Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

قياس توزيعات cAMP ثلاثية الأبعاد في الخلايا الحية باستخدام التصوير والتحليل عالي الطيفي (x وy وz و λ)

Published: October 27, 2020 doi: 10.3791/61720
Automatic Translation
1,2, 3, 1, 3, 1,2, 1,2, 1,2,3
1Department of Pharmacology, University of South Alabama, 2Center for Lung Biology, University of South Alabama, 3Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama

Summary

نظرا لانخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) المتأصلة في أجهزة الاستشعار المستندة إلى نقل الطاقة بالرنين Fӧrster (FRET) ، كان قياس إشارات cAMP صعبا ، خاصة في ثلاثة أبعاد مكانية. هنا، نقوم بوصف منهجية التصوير والتحليل فائقة الطيفية FRET التي تسمح بقياس توزيع cAMP في ثلاثة أبعاد مكانية.

Abstract

Cyclic AMP هو رسول الثاني الذي يشارك في مجموعة واسعة من الأنشطة الخلوية والفسيولوجية. تشير العديد من الدراسات إلى أن إشارات cAMP مجزأة ، وأن التقسيم يساهم في خصوصية الإشارات داخل مسار إشارات cAMP. وقد عزز تطوير أجهزة الاستشعار البيولوجية القائمة على نقل الطاقة بالرنين Fӧrster (FRET) القدرة على قياس وتصور إشارات cAMP في الخلايا. غير أن هذه القياسات كثيرا ما تقتصر على بعدين مكانيين، مما قد يؤدي إلى سوء تفسير للبيانات. وحتى الآن، لم تكن هناك سوى قياسات محدودة جدا لإشارات CAMP في ثلاثة أبعاد مكانية (س، ص، وz)، وذلك بسبب القيود التقنية في استخدام أجهزة استشعار FRET التي تظهر بطبيعتها نسبة إشارة منخفضة إلى ضوضاء (SNR). بالإضافة إلى ذلك، غالبا ما تكون أساليب التصوير التقليدية القائمة على الفلتر غير فعالة للقياس الدقيق لإشارات cAMP في المناطق شبه الخلوية المترجمة بسبب مجموعة من العوامل، بما في ذلك الكلام الطيفي المتقاطع، وقوة الإشارة المحدودة، والفلوروريشن التلقائي. للتغلب على هذه القيود والسماح باستخدام أجهزة الاستشعار الحيوية القائمة على FRET مع فلوروفورس متعددة ، قمنا بتطوير نهج التصوير والتحليل FRET الطيفية الفائقة التي توفر خصوصية طيفية لحساب كفاءات FRET والقدرة على فصل إشارات FRET الطيفية عن الفلورة التلقائية المحيرة و / أو الإشارات من تسميات فلورية إضافية. هنا، نقدم منهجية لتنفيذ التصوير FRET مفرط الطيفية، فضلا عن الحاجة إلى بناء مكتبة الطيفية المناسبة التي ليست أقل من المخ أو الإفراط في الاختزال لأداء التجهم الطيفي. بينما نقدم هذه المنهجية لقياس توزيعات CAMP ثلاثية الأبعاد في الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الرئوية (PMVECs) ، يمكن استخدام هذه المنهجية لدراسة التوزيعات المكانية لل CAMP في مجموعة من أنواع الخلايا.

Introduction

الأدينوسين الدوري أحادي الفوسفات (cAMP) هو رسول الثاني المشاركة في العمليات الخلوية والفسيولوجية الرئيسية بما في ذلك انقسام الخلايا، وتدفق الكالسيوم، ونسخ الجينات، ونقل الإشارات. وهناك مجموعة متزايدة من الأدلة تشير إلى وجود مقصورات cAMP في الخلية التي من خلالها يتم تحقيقخصوصيةالإشارات 1 ،2،3،4،5،6،7. حتى وقت قريب، تم الاستدلال على تجزئة cAMP على أساس تأثيرات فسيولوجية أو خلوية متميزة ناجمة عن ناهضات مستقبلات G-coupled المختلفة8و9و10و11. وفي الآونة الأخيرة، قدمت مسابير التصوير الفلوري المستندة إلى FRET مقاربات جديدة للقياس المباشر وإشارات CAMP ومراقبتها فيالخلية 12و13و14.

Förster نقل الطاقة الرنين (FRET) هي ظاهرة المادية التي نقل الطاقة يحدث بين جزيئات المانحة والمقبل بطريقة غير إشعاعية عندما تكون الجزيئات على مقربة15،16. مع تطوير مؤشرات الفلورسنت FRET المستندة ، تم استخدام هذه الظاهرة الفيزيائية في التطبيقات البيولوجيةلدراسة التفاعلاتالبروتين البروتين 17 ، البروتين المشارك توطين18، كا+2 مما يشير إلى19، التعبير الجيني20، انقسام الخلية21 والإشارات النيوكليوتيدات الدورية. وتتكون مؤشرات CAMP المستندة إلى FRET عادة من مجال ربط CAMP ، وفلوروفوري مانح ، وفلوروفوري مقبول22. على سبيل المثال، يتكون مستشعر H188 cAMP12،22 المستخدم في هذه المنهجية من نطاق ربط cAMP تم الحصول عليه من Epac ، يقع بين الفلوروفوريس الفيروزي (المانح) والزهرة (المقبول). في الظروف القاعدية (غير منضم)، الفيروز والزهرة في اتجاه مثل هذا FRET يحدث بين الفلوروفوريس. عند ربط cAMP بمجال الربط ، يحدث تغيير تشكيلي بحيث ينفصل الفيروز والزهرة مما يؤدي إلى انخفاض في FRET.

تقدم أساليب التصوير المستندة إلى FRET أداة واعدة للتحقيق في إشارات cAMP وتصورها داخل الخلية. ومع ذلك ، فإن تقنيات التصوير المجهري الحالية القائمة على FRET غالبا ما تكون ناجحة جزئيا فقط في تحقيق قوة إشارة كافية لقياس FRET مع الوضوح المكاني دون الخلوي. ويرجع ذلك إلى عدة عوامل، بما في ذلك قوة الإشارة المحدودة للعديد من مراسلي FRET، والمستوى العالي من الدقة المطلوبة لتحديد التغيرات بدقة في كفاءة FRET، ووجود عوامل محيرة، مثل الفلورة الذاتية الخلوية23،24. والنتيجة هي في كثير من الأحيان صورة FRET التي تعاني من ضعف SNR ، مما يجعل تصور التغيرات دون الخلوية في FRET صعبا للغاية. وبالإضافة إلى ذلك، تم إجراء التحقيق في إشارات cAMP المترجمة مكانيا بشكل حصري تقريبا في بعدين مكانيين فقط ونادرا ما اعتبر توزيع cAMP المحوري25. وهذا على الأرجح لأن انخفاض SNR أعاق القدرة على قياس وتصور تدرجات cAMP في ثلاثة أبعاد مكانية. للتغلب على القيود المفروضة على استخدام أجهزة استشعار FRET مع انخفاض SNR، قمنا بتنفيذ التصوير والتحليل hyperspectral النهج لقياس FRET في خلايا واحدة25،26،27.

تم تطوير نهج التصوير الطيفي الفائق من قبل وكالة ناسا للتمييز بين الأجسام الأرضية الموجودة في صور الأقمار الصناعية28،29. وقد ترجمت هذه التقنيات منذ ذلك الحين إلى مجال المجهر الفلوري30، مع العديد من أنظمة المجهر confocal التجارية التي تقدم كاشفات الطيفية. في التصوير الفلوري التقليدي (غير الطيفي)، تكون العينة متحمسة باستخدام فلتر تمرير النطاق أو خط ليزر، ويتم جمع الانبعاثات باستخدام فلتر تمرير النطاق الثاني، الذي يتم اختياره غالبا لتتناسب مع الطول الموجي لذروة الانبعاثات للفلوروفور (الفلوروفور). وعلى النقيض من ذلك، تسعى نهج التصوير الطيفي الفائق إلى أخذ عينات من ملف طيفي كامل إما لانبعاثات الفلورية26أو31أو32 أو الإثارة33و34 على فترات طول موجية محددة. في دراساتنا السابقة، أظهرنا أن التصوير والتحليل الطيفي المفرط يمكن أن يقدم كمية محسنة لإشارات FRET في الخلايا بالمقارنة مع تقنيات التصوير FRET التقليدية القائمة على التصفية26. هنا، نقدم منهجية لأداء التصوير والتحليل عالي الطيفية (x و y و z و λ) ثلاثي الأبعاد لقياس وتصور توزيعات cAMP في ثلاثة أبعاد مكانية. وقد سمحت هذه النهج التصور من التدرجات المكانية cAMP الناجمة عن ناهض في خلايا واحدة25. ومن المثير للاهتمام، اعتمادا على ناهض، قد تكون التدرجات cAMP واضحة في الخلايا. وتستخدم المنهجية المعروضة هنا الطيس الطيفي للخلفية غير الموحدة والفلورة الذاتية الخلوية لتحسين دقة قياسات FRET. في حين يتم إثبات هذه المنهجية في الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الرئوية (PMVECs) باستخدام جهاز استشعار حيوي CAMP FRET ، يمكن بسهولة تعديل المنهجية لاستخدامها مع مراسلي FRET البديلين أو خطوط الخلايا البديلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يتبع هذا البروتوكول الإجراءات التي وافقت عليها لجنة العناية والاستخدام المؤسسية للحيوانات في جامعة جنوب ألاباما.

1. إعداد الخلية والعينة والكواشف للتصوير

  1. عزل الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الرئوية للفئران (PMVECs) كما هو موضح سابقا35.
    ملاحظة: تم عزل الخلايا واستزراعها من قبل نواة ثقافة الخلية في جامعة جنوب ألاباما، موبايل، AL على أطباق ثقافة الخلية عيار 100 ملم.
  2. البذور PMVECs معزولة على 25 ملم يغطي الزجاج جولة والسماح لهم بالنمو في الحاضنة في 37 درجة مئوية حتى الخلايا تحقيق ما لا يقل عن 80٪ التقاء (على الأقل 24 ساعة).
    ملاحظة: قد تختلف الخلايا ونوع الخلية من دراسة إلى أخرى، وبالتالي يجب اتباع إجراءات زراعة الخلايا الخاصة بالخلايا لزرع الخلايا وتنميتها. يتوفر بروتوكول زرع الخلايا وزراعة الخلايا المستخدم في هذه الدراسات كمعلومات تكميلية في الملف المسمى "الثقافة التكميلية File_Cell والإصابة".
  3. مركبات PMVECs عبر البراز مع جهاز استشعار حيوي FRET واحتضان لمدة 48 ساعة في 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: يتم أيضا وصف بروتوكول لأجهزة PMVECs transfect في ملف معلومات تكميلية المسمى "الثقافة File_Cell التكميلية و Transfection".
  4. في يوم التصوير، دافئة ترود العازلة إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
    ملاحظة: يتكون المخزن المؤقت لتيرود من 145 مليون م كل، 4 م م كل، 10 م م HEPES، 10 mM الجلوكوز، 1 م مكل2 و 1 م م كاكل2
  5. جبل غطاء يحتوي على خلايا مصابة في غرفة الخلية وتأمين الجزء العلوي مع طوقا تصاعد لمنع تسرب.
  6. مسح الجزء السفلي من غطاء باستخدام مسح مهمة حساسة لتنظيف أي وسائل الإعلام الزائدة أو الخلايا الملتصقة.
  7. إضافة 800 ميكرولتر من العازلة العمل و 4 ميكرولتر من التسمية النووية 5 MM إلى غرفة الخلية والصخور بلطف لمدة 5 - 10 ثانية.
    ملاحظة: عند إضافة حلول عازلة أو كاشفة إلى الأغطية المحملة في غرفة الخلية، تأكد من إضافة الحل برفق وعلى جانب غرفة الخلية حتى لا يتم إزاحة الخلايا الملتصقة. إضافة 4 ميكرولتر من التسمية النووية 5 MM إلى 800 ميكرولتر من العازلة يجعل تركيز 25 ميكرومتر النهائي للتسمية النووية. بالنسبة للخلايا الملتصقة بشكل فضفاض مثل خلايا HEK293 ، اخلط الملصق النووي والعازل في قارورة أولا ثم أضف إلى الأغطية المثبتة في غرفة الخلية. وهذا سوف يمنع رفع الخلايا قبالة غطاء.
  8. قم بتغطية غرفة الخلية بورق الألومنيوم للحماية من الضوء واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  9. إعداد الكاشف: إضافة 1 ميكرولتر من 50 م م فورسكولين إلى 199 ميكرولتر من العازلة. وهذا سوف ينتج تركيز النهائي من forskolin من 50 ميكرومتر عند إضافتها إلى الخلايا التي تم إعدادها مع 800 ميكرولتر من العازلة. 1 ميكرولتر من DMSO في 199 μL من العازلة ينبغي أيضا أن تكون مستعدة لاستخدامها كتحكم في السيارة.
    ملاحظة: في هذه الدراسات، يستخدم فورسكولين كمنشط سيكلاسي أدينييليل لتحفيز إنتاج cAMP. إذا رغبت في ذلك، يمكن بسهولة تعديل هذه المنهجية للسماح بالعلاج مع الكواشف البديلة لتحفيز أو تثبيط سيكلاز أدينييل، فوسفوديستيراسيس، الخ.

2. الحصول على صورة

  1. استخدم مجهرا كونفوجال مجهزا بجهاز كشف طيفي.
    ملاحظة: تم تطوير جميع خطوات الحصول على الصور الموضحة هنا باستخدام نظام مجهر نيكون A1R المتاح تجاريا. قد تحتاج هذه الخطوات إلى تعديل إذا كنت تستخدم مجهر طيفي بديل. تأكد من تشغيل جميع المعدات قبل 30 دقيقة على الأقل من بدء التجربة للوصول إلى ظروف تشغيل مستقرة.
  2. حدد هدف غمر المياه 60x وإضافة قطرة ماء إلى الهدف.
    ملاحظة: بالنسبة للتصوير بالخلايا الحية عالي الدقة، يوصى باستخدام هدف فتحة رقمية عالية. يرجى الرجوع إلى قائمة المواد للحصول على معلومات حول الهدف المستخدم في هذه الدراسات.
  3. ضع غرفة الخلية المحملة (من الخطوة 1.7) على مرحلة المجهر.
  4. حدد مرشح DFT (DAPI/ FITC/TRITC) الذي تم تعيينه بضبط مقبض الفلتر على الجانب الأيمن من المجهر.
  5. تشغيل المجهر في وضع واسع النطاق الفلوري باستخدام العدسة لتحديد مجال الرؤية التي تحتوي على خلايا تعبر عن جهاز استشعار CAMP FRET.
    ملاحظة: تأكد من أن متوسط كثافة إشارة FRET عند الطول الموجي لذروة الانبعاثات المانحة أو المقبولة في الخلية المختارة هو 100 وحدة كثافة على الأقل (A.U.) أو 4X على الأقل إشارة خط الأساس لمنطقة بدون خلايا معبرة. ويمكن تأكيد ذلك باستخدام عارض ملف تعريف الطيف المتوفر في برنامج NIS Elements. عند البحث عن خلية ذات إشارة جيدة ، من المستحسن التخلص من الخلايا الساطعة بشكل مفرط (قد تتعرض للخطر).
  6. فتح برنامج NIS، والتحول إلى وضع confocal، وفتح زر الليزر المتشابكة وانقر على لايف.
  7. استخدام مقبض التركيز للتركيز على الخلايا من خلال النظر في المعاينة على الشاشة.
  8. تكوين إعدادات الجهاز والحصول على و z-المكدس في البرنامج، كما هو موضح أدناه.
  9. إعدادات الاستحواذ:
    ملاحظة: يمكن تطبيق إعدادات اقتناء الكاميرا والجهاز باستخدام صورة تم الحصول عليها مسبقا. افتح الصورة وانقر بزر الماوس الأيمن وحدد إعادة استخدام إعدادات الكاميرا.
    1. افتح قائمة إعدادات A1، وحدد المربعات المطابقة لخطوط الليزر 405 نانومتر و561 نانومتر، وحدد SD للكشف الطيفي، وحدد 10 للدقة و31 للقنوات.
      ملاحظة: تظهر قائمة إعدادات A1 كرمز تروس صغير في الزاوية العلوية اليسرى من إطار إعدادات A1 Plus. يستخدم الليزر 405 نانومتر لإثارة المانحة ويستخدم الليزر 561 نانومتر لإثارة التسمية النووية.
    2. تعيين نطاق الطول الموجي (410 - 730 نانومتر) عن طريق تحديد قيم الطول الموجي للبدء والنهاية.
    3. انقر فوق رمز binning/skip في قائمة إعدادات A1 وحدد المربع المرقم 15، ثم انقر فوق موافق في قائمة إعدادات A1.
      ملاحظة: هذا هو لإزالة قناة الطول الموجي الذي يتوافق مع الليزر 561 نانومتر الإثارة (وهذا هو عادة قناة الطول الموجي 15). من المهم عدم استخدام هذا النطاق الطول الموجي لتجنب إشارة منخفضة اصطناعيا ، والتي يمكن أن تخلق قطعة أثرية طيفية. الإشارة أقل في هذا النطاق بسبب الإصبع الميكانيكي الذي يغطي عنصر الكاشف لحمايته من تلف الليزر.
    4. تعيين كثافة الليزر إلى 8٪ و 2٪ لليزر 405 نانومتر و 561 نانومتر، على التوالي، سي HV (كسب كاشف) في 149، ونصف قطرها ثقب من 2.4 وحدات القرص متجدد الهواء (الاتحاد الافريقي).
      ملاحظة: قد يلزم تعديل كثافة الليزر اعتمادا على عمر الجهاز وحالة الليزر. إذا كان ضبط كثافة الليزر بين عينات مختلفة أو مجموعات تجريبية، فمن المهم للحفاظ على نفس النسبة من كثافة الليزر (على سبيل المثال، 8:2). بالإضافة إلى ذلك ، من المهم تحديد كثافة الليزر التي ليست مشرقة بحيث تخلق photobleaching السريع. يجب تعديل كسب الكاشف لزيادة كثافة الإشارة مع تقليل ضوضاء الكاشف. لهذه الدراسات، تم استخدام مكسب من 149. تم اختيار حجم الثقب من 2.4 الاتحاد الافريقي كتوازن بين الحصول على الصور مع إشارة كافية إلى نسبة الضوضاء (SNR) والحفاظ على المقاطع البصرية (confocality). زيادة في حجم الثقب يزيد SNR ولكن يقلل من الكونفكاليتي.
    5. تعيين سرعة المسح الضوئي إلى 0.25 إطارات الطيفية في الثانية، حدد الرمز المقابلة أحادي الاتجاه للمسح اتجاه، أدخل 4 للعد، وتعيين 1024 × 1024 لحجم المسح الضوئي.
      ملاحظة: إشارات FRET ضعيفة، وغالبا ما تكون سرعة المسح بطيئة مطلوبة. باستخدام سرعة المسح الضوئي من 0.25 ، واكتملت الحصول على الطيفية z - كومة في ~ 3 دقائق. يمكن زيادة سرعة المسح الضوئي أو تقليلها اعتمادا على الفلوروفوريس المستخدم. على سبيل المثال، بالنسبة للفلوروفورات الأكثر سطوعا مثل eGFP، يمكن استخدام سرعة مسح أسرع (إطاران/ثانية). الرقم الذي تم إدخاله تحت العد يتوافق مع قيمة متوسط الإطار 4 ، مما يساعد في تقليل الضوضاء أثناء الحصول على الصورة. بالنسبة للعينات المستقرة جدا وحيث الوقت ليس قيدا ، يمكن استخدام قيم متوسط أعلى (تصل إلى 16) للحصول على صور مع تحسين SNR.
  10. تعريف معلمات اكتساب z-stack:
    ملاحظة: قد تحتاج القيم المدخلة في الخطوات 2.10 إلى تعديل لاستيعاب التغييرات في ربط التسمية الفلورية أو تركيزها، ونوع التسمية، وعدد التسميات المستخدمة، وخط الخلية، والتغييرات الأخرى في إعداد العينة التي قد تؤثر على كثافة وضع العلامات على الخلايا و/أو الفلورة الذاتية الخلوية. عند ضبط معلمات الاستحواذ، ينبغي توخي الحذر لتحقيق خدمة SNR كافية مع تقليل الbleaching الضوئي. بالإضافة إلى ذلك، عند تكوين المقايسة الطيفية FRET، ينبغي توخي الحذر لضمان أن المعلمات تعمل بشكل جيد عبر جميع مجموعات العلاج. من المستحسن تشغيل تجربة لكل مجموعة علاج مع إعدادات المعلمة المقترحة لضمان أن SNR كافية وتقليل الbleaching الضوئي.
    1. افتح نافذة الاستحواذ على ND بالنقر فوق عرض التحكم في الاستحواذ → → اكتساب ND.
    2. أدخل المسار/الوجهة واسم ملف لحفظ الملف ND على الإطار المنبثق.
    3. حدد المربع المطابق لسلسلة z.
    4. انقر على العيش في نافذة إعدادات A1 زائد. سيؤدي ذلك إلى فتح نافذة عرض مباشرة.
    5. ضبط مقبض التركيز على المجهر لتحديد الجزء العلوي من الخلية وانقر فوق الأعلى في إطار اكتساب ND لتعيين الموضع الحالي كأعلى.
      ملاحظة: يقترح التركيز قليلا فوق الجزء العلوي من الخلية للتأكد من أن كافة الخلية يتم أخذ عينات في سلسلة z.
    6. ضبط مقبض التركيز على المجهر لتحديد الجزء السفلي من الخلية وانقر على أسفل في إطار اكتساب ND لتعيين الموقف الحالي كما في الجزء السفلي.
      ملاحظة: التركيز قليلا أسفل أسفل الخلية للتأكد من أن يتم أخذ عينات من كافة الخلية.
    7. أدخل 1 ميكرومتر لحجم الخطوة، وحدد الجزء العلوي السفلي للاتجاه z-المسح الضوئي وانقر فوق تشغيل على إطار اكتساب ND للحصول على z-كومة.
      ملاحظة: يحدد حجم الخطوة عدد شرائح z التي سيتم الحصول عليها اعتمادا على المواقع العلوية والسفلية (أي المسافة المقطوعة). تم اختيار حجم خطوة 1 ميكرومتر كحل وسط بين سرعة التصوير وأخذ عينات محور z وbleaching. باستخدام قطر الثقب confocal من 2.4 الاتحاد الافريقي والهدف 60x الغمر المياه أدى إلى سمك المقطع البصري من 1.73 ميكرومتر. وبالتالي، فإن حجم خطوة 1 ميكرومتر أقل قليلا من معايير أخذ العينات Nyquist، ولكن هذا هو الحل الوسط الذي تم إجراؤه لتقليل الوقت اللازم للحصول على z-كومة. بالنسبة للعينات المستقرة جدا، والتي لا تعتبر السرعة حرجة بالنسبة لها، يمكن استخدام خطوة أصغر من محور z وربما قطر ثقب كونفوج أصغر لزيادة دقة المحور z. يجب أن يؤدي الجزء السفلي العلوي إلى نتائج مماثلة ويمكن استخدامه لتقييم أي آثار للbleaching الضوئية التي قد تحدث أثناء الفحص z.
  11. إعداد نظام التركيز المثالي (PFS) إذا كان متوفرا:
    ملاحظة: يسمح PFS للنظام بالتعويض عن التقلبات في العمق البؤري أثناء الحصول على الصورة. قد يتم استخدام الخطوات التالية لإعداد PFS، وقد تختلف هذه الخطوات قليلا استنادا إلى إصدار نيكون A1R وإصدار NIS Elements المستخدم.
    1. تمييز الوضع المتماثل المعرف بواسطة رمز النطاق في إطار اكتساب ND.
    2. قم بتشغيل زر PFS على الوجه الأمامي للمجهر (تأكد من أن مقبض المرآة الديكهروي الموجود في القسم أسفل مرحلة العينة هو 'في').
    3. أعد تعريف الجزء العلوي (تدوير عكس عقارب الساعة) والسفلي (تدوير باتجاه عقارب الساعة) باستخدام المقبض على الوجه الأمامي لوحدة تحكم إزاحة PFS.
    4. تعريف نسبي z-position/z-العمق بالنقر فوق 'النسبي' على إطار اكتساب ND.
    5. انقر فوق الذاكرة على الوجه الأمامي للمجهر بحيث يحفظ البرنامج عمق z النسبي.
  12. بعد اكتمال عملية الاستحواذ على z-stack، أضف الكاشف المطلوب برفق (forskolin أو التحكم في السيارة) باستخدام ماصة وانتظر لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: إضافة الكاشف بلطف شديد حتى لا تزعج الخلايا أو تحريك موضع غرفة الخلية داخل المجهر XY المرحلة; من المفيد التحقق في عرض مباشر لاحق أو صورة من أن حقل الرؤية لم يتغير أثناء إضافة الكاشف. وقت الانتظار لمدة 10 دقائق هو لعلاج فورسكولين حيز التنفيذ. إذا تم استخدام علاج بديل، قد تحتاج إلى تعديل وقت الانتظار.
  13. بعد 10 دقائق تغيير اسم الملف ثم انقر فوق تشغيل في إطار الحصول على ND.
  14. كرر الخطوات 2.11 - 2.13 كما هو موضح أعلاه لما لا يقل عن 5 يغطي الأغطية وذلك لتحقيق نتائج كافية للتحليل الإحصائي (ن = 5 لكل مجموعة العلاج - فورسكولين والتحكم في السيارة).
  15. إعداد عينات وعينات فارغة لبناء المكتبة الطيفية والحصول على صور طيفية باستخدام إعدادات اقتناء مماثلة كما هو موضح في الخطوتين 2-9 و 2-10.

3. تحليل الصور

ملاحظة: سيتم استخدام هذه الصور لبناء مكتبة طيفية تحتوي على الأطياف النقية لجميع أعضاء النهاية الفردية الموجودة في الدراسة. قد تختلف الأعضاء النهائية في المكتبة الطيفية من دراسة إلى أخرى إذا تم استخدام الفلوروفوريس المختلفة. 10- وترد إجراءات مفصلة لبناء المكتبة الطيفية في ملف معلومات تكميلي يسمى "مكتبة File_Spectral التكميلية". هنا، نقوم بوصف تصدير البيانات إلى ملفات .tiff، والطياف الطيفي الخطي، وقياسات كفاءة FRET، وإعادة البناء ثلاثي الأبعاد، وتقدير مستويات cAMP. يمكن إجراء تحليل الصور باستخدام أنظمة تحليل وبرمجة مختلفة للصور مثل ImageJ أو Python أو MATLAB أو CellProfiler. في هذه الدراسات، تم استخدام نصوص MATLAB.

  1. تصدير بيانات الصور:
    1. إنشاء مجلدات جديدة بنفس اسم الملف المطابق للصور الطيفية z-المكدس المكتسبة في الخطوتين 2.13 و 2.14.
      ملاحظة: الخطوات التالية الموضحة لتصدير البيانات محددة ل NIS عناصر AR الإصدار 4.30.01. قد تختلف هذه الخطوات قليلا استنادا إلى إصدار البرنامج.
    2. انقر فوق ملف، الذي سيفتح نافذة ملف. تصفح وحدد ملف الصورة الطيفية المكتسبة في الخطوة 2.12 وانقر فوق فتح.
    3. بمجرد تحميل الملف، انقر فوق ملف→ استيراد/تصدير→ تصدير مستند ND.
    4. في النافذة المنبثقة: استعرض وحدد المجلد الذي تم إنشاؤه في الخطوة 3.1.1، وحدد تنسيق الصورة المعلمة (TIF) لنوع الملف، ثم حدد صورة أحادية لكل قناة والحفاظ على عمق البت.
      ملاحظة: سيتم إنشاء بادئة الملف مسبقا; تغيير هذه القيمة من أجل الراحة. سيتغير ترتيب الفهرس اعتمادا على القنوات المحددة، ويجب أن يعرض "z, c" للفهرسة وفقا لموقع شريحة z أولا ورقم النطاق الطول الموجي الثاني. تأكد من أن المربعات المطابقة لتطبيق LUTs أو إدراج تراكبات أو استخدام أسماء النقاط غير محددة.
    5. انقر فوق تصدير لتصدير ملفات tiff إلى مجلد وجهة كملفات tiff الفردية.
    6. كرر الخطوات 3.1.2 - 3.1.5 لتصدير ملفات الصور الطيفية المكتسبة في الخطوة 2.13.
  2. الطيز الطيفي الخطي:
    1. افتح برنامج البرمجة.
      ملاحظة: يتم توفير مخصص النصي البرمجة المتقدمة إلى الصور الطيفية الخام unmix على جامعة جنوب ألاباما بيوماينج وموقع BioSystems، تحت علامة التبويب الموارد (https://www.southalabama.edu/centers/bioimaging/resources.html).
    2. افتح الملف المسمى "خطي Unmixing.m" وانقر فوق زر التشغيل في شريط أدوات المحرر.
    3. استعرض وحدد المجلد الذي يحتوي على تسلسل الملف *.tif المصدر الذي تم إنشاؤه بواسطة برنامج NIS Elements.
    4. انقر فوق موافق للمتابعة، والتي ستفتح نافذة جديدة تسمى الطول الموجي و Z-شريحة.
    5. نسخ اسم الملف الأول (بدون شريحة z ورقم القناة) في المجلد المحدد في الخطوة 3.2.4 ولصقه في الخطوة الأولى من مربع الحوار المسمى "أدخل اسم الصورة".
    6. أدخل عدد القنوات في الخطوة الثانية المسماة "أدخل عدد نطاقات الطول الموجي"، وعدد شرائح z في الخطوة الثالثة المسماة "أدخل عدد شرائح Z" وانقر فوق موافق.
      ملاحظة: قد يتغير عدد نطاقات الأطوال الموجية إذا تم إجراء تغييرات على إعدادات الامتلاك، مثل ضبط نطاق الطول الموجي أو حجم خطوة الطول الموجي. قد يتغير عدد شرائح Z أيضا اعتمادا على ارتفاع الخلية.
    7. تصفح وحدد ملف الطول الموجي المسمى "Wavelength.mat" في النافذة المنبثقة المسماة "حدد ملف معلومات الطول الموجي" وانقر فوق فتح.
    8. استعرض وحدد ملف "Library.mat" في النافذة المنبثقة الجديدة المسماة "حدد ملف المكتبة الطيفية"، وانقر فوق فتح وانتظر حتى يتم الانتهاء من إلغاء تقسيم الشرائح.
      ملاحظة: ملف Library.mat هو ملف يحتوي على أطياف نقية لكل فلوروفوري عضو نهاية مع الفلورورسينس الخلية والتوقيعات الطيفية الخلفية. في هذه الحالة، تشمل الفلوروفوريس الأعضاء النهائية الفيروز والزهرة وDRAQ5. وتشمل التوقيعات الطيفية الخلفية الفلورة الخلوية أو المصفوفة، وفلورة الأغطية، والحيود coverslip. ملف Wavelength.mat هو ملف يحتوي على معلومات قناة الطول الموجي المستخدمة للحصول على الصورة الطيفية. يتوفر ملف مكتبة مثال وملف الطول الموجي على موقع الويب الخاص بالتمييم الحيوي والنظم الحيوية (انظر الملاحظة تحت 3.2.1). لمزيد من المعلومات حول كيفية إنشاء مكتبة طيفية وملفات الطول الموجي، راجع ملف معلومات تكميلية باسم "مكتبة File_Spectral التكميلية". سيتم حفظ الصور غير المهولة المقابلة لكل شريحة z في المجلد المسمى "Unmixed" الذي تم إنشاؤه أثناء عملية الدمج داخل المجلد الذي تم تحديده في الخطوة 3.2.3.
  3. حساب الكفاءة FRET:
    1. افتح البرنامج النصي البرمجي المسمى "multiFRRCF.m" وانقر فوق تشغيل.
      ملاحظة: يتوفر ملف البرمجة هذا من موقع جامعة جنوب ألاباما للتصوير الحيوي والنظم الحيوية (انظر الملاحظة تحت الخطوة 3.2.1).
    2. أدخل عدد التجارب التجريبية لتحليلها في مربع الحوار المنبثق المسمى "كم عدد المجلدات التي يجب إعادة تشريحها" وانقر فوق موافق.
      ملاحظة: يجب حفظ بيانات الصورة من كل تجربة في مجلد صورة غير مطلق منفصل. تسمح هذه الخطوة ببساطة رمز التحليل حلقة عبر العديد من المجلدات كخطوة توفير الوقت.
    3. تصفح وحدد المجلد (المجلدين) غير المهولين وانقر فوق موافق.
      ملاحظة: يعتمد عدد المرات التي يفتح إطار منبثق "استعراض للمجلد" على الرقم الذي تم إدخاله في مربع الحوار "كم عدد المجلدات لإعادة تشريحها" في الخطوة السابقة. استعرض وحدد المجلدات واحدا تلو الآخر.
    4. في النافذة المنبثقة الجديدة، أدخل المعلومات التالية في المربعات المعنية: عامل القياس هو 12.4، والعتبة هي 5.6، X، Y، وZ Frequency هي 5 و5 و1 على التوالي، وخوارزميات التنعيم هي غاوسية.
      ملاحظة: عامل القياس قيمة بالبكسل/ميكرومتر وسيتم استخدامه في قياس أخذ العينات اتجاه Z إلى أن الاتجاه XY. يتم الحصول على عامل التحجيم من حجم بكسل الصورة ، والذي يتم توفيره عادة كالبيانات الوصفية في الصورة لمعظم أنظمة المجهر confocal. على سبيل المثال، إذا تم الحصول على الصورة مع تباعد 0.08 ميكرومتر/بكسل، يجب أن يكون عامل القياس 12.5 بكسل/ميكرومتر. سيتم استخدام قيمة العتبة عتبة الصور وتوليد قناع ثنائي للخلية. أنشأنا قائمة بالقيم المثلى استنادا إلى كثافة المتبرع +المقبول للصورة. استخدم 4.5 كقيمة عتبة إذا كانت الصورة تحتوي على كثافة متبرع + مقبول مشرق وخلفية منخفضة ، وقيمة تتراوح بين 5.6 إلى 6.5 للصور التي تحتوي فقط على كثافة متوسطة + متبرع + مقبول و / أو خلفية أعلى ، وقيمة 7.5 وما فوق للصور التي تحتوي على كثافة المانح + المقبول التي هي أقل من الخلفية. تتوافق قيمة التكرار مع الفاصل الزمني، بعدد وحدات البكسل، حيث يتم تنفيذ التقطيع في الخطوات اللاحقة. على سبيل المثال، إذا كان عمق Z للخلية هو 17 ميكرومتر بحجم خطوة 1 ميكرومتر ويتم استخدام عامل قياس 12.5 بكسل/ميكرومتر في اتجاه XY، إعادة ختم عمق مجموعة بيانات الصورة ثلاثية الأبعاد عند 212 بكسل (اتجاه Z). استنادا إلى قيمة التردد Z التي تم إدخالها (على سبيل المثال، بكسل واحد)، سيتم إعادة تقسيم مجموعة بيانات الصورة ثلاثية الأبعاد بداية من أعلى مجموعة بيانات الصورة ثم تتحرك بزيادات بمقدار بكسل واحد إلى الأسفل. وينتج عن ذلك 212 صورة أعيد تقطيعها. إذا تم إدخال فاصل زمني أكبر لقيمة التردد لتردد Z، إنشاء عدد أقل من الصور التي تم إعادة تقطيعها. يتم حفظ الصور التي تم إعادة تقطيعها في خطوات لاحقة.
    5. انقر فوق تشغيل وانتظر حتى يتم تنفيذ كافة القياسات FRET وإعادة تقطيع.
      ملاحظة: يتم إنشاء مجلد منفصل داخل الدليل الأصل الذي يتم حفظ الصور كفاءة FRET تدرج الرمادي resliced والصور ذات اللون (تطبيق خريطة ملونة) FRET الكفاءة. على سبيل المثال، يتم حفظ كافة الصور FRET الرمادي وخريطة اللون resliced في الاتجاه X (YZ plane) في مجلد يسمى "Resliced_XFRET".
    6. كرر التحليل مع إعدادات مماثلة لجميع التجارب – قبل وبعد علاجات فورسكولين وضوابط السيارة.
      ملاحظة: توضح الخطوات المذكورة في المقطع 3.3 القيم لإدخال مخصص FRET تحليل البرمجة النصية لإنشاء بيانات صورة FRET ثلاثي الأبعاد. ومع ذلك، ينفذ هذا البرنامج النصي عدة عمليات أثناء التشغيل، بما في ذلك: تحميل بيانات الصور، وإنشاء مداخن الصور، والتنعيم، وحسابات كفاءة FRET، وإنشاء وتطبيق قناع حدود الخلية، وإعادة بناء الصور ثلاثية الأبعاد، وإعادة تقطيع الصور ثلاثية الأبعاد على فترات محددة (الترددات)، وتطبيق خريطة ملونة لتصور تغييرات FRET، وحفظ بيانات الصورة التي تم إعادة تقطيعها إلى نفس الدليل. تم تضمين تفاصيل إضافية كتعليقات في البرنامج النصي للبرنامج.

4. رسم خرائط كفاءة FRET لمستويات cAMP

  1. افتح ملف البرمجة المسمى "Mapping_FRET Efficiency_to_cAMP_concentration.m" وانقر فوق تشغيل على النافذة الرئيسية.
    ملاحظة: الملف متوفر على موقع "بيو إيماجينج" و "النظم الحيوية" (انظر الملاحظة تحت 3.2.1). يقرأ هذا الملف الصور ذات التدرج الرمادي من الكفاءة FRET ويحولها إلى مستويات cAMP استنادا إلى منحنى مميز. يستخدم هذا المنحنى المميز علاقة cAMP-to-FRET الموثقة في الأدب15،36 الموضحة في معادلة هيل (المعادلة الثالثة الموضحة أدناه). ومع ذلك ، من الصعب تقدير Kd من المسبار في الخلايا السليمة وافترضنا أنه 1 ميكرومتر في حساباتنا. ومن ثم، تظهر النتائج كدالة ل Kd. (أي [ cAMP ] = x * Kd). وترد أدناه المعادلات المستخدمة لقياس كفاءة FRET ورسم خرائط FRET لمستويات CAMP:
    Equation 1
    حيث E هو كفاءة FRET،وظاهر و دواضحة هي كثافة بكسل unmixed من الصور المقبولة والمانحة، على التوالي.
    Qa و Qd هي غلة الكم من المقبول والمتبرع. لاحظ أن Qa و Qd يلغيان عندما يتم دمج معادلة kλ في معادلة الكفاءة FRET ، kλ هو عامل تصحيح:
    Equation 2
    Equation 3Equation 4وهي معاملات الانقراض من المانح والمقبل في الطول الموجي الإثارة المانحة، i (405nm).
    Equation 5
    E هو كفاءة FRET وKD = ثابت التفكك = 1 ميكرومتر.
  2. انتقل وحدد أول صورة FRET مقياس رمادي (حفظها في الخطوة 3.3.5) وانقر فوق موافق.
  3. افتح صور FRET/cAMP لفحص توزيع إشارات cAMP في ثلاثة أبعاد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يصف هذا البروتوكول استخدام نهج التصوير والتحليل فائق الطيفية FRET لقياس تدرجات cAMP في ثلاثة أبعاد مكانية في الخلايا الحية. وهناك عدة خطوات رئيسية في تحقيق هذه النتائج، يلزم إيلاء اهتمام دقيق لها أثناء تحليل البيانات وقياسها كميا. وتشمل هذه الخطوات الرئيسية بناء مكتبة طيفية مناسبة، وطيافات خلفية، وتحديد عتبات لتحديد حدود الخلايا، وحسابات كفاءة FRET. يوضح الشكل 1 التدفق التخطيطي لجميع الخطوات التي ينطوي عليها قياس كفاءة FRET ومستويات CAMP في الخلايا الحية. وعند تنفيذ خطوات التصوير والتحليل هذه بشكل صحيح، فإنها ستسمح بقياس كفاءة FRET وتقدير التدرجات المكانية ل cAMP في 3 أبعاد في الخلية، مع احتساب إشارات الخلفية غير الموحدة.

يصور الشكل 2 وجهات النظر ثلاثية الأبعاد لبيانات الصور الهايبرسبرالية الخام ذات الألوان الزائفة التي تم الحصول عليها باستخدام مجهر نيكون A1R confocal عند ظروف خط الأساس(الشكل 2A)وبعد 10 دقائق (الشكل 2B) علاج فورسكولين. لاحظ أنه تم استخدام معلمات مماثلة للكشف والنظام للحصول على أكوام صور المعالجة قبل وبعد المعالجة للحفاظ على الاتساق للتحليل الكمي. لاحظ أيضا أن التغييرات في FRET ليست واضحة في هذه الصورة ، لأن هذا هو مجرد تصور للبيانات الخام ، قبل حساب كفاءة FRET.

وهناك حاجة إلى مكتبة طيفية مع أطياف نقية من جميع الأعضاء النهائيين لمزيد من تحليل بيانات الصورة الطيفية الخام. بناء مكتبة طيفية مناسبة هي واحدة من الخطوات الرئيسية لضمان القياسات المناسبة لكفاءة FRET. يوضح الشكل 3 بناء مكتبة طيفية تحتوي على الأطياف النقية للأعضاء النهائيين (في هذه الدراسات الحالية ، فإن الأعضاء النهائيين هم الفيروز والزهرة وDRAQ5). لقياس كفاءة FRET ، من المهم الحصول على أطياف الفيروز والزهرة باستخدام عينة مع قياس ستويتشوميتري 1:1. هنا، قدمنا نهجا حيث يتم تدمير الفلوروفور المقبول بالكامل، مما يسمح بالتوقيع الطيفي للمتبرع والمقبل مع قياس ستويتشوميتري 1:1 الذي سيتم الحصول عليه(الشكل 3A-F). وبالإضافة إلى ذلك، تم تطبيق علاقات القوة الخطية بين أشعة الليزر(الشكل التكميلي 1)لحساب الطيف المقبول مع كثافة التي من المتوقع إذا كان متحمسا باستخدام الليزر الإثارة المانحة، في هذه الحالة 405 نانومتر للفيروز (الشكل 3G). وهذا يضمن أن إشارات المانحة والمتقبلة غير المفرخة قابلة للمقارنة في الكثافة المطلقة عندما تكون FRET متحمسة بخط ليزر واحد 405 نانومتر. استخدمت الخلايا غير المصابة المسماة بالصبغة النووية DRAQ5 (الشكل 3H) للحصول على الطيف النقي من DRAQ5 (الشكل 3I). الجمع بين أطياف المانح، الفيروز (الشكل 3F)،المقبول، الزهرة (الشكل 3G)، وDRAQ5 (الشكل 3I)، تم إنشاء مكتبة مكونة من 3 (الشكل 3J).

قد تكون الإشارات من مصادر أخرى غير ملصقات الفلورسنت موجودة أيضا في عينة. ولحصر هذه النماذج، تم تحديد ثلاثة تواقيع طيفية مختلفة ذات قمم تحدث عند 424 نانومتر و504 نانومتر و574 نانومتر داخل عينات خلوية غير محددة. ونحن نعتقد أن هذه التوقيعات الطيفية تتوافق مع انعكاس الغطاء ومصفوفة الخلية أو الفلوروريسينس الخلوي. ويصور الشكل 4 مصادر هذه التوقيعات الطيفية الثلاثة للخلفية. ومن المهم ملاحظة أن هذه الإشارات توزع بشكل غير موحد داخل العينة، وبالتالي لا يمكن طرحها ببساطة. ومع ذلك، فإن إضافة التوقيعات الطيفية لهذه الإشارات إلى المكتبة الطيفية واستخدام التشوه الخطي لفصل الإشارات يمثل نهجا لإزالة هذه الإشارات المحيرة من إشارات المانح والمقبول قبل حساب كفاءات FRET. ولتحقيق ذلك، أضيفت التوقيعات الطيفية الخلفية الثلاثة إلى المكتبة الطيفية المكونة من ثلاثة مكونات، وشكلت مكتبة جديدة مكونة من 6 مكونات تتكون من المانح (الفيروز) والمقبل (فينوس) وDRAQ5 وثلاثة توقيعات طيفية خلفية.

تمت كتابة برنامج نصي برمجة مخصصة إلى unmix بيانات الصورة الطيفية إلى endmembers الفردية، وتم كتابة برنامج نصي منفصل لإجراء حسابات الكفاءة FRET اللاحقة. تم تنفيذ الطياف الطيفي الخطي (الموضح في الشكل 5)باستخدام المكتبة الطيفية المكونة من 6 مكونات. تم تنفيذ Unmixing لكل شريحة في كومة الصور المحورية ، ويشار إليها أيضا باسم z-stack (راجع التصور ثلاثي الأبعاد لبيانات الصورة الطيفية الخام في الشكل 5A). وأدى ذلك إلى صور منفصلة غير مطلقة لكل عضو، لكل شريحة z في المكدس z(الشكل 5C-E،لا تظهر الصور غير المهولة في الخلفية). إذا رغبت في ذلك، قد تكون الإشارات غير المهذبة ذات لون زائف للتصور بلون مختلف معين لكل إشارة غير مطلقة(الشكل 5F-H).

ويوضح الشكل 6 الخطوات التي تنطوي عليها حسابات الكفاءة في FRET، وكذلك خطوات رسم خرائط كفاءة FRET لمستويات CAMP. تم إنشاء صورة كفاءة FRET باستخدام صور المانح والمقبول الممهدة. تم الحصول على صورة قناع ثنائي باستخدام المانحة unmixed، والمقبل، والصور النووية. تم تطبيق القناع على صورة كفاءة FRET لإزالة المساهمات من وحدات البكسل خارج الخلية. على الرغم من أن الصور غير المفرغة من شرائح z المفردة استخدمت في العرض التصويري لقياسات كفاءة FRET ، فقد تم إجراء هذه الحسابات على كل شريحة داخل كومة الصور ثلاثية الأبعاد. ثم أعيد تقطيع مجموعة بيانات صورة FRET ثلاثية الأبعاد في ثلاث مستويات متعامدة لتصور التدرجات المكانية لإشارات cAMP في اتجاهات مختلفة.

تصور التغيرات الناجمة عن ناهض في كفاءة FRET ومستويات cAMP
توفر الخطوات المذكورة أعلاه طريقة لحساب كفاءة FRET ومستويات cAMP من بيانات الصور الطيفية الفائقة في ثلاثة أبعاد مكانية. يمكن تطبيق هذه الخطوات على الاستعدادات الخلوية قبل وبعد العلاج بالمركبات التي تثير استجابة CAMP ، مثل فورسكولين. هنا، نقدم مثالا على استخدام هذا النهج لمراقبة التغيرات في FRET وتوزيع cAMP في PMVECs بعد العلاج مع 50 ميكرومتر فورسكولين. يوضح الشكل 7 التغيرات في كفاءة FRET ومستويات cAMP في شرائح مختلفة من مستوى XY (شرائح z) ، من apical إلى القاعدية ، مما يسمح بمقارنة ظروف خط الأساس (قبل علاج فورسكولين) و10 دقائق بعد العلاج. في هذا المثال التوضيحي، انخفضت كفاءة FRET (العمودان 1 و 3 في الشكل 7)عند علاج فورسكولين، مما يرتبط بزيادة في مستويات cAMP (العمودان 2 و 4 في الشكل 7). ولوحظ الحد الأدنى من التباين المكاني للجامب داخل طائرة XY واحدة. ومع ذلك ، لوحظت التدرجات المحورية (apical-to-basal) cAMP المكانية ، كما يمكن تخمينها من خلال ملاحظة أن الشريحة apical لها لون أحمر أعمق (مما يشير إلى مستويات cAMP أعلى من خلال جدول البحث عن اللون الذي تم تطبيقه) من الشريحة القاعدية بعد علاج فورسكولين (العمود 4 في الشكل 7). يمكن في كثير من الأحيان تصور توزيعات Axial FRET أو cAMP بشكل أفضل باستخدام الصور التي تم الحصول عليها من المستويين المكانيين المتعامدين: يصور الشكل 8 كفاءة FRET ومستويات cAMP في مستوى YZ عند خط الأساس (العمودان 1 و 2) وبعد 10 دقائق من علاج فورسكولين (العمودان 3 و 4) ، في حين يصور الشكل التكميلي 2 كفاءة FRET والتغيرات في مستوى CAMP في مستوى XZ. وتبين هذه النتائج جدوى قياس FRET وتقدير مستويات CAMP من بيانات الصور الطيفية الفائقة الأبعاد ثلاثية الأبعاد، كما توضح أهمية تصور التوزيعات المحورية ل FRET أو cAMP. وفي حين أنه خارج نطاق هذه الورقة المنهجية، فقد يكون التوزيع المكاني المحوري للنيوكليوتيدات الدورية يسهم في خصوصية مسارات الإشارات بالنيوكليوتيدات الدورية.

عند تنفيذ الأساليب المذكورة أعلاه ، من المهم التحقق بدقة من دقة الخطوات وتشغيل الضوابط التجريبية والمركبات المناسبة لضمان أن التغييرات في FRET (وcAMP المقابلة) ترجع إلى تغييرات فعلية في إشارات المانحة والمقببة وليست قطعا أثرية للتصوير. على سبيل المثال، تتضمن الخطوات الهامة التي يجب مراعاتها ما يلي:

استخدام مكتبة طيفية مناسبة تحتوي على جميع المكونات الطيفية المطلوبة
كما ذكر، يمكن أن يكون هناك مساهمة كبيرة من إشارات الخلفية من autofluorescence الخلوية، مصفوفة المودعة، أو الضوء المنعكس من coverlip (الإثارة الانبعاثات تنزف من خلال). يمثل الشكل 9 مجموعة بيانات مثال توضح أنه تم الاحتفاظ بإشارة الخلفية داخل الصور عندما تم استخدام مكتبة مكونة من 3 مكونات (الفيروز والزهرة وDRAQ5) لطي البيانات الطيفية. وعلى النقيض من ذلك، أزيلت إشارة الخلفية بشكل فعال عند استخدام مكتبة طيفية أكثر اكتمالا (ومناسبة) مكونة من 6 مكونات.

استخدام قيمة عتبة أمثل لإنشاء قناع خلية
في العديد من التجارب التي قمنا بها، تبلغ كثافة إشارة الخلفية ما يقرب من 50-60٪ من كثافة إشارة FRET الموجودة داخل بيانات الصورة الطيفية الخام (أي عند تصور بيانات الصور الطيفية غير المجهزة، تكون ذروة إشارة FRET أعلى ب ~2X فقط من إشارة الخلفية المحيطة). وبالتالي، فصل إشارة الخلفية من إشارة المقدمة باستخدام قيمة عتبة للحصول على قناع ثنائي هو خطوة حساسة ويجب أن يتم بعناية من أجل تجنب تحليل القطع الأثرية. يوضح الشكل 10 تأثير قيم العتبة المختلفة المطبقة على تجزئة الخلية لإنشاء قناع ثنائي للخلية. قد تتضمن قيمة عتبة منخفضة إشارة خلفية كجزء من الخلية المعبرة. ومن ناحية أخرى، قد تحول قيمة العتبة المرتفعة بشكل مفرط دون قياس FRET في الخلايا المنخفضة التعبير أو مناطق الخلية ذات إشارة المانح+المقبول المنخفضة (إما أجزاء رقيقة جدا من الخلية أو أجزاء قد يكون تركيزها الإقليمي أقل من مسبار FRET).

اختيار خلية مصابة مع المانح + شدة إشارة القبول ≥ إشارة الخلفية
ويبين الشكل 11 مجموعة بيانات نموذجية حيث تم قياس كفاءة FRET ومستوياتها المناظرة من الصور غير المهولة التي تم الحصول عليها باستخدام مكتبة طيفية مكونة من 6 مكونات للطياف الخطي. على الرغم من استخدام المكتبة المكونة من 6 مكونات لبيانات الصور الطيفية غير المطلقة واختيار عتبة عالية لإنشاء حدود الخلية والقناع النووي ، كانت صور كفاءة FRET لا تزال عرضة لإشارة ضوضاء خلفية عالية بالقرب من الجانب القاعدي للخلية. في هذه الحالة ، كان وجود ضوضاء الخلفية بسبب اختيار خلية كانت تعبر فقط بشكل ضعيف عن مسبار FRET ، وكانت قوة إشارة المانح + المقبول مساوية تقريبا لقوة إشارة الخلفية ، حتى بعد الإصابة. وهكذا، بالإضافة إلى تطبيق خطوات التحليل المتطورة المذكورة أعلاه، من المهم أيضا اختيار خلية ذات تعبير كاف عن مسبار FRET وإشارة FRET كافية في المقابل (إشارة المانح والمقبول على الأقل متساوية أو أعلى من إشارة الضوضاء) أثناء الاقتناء من أجل ضمان نتائج عالية الجودة.

Figure 1
الشكل 1: مخطط انسيابي يصور الخطوات التي تنطوي عليها كفاءة FRET وقياسات المستوى في ثلاثة أبعاد مكانية باستخدام التصوير والتحليل الفائق الطيفي FRET. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تصور ثلاثي الأبعاد لخلية تعبر عن مراسل CAMP FRET (أخضر) ونوى من الخلية والخلايا المحيطة غير المعبرة (حمراء). بيانات الصورة الطيفية الخام المكتسبة باستخدام مجهر نيكون A1R الطيفي confocal كانت ملونة كاذبة وفقا لطول الموجة وتصور في 3 أبعاد باستخدام برنامج عناصر NIS. أ) بيانات الصور ثلاثية الأبعاد عند خط الأساس وB) بعد 10 دقائق من علاج فورسكولين 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: بناء مكتبة طيفية تحتوي على الأطياف النقية للتسميات الفلورية في الدراسة (يشار إليها باسم الأعضاء النهائيين من قبل مجال الاستشعار عن بعد). أ) صورة زائفة اللون للخلايا التي تعبر عن جهاز الاستشعار الحيوي FRET المكتسبة في 405 نانومتر الإثارة (الإثارة المانحة). ب) الطيف المقابل لإشارة FRET: تم رسم 4 مناطق مختلفة من الاهتمام (ROIs) على الصورة A التي تظهرها المستطيلات الحمراء والصفراء والزرقاء والخضراء. وتم تصدير متوسط الكثافة عند كل طول موجي لكل عائد استثمار مختار. وقد تم رسم متوسط الكثافة من هذه ال 4 ROIs عند كل طول موجي للانبعاثات. وتتوافق قمم الانبعاثات في الطيف مع كل من المانح (الفيروز) والمقبل (الزهرة) الفلوروفور. ج) صورة زائفة اللون من الخلايا التي تعبر عن الاستشعار البيولوجي FRET المكتسبة في 488 نانومتر الإثارة (acceptor الإثارة). د) قدر متوسط الطيف كما هو موضح في B من عدة مؤشرات استثمار في C (نفس المناطق كما هو الحال في A) مع ذروة الانبعاثات المستحقة فقط للمقبل. ه) صورة زائفة اللون من الخلايا التي تعبر عن الاستشعار البيولوجي FRET المكتسبة في 405 نانومتر الإثارة بعد تدمير الصورة من الفلوروفور مقبول من قبل 514 نانومتر الإشعاع. واو) قدر متوسط الطيف كما هو موضح في باء من عدة مؤشرات استثمار في E (نفس المناطق التي بلغ فيها المعدل A) ذروة الانبعاثات المستحقة للمانح فقط. لاحظ أن كثافة المانح تزداد في F بالمقارنة مع إشارة FRET الأصلية ، مما يشير إلى أنه بعد bleaching من المقبول ، يؤدي إثارة المانحين إلى انبعاث مباشر من المانحين. ز) الطيف المقبول كما هو متوقع إذا تم الحصول عليها باستخدام 405 نانومتر الإثارة. وقد قدر ذلك باستخدام الحقائق التي 405 نانومتر و 488 نانومتر ليزر الإثارة لديها استجابة الخطية التي يمكن أن تتميز باستخدام مطياف ودمج المجال(الشكل التكميلي 1)ومعامل الانقراض تعتمد على الطول الموجي من الزهرة. وبالتالي، يمكن تحويل طيف الزهرة التي تم الحصول عليها في 488 نانومتر الإثارة إلى الطيف فينوس التي من المتوقع إذا تم الحصول عليها في 405 نانومتر الإثارة H) صورة زائفة اللون من الخلايا المسماة مع التسمية النووية، DRAQ5. I) الطيف المتوسط من عدة مناطق ذات أهمية في H. J) المكتبة الطيفية الناتجة التي تحتوي على الأطياف النقية العادية للمتبرع وDRAQ5 والطيف المصحح للطول الموجي للإثارة للمقبل. لاحظ أن أطياف الفيروز والزهرة تم تطبيعها إلى أقصى قيمة للبيانات الطيفية المشتركة الفيروز + الزهرة في حين تم تطبيع DRAQ5 ببساطة إلى وحدة بقيمة الطول الموجي لذروة الانبعاثات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تم تحديد التوقيعات الطيفية الخلفية وإدراجها في المكتبة الطيفية لمراعاة إشارات تفلور الخلفية أثناء عملية التهكم. أ، ب) لوحظ توقيعان طيفيان مضانان للخلفية عند توصيف عينة فارغة (غطاء غير مسمى). وقد سميت هذه التوقيعات الطيفية على أساس أطوالها الموجية القصوى - واحدة في 424 نانومتر (من مضان coverslip) والأخرى في 504 نانومتر (على الأرجح من انعكاس أو تشتت الظهر). ج) لوحظ توقيع طيفي ثالث للخلفية بطول موجي ذروة انبعاث يبلغ 574 نانومتر عند تحليل الخلايا غير المسماة، وربما من الفلورة الذاتية الخلوية أو الفلورسينس للمصفوفة الأساسية. د) أطياف الخلفية المستخرجة من الصور A و B و C. وأضيفت هذه الأطياف الخلفية الثلاثة إلى المكتبة القائمة المكونة من ثلاثة مكونات(الشكل 3J)لتطوير مكتبة طيفية مكونة من 6 مكونات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: الطياف الطيفي الخطي باستخدام مكتبة طيفية مكونة من 6 مكونات تفسر إشارات الخلفية. أ) بيانات الصورة الطيفية الخام المكتسبة ككدسة z المحورية. ب) مكتبة طيفية مكونة من 6 مكونات تستخدم للبيانات الطيفية الخام غير المطلقة خطيا. C، D، و E) الرمادي مقياس الصور غير المهولة من DRAQ5، الفيروز، والزهرة، على التوالي، نتجت عن التجهم الطيفي الخطي. F، G، و H) صور ملونة زائفة غير مهولة من DRAQ5، الفيروز، والزهرة على التوالي. كما تم حساب الصور غير المفرخة لإشارات الخلفية (البيانات غير المعروضة هنا لأن الملصقات الفلورية فقط هي ذات أهمية لهذه المنهجية - الرجوع إلى الشكل 4 في Annamdevula ، وآخرون للحصول على أمثلة من إشارات الخلفية غير المفرخة25). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: مخطط انسيابي يصور الخطوات التي ينطوي عليها حساب مستويات FRET وcAMP من بيانات الصور الطيفية غير المفرطة. أ) صورة ممثلة غير مصورة للمانح، الفيروز. ب) صورة ممثل unmixed من المقبول، فينوس. ج) صورة ممثلة غير منقوسة من النوى، DRAQ5. D) يتم إنشاء قناع الخلية الثنائية عن طريق عتبة المانحة unmixed + acceptor صورة summed. ه) يتم تطبيق عتبة على الصورة النووية لإنشاء قناع ثنائي للنواة. F) تم حساب كفاءة البكسل WISE الحكيمة من صور المتبرع والمقبول غير المفرخة. ز) تم إنشاء قناع ثنائي مركب من حدود الخلية والأقنعة النووية. H) صورة الكفاءة FRET ملثمين: تم تطبيق قناع الخلية المركبة على صورة الكفاءة FRET لاستبعاد إشارات FRET غير محددة خارج الخلية وداخل النواة. I) تم تطبيق خريطة ملونة لصورة الكفاءة FRET ملثمين لتصور أفضل التغيرات المكانية في FRET. J) صورة مستويات cAMP التي تم تقديرها من صورة كفاءة FRET. K) تم تطبيق خريطة اللون لتصور أفضل التغيرات المكانية في cAMP. تم استخدام أشرطة الألوان المعروضة على الجانب الأيمن لتصور كفاءة FRET (اللوحة العليا) ومستويات cAMP (اللوحة السفلية). تمثل الصور المعروضة في هذا الشكل شريحة z محورية واحدة، ولكن يتم إجراء عملية التحليل الموضحة في هذا الشكل على المكدس المحوري بأكمله. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: كفاءة FRET الناجمة عن Forskolin والتدرجات المكانية cAMP التي يتم تصورها في PMVECs. تم إنشاء صور الطائرة XY عن طريق إعادة تقطيع بيانات صورة FRET و cAMP المعاد بناؤها ثلاثية الأبعاد في الاتجاه المحوري (Z) من الجانب القاعدي للخلية. يتم عرض خمس شرائح XY متجاورة. يمثل العمودان 1 و3 كفاءة FRET عند خط الأساس وبعد 10 دقائق من العلاج مع 50 ميكرومتر فورسكولين على التوالي. يشير العمودان 2 و4 إلى المستويات عند خط الأساس وبعد 10 دقائق من علاج فورسكولين. تم استخدام أشرطة الألوان لربط التغييرات في خريطة اللون بكفاءة FRET (أعلى) ومستويات cAMP (أسفل). تستخدم الخطوط البيضاء المعروضة على الصور في العمود 2 والعمود 4 لإنشاء ملف تعريف الكثافة (ملف تعريف مسح الخط) لإشارات cAMP عبر هذا الخط المحدد. مؤامرة الشخصية كثافة التي تم الحصول عليها من منتصف شريحة من الخلية في خط الأساس (التشكيل الجانبي الأزرق) وبعد علاج فورسكولين (التشكيل الجانبي الأخضر) يوضح التوزيع المكاني للإشارات cAMP عبر مسح الخط. يشير شريط المقياس إلى 20 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: كفاءة FRET الناجمة عن Forskolin والتدرجات المكانية cAMP التي يتم تصورها في الاتجاه المحوري. تم إنشاء صور طائرة YZ عن طريق إعادة تقطيع بيانات صورة FRET و cAMP المعاد بناؤها ثلاثية الأبعاد في الاتجاه الجانبي (X) (من الجانب الأيسر إلى الجانب الأيمن من الخلية). يمثل العمودان 1 و3 كفاءة FRET عند خط الأساس وبعد 10 دقائق من علاج فورسكولين 50 ميكرومتر على التوالي. العمودان 2 و4 يمثلان مستويات cAMP عند خط الأساس وبعد 10 دقائق من علاج فورسكولين. تم استخدام أشرطة الألوان على اليمين لربط التغييرات في خريطة الألوان بكفاءة FRET (أعلى) ومستويات cAMP (أسفل). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 9
الشكل 9: مقارنة فعالية استخدام إما مكتبة طيفية مكونة من 3 مكونات أو 6 مكونات لحساب صور مستويات FRET وcAMP. ولوحظت إشارات خلفية غير محددة في صور محسوبة باستخدام مكتبة مكونة من ثلاثة مكونات، لا تراعي التوقيعات الطيفية للخلفية. وينطبق هذا بشكل خاص على الصور القريبة من الجانب القاعدي من الخلية بعد علاج فورسكولين 50 ميكرومتر (العمود 2). وعلى النقيض من ذلك، تمت إزالة القطع الأثرية للإشارات الخلفية بشكل فعال عند استخدام مكتبة مكونة من 6 مكونات تتضمن توقيعات طيفية خلفية، مما يحسن القدرة على تقسيم الخلية وتحليل إشارات FRET وcAMP. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 10
الشكل 10: يمكن إدخال صور تحليل القطع الأثرية إذا لم يتم تحديد قيمة عتبة مناسبة لتحديد الخلية والحدود النووية. واستخدمت صور المانحين والمتقبلين غير المهولين لإنشاء قناع بثلاث قيم عتبة مختلفة: 0.35 (الأعمدة 1 ك 2)، و0.65 (العمودان 3 و4)، و0.9 (العمودان 5 و6). تعرض الأعمدة 1 و3 و5 كفاءة FRET عند خط الأساس. تعرض الأعمدة 2 و4 و6 كفاءة FRET في 10 دقائق بعد معالجة فورسكولين 50 ميكرومتر. أدى تحديد عتبة منخفضة جدا إلى تضمين أجزاء من الخلفية، أو منطقة خارج الخلية، مع الخلية للتحليل، بينما أدى تحديد عتبة عالية جدا إلى فقدان جزء من الخلية (انظر الشريحة apical في الأعمدة 4-5 بالمقارنة مع الأعمدة 3-4). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 11
الشكل 11: قد تستمر القطع الأثرية لإشارة الخلفية حتى بعد إلغاء تحديد الخلفية وتحديد عتبة مناسبة أثناء إنشاء قناع ثنائي. يظهر العمود 1 شرائح تمثيلية، متوسطة، وباسالية عند خط الأساس، ويظهر العمود 2 نفس الشيء في 10 دقائق بعد علاج فورسكولين 50 ميكرومتر. على الرغم من استخدام مكتبة مكونة من 6 مكونات للملم التي تمثل إشارات الخلفية واستخدام عتبة أعلى من 0.85 لتوليد قناع ثنائي، كانت المناطق الخلفية لا تزال تعرف بأنها جزء من الخلية، وخاصة بعد العلاج مع فورسكولين. إذا حدث هذا، قد يكون التفسير المحتمل هو أنه تم اختيار خلية ذات تعبير ضعيف لمراسل FRET للتصوير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: قياسات كثافة خط الليزر كدالة لإعداد الليزر في البرنامج. تم معايرة مطياف مقترن بالألياف ومجال متكامل إلى مصباح يمكن تتبعه من NIST لقياس كثافة الليزر لكل من خط الليزر 405 نانومتر وخط الليزر 488 نانومتر. أ) العدد الإجمالي للفوتونات التي تقاس في مرحلة المجهر المقابلة لكثافة الليزر المختلفة لليزر 405 نانومتر. ب) إجمالي عدد فوتونات قياسها في مرحلة المجهر المقابلة لكثافة الليزر المختلفة من الليزر 488 نانومتر. ولوحظت استجابة خطية في كثافة الليزر لكل من أشعة الليزر كما تقاس في مرحلة المجهر. كان خط الاتجاه الخطي مناسبا واستخدمت معادلة خط الاتجاه لكل خط ليزر لحساب طيف المقبول الذي كان متوقعا إذا كان متحمسا لخط الليزر 405nm (إثارة المتبرع). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 2: كفاءة FRET الناجمة عن Forskolin والتدرجات المكانية cAMP تصور في الاتجاه المحوري. تم إنشاء صور طائرة XZ عن طريق إعادة تقطيع بيانات صورة FRET و cAMP المعاد بناؤها ثلاثية الأبعاد في الاتجاه الجانبي (Y) (من الأمام إلى الخلف من الخلية). يمثل العمودان 1 و3 كفاءة FRET عند خط الأساس وبعد 10 دقائق من علاج فورسكولين 50 ميكرومتر على التوالي. العمودان 2 و4 يمثلان مستويات cAMP عند خط الأساس وبعد 10 دقائق من علاج فورسكولين. تم استخدام أشرطة الألوان على اليمين لربط التغييرات في خريطة الألوان بكفاءة FRET (أعلى) ومستويات cAMP (أسفل). على غرار النتائج المعروضة لطائرات YZ (الشكل 8) ، يمكن تصور التدرجات المكانية القاعدية في كفاءة FRET ومستويات cAMP كتغيرات في اللون من أعلى إلى أسفل شريحة YZ واحدة ، سواء في ظروف خط الأساس (أي شريحة معينة في الأعمدة 1-2) وبعد معالجة فورسكولين 50 ميكرومتر (الأعمدة 3-4). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.

ملفات تكميلية. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذه الملفات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد سمح تطوير أجهزة الاستشعار الحيوية FRET قياس وتصور إشارات النيوكليوتيدات الدورية في خلايا واحدة، وهناك وعد كبير لتصور الأحداث الإشارات دون الخلوية13،22،37،38. ومع ذلك ، فإن استخدام أجهزة الاستشعار الحيوية FRET يمثل العديد من القيود ، بما في ذلك خصائص الإشارة المنخفضة إلى الضوضاء للعديد من مراسلي FRET القائمين على البروتين الفلوري وضعف كفاءة العدوى أو التعبير لمراسلي FRET (قد يكون هذا تحديا خاصا في بعض خطوط الخلايا ، مثل PMVECs)23،24. غالبا ما يؤدي تصوير البروتينات الفلورية الضعيفة التعبير ، إلى جانب حسابات FRET النسبة ، إلى درجة عالية من عدم اليقين أو التقلبات في كفاءة FRET المحسوبة. في محاولة لتحسين موثوقية قياسات FRET، ونحن وغيرهم قد أظهرت سابقا استخدام التصوير والتحليل hyperspectral لقياس إشارات FRET والحد من الكلام المتبادل أو النزيف من خلال إشارات الفلورية بين التسميات الفلورية وآثار autofluorescence26،31،32،39. وبسبب القيود المفروضة على قوة الإشارة، اقتصرت دراسات FRET الطيفية هذه على بعدين مكانيين (X و Y) حتى وقت قريب جدا. ومن ثم، قدموا عرض شريحة واحدة من التغييرات FRET داخل الخلية.

في الدراسات الحديثة، لاحظنا أن FRET (ومستويات cAMP المقابلة) يبدو أن توزع مكانيا ليس فقط في الطائرة XY، ولكن أيضا عبر طائرات XZ و YZ25. نهج التصوير FRET hyperspectral الموصوفة هنا يوسع قدرتنا على تصور وقياس FRET والنيوكليوتيدات الدورية (cAMP) التغييرات في ثلاثة أبعاد المكانية، وفتح إمكانيات جديدة لتقييم تجزئة الإشارة. يسمح هذا النهج التصوير والتحليل الطيفي الفائق الأبعاد (X وY وZ وλ) بقياس وتصور تدرجات cAMP في ثلاثة أبعاد مكانية مع احتساب إشارات الخلفية غير الموحدة. هنا، لقد أظهرنا كيفية تنفيذ هذا النهج من خلال مثال التدرجات المكانية CAMP الناجمة عن الفسكولين. في بيانات الصورة بعد المعالجة ، يمكن ملاحظة التدرجات المكانية CAMP من الجانب القاعدي للخلية(الشكل 7 والشكل 8). لم cAMP المنتجة عند العلاج مع forskolin لا يبدو للوصول إلى تقاطعات الخلية الخلية(الشكل 7 والشكل 8).

ومن المهم، عند استخدام المنهجية الموصوفة هنا، مراعاة مختلف مصادر الخلفية وإشارات التفلور التلقائي للسماح بتقدير دقيق لكفاءات FRET. يوفر التوجس الخطي سبيلا محتملا للمحاسبة على أطياف الخلفية الفريدة ، إذا كانت توقيعاتها مختلفة عن المسابير الفلورية المثيرة للاهتمام. على وجه الخصوص، يكون الطرح الخطي أكثر ملاءمة لفصل إشارات الخلفية والفلورة التلقائية من طرح الخلفية القياسية. 40,41,42 في المثال المبين هنا, تم قياس ثلاثة توقيعات طيفية مختلفة وتعيين اسم على أساس الطول الموجي ذروة الانبعاثات من التوقيع: الطيف الخلفي 424 نانومتر (ربما من مضان coverslip), الطيف الخلفية 504 نانومتر (من المرجح بسبب الضوء المنعكس أو الخلفي المتناثر), وطيف الخلفية نانومتر 574 (ربما بسبب الخلية أو المصفوفة الخلوية autofluorescence). ولتوضيح آثار عدم مراعاة هذه التوقيعات، أنشئت مكتبتان طيفيتان، وقورنت الصور غير المهولة. أولا، تم إنشاء مكتبة طيفية تحتوي فقط على ملصقات الفلورسنت في العينة، الفيروز والزهرة وDRAQ5، ووصفت المكتبة المكونة من 3 مكونات. ثانيا، تم إنشاء مكتبة طيفية تحتوي بالإضافة إلى ذلك على التوقيعات الطيفية الخلفية الثلاثة وسمت المكتبة المكونة من 6 مكونات. كما هو موضح أعلاه، فإن عدم التوصل إلى المكتبة المكونة من 6 مكونات (عدم التخلص من الخلفية) سمح بإزالة إشارات الخلفية، في حين أن عدم التخلص من المكتبة المكونة من 3 مكونات لم يسمح(الشكل 9). في العمل السابق، أظهرنا أن الخطأ التربيعي المتوسط الجذر (RMSE) المرتبطة unmixing الخطية يتم تقليل عند استخدام مكتبة الطيفية التي تمثل كل من التسميات الفلورية والتوقيعات الخلفية. وتجدر الإشارة إلى أن التوزيع المحوري للفلورة الخلفية غالبا ما يكون غير موحد، وبالتالي، فإن طرح خلفية بسيطة لن تعمل على تصحيح بيانات الصورة. وبالتالي، فإن النهج الطيفي غير المفكك ضروري لتوفير إزالة خلفية دقيقة وقياسات موثوقة ل FRET.

من المهم تحسين معلمات النظام لتحديد أفضل إعدادات النظام والكاميرا الممكنة عند الحصول على الصور الطيفية. يجب أن يكون الهدف العام هو تحسين SNR مع تقليل وقت الاستحواذ ومنع التحدث بالصور. 43 وهكذا، عند تحسين نظام التصوير، غالبا ما تكون هناك حاجة إلى حل وسط بين الحلول المكانية والزمنية والطيفية. في هذه الدراسات، تم اختيار القيم المثلى لإعدادات النظام والكاميرا بما في ذلك حجم الثقب، وطاقة الليزر، وسرعة المسح الضوئي، وحجم المسح الضوئي، ومتوسط الإطار كما هو موضح في قسم البروتوكول. باستخدام هذه الإعدادات ، يتم تحقيق أخذ العينات المكانية من 80 نانومتر / بكسل ، وأخذ العينات الزمنية من ~ 3 دقائق لكل مكدس z الطيفي (~ 10 ثوان / صورة XY) وأخذ العينات الطيفية للفاصل الزمني 10 نانومتر مع bleaching ضئيلة أو الحد الأدنى.

لضمان تقديرات دقيقة لكفاءة FRET ، من الضروري قياس أطياف المانح والمقبل كما هو متوقع مع قياس ستويتشوميتري 1: 1 وأطوال موجية مماثلة للإثارة(الشكل 3). تم تطبيع أطياف الفيروز والزهرة فيما يتعلق بالطول الموجي لانبعاثات الذروة الفيروزية. أنتجت كفاءة FRET التي تم تقديرها باستخدام هذه المكتبة الطيفية قيما مماثلة لتلك التي تم الإبلاغ عنها في الأدب12،22. عادة، يتم تطبيع أطياف الأعضاء النهائية في المكتبة إلى وحدة. ومع ذلك، لحساب كفاءة FRET بدقة، يجب الحصول على طيف المقبول فيما يتعلق بطيف المانح (أي في تركيز متساوي الألوان أو قياس ستويتشوميتري 1:1 ويشار إليه بنفس الطول الموجي للإثارة). بالإضافة إلى استخدام مكتبة شيدت بشكل صحيح ، وتشارك عدة خطوات في التقدير المناسب لكفاءة FRET وتجنب القطع الأثرية التحليل. وتشمل هذه اختيار خلية التعبير مع كثافة إشارة كافية (الشكل 11)، وتمييس الصور unmixed قبل تقدير كفاءة FRET (تم تطبيق طمس غاوسي في هذا المثال)، وذلك باستخدام قيمة عتبة مناسبة لإنشاء قناع (الشكل 10)،وتقدير عامل تصحيح باستخدام معاملات الانقراض من المانح والمقبل (مكتبة File_Spectral التكميلية). عند اتباع هذه الخطوات، يمكن تصور التوزيعات ثلاثية الأبعاد لكفاءة FRET ومستويات cAMP الأساسية بدقة في خلايا واحدة.

وقد قدرت إشارات cAMP المترجمة في أبعاد 2 المكانية باستخدام أجهزة الاستشعار البيولوجية FRET المستهدفة13،37. ومع ذلك، فإن استهداف مسابير FRET إلى مقصورات فرعية محددة (على سبيل المثال، غشاء البلازما أو طوافات الدهون) يؤدي عادة إلى زيادة التركيز المحلي للمسبار. قد يؤدي هذا إلى قياس القطع الأثرية المقدمة بسبب FRET بين الجزيئية أو ثنائية الجزيئية. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر النتائج المعروضة هنا وفي Annamdevula et.al، 2018 ، Cytometry A25 أهمية القياسات ثلاثية الأبعاد ل FRET من المسابير القابلة للذوبان أو المستهدفة.

وعلى الرغم من أهمية قياس إشارات CAMP في ثلاثة أبعاد مكانية، هناك أيضا قيود على هذا النهج. القيد الأكثر تقييدا هو فترات الاستحواذ الطويلة المطلوبة - حوالي 3 دقائق لكل مكدس z الطيفي. يمنع معدل الامتلاك هذا استخدام هذا النهج للكشف عن أي شيء آخر غير توزيعات cAMP ثابتة في الخلايا. ومع ذلك ، فإن النتائج المقدمة تثبت أهمية تضمين قياسات cAMP ثلاثية الأبعاد (x ، y ، z) ثابتة كمكملات حاسمة لقياسات الأبعاد الثنائية القياسية (x ، y). في المستقبل سيكون من المثير للاهتمام دمج البروتينات والهياكل الخلوية المسماة في التصميم التجريبي. ومن شأن الاختيار الدقيق للفلوروفوريس المستخدم لتسمية البروتينات (و/أو الهياكل) أن يسمح بتقييم التوزيعات ثلاثية الأبعاد للبروتينات المسماة و FRET دون فقدان إضافي لسرعة الامتلاك. وهذا بدوره سيسمح بقياس إشارات CAMP المترجمة وإشارات cAMP بالقرب من البروتينات المسماة في ثلاثة أبعاد مكانية ، مما يوفر مكملا تجريبيا مهما لمسابير cAMP المستهدفة ويزيد من توسيع فائدة القياسات الطيفية الفائقة لتوزيعات CAMP ثلاثية الأبعاد في الخلايا الحية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الدكتوران ليفسلي وريتش يكشفان عن اهتمامهما المالي بشركة ناشئة، SpectraCyte، ذ.م.م، التي تم تشكيلها لتسويق تقنيات التصوير الطيفي. ومع ذلك، تم إجراء جميع الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول باستخدام المنتجات المتاحة تجاريا غير المرتبطة SpectraCyte، ذ م م.

Acknowledgments

الكتاب يود أن نعترف الدكتور كيس Jalink (معهد السرطان الهولندي ومركز فان ليوينهوك للمجهر المتقدم ، أمستردام ، هولندا) لتزويدنا H188 cAMP FRET الاستشعار البيولوجي وكيني ترينه (كلية الهندسة ، جامعة جنوب ألاباما) للمساعدة التقنية في الحد من الوقت الذي استغرقه لتشغيل العرف لدينا وضعت البرامج النصية.

ويود المؤلفون أن يعترفوا بمصادر التمويل: رابطة القلب الأمريكية (16PRE27130004)، المؤسسة الوطنية للعلوم؛ مؤسسة العلوم الوطنية (16PRE27130004)، المؤسسة الوطنية للعلوم؛ مؤسسة القلب الأمريكية (16PRE27130004)، المؤسسة الوطنية للعلوم( 160004). (1725937) المعاهد القومية للصحة، S100D020149، S10RR027535، R01HL058506، P01HL066299).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Attofluor Cell Chamber Invitrogen A7816 Attofluor contains steel cell chambers and a rubber O-ring. Cell chamber holds the coverslip and O-ring provides a lock in mechanism to hold the buffer in cell chamber with out leakage
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific BP231-100 Solvent used to prepare stock solution forskolin.
DRAQ5 Fluoroscent Probe Solution Thermo Scientific 62252 Nuclear label
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965-092 Contains nutrients and growth factors for the cells to grow and divide in the culture dishes.
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F6178 Growth factor suppliment that is added to culture medium, DMEM
Forskolin Sigma F3917 Adenyly cyclase activator.
H188 Cyclic AMP FRET biosensor Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink Gift Plasmid encoding Turquoise (donor fluorophore), Venus (acceptor fluorophore), and binding domain obtained from Epac.
Image J image.net Free download Another image processing platform used to extact spectral information and image processing.
Integrating Sphere Ocean Optics FOIS-1 Used to measure illumination intensity of the laser line at different laser intensities (?).
Laminin Mouse Protein, Natural Invitrogen 23017-015 Coverslips are coated with laminin and this helps in cell attachment, growth and motility of the cell.
Lipofectamine 3000 Transfection Kit Invitrogen L3000-015 Transfection reagent used to transfect cells with H188 FRET biosensor
MATLAB Mathworks R2019a Image processing operations (linear unmixing and FRET efficiency calculations) are performed by writing custom programs in MATLAB programming environment
Nikon A1R confocal microscope Nikon Instruments Nikon A1R Spectral image acquisition is performed using confocal microscope.
Nikon Elements Software Nikon Instruments Software dongle used to export and handle nd2 image files (multidimensional image files) that are aquired using Nikon A1R
NIST-Traceable Calibration Lamp Ocean Optics LS-1-CAL-INT A lamp with a known spectrum for use as a standard
PBS pH 7.4 (1X) Gibco 10010-023 coomonly used buffer suring cell culture
Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs) In house - Cell culture core, Univeristy of South Alabama Isolated from Rat pulmonary microvasculature PMVECs form inner lining of a blood vessel.
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Gibco 15140-122 antibiotics are added to culture medum to prevent contamination of the cells.
Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides Clay Adams 3010 Microscope slides used for cell fixation
ProLong Diamond Antifade Mounting Media Invitrogen P36961 If samples are fixed using antifade mountant, then the later protects fluoroscent dyes and chromophores from fading.
Spectrometer Ocean Optics QE65000 Used to measure spectral response of the light source (?)
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200-056 Digests the protein-protein bond between the cell and cell matrix and helps to disscociate and lift the cells during cell plating.
Tyrodes Buffer Made in-house Made in-house Tyrodes buffer is used to make working solutions and to maintain cells in aqueous solution during image acquisition.
6 Well Cell Culture Plate Corning 3506 Laminin coated coverslips are placed in 6-well culture dish (one coverlisps/well). Cells along with medium is added into each well.
25 mm Round Microscope Cover Slips Fisher Scientific 12545102 Cells were grown on round glass coverslips
60X Ojective Nikon Instruments Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 water immersion and commonly used objective for cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Corbin, J. D., Sugden, P. H., Lincoln, T. M., Keely, S. L. Compartmentalization of adenosine 3':5'-monophosphate and adenosine 3':5'-monophosphate-dependent protein kinase in heart tissue. The Journal of Biological Chemistry. 252, 3854-3861 (1977).
  2. Terrin, A., et al. PGE1 stimulation of HEK293 cells generates multiple contiguous domains with different [cAMP]: role of compartmentalized phosphodiesterases. The Journal of Cell Biology. 175, 441-451 (2006).
  3. Bacskai, B. J., et al. Spatially resolved dynamics of cAMP and protein kinase A subunits in Aplysia sensory neurons. Science. 260, 222-226 (1993).
  4. Iancu, R. V., Ramamurthy, G., Harvey, R. D. Spatial and temporal aspects of cAMP signalling in cardiac myocytes. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 35, 1343-1348 (2008).
  5. Brunton, L. L., Hayes, J. S., Mayer, S. E. Functional compartmentation of cyclic AMP and protein kinase in heart. Advances in Cyclic Nucleotide Research. 14, 391-397 (1981).
  6. Hohl, C. M., Li, Q. Compartmentation of cAMP in adult canine ventricular myocytes. Relation to single-cell free Ca2+ transients. Circulation Research. 69, 1369-1379 (1991).
  7. Rich, T. C., et al. A uniform extracellular stimulus triggers distinct cAMP signals in different compartments of a simple cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 13049-13054 (2001).
  8. Sayner, S. L., Alexeyev, M., Dessauer, C. W., Stevens, T. Soluble adenylyl cyclase reveals the significance of cAMP compartmentation on pulmonary microvascular endothelial cell barrier. Circulation Research. 98, 675-681 (2006).
  9. Rich, T. C., Tse, T. E., Rohan, J. G., Schaack, J., Karpen, J. W. In vivo assessment of local phosphodiesterase activity using tailored cyclic nucleotide-gated channels as cAMP sensors. The Journal of General Physiology. 118, 63-78 (2001).
  10. Blackman, B. E., et al. PDE4D and PDE4B function in distinct subcellular compartments in mouse embryonic fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 286, 12590-12601 (2011).
  11. Sayner, S. L., et al. Paradoxical cAMP-induced lung endothelial hyperpermeability revealed by Pseudomonas aeruginosa ExoY. Circulation Research. 95, 196-203 (2004).
  12. Klarenbeek, J., Jalink, K. Detecting cAMP with an EPAC-based FRET sensor in single living cells. Methods in Molecular Biology. 1071, 49-58 (2014).
  13. Surdo, N. C., et al. FRET biosensor uncovers cAMP nano-domains at β-adrenergic targets that dictate precise tuning of cardiac contractility. Nature Communications. 8, 15031 (2017).
  14. Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Reports. 5, 1176-1180 (2004).
  15. Vogel, S. S., Thaler, C., Koushik, S. V. Fanciful FRET. Science's STKE. 2006, (2006).
  16. Clegg, R. M. The History of FRET: From conception through the labors of birth. Reviews in Fluorescence. 3, (2006).
  17. Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-224 (2006).
  18. Manzella-Lapeira, J., Brzostowski, J. A. Imaging protein-protein interactions by Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy in live cells. Current Protocols in Protein Science. 93, 58 (2018).
  19. Cooper, D. M. F., Mons, N., Karpen, J. W. Adenylyl cyclases and the interaction between calcium and cAMP signalling. Nature. 374, 421-424 (1995).
  20. Sassone-Corsi, P. Coupling gene expression to cAMP signalling: role of CREB and CREM. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 30, 27-38 (1998).
  21. Rebhun, L. I. Cyclic nucleotides, calcium, and cell division. International Review of Cytology. 49, 1-54 (1977).
  22. Klarenbeek, J., Goedhart, J., Van Batenburg, A., Groenewald, D., Jalink, K. Fourth-generation Epac-based FRET sensors for cAMP feature exceptional brightness, photostability and dynamic range: characterization of dedicated sensors for FLIM, for ratiometry and with high affinity. PLOS ONE. 10, 0122513 (2015).
  23. Leavesley, S. J., Rich, T. C. FRET: signals hidden within the noise. Cytometry Part A. 85, 918-920 (2014).
  24. Rich, T. C., Webb, K. J., Leavesley, S. J. Can we decipher the information content contained within cyclic nucleotide signals. The Journal of General Physiology. 143, 17-27 (2014).
  25. Annamdevula, N. S., et al. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
  26. Leavesley, S. J., Britain, A. L., Cichon, L. K., Nikolaev, V. O., Rich, T. C. Assessing FRET using spectral techniques. Cytometry Part A. 83, 898-912 (2013).
  27. Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming limitations of FRET measurements. Cytometry Part A. 89, 325-327 (2016).
  28. Fink, D. J. Monitoring Earcths Resources from Space. Technology Review. 75, 32-41 (1973).
  29. Goetz, A. F. H., Vane, G., Solomon, J. E., Rock, B. N. Imaging Spectrometry for Earth Remote Sensing. Science. 228, 1147-1153 (1985).
  30. Bücherl, C. A., Bader, A., Westphal, A. H., Laptenok, S. P., Borst, J. W. FRET-FLIM applications in plant systems. Protoplasma. 251, 383-394 (2014).
  31. Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. Journal of Microscopy. 228, 139-152 (2007).
  32. Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Letters. 531, 245-249 (2002).
  33. Griswold, J. R., Annamdevula, N., Deal, J., Rich, T., Leavesley, S. Estimating FRET Efficiency using Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging. Biophysical Journal. 112, 586 (2017).
  34. Favreau, P. F., et al. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19, 046010 (2014).
  35. King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvascular Research. 67, 139-151 (2004).
  36. Thaler, C., Koushik, S. V., Blank, P. S., Vogel, S. S. Quantitative multiphoton spectral imaging and its use for measuring resonance energy transfer. Biophysical Journal. 89, 2736-2749 (2005).
  37. Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Frontiers in Pharmacology. 9, 332 (2018).
  38. Johnstone, T. B., Agarwal, S. R., Harvey, R. D., Ostrom, R. S. cAMP signaling compartmentation: Adenylyl cyclases as anchors of dynamic signaling complexes. Mol Pharmacol. , (2017).
  39. Zhang, J., Li, H., Chai, L., Zhang, L., Qu, J., Chen, T. Quantitative FRET measurement using emission-spectral unmixing with independent excitation crosstalk correction. Journal of Microscopy. 257, 104-116 (2015).
  40. Zhang, J., Lin, F., Chai, L., Wei, L., Chen, T. IIem-spFRET: improved Iem-spFRET method for robust FRET measurement. Journal of Biomedical Optics. 21, 105003 (2016).
  41. Levy, S., et al. SpRET: highly sensitive and reliable spectral measurement of absolute FRET efficiency. Microscopy and Microanalysis. 17, 176-190 (2011).
  42. West, S. J., et al. Hyperspectral Measurements Allow Separation of FRET Signals from Non-Uniform Background Fluorescence. Biophysical Journal. 112, 453 (2017).
  43. Annamdevula, N. S., et al. An approach for characterizing and comparing hyperspectral microscopy systems. Sensors. 13, Basel. 9267-9293 (2013).

Tags

علم الأحياء، العدد 164، Cyclic AMP، المكانية، FRET، فرط الطيفية، المجهر، FRET الطيفية
قياس توزيعات cAMP ثلاثية الأبعاد في الخلايا الحية باستخدام التصوير والتحليل عالي الطيفي (x وy وz و λ)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Annamdevula, N. S., Sweat, R., Gunn, … More

Annamdevula, N. S., Sweat, R., Gunn, H., Griswold, J. R., Britain, A. L., Rich, T. C., Leavesley, S. J. Measurement of 3-Dimensional cAMP Distributions in Living Cells using 4-Dimensional (x, y, z, and λ) Hyperspectral FRET Imaging and Analysis. J. Vis. Exp. (164), e61720, doi:10.3791/61720 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter