が必要な重要なステップがいくつかあります。これらの主要なステップには、適切なスペクトルライブラリの構築、バックグラウンドスペクトルの非混合、セル境界を識別するためのしきい値、FRET効率計算などがあります。 図1 は、生細胞におけるFRET効率およびcAMPレベルの測定に関与するすべてのステップの概略的な流れを示す。これらのイメージングと解析のステップを適切に実行すると、FRET効率の測定と、非均一なバックグラウンド信号を考慮しながら、セル内の3次元のcAMP空間勾配の推定が可能になります。
図2 は、基準条件でニコンA1R共焦点顕微鏡を用いて取得した偽色の生ハイパースペクトル画像データの3次元図(図2A)及び10分後(図2B)フォルスコリン処理を示す。同様の検出器とシステムパラメータを使用して、定量分析のために一貫性を保つために、処理前と後の画像スタックを取得することに注意してください。また、FRET の効率を計算する前に、これは純粋に生データの視覚化であるため、FRET の変化は、このイメージでは明らかではありません。
生のスペクトル画像データをさらに解析するには、すべてのエンドメンバーの純粋なスペクトルを持つスペクトルライブラリが必要です。適切なスペクトルライブラリを構築することは、FRET効率の適切な測定を確実にするための重要なステップの1つです。図 3は、エンドメンバーの純粋なスペクトルを含むスペクトル ライブラリの構築を示しています (現在の研究では、エンドメンバーはターコイズ、ヴィーナス、DRAQ5 です)。FRET効率を測定するには、1:1のサンプルを使用してターコイズとヴィーナスのスペクトルを得ることが重要です。ここでは、アクセクサフルオロフォアが完全に写真破壊され、1:1ストイチオメトリーを持つドナーとアクセクサのスペクトルシグネチャが得られるアプローチを提供しました(図3A-F)。また、レーザー間の線形電力関係(補足図1)は、ドナー励起レーザーを用いて励起された場合に期待される強度でアクセプタスペクトルを計算するために適用された(この場合はターコイズ用405nm(図3G)。これにより、FRETが単一の405 nmレーザーラインで励起される場合、混合されていないドナーとアクソクサの信号が絶対強度で同等であることを保証します。核色素で標識された非トランスフェクト細胞は、DRAQ5(図3H)を利用してDRAQ5の純粋なスペクトルを得た(図3I)。ドナーのスペクトルを組み合わせることで、ターコイズ(図3F)、アクセプター、ビーナス(図3G)、DRAQ5(図3I)を組み合わせて、3成分ライブラリを作成した(図3J)。
蛍光標識以外のソースからのシグナルもサンプル中に存在してもよい。これらを説明するために、424 nm、504 nm、および574 nmで発生するピークを持つ3つの異なるスペクトルシグネチャが、ラベルなしの細胞サンプル内で同定された。これらのスペクトルシグネチャは、カバースリップ反射率と細胞マトリックスまたは細胞自己蛍光に対応すると考えています。 図 4 は、これら 3 つの背景スペクトル シグネチャのソースを示しています。これらの信号はサンプル内で不均一に分布しているため、単純に減算することはできません。しかし、これらの信号のスペクトルシグネチャをスペクトルライブラリに追加し、線形非混合を使用して信号を分離すると、FRET効率を計算する前にドナーとアクセクサ信号からこれらの交交する信号を除去するアプローチが提示されます。これを達成するために、3つの背景スペクトルシグネチャを3成分スペクトルライブラリに追加し、ドナー(ターコイズ)、アクセプター(金星)、DRAQ5、および3つのバックグラウンドスペクトルシグネチャからなる新しい6成分ライブラリを形成しました。
スペクトル画像データを個々のエンドメンバーにミックス解除するカスタムプログラミングスクリプトが作成され、FRET効率計算を続けるために別のスクリプトが作成されました。線形スペクトル非混合(図5を参照)は、6成分スペクトルライブラリを使用して行った。アンミックスは、軸方向画像スタック内の各スライスに対して、zスタックとも呼ばれる(図5Aの生スペクトル画像データの3次元可視化を参照)その結果、z スタック内の z スライスごとに、エンドメンバーごとに別々の混合されていないイメージが生じ、その結果、各エンドメンバーが異なっています (図 5C–E、背景の混合されていない画像は表示されません)。必要に応じて、混合されていない信号は、それぞれの混合されていない信号に異なる色を割り当てた可視化のために偽色で表示される場合があります(図5F-H)。
図 6 は、FRET 効率計算に関連するステップと、FRET 効率を cAMP レベルにマッピングするステップを示しています。フレット効率画像は、平滑化されていない混合ドナーとアクセクサ画像を使用して生成されました。バイナリマスク画像は、混合されていないドナー、アクサクサ、および核画像を使用して取得された。マスクは、細胞外のピクセルから寄与を除去するために、FRET効率画像に適用されました。FRET効率測定の図示デモには、単一のzスライスからの混合画像が使用されましたが、これらの計算は3次元画像スタック内の各スライスに対して実行されました。3次元FRET画像データセットは、次に3つの直交面で再スライスされ、異なる方向のcAMP信号の空間的勾配を視覚化しました。
FRET効率とcAMPレベルにおけるアゴニストによる変化の可視化
上述のステップは、3つの空間次元でのハイパースペクトル画像データからFRET効率およびcAMPレベルを計算する方法を提供する。これらのステップは、フォルスコリンのようなcAMP応答を引き出す化合物で処理の前後の細胞製剤に適用することができる。ここでは、このアプローチを用いて、50 μMフォルスコリンによる処理後のPMVECにおけるFRETおよびcAMP分布の変化を観察する例を示します。 図7 は、異なるXY平面スライス(zスライス)におけるFRET効率およびcAMPレベルの変化を、補助的なものから基底まで、ベースライン条件(フォルスコリン処理前)および10分後処理の比較を可能にする。この例例では、FRET効率が低下した( 図7のカラム1および3)フォルスコリン処理の際に、cAMPレベルの増加に関連する( 図7の列2および4)。単一のXY平面内のcAMPの最小空間変動が観察された。しかし、アピカルスライスがフォルスコリン処理後の基底スライスよりも深い赤色(適用されたカラールックアップテーブルを通して高いcAMPレベルを示す)を有することに注意して推測できるように、軸方向(補助的から基底)cAMP空間勾配が観察された( 図7の列4)。軸フレットまたは cAMP 分布は、2 つの直交空間平面から得られた画像を使用してよく視覚化できる場合が多く、 図 8 は、YZ 平面の FRET 効率と cAMP レベルをベースライン (列 1 および 2 列) および forskolin 処理後 10 分 (列 3 および 4) で示し、 補足図 2 は、XZ 平面における FRET 効率と cAMP レベルの変化を示しています。これらの結果は、3次元ハイパースペクトル画像データからFRETを測定し、cAMPレベルを推定する可能性を示し、またFRETまたはcAMPの軸分布を視覚化することの重要性を示す。この方法論的論文の範囲を超えて、環状ヌクレオチドの軸方向空間分布が環状ヌクレオチドシグナル伝達経路内の特異性に寄与することがある。
上記の方法を実行する場合、ステップの精度を細心の注意を払ってチェックし、適切な実験的および車両制御を実行して、FRET(および対応するcAMP)の変化がドナーおよびアクセプター信号の実際の変化によるものであり、アーティファクトをイメージングしていないことを確認することが重要です。たとえば、考慮すべき重要な手順は次のとおりです。
必要なすべてのスペクトルコンポーネントを含む適切なスペクトルライブラリの使用
前述のように、細胞の自己蛍光、堆積マトリックス、またはカバースリップからの反射光(励起放出ブリードスルー)からのバックグラウンド信号の有意な寄与がある可能性があります。 図9 は、スペクトルデータの混合解除に3成分(ターコイズ、ヴィーナス、DRAQ5)ライブラリを使用した場合に背景信号が画像内に保持されたことを示すデータセットの例を表しています。対照的に、バックグラウンド信号は、より完全な(そして適切な)6成分スペクトルライブラリを使用した場合に効果的に除去された。
最適なしきい値を使用してセル・マスクを生成する
我々が行った多くの実験において、バックグラウンド信号強度は、生スペクトル画像データ内に存在するFRET信号強度の約50〜60%である(すなわち、未処理のスペクトル画像データを可視化する場合、FRET信号のピークは周囲のバックグラウンド信号のピークよりも〜2倍高い)。したがって、バイナリマスクを得るために閾値を使用してフォアグラウンド信号からバックグラウンド信号を分離することは、敏感なステップであり、分析アーティファクトを避けるために慎重に行わなければならない。 図 10 は、セルのバイナリー・マスクを作成するために、セル・セグメンテーションに適用されるさまざまなしきい値の効果を示しています。低い閾値は、発現セルの一部としてバックグラウンド信号を含み得る。一方、閾値が高過ぎ、低発現細胞または低供与体+アクセプターシグナルを有する細胞の領域(FRETプローブの局所濃度が低い細胞または部分の非常に薄い部分)におけるFRETの測定を妨げる可能性がある。
バックグラウンド信号のドナー+アクセクサ信号強度≥トランスフェクトされた細胞の選択
図11 は、6成分スペクトルライブラリを用いて得られた非混合画像からFRET効率および対応するレベルを測定したデータセットの例を示す。6成分ライブラリを使用してスペクトル画像データをアンミックスし、セル境界と核マスクを作成するための高い閾値を選択したにもかかわらず、FRET効率画像は依然として細胞の基底側付近で高いバックグラウンドノイズ信号を受けやすかった。この場合、バックグラウンドノイズの存在は、FRETプローブを弱く発現しただけの細胞の選択によるもので、ドナー+アクセクサ信号強度は、混合解除後もバックグラウンド信号強度とほぼ同じであった。したがって、上述の高度な分析ステップを適用することに加えて、高品質の結果を確保するためには、FRETプローブの十分な発現を有するセルを選択し、かつ、高い品質を確保するために、取得時に十分なFRET信号(ドナーおよびアクセクサ信号が少なくとも同等以上のノイズ信号)を選択することも重要である。
図1:FRETの効率とレベル測定に関わるステップを、ハイパースペクトルFRETイメージングと解析を用いた3つの空間次元で示したフローチャート。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:cAMP FRETレポーター(緑色)と細胞および周囲の非発現細胞(赤色)からの核を発現する細胞の3次元可視化。ニコンA1Rスペクトル共焦点顕微鏡を用いて取得した生スペクトル画像データは、波長に応じて偽色化され、NIS Elementsソフトウェアを用いて3次元で可視化されています。A)ベースラインおよびB)50 μMフォルスコリン処理後10分の3次元画像データ。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:研究における蛍光標識の純粋スペクトルを含むスペクトルライブラリの構築(リモートセンシング分野によるエンドメンバーと呼ぶ)。A)405nm励起(ドナー励起)で取得したFRETバイオセンサーを発現する細胞の偽色画像。B) FRET信号に対応するスペクトル:4つの異なる関心領域(ROI)が、赤、黄、青、緑の長方形で示された画像Aに描かれた。選択したROIごとに各波長の平均強度をエクスポートした。これらの4つのROIからの平均強度を各発光波長でプロットした。スペクトルの放射ピークは、ドナー(ターコイズ)とアクセプター(金星)蛍光色素の両方に対応しています。C)488nmの励起(アクセプター励起)で取得したFRETバイオセンサーを発現する細胞の偽色画像。D)平均スペクトルは、アクセプタによる放射ピークを有するC(Aと同じ領域)のいくつかのROIからBで説明したように推定された。E)514nm照射によるアクセクターフルオロフォアの光破壊後405nm励起で取得したFRETバイオセンサを発現する細胞の偽色画像。F)平均スペクトルは、ドナーのみに起因する発光ピークを有するE(Aと同じ領域)のいくつかのROIからBで説明したように推定された。なお、ドナー強度は、元のFRET信号と比較するとFで増加し、アクソクザの光剥離後、ドナー励起が直接ドナー放出を招くことを示す。G)405nm励起を用いて得られた場合に期待されるアクソクタースペクトル。これは、405nmおよび488nmの励起レーザーが分光計と積分球(補足図1)と金星の波長依存性の絶滅係数を使用して特徴づけることができる線形応答を有するという事実を利用して推定された。したがって、488nmの励起で得られた金星スペクトルは、405nm励起H)核ラベルで標識された細胞の偽色の画像であるDRAQ5で得られると予想される金星スペクトルに変換することができる。I) H. J. に関心のあるいくつかの領域からの平均スペクトル) ドナーと DRAQ5 の正規化された純粋なスペクトルと、アクセプティカの励起波長補正スペクトルを含む結果のスペクトルライブラリ。なお、ターコイズと金星スペクトルは、結合ターコイズ+金星スペクトルデータの最大値に正規化され、DRAQ5はピーク発光波長の値で単にユニティに正規化された点に注意してください。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:バックグラウンドスペクトルシグネチャを同定し、非混合プロセス中のバックグラウンド蛍光信号を説明するためにスペクトルライブラリに含めた。A, B) サンプルブランク(ラベルなしカバースリップ)を特徴付ける際に、2つの背景蛍光スペクトルシグネチャが観察された。これらのスペクトル シグネチャは、ピーク波長に基づいて命名されました - 1 つは 424 nm (カバースリップ蛍光から) 504 nm (反射率または背面散乱による可能性が高い) で 1 つ。C)第3のバックグラウンドスペクトルシグネチャは、非標識細胞を分析したときに574nmのピーク発光波長で観察され、潜在的に基底マトリックスの細胞自己蛍光または蛍光から観察された。D) 画像 A、B、および C から抽出された背景スペクトル。これら3つの背景スペクトルは、6成分スペクトルライブラリを開発するために、既存の3成分ライブラリ(図3J)に追加されました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:バックグラウンド信号を占める6成分スペクトルライブラリを使用した線形スペクトルの非混合A) 軸方向の z スタックとして取得された生スペクトル画像データ。B) 生スペクトルデータを直線的にアンミックスするために使用される6成分スペクトルライブラリ。C、D、およびE)DRAQ5、ターコイズ、金星のグレースケール未混合画像は、それぞれ線形スペクトル非混合から生じる。F、G、H)それぞれDRAQ5、ターコイズ、金星の偽色の混合されていない画像。背景信号の非混合画像も計算された(この方法論に関心のある蛍光ラベルとしてここに示されていないデータ - Annamdevulaの 図4 を参照して、未混合の背景信号25の例を参照してください)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:非混合スペクトル画像データからのFRETおよびcAMPレベルの計算に関与するステップを示すフローチャート。A)ドナー、ターコイズの代表的な混合画像。B)アクソーバ、金星の代表的な混合画像。C)代表的な核の混合画像、DRAQ5。D)バイナリセルマスクは、混合されていないドナー+アクセクサの合計画像を閾値することによって生成される。E) 核画像に閾値を適用し、核のバイナリマスクを作成します。F)画素の賢明なFRET効率は、混合していないドナーとアクセクター画像から計算した。G) 複合バイナリマスクは、セルボーダーと核マスクから作成されました。H) マスクされたFRET効率画像:複合細胞マスクをFRET効率画像に適用し、細胞外および核内の非特異的FRET信号を除外した。I) FRET の空間変化をより良く視覚化するために、マスクされた FRET 効率画像にカラーマップが適用されました。J) FRET効率画像から推定されたcAMPレベル画像。K) カラーマップは、cAMP の空間的変化をより良く視覚化するために適用されました。右側に表示されるカラーバーは、FRETの効率(上パネル)とcAMPレベル(下部パネル)を視覚化するために使用されました。この図に示すイメージは、1 つの軸 z スライスを表しますが、この図で説明する解析操作は軸方向の z スタック全体で実行されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:フォルスコリン誘発フレット効率とcAMP空間勾配をPMVECで可視化XY平面画像は、アピカルから細胞の基底側に軸方向(Z)方向に3次元再構成FRETおよびcAMP画像データを複製することによって生成された。5 つの連続した XY スライスが表示されます。カラム1および3は、ベースラインでのFRET効率を表し、処理後10分でそれぞれ50μMフォルスコリンを使用します。列 2 および 4 は、ベースラインのレベルとフォルスコリン処理後 10 分を示します。カラーバーは、カラーマップの変化をFRET効率(上)とcAMPレベル(下)に関連付けるために使用されました。2 列目と 4 列目の画像に表示される白い線は、この選択したラインを通る cAMP 信号の強度プロファイル(ラインスキャンプロファイル)を生成するために使用されます。ベースライン(青いプロファイル)およびフォルスコリン処理(緑色のプロファイル)の後の細胞の中間スライスから得られた強度プロファイルプロットは、ラインスキャンを介したcAMP信号の空間分布を示している。スケールバーは20 μmを示します。
図8:フォルスコリン誘導FRET効率とcAMP空間勾配は軸方向に可視化した。YZ平面画像は、3次元再構成FRETおよびcAMP画像データを横方向(セルの左から右)に複製することによって生成された。カラム1および3は、ベースラインでのFRET効率を表し、50 μMフォルスコリン処理後の10分でそれぞれ効率を表します。列2および4は、ベースラインおよびフォルスコリン治療後10分のcAMPレベルを表す。右側のカラーバーは、カラーマップの変化をFRET効率(上)とcAMPレベル(下)に関連付けるために使用されました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図9:FRETおよびcAMPレベル画像を計算するための3成分または6成分スペクトルライブラリを利用することの有効性の比較。非特異的な背景信号は、バックグラウンドスペクトルシグネチャを考慮していない3成分ライブラリを使用して計算された画像で観察されました。これは、50 μM フォルスコリン処理に続く細胞の基底側付近の画像(コラム2)に特に当てはまり、対照的に、バックグラウンド信号アーティファクトは、バックグラウンドスペクトルシグネチャを含む6コンポーネントライブラリを使用する場合に効果的に除去され、セルをセグメント化し、FRETおよびcAMP信号を分析する能力が向上しました。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 10: セルと核の境界を表すために適切なしきい値が選択されていない場合、画像解析アーティファクトを導入できます。混合されていないドナーとアクサクサの画像は、0.35 (列 1 を 2)、0.65 (列 3 および 4) および 0.9 (列 5 および 6) の 3 つの異なるしきい値を持つマスクを作成するために使用されました。列 1、3、および 5 は、ベースラインでの FRET 効率を示します。カラム2、4、および6は、50 μMフォルスコリン処理後10分でFRET効率を表示します。閾値が低すぎる場合、バックグラウンドの一部、または細胞外領域が分析のために細胞に含まれる一方で、高すぎる閾値を選択するとセルの一部が失われました(列3〜4と比較した場合、4〜5列のアピカルスライスを参照)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 11: バックグラウンド信号アーティファクトは、バイナリマスクの作成時にバックグラウンドをアンミックスし、適切なしきい値を選択した後でも持続する可能性があります。列1はベースラインおよびコラム2の代表的な尖形、中間および基礎スライスを示し、コラム2は50 μMフォルスコリン処理の後の10分で同じを示す。バックグラウンド信号を考慮した6成分ライブラリを使用し、バイナリマスク生成に0.85の高い閾値を利用したにもかかわらず、特にフォルスコリンで処理した後も、バックグラウンド領域は細胞の一部であると同定されました。このような場合、FRETレポーターの発現が弱い細胞が撮像用に選択された可能性がある。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足図1:ソフトウェアのレーザー設定の関数としてのレーザー線強度の測定。 ファイバー結合分光計と積分球をNIST追跡可能なランプに較正し、405 nmレーザーラインと488nmレーザーラインの両方のレーザー強度を測定しました。A)405nmレーザーの異なるレーザー強度に対応する顕微鏡段階で測定された光子の総数。B)488nmレーザーの異なるレーザー強度に対応する顕微鏡段階で測定された光子の総数。レーザー強度の線形応答は、顕微鏡段階で測定された両方のレーザーについて観察された。線形近似曲線が適合し、各レーザーラインの近似曲線方程式を使用して、405nmレーザーライン(ドナー励起)で励起された場合に期待されるアクソクサスペクトルを計算しました。 こちらをクリックして、この図をダウンロードしてください。
補足図2:フォルスコリン誘導FRET効率とcAMP空間勾配は軸方向に可視化した。 XZ平面画像は、3次元の再構成されたFRETおよびcAMP画像データを横方向(Y)方向(セルの前面から後方)に複製することによって生成された。カラム1および3は、ベースラインでのFRET効率を表し、50 μMフォルスコリン処理後の10分でそれぞれ効率を表します。列2および4は、ベースラインおよびフォルスコリン治療後10分のcAMPレベルを表す。右側のカラーバーは、カラーマップの変化をFRET効率(上)とcAMPレベル(下)に関連付けるために使用されました。YZ平面(図8)の結果と同様に、FRET効率およびcAMPレベルにおける基礎的な空間勾配は、ベースライン条件(列1〜2の任意のスライス)および50 μMフォルスコリン処理(列3〜4)の両方で、単一のYZスライスの上から下までの色の変化として視覚化される可能性があります。 こちらをクリックして、この図をダウンロードしてください。
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Discussion
FRETバイオセンサーの開発により、単一細胞における環状ヌクレオチドシグナルの測定と可視化が可能となり、細胞内シグナル伝達事象13,22,37,38を可視化する大きな約束がある。しかし、FRETバイオセンサーの使用は、多くの蛍光タンパク質ベースのFRETレポーターの低いシグナル間特性およびFRETレポーターの弱いトランスフェクションまたは発現効率(これはPMVECなどの特定の細胞株において特に困難である可能性がある)23,24を含むいくつかの制限を提示する。微弱発現蛍光タンパク質のイメージングは、レシオメトリックFRET計算と組み合わせることで、多くの場合、計算されたFRET効率において高い不確実性または変動をもたらす。FRET測定の信頼性を向上させるために、我々および他の人々は、FRET信号を測定し、蛍光標識と自己蛍光効果26、31、32、39の間の蛍光信号のクロストークまたはブリードを低減するために、ハイパースペクトルイメージングおよび分析の使用を実証しました。信号強度の制限により、これらのスペクトルFRET研究はごく最近まで2つの(XおよびY)空間寸法に制限されていました。したがって、彼らはセル内のFRETの変更の単一スライスビューを提供しました。
最近の研究では、FRET(および対応するcAMPレベル)は、XY平面だけでなく、XZおよびYZ平面25全体に空間的に分布しているように見えることを指摘した。ここで説明するハイパースペクトルFRETイメージングアプローチは、FRETおよび環状ヌクレオチド(cAMP)の変化を3つの空間次元に視覚化および測定する能力を拡張し、シグナル区画化を評価するための新たな可能性を開きます。この4次元(X、Y、Z、およびλ)ハイパースペクトルイメージングと解析アプローチにより、非均一なバックグラウンド信号を考慮しながら、3つの空間次元でcAMP勾配を測定および可視化することができます。ここでは、フォルスコリンによるcAMP空間勾配の例を通じて、このアプローチを実装する方法を示しました。処理後の画像データでは、cAMP空間勾配は、細胞の基礎側に対する補助的な位置まで観察することができる(図7および図8)。フォルスコリンによる治療で製造されたcAMPは、細胞細胞接合部に達していないように見えた(図7および図8)。
ここで説明した方法論を利用する上で、FRET効率を正確に推定できるように、さまざまな背景源と自己蛍光シグナルを考慮することが重要でした。リニアアンミックスは、そのシグネチャが目的の蛍光プローブと異なる場合、ユニークな背景スペクトルを考慮するための潜在的な手段を提供します。特に、線形アンミックスは、標準的な背景減算よりも背景と自己蛍光信号を分離する方が適しています。40、41、42ここに示す例では、3つの異なるスペクトルシグネチャを測定し、シグネチャのピーク発光波長に基づいて名前を割り当てた:424nmバックグラウンドスペクトル(おそらくカバースリップ蛍光から)、504 nmバックグラウンドスペクトル(反射または背面散乱光による可能性がある)、および574 nmバックグラウンドスペクトル(おそらく細胞または細胞マトリックスオートフルエンスによる)。これらのシグネチャを考慮しなかった場合の影響を説明するために、2 つのスペクトル ライブラリが作成され、混合されていないイメージが比較されました。まず、試料中の蛍光標識のみを含むスペクトルライブラリ、ターコイズ、ヴィーナス、DRAQ5を作成し、3成分ライブラリにラベルを付けました。次に、3 つの背景スペクトル シグネチャを追加したスペクトル ライブラリが作成され、6 コンポーネント ライブラリにラベルが付きました。上記のように、6成分ライブラリとの混合解除(バックグラウンドアンミックス)はバックグラウンド信号の除去を可能にし、3成分ライブラリとの混合解除は行わなかった(図9)。これまでの研究では、蛍光ラベルと背景シグネチャの両方を占めるスペクトルライブラリを使用する場合、線形アンミックスに関連する二乗平均誤差(RMSE)が減少することが示されました。背景蛍光の軸分布は、多くの場合、不均一であり、したがって、単純な背景減算は、画像データを修正するために働かないことを留意すべきです。したがって、正確なバックグラウンド除去と信頼性の高いFRET測定を提供するために、スペクトルアンミックスアプローチが必要です。
スペクトル画像を取得する際に、システムパラメータを最適化して、可能な限り最適なシステムとカメラの設定を選択することが重要です。全体的な目標は、取得時間を最小限に抑え、光のブリーチを防ぎながら、SNRを最適化することです。したがって、43 は、画像システムを最適化する際に、空間的、時間的、およびスペクトル分解能の間の妥協がしばしば必要となる。これらの研究では、プロトコルセクションで説明されているように、ピンホールサイズ、レーザーパワー、スキャン速度、スキャンサイズ、フレーム平均化など、システムとカメラの設定に最適な値を選択しました。これらの設定を利用して、80 nm/pixelの空間サンプリング、スペクトルzスタックあたり〜3分の時間サンプリング(約10秒/XY画像)、10nm間隔のスペクトルサンプリングは、無視できる、または最小限のフォトブリーチで達成されます。
FRET効率の正確な推定を確実にするために、1:1のストイチオメトリーと同一の励起波長で期待されるようにドナーとアクセクサスペクトルを測定する必要があります(図3)。ターコイズと金星スペクトルは、ターコイズピーク発光波長に対して正規化した。このスペクトルライブラリを用いて推定されたFRET効率は、文献12,22で報告されているものと同様の値を生成した。通常、ライブラリ内のエンドメンバースペクトルは、統一に正規化されます。しかし、FRET効率を正確に計算するには、ドナースペクトルに対してアクセクサスペクトルを取得する必要があります(すなわち、等値濃度または1:1の励起波長を参照)。適切に構築されたライブラリの使用に加えて、FRET効率の適切な推定と分析アーティファクトの回避にはいくつかのステップが関与しています。これには、十分な信号強度を持つ発現セルの選択(図11)、FRET効率を推定する前の混合していない画像の平滑化(この例ではガウスブラーが適用された)、マスクを作成するための適切な閾値(図10)、ドナーとアクセクターの消滅係数を使用した補正係数の推定(補足File_Spectralライブラリ)が含まれます。これらのステップに従うと、FRET効率および基礎となるcAMPレベルの3次元分布を単一細胞で正確に可視化することができる。
局在したcAMP信号は、標的化FRETバイオセンサー13,37を用いて2空間次元で推定されている。しかし、特定の細胞下区画(例えば、形質膜または脂質いかだ)にFRETプローブを標的とすると、通常、プローブの局所濃度が増加する。これは、分子間または二分子FRETに起因する測定アーティファクトをもたらす可能性があります。さらに、2018年のアンナムデブラ et.al で発表された結果は、サイトメトリーA25が可溶性または標的プローブのいずれかからFRETの3次元測定の重要性を示す。
3つの空間次元でcAMP信号を測定することの重要性にもかかわらず、このアプローチには限界もあります。最も制限の厳しい制限は、必要な長い取得時間(スペクトル z スタックあたり約3分)です。この取得率は、このアプローチを使用して、細胞内の準安定状態のcAMP分布以外のものを検出することを妨げるものです。しかし、提示された結果は、標準の2次元(x、y)測定値に対する重要な補完として、準定常状態3次元(x、y、z)cAMP測定値を含む重要性を示しています。将来的には、標識タンパク質や細胞構造を実験計画に組み込むことが興味深いものになるでしょう。タンパク質(および/または構造)の標識に使用される蛍光体の慎重な選択は、取得速度の追加損失なしに標識タンパク質およびFRETの3次元分布の評価を可能にするであろう。これにより、標識されたタンパク質の近くで局在したcAMP信号とcAMP信号を3つの空間次元で測定することができ、標的cAMPプローブに重要な実験的補完を提供し、生きている細胞における3次元cAMP分布のハイパースペクトル測定の有用性をさらに拡大する。
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Disclosures
リーブズリー博士とリッチ博士は、スペクトルイメージング技術を商業化するために設立された新興企業SpectraCyte,LLCに対する金銭的関心を開示しています。しかし、このプロトコルに記載されているすべての手順は、SpectraCyte, LLCに関連しない市販の製品を使用して実施した。
Acknowledgments
著者らは、H188 cAMP FRETバイオセンサーとケニー・トリン(南アラバマ大学工学部)が独自に開発したプログラミングスクリプトを実行するのに要する時間を短縮するための技術的支援を提供したキース・ジャリンク博士(オランダ癌研究所とファン・レーウェンフック先端顕微鏡センター、アムステルダム、オランダ)を認めたいと考えています。
著者らは、資金源を認めたい:アメリカ心臓協会(16PRE27130004)、国立科学財団。(1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Attofluor Cell Chamber | Invitrogen | A7816 | Attofluor contains steel cell chambers and a rubber O-ring. Cell chamber holds the coverslip and O-ring provides a lock in mechanism to hold the buffer in cell chamber with out leakage |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Solvent used to prepare stock solution forskolin. |
| DRAQ5 Fluoroscent Probe Solution | Thermo Scientific | 62252 | Nuclear label |
| Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Contains nutrients and growth factors for the cells to grow and divide in the culture dishes. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F6178 | Growth factor suppliment that is added to culture medium, DMEM |
| Forskolin | Sigma | F3917 | Adenyly cyclase activator. |
| H188 Cyclic AMP FRET biosensor | Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink | Gift | Plasmid encoding Turquoise (donor fluorophore), Venus (acceptor fluorophore), and binding domain obtained from Epac. |
| Image J | image.net | Free download | Another image processing platform used to extact spectral information and image processing. |
| Integrating Sphere | Ocean Optics | FOIS-1 | Used to measure illumination intensity of the laser line at different laser intensities (?). |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Invitrogen | 23017-015 | Coverslips are coated with laminin and this helps in cell attachment, growth and motility of the cell. |
| Lipofectamine 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000-015 | Transfection reagent used to transfect cells with H188 FRET biosensor |
| MATLAB | Mathworks | R2019a | Image processing operations (linear unmixing and FRET efficiency calculations) are performed by writing custom programs in MATLAB programming environment |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon Instruments | Nikon A1R | Spectral image acquisition is performed using confocal microscope. |
| Nikon Elements Software | Nikon Instruments | Software dongle | used to export and handle nd2 image files (multidimensional image files) that are aquired using Nikon A1R |
| NIST-Traceable Calibration Lamp | Ocean Optics | LS-1-CAL-INT | A lamp with a known spectrum for use as a standard |
| PBS pH 7.4 (1X) | Gibco | 10010-023 | coomonly used buffer suring cell culture |
| Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs) | In house - Cell culture core, Univeristy of South Alabama | Isolated from Rat pulmonary microvasculature | PMVECs form inner lining of a blood vessel. |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | antibiotics are added to culture medum to prevent contamination of the cells. |
| Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides | Clay Adams | 3010 | Microscope slides used for cell fixation |
| ProLong Diamond Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36961 | If samples are fixed using antifade mountant, then the later protects fluoroscent dyes and chromophores from fading. |
| Spectrometer | Ocean Optics | QE65000 | Used to measure spectral response of the light source (?) |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 | Digests the protein-protein bond between the cell and cell matrix and helps to disscociate and lift the cells during cell plating. |
| Tyrodes Buffer | Made in-house | Made in-house | Tyrodes buffer is used to make working solutions and to maintain cells in aqueous solution during image acquisition. |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3506 | Laminin coated coverslips are placed in 6-well culture dish (one coverlisps/well). Cells along with medium is added into each well. |
| 25 mm Round Microscope Cover Slips | Fisher Scientific | 12545102 | Cells were grown on round glass coverslips |
| 60X Ojective | Nikon Instruments | Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 | water immersion and commonly used objective for cells |
References
- Corbin, J. D., Sugden, P. H., Lincoln, T. M., Keely, S. L. Compartmentalization of adenosine 3':5'-monophosphate and adenosine 3':5'-monophosphate-dependent protein kinase in heart tissue. The Journal of Biological Chemistry. 252, 3854-3861 (1977).
- Terrin, A., et al. PGE1 stimulation of HEK293 cells generates multiple contiguous domains with different [cAMP]: role of compartmentalized phosphodiesterases. The Journal of Cell Biology. 175, 441-451 (2006).
- Bacskai, B. J., et al. Spatially resolved dynamics of cAMP and protein kinase A subunits in Aplysia sensory neurons. Science. 260, 222-226 (1993).
- Iancu, R. V., Ramamurthy, G., Harvey, R. D. Spatial and temporal aspects of cAMP signalling in cardiac myocytes. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 35, 1343-1348 (2008).
- Brunton, L. L., Hayes, J. S., Mayer, S. E. Functional compartmentation of cyclic AMP and protein kinase in heart. Advances in Cyclic Nucleotide Research. 14, 391-397 (1981).
- Hohl, C. M., Li, Q. Compartmentation of cAMP in adult canine ventricular myocytes. Relation to single-cell free Ca2+ transients. Circulation Research. 69, 1369-1379 (1991).
- Rich, T. C., et al. A uniform extracellular stimulus triggers distinct cAMP signals in different compartments of a simple cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 13049-13054 (2001).
- Sayner, S. L., Alexeyev, M., Dessauer, C. W., Stevens, T. Soluble adenylyl cyclase reveals the significance of cAMP compartmentation on pulmonary microvascular endothelial cell barrier. Circulation Research. 98, 675-681 (2006).
- Rich, T. C., Tse, T. E., Rohan, J. G., Schaack, J., Karpen, J. W. In vivo assessment of local phosphodiesterase activity using tailored cyclic nucleotide-gated channels as cAMP sensors. The Journal of General Physiology. 118, 63-78 (2001).
- Blackman, B. E., et al. PDE4D and PDE4B function in distinct subcellular compartments in mouse embryonic fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 286, 12590-12601 (2011).
- Sayner, S. L., et al. Paradoxical cAMP-induced lung endothelial hyperpermeability revealed by Pseudomonas aeruginosa ExoY. Circulation Research. 95, 196-203 (2004).
- Klarenbeek, J., Jalink, K. Detecting cAMP with an EPAC-based FRET sensor in single living cells. Methods in Molecular Biology. 1071, 49-58 (2014).
- Surdo, N. C., et al. FRET biosensor uncovers cAMP nano-domains at β-adrenergic targets that dictate precise tuning of cardiac contractility. Nature Communications. 8, 15031 (2017).
- Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Reports. 5, 1176-1180 (2004).
- Vogel, S. S., Thaler, C., Koushik, S. V. Fanciful FRET. Science's STKE. 2006, (2006).
- Clegg, R. M. The History of FRET: From conception through the labors of birth. Reviews in Fluorescence. 3, (2006).
- Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-224 (2006).
- Manzella-Lapeira, J., Brzostowski, J. A. Imaging protein-protein interactions by Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy in live cells. Current Protocols in Protein Science. 93, 58 (2018).
- Cooper, D. M. F., Mons, N., Karpen, J. W. Adenylyl cyclases and the interaction between calcium and cAMP signalling. Nature. 374, 421-424 (1995).
- Sassone-Corsi, P. Coupling gene expression to cAMP signalling: role of CREB and CREM. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 30, 27-38 (1998).
- Rebhun, L. I. Cyclic nucleotides, calcium, and cell division. International Review of Cytology. 49, 1-54 (1977).
- Klarenbeek, J., Goedhart, J., Van Batenburg, A., Groenewald, D., Jalink, K. Fourth-generation Epac-based FRET sensors for cAMP feature exceptional brightness, photostability and dynamic range: characterization of dedicated sensors for FLIM, for ratiometry and with high affinity. PLOS ONE. 10, 0122513 (2015).
- Leavesley, S. J., Rich, T. C. FRET: signals hidden within the noise. Cytometry Part A. 85, 918-920 (2014).
- Rich, T. C., Webb, K. J., Leavesley, S. J. Can we decipher the information content contained within cyclic nucleotide signals. The Journal of General Physiology. 143, 17-27 (2014).
- Annamdevula, N. S., et al. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
- Leavesley, S. J., Britain, A. L., Cichon, L. K., Nikolaev, V. O., Rich, T. C. Assessing FRET using spectral techniques. Cytometry Part A. 83, 898-912 (2013).
- Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming limitations of FRET measurements. Cytometry Part A. 89, 325-327 (2016).
- Fink, D. J. Monitoring Earcths Resources from Space. Technology Review. 75, 32-41 (1973).
- Goetz, A. F. H., Vane, G., Solomon, J. E., Rock, B. N. Imaging Spectrometry for Earth Remote Sensing. Science. 228, 1147-1153 (1985).
- Bücherl, C. A., Bader, A., Westphal, A. H., Laptenok, S. P., Borst, J. W. FRET-FLIM applications in plant systems. Protoplasma. 251, 383-394 (2014).
- Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. Journal of Microscopy. 228, 139-152 (2007).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Letters. 531, 245-249 (2002).
- Griswold, J. R., Annamdevula, N., Deal, J., Rich, T., Leavesley, S. Estimating FRET Efficiency using Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging. Biophysical Journal. 112, 586 (2017).
- Favreau, P. F., et al. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19, 046010 (2014).
- King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvascular Research. 67, 139-151 (2004).
- Thaler, C., Koushik, S. V., Blank, P. S., Vogel, S. S. Quantitative multiphoton spectral imaging and its use for measuring resonance energy transfer. Biophysical Journal. 89, 2736-2749 (2005).
- Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Frontiers in Pharmacology. 9, 332 (2018).
- Johnstone, T. B., Agarwal, S. R., Harvey, R. D., Ostrom, R. S. cAMP signaling compartmentation: Adenylyl cyclases as anchors of dynamic signaling complexes. Mol Pharmacol. , (2017).
- Zhang, J., Li, H., Chai, L., Zhang, L., Qu, J., Chen, T. Quantitative FRET measurement using emission-spectral unmixing with independent excitation crosstalk correction. Journal of Microscopy. 257, 104-116 (2015).
- Zhang, J., Lin, F., Chai, L., Wei, L., Chen, T. IIem-spFRET: improved Iem-spFRET method for robust FRET measurement. Journal of Biomedical Optics. 21, 105003 (2016).
- Levy, S., et al. SpRET: highly sensitive and reliable spectral measurement of absolute FRET efficiency. Microscopy and Microanalysis. 17, 176-190 (2011).
- West, S. J., et al. Hyperspectral Measurements Allow Separation of FRET Signals from Non-Uniform Background Fluorescence. Biophysical Journal. 112, 453 (2017).
- Annamdevula, N. S., et al. An approach for characterizing and comparing hyperspectral microscopy systems. Sensors. 13, Basel. 9267-9293 (2013).
