Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Messung von 3-dimensionalen cAMP-Verteilungen in lebenden Zellen mittels 4-dimensionaler (x, y, z und λ) hyperspektraler FRET-Bildgebung und -Analyse

Published: October 27, 2020 doi: 10.3791/61720
Automatic Translation
1,2, 3, 1, 3, 1,2, 1,2, 1,2,3
1Department of Pharmacology, University of South Alabama, 2Center for Lung Biology, University of South Alabama, 3Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama

Summary

Aufgrund des inhärenten niedrigen Signal-Rausch-Verhältnisses (SNR) von Fӧrster-Resonanz-Energieübertragungssensoren (FRET) war die Messung von cAMP-Signalen eine Herausforderung, insbesondere in drei räumlichen Dimensionen. Hier beschreiben wir eine hyperspektrale FRET-Bildgebungs- und Analysemethodik, die die Messung der cAMP-Verteilung in drei räumlichen Dimensionen ermöglicht.

Abstract

Cyclic AMP ist ein zweiter Botenstoff, der an einer Vielzahl von zellulären und physiologischen Aktivitäten beteiligt ist. Mehrere Studien deuten darauf hin, dass cAMP-Signale kompartimentiert sind und dass die Kompartimentierung zur Signalspezifität innerhalb des cAMP-Signalwegs beiträgt. Die Entwicklung von FRET-basierten Biosensoren (Fӧrster resonance energy transfer) hat die Fähigkeit zur Messung und Visualisierung von cAMP-Signalen in Zellen gefördert. Diese Messungen beschränken sich jedoch oft auf zwei räumliche Dimensionen, was zu Fehlinterpretationen von Daten führen kann. Bisher gab es nur sehr begrenzte Messungen von cAMP-Signalen in drei räumlichen Dimensionen (x, y und z), aufgrund der technischen Einschränkungen bei der Verwendung von FRET-Sensoren, die von Natur aus ein niedriges Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) aufweisen. Darüber hinaus sind herkömmliche filterbasierte Bildgebungsansätze aufgrund einer Reihe von Faktoren, einschließlich spektralem Übersprechen, begrenzter Signalstärke und Autofluoreszenz, oft unwirksam für die genaue Messung von cAMP-Signalsignalen in lokalisierten subzellulären Regionen. Um diese Einschränkungen zu überwinden und die Verwendung von FRET-basierten Biosensoren mit mehreren Fluorophoren zu ermöglichen, haben wir hyperspektrale FRET-Bildgebungs- und Analyseansätze entwickelt, die spektrale Spezifität für die Berechnung von FRET-Wirkungsgraden und die Fähigkeit bieten, FRET-Signale spektral von verwirrender Autofluoreszenz und / oder Signalen von zusätzlichen fluoreszierenden Markierungen zu trennen. Hier stellen wir die Methodik zur Implementierung der hyperspektralen FRET-Bildgebung sowie die Notwendigkeit vor, eine geeignete Spektralbibliothek zu konstruieren, die weder unter- noch übersampelt ist, um eine spektrale Entmischung durchzuführen. Während wir diese Methodik zur Messung dreidimensionaler cAMP-Verteilungen in pulmonalen mikrovaskulären Endothelzellen (PMVECs) vorstellen, könnte diese Methodik verwendet werden, um räumliche Verteilungen von cAMP in einer Reihe von Zelltypen zu untersuchen.

Introduction

Cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP) ist ein zweiter Botenstoff, der an wichtigen zellulären und physiologischen Prozessen wie Zellteilung, Kalziumzufluss, Gentranskription und Signaltransduktion beteiligt ist. Eine wachsende Zahl von Beweisen deutet auf die Existenz von cAMP-Kompartimenten in der Zelle hin, durch die die Signalspezifität erreicht wird1,2,3,4,5,6,7. Bis vor kurzem wurde die cAMP-Kompartimentierung auf der Grundlage verschiedener physiologischer oder zellulärer Effekte abgeleitet, die von verschiedenen G-gekoppelten Rezeptoragonisten induziert wurden8,9,10,11. In jüngerer Zeit haben FRET-basierte Fluoreszenzbildgebungssonden neue Ansätze für die direkte Messung und Beobachtung von cAMP-Signalen in einer Zelle12,13,14geliefert.

Förster-Resonanz-Energietransfer (FRET) ist ein physikalisches Phänomen, bei dem die Energieübertragung zwischen Donor- und Akzeptormolekülen in einer nicht-strahlenden Weise stattfindet, wenn sich die Moleküle in unmittelbarer Nähebefinden 15,16. Mit der Entwicklung von FRET-basierten Fluoreszenzindikatoren wurde dieses physikalische Phänomen in biologischen Anwendungen verwendet, um Protein-Protein-Interaktionen17, Protein-Co-Lokalisation18, Ca+2-Signalisierung 19, Genexpression20, Zellteilung21 und zyklische Nukleotidsignalisierung zu untersuchen. FRET-basierte cAMP-Indikatoren bestehen typischerweise aus einer cAMP-Bindungsdomäne, einem Donorfluorophor und einem Akzeptorfluorophor22. Zum Beispiel besteht der H188 cAMP-Sensor12,22, der in dieser Methodik verwendet wird, aus einer cAMP-Bindungsdomäne, die aus Epac gewonnen wird und zwischen Türkis- (Spender-) und Venus- (Akzeptor) Fluorophoren liegt. Bei basalen Bedingungen (ungebunden) sind Türkis und Venus in einer Ausrichtung, so dass FRET zwischen den Fluorophoren auftritt. Bei der Bindung von cAMP an die Bindungsdomäne tritt eine Konformationsänderung auf, so dass sich Türkis und Venus auseinander bewegen, was zu einer Abnahme der FRET führt.

FRET-basierte Bildgebungsansätze bieten ein vielversprechendes Werkzeug zur Untersuchung und Visualisierung von cAMP-Signalen innerhalb einer Zelle. Aktuelle FRET-basierte mikroskopische Bildgebungsverfahren sind jedoch oft nur teilweise erfolgreich, um eine ausreichende Signalstärke zu erreichen, um FRET mit subzellulärer räumlicher Klarheit zu messen. Dies ist auf mehrere Faktoren zurückzuführen, darunter die begrenzte Signalstärke vieler FRET-Reporter, die hohe Präzision, die erforderlich ist, um Änderungen der FRET-Effizienz genau zu quantifizieren, und das Vorhandensein von Störfaktoren wie zellulärer Autofluoreszenz23,24. Das Ergebnis ist oft ein FRET-Bild, das von schwachem SNR geplagt wird, was die Visualisierung subzellulärer Veränderungen in FRET sehr schwierig macht. Darüber hinaus wurde die Untersuchung von räumlich lokalisierten cAMP-Signalen fast ausschließlich in nur zwei räumlichen Dimensionen durchgeführt und die axiale cAMP-Verteilung wurde selten berücksichtigt25. Dies liegt wahrscheinlich daran, dass ein niedriger SNR die Fähigkeit behinderte, cAMP-Gradienten in drei räumlichen Dimensionen zu messen und zu visualisieren. Um die Einschränkungen bei der Verwendung von FRET-Sensoren mit niedrigem SNR zu überwinden, haben wir hyperspektrale Bildgebungs- und Analyseansätze zur Messung von FRET in einzelnen Zellen25,26,27implementiert.

Hyperspektrale Bildgebungsansätze wurden von der NASA entwickelt, um terrestrische Objekte in Satellitenbildern zu unterscheiden28,29. Diese Techniken wurden seitdem in das Fluoreszenzmikroskopiefeld30übersetzt, wobei mehrere kommerzielle konfokale Mikroskopsysteme Spektraldetektoren anbieten. Bei der traditionellen (nicht-spektralen) Fluoreszenzbildgebung wird die Probe mit einem Bandpassfilter oder einer Laserlinie angeregt, und die Emission wird mit einem zweiten Bandpassfilter gesammelt, der oft so ausgewählt wird, dass er der Maximalen Emissionswellenlänge des Fluorophors entspricht. Im Gegensatz dazu versuchen hyperspektrale Bildgebungsansätze, ein vollständiges spektrales Profil entweder der Fluoreszenzemission26,31,32 oder der Anregung 33,34in bestimmten Wellenlängenintervallen zu testen. In unseren früheren Studien haben wir gezeigt, dass hyperspektrale Bildgebungs- und Analyseansätze im Vergleich zu herkömmlichen filterbasierten FRET-Bildgebungsverfahren eine verbesserte Quantifizierung von FRET-Signalen in Zellen bieten können26. Hier stellen wir eine Methodik zur Durchführung von 4-dimensionalen (x, y, z und λ) hyperspektralen FRET-Bildgebung und -Analyse vor, um cAMP-Verteilungen in drei räumlichen Dimensionen zu messen und zu visualisieren. Diese Ansätze haben die Visualisierung von agonisteninduzierten cAMP-Raumgradienten in einzelnen Zellenermöglicht 25. Interessanterweise können je nach Agonist cAMP-Gradienten in Zellen sichtbar sein. Die hier vorgestellte Methodik nutzt die spektrale Entmischung von ungleichmäßigem Hintergrund und zellulärer Autofluoreszenz, um die Genauigkeit der FRET-Messungen zu verbessern. Während diese Methodik in pulmonalen mikrovaskulären Endothelzellen (PMVECs) mit einem cAMP FRET-Biosensor demonstriert wird, könnte die Methodik leicht für die Verwendung mit alternativen FRET-Reportern oder alternativen Zelllinien modifiziert werden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dieses Protokoll folgt Verfahren, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of South Alabama genehmigt wurden.

1. Zell-, Proben- und Reagenzienvorbereitung für die Bildgebung

  1. Isolieren Sie pulmonale mikrovaskuläre Endothelzellen (PMVECs) von Ratten wie zuvor beschrieben35.
    HINWEIS: Die Zellen wurden vom Zellkulturkern an der University of South Alabama, Mobile, AL, auf 100-mm-Zellkulturschalen isoliert und kultiviert.
  2. Samenisolierte PMVECs auf 25 mm runden Glasdeckeln und lassen sie im Inkubator bei 37 °C wachsen, bis die Zellen mindestens 80% Konfluenz erreichen (mindestens 24 Stunden).
    HINWEIS: Zellen und Zelltyp können von Studie zu Studie variieren, und daher sollten zellspezifische Zellkulturverfahren befolgt werden, um Zellen zu säen und zu züchten. Das in diesen Studien verwendete Zellaussaat- und Kultivierungsprotokoll ist als ergänzende Information in der Datei "Supplemental File_Cell Culture and Transfection" verfügbar.
  3. PmVECs mit einem FRET-Biosensor transfizieren und 48 Stunden bei 37 °C inkubieren.
    HINWEIS: Das Protokoll zur Transfektierung von PMVECs wird auch in der ergänzenden Informationsdatei "Supplemental File_Cell Culture and Transfection" beschrieben.
  4. Am Tag der Bildgebung tyrodes Puffer in einem Wasserbad auf 37 °C erwärmen.
    HINWEIS: Tyrodes Puffer besteht aus 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM Glucose, 1 mM MgCl2 und 1 mM CaCl2
  5. Montieren Sie einen Abdeckrlip mit transfizierten Zellen in einer Zellkammer und befestigen Sie die Oberseite mit einer Montagedichtung, um ein Auslaufen zu verhindern.
  6. Wischen Sie die Unterseite des Abdecks mit einem empfindlichen Aufgabentuch ab, um überschüssige Medien oder anhaftende Zellen zu reinigen.
  7. 800 μL Arbeitspuffer und 4 μL 5 mM Kernmarkmark in die Zellkammer geben und 5 – 10 Sekunden sanft schaukeln.
    HINWEIS: Wenn Sie Puffer- oder Reagenzlösungen zu in der Zellkammer montierten Abdeckren hinzufügen, stellen Sie sicher, dass Sie die Lösung vorsichtig und an der Seite der Zellkammer hinzufügen, um adhärente Zellen nicht zu verdrängen. Die Zugabe von 4 μL 5 mM Kernmarkmark zu 800 μL Puffer ergibt eine Endkonzentration von 25 μM Kernmarkmark. Für lose haftbare Zellen wie HEK293-Zellen mischen Sie zuerst Kernmarkmark und Puffer in einer Durchstechflasche und fügen Sie sie dann zu den in der Zellkammer montierten Abdeckungslippen hinzu. Dies verhindert, dass die Zellen von der Abdeckung abgezogen werden.
  8. Decken Sie die Zellkammer zum Schutz vor Licht mit Aluminiumfolie ab und inkubieren Sie sie 10 Minuten bei Raumtemperatur.
  9. Reagenzvorbereitung: 1 μL 50 mM Forskolin zu 199 μL Puffer hinzufügen. Dies führt zu einer Endkonzentration von Forskolin von 50 μM, wenn sie zu Zellen hinzugefügt wird, die mit 800 μL Puffer hergestellt wurden. 1 μL DMSO in 199 μL Puffer sollte auch für die Verwendung als Fahrzeugsteuerung vorbereitet werden.
    HINWEIS: In diesen Studien wird Forskolin als Adenylylcyclase-Aktivator verwendet, um die cAMP-Produktion zu stimulieren. Falls gewünscht, kann diese Methodik leicht modifiziert werden, um eine Behandlung mit alternativen Reagenzien zur Stimulation oder Hemmung von Adenylylcyclase, Phosphodiesterasen usw. zu ermöglichen.

2. Bilderfassung

  1. Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop, das mit einem Spektraldetektor ausgestattet ist.
    HINWEIS: Alle hier beschriebenen Bildaufnahmeschritte wurden mit einem handelsüblichen Nikon A1R Mikroskopsystem entwickelt. Diese Schritte müssen möglicherweise angepasst werden, wenn ein alternatives Spektralmikroskop verwendet wird. Stellen Sie sicher, dass alle Geräte mindestens 30 Minuten vor Beginn des Experiments eingeschaltet sind, um stabile Betriebsbedingungen zu erreichen.
  2. Wählen Sie das 60-fache Wasserimmersionsziel und fügen Sie dem Objektiv einen Tropfen Wasser hinzu.
    HINWEIS: Für hochauflösende Live-Cell-Bildgebung wird empfohlen, ein Objektiv mit hoher numerischer Apertur zu verwenden. Bitte beachten Sie die Liste der Materialien für Informationen über das in diesen Studien verwendete Ziel.
  3. Legen Sie die beladene Zellkammer (ab Schritt 1.7) auf den Mikroskopstand.
  4. Wählen Sie den DFT-Filtersatz (DAPI/FITC/TRITC) aus, indem Sie den Filterknopf auf der rechten Seite des Mikroskops einstellen.
  5. Betreiben Sie das Mikroskop im Fluoreszenz-Weitfeldmodus mit den Okularen, um ein Sichtfeld auszuwählen, das Zellen enthält, die den cAMP FRET-Sensor exprimieren.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die durchschnittliche Intensität des FRET-Signals an der Spitzenwellenlänge der Donor- oder Akzeptoremission in der ausgewählten Zelle mindestens 100 Intensitätseinheiten (A.U.) oder mindestens das 4-fache des Basissignals einer Region ohne exprimierende Zellen beträgt. Dies kann mit dem in der NIS Elements-Software verfügbaren Spektrumprofil-Viewer bestätigt werden. Bei der Suche nach einer Zelle mit gutem Signal ist es ratsam, übermäßig helle Zellen zu verwerfen (sie können kompromittiert sein).
  6. Öffnen Sie die NIS-Software, wechseln Sie in den konfokalen Modus, entsperren Sie die Laser-Interlock-Taste und klicken Sie auf Live.
  7. Verwenden Sie den Fokusknopf, um sich auf die Zellen zu konzentrieren, indem Sie sich die Vorschau auf dem Bildschirm ansehen.
  8. Konfigurieren Sie geräte-, erfassungs- und Z-Stack-Einstellungen in der Software, wie unten beschrieben.
  9. Erfassungseinstellungen:
    HINWEIS: Kamera- und Geräteerfassungseinstellungen können mithilfe eines zuvor aufgenommenen Bildes angewendet werden. Öffnen Sie das Bild, klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie Kameraeinstellungen wiederverwenden.
    1. Öffnen Sie das A1-Einstellungsmenü, aktivieren Sie die Kontrollkästchen für 405 nm und 561 nm Laserlinien, wählen Sie SD für Spektraldetektor, wählen Sie 10 für Auflösung und 31 für Kanäle.
      HINWEIS: Das A1-Einstellungsmenü wird als kleines Zahnradsymbol in der oberen linken Ecke des Fensters A1 Plus-Einstellungen angezeigt. Der 405-nm-Laser wird für die Donor-Anregung und der 561-nm-Laser für die Anregung von Kernmarkierungen verwendet.
    2. Legen Sie den Wellenlängenbereich (410 – 730 nm) fest, indem Sie Start- und Endwellenlängenwerte auswählen.
    3. Klicken Sie im Menü A1-Einstellungen auf das Symbol zum Binning/Überspringen, wählen Sie das Feld mit der Nummer 15 aus, und klicken Sie dann im Menü A1-Einstellungen auf OK.
      HINWEIS: Dies dient dazu, den Wellenlängenkanal zu entfernen, der dem 561-nm-Anregungslaser entspricht (dies ist typischerweise der15. Wellenlängenkanal). Es ist wichtig, dieses Wellenlängenband nicht zu verwenden, um ein künstlich niedriges Signal zu vermeiden, das ein spektrales Artefakt erzeugen kann. Das Signal ist in diesem Band aufgrund des mechanischen Fingers, der das Detektorelement bedeckt, um es vor Laserschäden zu schützen, niedriger.
    4. Stellen Sie die Laserdicken für die Laser 405 nm bzw. 561 nm auf 8% bzw. 2% ein, Si Hv (Detektorverstärkung) bei 149 und einen Lochradius von 2,4 luftigen Scheibeneinheiten (AU).
      HINWEIS: Die Laserdicken müssen möglicherweise je nach Alter des Instruments und Zustand der Laser angepasst werden. Bei der Anpassung der Laserdicken zwischen verschiedenen Proben oder Versuchsgruppen ist es wichtig, das gleiche Verhältnis der Laserdicken (z. B. 8:2) beizubehalten. Darüber hinaus ist es wichtig, eine Laserintensität zu wählen, die nicht so hell ist, dass eine schnelle Photobleachung entsteht. Die Detektorverstärkung sollte angepasst werden, um die Signalintensität zu maximieren und gleichzeitig das Detektorrauschen zu minimieren. Für diese Studien wurde ein Gewinn von 149 verwendet. Eine Lochgröße von 2,4 AE wurde als Ausgleich zwischen der Aufnahme von Bildern mit ausreichendem Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) und der Aufrechterhaltung der optischen Schnitte (Konfoalität) gewählt. Eine Zunahme der Lochgröße erhöht den SNR, verringert aber die Konfoalität.
    5. Stellen Sie die Scangeschwindigkeit auf 0,25 Spektralbilder pro Sekunde ein, wählen Sie das Symbol für unidirektional für die Scanrichtung aus, geben Sie 4 für die Anzahl ein und legen Sie 1024 x 1024 für die Scangröße fest.
      HINWEIS: FRET-Signale sind schwach und eine langsame Scangeschwindigkeit ist oft erforderlich. Bei einer Scangeschwindigkeit von 0,25 ist die Erfassung eines spektralen Z-Stacks in ~3 Minuten abgeschlossen. Die Scangeschwindigkeit kann je nach verwendeten Fluorophoren erhöht oder verringert werden. Zum Beispiel kann für hellere Fluorophore wie eGFP eine schnellere Scangeschwindigkeit (2 Bilder / Sekunde) verwendet werden. Die unter Anzahl eingegebene Zahl entspricht einem Frame-Mittelwert von 4, was bei der Rauschunterdrückung während der Bildaufnahme hilft. Für sehr stabile Proben und wenn die Zeit keine Einschränkung ist, können höhere Mittelwerte (bis zu 16) verwendet werden, um Bilder mit verbessertem SNR zu erhalten.
  10. Definieren Sie Z-Stack-Erfassungsparameter:
    HINWEIS: Die in Schritt 2.10 eingegebenen Werte müssen möglicherweise angepasst werden, um Änderungen der Bindung oder Konzentration fluoreszierender Markierungen, der Art des Etiketts, der Anzahl der verwendeten Etiketten, der Zelllinie und anderer Änderungen in der Probenvorbereitung Rechnung zu tragen, die sich auf die Zellmarkierungsdichte und/oder die zelluläre Autofluoreszenz auswirken können. Bei der Einstellung der Erfassungsparameter sollte darauf geachtet werden, einen ausreichenden SNR zu erreichen und gleichzeitig die Photobleachung zu minimieren. Darüber hinaus sollte bei der Konfiguration eines spektralen FRET-Assays darauf geachtet werden, dass die Parameter über alle Behandlungsgruppen hinweg gut funktionieren. Es ist ratsam, eine Studie mit jeder Behandlungsgruppe mit den vorgeschlagenen Parametereinstellungen durchzuführen, um sicherzustellen, dass SNR ausreichend ist und Photobleaching minimiert wird.
    1. Öffnen Sie das Fenster ND-Erfassung, indem Sie auf Ansicht klicken, → Erfassungssteuerung → ND-Erfassung .
    2. Geben Sie den Pfad/das Ziel und einen Dateinamen ein, um die ND-Datei im Popup-Fenster zu speichern.
    3. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen für die z-Reihe.
    4. Klicken Sie im Fenster A1 Plus Einstellungen auf live. Dadurch öffnet sich ein Live-Sichtfenster.
    5. Stellen Sie den Fokusknopf am Mikroskop ein, um die Oberseite der Zelle auszuwählen, und klicken Sie im ND-Erfassungsfenster auf Oben, um die aktuelle Position als Oberseite festzulegen.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, etwas über der Oberseite der Zelle zu fokussieren, um sicherzustellen, dass die gesamte Zelle in der z-Serie abgetastet wird.
    6. Stellen Sie den Fokusknopf am Mikroskop ein, um die Unterseite der Zelle auszuwählen, und klicken Sie im ND-Erfassungsfenster auf Unten, um die aktuelle Position als Unterseite festzulegen.
      HINWEIS: Konzentrieren Sie den Fokus etwas unterhalb der Unterseite der Zelle, um sicherzustellen, dass die gesamte Zelle abgetastet wird.
    7. Geben Sie 1 μm für die Schrittgröße ein, wählen Sie oben unten für die Z-Scan-Richtung und klicken Sie im Fenster ND-Erfassung auf Ausführen, um einen Z-Stack zu erhalten.
      HINWEIS: Die Schrittgröße bestimmt die Anzahl der Z-Slices, die in Abhängigkeit von der oberen und unteren Position (d. h. der zurückgelegten Entfernung) erfasst werden. Als Kompromiss zwischen Bildgeschwindigkeit, z-Achsenabtastung und Photobleaching wurde eine Schrittgröße von 1 μm gewählt. Die Verwendung des konfokalen Lochdurchmessers von 2,4 AE und des 60-fachen Wasserimmersionsobjektivs führte zu einer optischen Querschnittsdicke von 1,73 μm. Daher liegt eine Schrittgröße von 1 μm leicht unter den Nyquist-Abtastkriterien, aber dies ist ein Kompromiss, der eingegangen wurde, um die Zeit zu reduzieren, die für die Erfassung eines Z-Stacks benötigt wird. Für sehr stabile Proben, für die die Geschwindigkeit nicht kritisch ist, kann ein kleinerer z-Achsenschritt und möglicherweise ein kleinerer konfokales Lochdurchmesser verwendet werden, um die Auflösung der z-Achse zu erhöhen. Bottom-Top sollte ähnliche Ergebnisse liefern und kann verwendet werden, um alle Effekte von Photobleaching zu bewerten, die während des Z-Scans auftreten können.
  11. Richten Sie das Perfect Focus System (PFS) ein, falls verfügbar:
    HINWEIS: MIT PFS kann das System Schwankungen der Brennweite während der Bildaufnahme ausgleichen. Die folgenden Schritte können zum Einrichten von PFS verwendet werden, und diese Schritte können je nach Version der Nikon A1R und der verwendeten Version von NIS Elements leicht variieren.
    1. Markieren Sie den symmetrischen Modus, der durch das Bereichssymbol im ND-Erfassungsfenster definiert ist.
    2. Schalten Sie die PFS-Taste auf der Vorderseite des Mikroskops ein (stellen Sie sicher, dass der dichroitische Spiegelknopf im Abschnitt unterhalb der Probenstufe "in" ist).
    3. Definieren Sie die Oberseite (gegen den Uhrzeigersinn drehen) und die Unterseite (im Uhrzeigersinn drehen) mit dem Knopf auf der Vorderseite des PFS-Offset-Controllers neu.
    4. Definieren Sie eine relative z-Position/z-Tiefe, indem Sie im ND-Erfassungsfenster auf "relativ" klicken.
    5. Klicken Sie auf den Speicher auf der Vorderseite des Mikroskops, damit die Software die relative z-Tiefe speichert.
  12. Nachdem die Z-Stack-Erfassung abgeschlossen ist, fügen Sie das gewünschte Reagenz (Forskolin oder Fahrzeugsteuerung) vorsichtig mit einer Pipette hinzu und warten Sie 10 Minuten.
    HINWEIS: Fügen Sie das Reagenz sehr vorsichtig hinzu, um die Zellen nicht zu stören oder die Position der Zellkammer innerhalb des Mikroskop-XY-Stadiums zu verschieben; Es ist hilfreich, in einer nachfolgenden Live-Ansicht oder einem nachfolgenden Bild zu überprüfen, ob sich das Sichtfeld während der Reagenzienzugabe nicht verschoben hat. Die 10-minütige Wartezeit beträgt, bis die Forskolin-Behandlung wirksam wird. Wenn eine alternative Behandlung verwendet wird, muss die Wartezeit möglicherweise angepasst werden.
  13. Ändern Sie nach 10 Minuten den Dateinamen und klicken Sie im Fenster ND-Erfassung auf Ausführen.
  14. Wiederholen Sie die Schritte 2.11 – 2.13 wie oben beschrieben für mindestens 5 Coverlips, um ausreichende Ergebnisse für die statistische Analyse zu erzielen (n = 5 für jede Behandlungsgruppe - Forskolin und Fahrzeugkontrolle).
  15. Bereiten Sie Proben und Probenrohlinge vor, um die Spektralbibliothek zu erstellen, und erfassen Sie Spektralbilder mit ähnlichen Erfassungseinstellungen, wie in den Schritten 2.9 und 2.10 beschrieben.

3. Bildanalyse

HINWEIS: Diese Bilder werden verwendet, um eine Spektralbibliothek zu erstellen, die die reinen Spektren aller einzelnen Endmitglieder enthält, die in der Studie vorhanden sind. Die Endmitglieder in der Spektralbibliothek können von Studie zu Studie variieren, wenn verschiedene Fluorophore verwendet werden. Ein detailliertes Verfahren zum Aufbau der Spektralbibliothek finden Sie in einer ergänzenden Informationsdatei mit dem Namen "Supplemental File_Spectral Library". Hier beschreiben wir den Export von Daten in .tiff Dateien, lineare spektrale Entmischung, FRET-Effizienzmessungen, dreidimensionale Rekonstruktion und cAMP-Niveauschätzung. Die Bildanalyse kann mit verschiedenen Bildanalyse- und Programmierplattformen wie ImageJ, Python, MATLAB oder CellProfiler durchgeführt werden. In diesen Studien wurden MATLAB-Skripte verwendet.

  1. Bilddaten exportieren:
    1. Erstellen Sie neue Ordner mit demselben Dateinamen, der den spektralen Z-Stack-Bildern entspricht, die in den Schritten 2.13 und 2.14 aufgenommen wurden.
      HINWEIS: Die folgenden Schritte zum Exportieren von Daten sind spezifisch für NIS Elements AR Version 4.30.01. Diese Schritte können je nach Version der Software leicht variieren.
    2. Klicken Sie auf Datei, um ein Dateifenster zu öffnen. Durchsuchen und wählen Sie die in Schritt 2.12 aufgenommene Spektralbilddatei aus, und klicken Sie auf Öffnen.
    3. Sobald die Datei geladen ist, klicken Sie auf Datei→ Importieren/Exportieren→ ND-Dokument exportieren.
    4. Im Popup-Fenster: Durchsuchen und wählen Sie den in Schritt 3.1.1 erstellten Ordner aus, wählen Sie Tagged Image Format (TIF) für Dateityp, dann Mono-Bild für jeden Kanal und Bittiefe beibehalten.
      HINWEIS: Das Dateipräfix wird vorgeneriert. Ändern Sie diesen Wert aus Gründen der Bequemlichkeit. Die Indexreihenfolge ändert sich je nach den ausgewählten Kanälen und sollte "z, c" für die Indizierung nach z-Slice-Position zuerst und Wellenlängenband nummer sekunde anzeigen. Stellen Sie sicher, dass die Felder für LUTs anwenden oder Überlagerungen einfügen oder Punktnamen verwenden deaktiviert sind.
    5. Klicken Sie auf Exportieren, um die TIFF-Dateien als einzelne TIFF-Dateien in einen Zielordner zu exportieren.
    6. Wiederholen Sie die Schritte 3.1.2 bis 3.1.5, um spektrale Bilddateien zu exportieren, die in Schritt 2.13 aufgenommen wurden.
  2. Lineare spektrale Entmischung:
    1. Öffnen Sie die Programmiersoftware.
      HINWEIS: Ein speziell entwickeltes Programmierskript zum Entmischen von spektralen Rohbildern wird auf der Website der University of South Alabama BioImaging and BioSystems unter der Registerkarte Ressourcen (https://www.southalabama.edu/centers/bioimaging/resources.html) bereitgestellt.
    2. Öffnen Sie die Datei mit der Bezeichnung "Linear Unmixing.m" und klicken Sie in der Symbolleiste des Editors auf die Schaltfläche Ausführen.
    3. Durchsuchen und wählen Sie den Ordner aus, der die exportierte *.tif Dateisequenz enthält, die von der NIS Elements-Software generiert wurde.
    4. Klicken Sie auf OK, um fortzufahren, wodurch ein neues Fenster mit den Namen Wellenlänge und Z-Slicegeöffnet wird.
    5. Kopieren Sie den Dateinamen der ersten Datei (ohne Z-Slice und Kanalnummer) in den in Schritt 3.2.4 ausgewählten Ordner und fügen Sie ihn in den ersten Schritt des Dialogfelds mit der Bezeichnung "Bildnamen eingeben" ein.
    6. Geben Sie die Anzahl der Kanäle im zweiten Schritt mit der Bezeichnung "Geben Sie die Anzahl der Wellenlängenbänder ein", die Anzahl der Z-Slices im dritten Schritt mit der Bezeichnung "Geben Sie die Anzahl der Z-Slices ein" ein und klicken Sie auf OK.
      HINWEIS: Die Anzahl der Wellenlängenbänder kann sich ändern, wenn Änderungen an den Erfassungseinstellungen vorgenommen werden, z. B. durch Anpassen des Wellenlängenbereichs oder der Wellenlängenschrittgröße. Die Anzahl der Z-Slices kann sich auch in Abhängigkeit von der Höhe der Zelle ändern.
    7. Durchsuchen und wählen Sie die Wellenlängendatei "Wavelength.mat" im Popup-Fenster mit der Bezeichnung "Wählen Sie die Wellenlängeninformationsdatei aus" und klicken Sie auf Öffnen.
    8. Durchsuchen und wählen Sie die Datei "Library.mat" im neuen Popup-Fenster mit der Bezeichnung "Wählen Sie die Spektralbibliotheksdatei aus", klicken Sie auf Öffnen und warten Sie, bis die Entmischung der Slices abgeschlossen ist.
      HINWEIS: Library.mat-Datei ist eine Datei, die reine Spektren für jedes Endmemberfluorophor zusammen mit Zellautofluoreszenz und Hintergrundspektralsignaturen enthält. In diesem Fall umfassen Endelementfluorophore Türkis, Venus und DRAQ5. Zu den spektralen Hintergrundsignaturen gehören zelluläre oder Matrix-Autofluoreszenz, Coverslip-Fluoreszenz und Coverslip-Beugung. Die Datei Wavelength.mat ist eine Datei mit Wellenlängenkanalinformationen, die zur Erfassung des Spektralbildes verwendet werden. Eine Beispielbibliotheksdatei und eine Wellenlängendatei sind auf der Bioimaging and Biosystems-Website verfügbar (siehe Hinweis unter 3.2.1). Weitere Informationen zum Generieren von Spektralbibliotheks- und Wellenlängendateien finden Sie in der ergänzenden Informationsdatei "Supplemental File_Spectral Library". Nicht gemischte Bilder, die jedem Z-Slice entsprechen, werden in dem Ordner "Unmixed" gespeichert, der während des Entmischvorgangs innerhalb des in Schritt 3.2.3 ausgewählten Ordners erstellt wurde.
  3. FRET-Effizienzberechnung:
    1. Öffnen Sie das Programmierskript "multiFRRCF.m" und klicken Sie auf Ausführen.
      HINWEIS: Diese Programmierdatei ist auf der Website der University of South Alabama Bioimaging and Biosystems verfügbar (siehe Hinweis unter Schritt 3.2.1).
    2. Geben Sie die Anzahl der zu analysierenden experimentellen Versuche in das Popup-Dialogfeld mit dem Namen "Wie viele Ordner sollen neu aufgebläst werden" ein und klicken Sie auf OK.
      HINWEIS: Bilddaten aus jedem Experiment sollten in einem separaten, nicht gemischten Bildordner gespeichert werden. Dieser Schritt ermöglicht es dem Analysecode einfach, viele Ordner als zeitsparenden Schritt zu durchlaufen.
    3. Suchen Sie nach den nicht gemischten Ordnern, wählen Sie sie aus, und klicken Sie auf OK.
      HINWEIS: Wie oft das Popup-Fenster "Nach Ordner suchen" geöffnet wird, hängt von der Anzahl ab, die im Dialogfeld "Wie viele Ordner neu aufgebläst werden sollen" im vorherigen Schritt eingegeben wurde. Durchsuchen und wählen Sie die Ordner nacheinander aus.
    4. Geben Sie im neuen Popup-Fenster die folgenden Informationen in die entsprechenden Felder ein: Skalierungsfaktor ist 12,4, Schwellenwert ist 5,6, X, Y und Z Frequenz sind 5, 5 bzw. 1 und Glättungsalgorithmus ist Gauß.
      HINWEIS: Der Skalierungsfaktor ist ein Wert in Pixel/μm und wird verwendet, um die Z-Richtungsabtastung auf die XY-Richtung zu skalieren. Der Skalierungsfaktor ergibt sich aus der Bildpixelgröße, die bei den meisten konfokalen Mikroskopsystemen normalerweise als Metadaten im Bild bereitgestellt wird. Wenn das Bild beispielsweise mit einem Abstand von 0,08 μm/Pixel aufgenommen wird, sollte der Skalierungsfaktor 12,5 Pixel/μm betragen. Der Schwellenwert wird verwendet, um den Schwellenwert für die Bilder festzulegen und eine binäre Maske der Zelle zu generieren. Wir haben eine Liste optimaler Werte basierend auf der Intensität des Bildgebers + Akzeptors erstellt. Verwenden Sie 4,5 als Schwellenwert, wenn das Bild eine helle Donor+Akzeptor-Intensität und einen niedrigen Hintergrund aufweist, einen Wert zwischen 5,6 und 6,5 für Bilder mit nur moderater Donor+Akzeptor-Intensität und/oder höherem Hintergrund und einen Wert von 7,5 und höher für Bilder mit einer Donor+Akzeptor-Intensität, die niedriger ist als der Hintergrund. Der Frequenzwert entspricht dem Intervall in Pixelanzahl, in dem das Slicing in den nachfolgenden Schritten durchgeführt wird. Wenn beispielsweise die Z-Tiefe der Zelle 17 μm mit einer Schrittgröße von 1 μm beträgt und ein Skalierungsfaktor von 12,5 Pixel/μm in XY-Richtung verwendet wird, wird die Tiefe des 3-dimensionalen Bilddatensatzes mit 212 Pixeln (Z-Richtung) neu abgerechnet. Basierend auf dem eingegebenen Z-Frequenzwert (z. B. 1 Pixel) wird der 3-dimensionale Bilddatensatz beginnend am oberen Teil des Bilddatensatzes neu geschnitten und dann in Schritten von 1 Pixel nach unten bewegt. Daraus ergeben sich 212 neu liced Bilder. Würde für Z-Frequenz ein größeres Frequenzwertintervall eingegeben, würden weniger resliced Bilder generiert. Neu licierte Bilder werden in nachfolgenden Schritten gespeichert.
    5. Klicken Sie auf Ausführen und warten Sie, bis alle FRET-Messungen und -Neuaufteilungen durchgeführt wurden.
      HINWEIS: Im übergeordneten Verzeichnis wird ein separater Ordner erstellt, in dem neu geordnete Graustufen-FRET-Effizienzbilder und farbige (eine Angewendete Farbkarte) FRET-Effizienzbilder gespeichert werden. Beispielsweise werden alle Graustufen- und Farbkarten-FRET-Bilder, die in X-Richtung (YZ-Ebene) neu aufgeschrieben sind, in einem Ordner namens "Resliced_XFRET" gespeichert.
    6. Wiederholen Sie die Analyse mit ähnlichen Einstellungen für alle Experimente – vor und nach Forskolin-Behandlungen und Fahrzeugkontrollen.
      HINWEIS: Die in Abschnitt 3.3 genannten Schritte beschreiben die Werte, die für das benutzerdefinierte FRET-Analyseprogrammierskript zum Generieren von 3-dimensionalen FRET-Bilddaten eingegeben werden müssen. Dieses Skript führt jedoch während der Ausführung mehrere Operationen aus, darunter: Laden von Bilddaten, Erstellen von Bildstapeln, Glätten, FRET-Effizienzberechnungen, Erstellen und Anwenden einer Zellrahmenmaske, 3-dimensionale Bildrekonstruktion, Neulizieren von 3-dimensionalen Bildern in bestimmten Intervallen (Frequenzen), Anwenden einer Farbkarte zur Visualisierung von FRET-Änderungen und Speichern der neu licierten Bilddaten im selben Verzeichnis. Weitere Details wurden als Kommentare in das Programmskript aufgenommen.

4. Zuordnung der FRET-Effizienz zu cAMP-Werten

  1. Öffnen Sie die Programmierdatei mit dem Namen "Mapping_FRET Efficiency_to_cAMP_concentration.m" und klicken Sie im Hauptfenster auf Ausführen.
    HINWEIS: Die Datei ist auf der BioImaging- und BioSystems-Website verfügbar (siehe Hinweis unter 3.2.1). Diese Datei liest Graustufen-FRET-Effizienzbilder und konvertiert sie basierend auf einer Kennlinie in cAMP-Werte. Diese Kennlinie verwendet eine cAMP-zu-FRET-Beziehung, die in Literatur15,36 dokumentiert ist und durch die Hill-Gleichung (die dritte unten gezeigte Gleichung) beschrieben wird. Kd der Sonde in intakten Zellen ist jedoch schwer abzuschätzen und wir haben in unseren Berechnungen davon ausgegangen, dass es 1 μM ist. Daher werden die Ergebnisse als Funktion von Kd angezeigt. (d. h. [cAMP] = x* Kd). Gleichungen, die zur Messung der FRET-Effizienz und zur Zuordnung von FRET zu cAMP-Werten verwendet werden, sind unten dargestellt:
    Equation 1
    Dabei ist E die FRET-Effizienz, und einscheinbarer und ein dscheinbarer sind ungemischte Pixeldicken von Akzeptor- bzw. Spenderbildern.
    Qa und Qd sind Quantenausbeuten von Akzeptor und Donor. Beachten Sie, dass Qa und Qd aufheben, wenn die Gleichung für kλ in die FRET-Effizienzgleichung aufgenommen wird, kλ ist ein Korrekturfaktor:
    Equation 2
    Equation 3 und Equation 4 sind Extinktionskoeffizienten von Donor und Akzeptor bei der Donoranregungswellenlänge i (405nm).
    Equation 5
    E ist FRET-Wirkungsgrad und KD = Dissoziationskonstante = 1 μM.
  2. Navigieren Sie, wählen Sie das erste Graustufen-FRET-Bild (gespeichert in Schritt 3.3.5) aus und klicken Sie auf OK.
  3. Öffnen Sie die FRET/cAMP-Bilder, um die Verteilung der cAMP-Signale dreidimensional zu untersuchen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung hyperspektraler FRET-Bildgebungs- und Analyseansätze zur Messung von cAMP-Gradienten in drei räumlichen Dimensionen in lebenden Zellen. Bei der Generierung dieser Ergebnisse gibt es mehrere wichtige Schritte, für die bei der Analyse und Quantifizierung der Daten sorgfältige Aufmerksamkeit erforderlich ist. Zu diesen Schlüsselschritten gehören der Aufbau einer geeigneten Spektralbibliothek, die spektrale Entmischung im Hintergrund, die Schwellenwerte zur Identifizierung von Zellgrenzen und FRET-Effizienzberechnungen. Abbildung 1 zeigt den schematischen Ablauf aller Schritte zur Messung der FRET-Effizienz und der cAMP-Werte in lebenden Zellen. Bei richtiger Durchführung ermöglichen diese Bildgebungs- und Analyseschritte die Messung der FRET-Effizienz und die Schätzung von räumlichen cAMP-Gradienten in 3 Dimensionen in einer Zelle unter Berücksichtigung ungleichmäßiger Hintergrundsignale.

Abbildung 2 zeigt 3-dimensionale Ansichten von falsch eingefärbten hyperspektralen Rohbilddaten, die mit einem konfokalen Nikon A1R-Mikroskop zu Studienbeginnbedingungen (Abbildung 2A) und 10 Minuten nach (Abbildung 2B) für die Forskolinbehandlung aufgenommen wurden. Beachten Sie, dass ähnliche Detektor- und Systemparameter verwendet wurden, um Bildstapel vor und nach der Behandlung zu erfassen, um die Konsistenz für die quantitative Analyse aufrechtzuerhalten. Beachten Sie auch, dass Änderungen in FRET in diesem Bild nicht offensichtlich sind, da dies eine reine Visualisierung von Rohdaten ist, bevor die FRET-Effizienz berechnet wird.

Eine Spektralbibliothek mit reinen Spektren aller Endelemente wird benötigt, um spektrale Rohbilddaten weiter zu analysieren. Der Aufbau einer geeigneten Spektralbibliothek ist einer der wichtigsten Schritte, um angemessene Messungen der FRET-Effizienz sicherzustellen. Abbildung 3 zeigt den Aufbau einer Spektralbibliothek, die die reinen Spektren von Endstücken enthält (in diesen aktuellen Studien sind die Endmitglieder Türkis, Venus und DRAQ5). Um die FRET-Effizienz zu messen, ist es wichtig, die Spektren von Türkis und Venus mit einer Probe mit 1:1-Stöchiometrie zu erhalten. Hier haben wir einen Ansatz bereitgestellt, bei dem das Akzeptorfluorophor vollständig photozerstört ist, so dass spektrale Signaturen des Donors und Akzeptors mit 1:1-Stöchiometrie erhalten werden können (Abbildung 3A-F). Zusätzlich wurden lineare Leistungsverhältnisse zwischen den Lasern (Ergänzende Abbildung 1) angewendet, um das Akzeptorspektrum mit einer Intensität zu berechnen, die bei Einer Anregung mit dem Donoranregungslaser zu erwarten wäre, in diesem Fall 405 nm für Türkis (Abbildung 3G). Dies stellt sicher, dass ungemischte Donor- und Akzeptorsignale in absoluter Intensität vergleichbar sind, wenn FRET mit einer einzigen 405 nm Laserlinie angeregt wird. Nicht transfizierte Zellen, die mit dem Kernfarbstoff DRAQ5 (Abbildung 3H) markiert waren, wurden verwendet, um das reine Spektrum von DRAQ5 zu erhalten (Abbildung 3I). Durch die Kombination der Spektren des Spenders, Türkis (Abbildung 3F), Akzeptor, Venus (Abbildung 3G) und DRAQ5 (Abbildung 3I) wurde eine 3-Komponenten-Bibliothek erstellt (Abbildung 3J).

Signale von anderen Quellen als den fluoreszierenden Markierungen können auch in einer Probe vorhanden sein. Um diese zu berücksichtigen, wurden drei verschiedene spektrale Signaturen mit Peaks identifiziert, die bei 424 nm, 504 nm und 574 nm in unmarkierten Zellproben auftreten. Wir glauben, dass diese spektralen Signaturen dem Reflexionsreichtum der Abdeckung und der Zellmatrix oder der zellulären Autofluoreszenz entsprechen. Abbildung 4 zeigt die Quellen dieser drei spektralen Hintergrundsignaturen. Es ist wichtig zu beachten, dass diese Signale innerhalb der Probe ungleichmäßig verteilt sind und daher nicht einfach abgezogen werden können. Das Hinzufügen der spektralen Signaturen dieser Signale zur Spektralbibliothek und die Verwendung der linearen Entmischung zur Trennung der Signale stellt jedoch einen Ansatz dar, um diese verwirrenden Signale vor der Berechnung der FRET-Wirkungsgrade von den Donor- und Akzeptorsignalen zu entfernen. Um dies zu erreichen, wurden die drei Hintergrundspektralsignaturen der 3-Komponenten-Spektralbibliothek hinzugefügt und bilden eine neue 6-Komponenten-Bibliothek, die aus Donor (Türkis), Akzeptor (Venus), DRAQ5 und drei Hintergrundspektralsignaturen besteht.

Ein benutzerdefiniertes Programmierskript wurde geschrieben, um die spektralen Bilddaten in einzelne Endmember zu mischen, und ein separates Skript wurde geschrieben, um nachfolgende FRET-Effizienzberechnungen durchzuführen. Die lineare spektrale Entmischung (dargestellt in Abbildung 5)wurde unter Verwendung der 6-Komponenten-Spektralbibliothek durchgeführt. Die Entmischung wurde für jedes Slice im axialen Bildstapel durchgeführt, das auch als Z-Stack bezeichnet wird (siehe die 3-dimensionale Visualisierung von spektralen Rohbilddaten in Abbildung 5A). Dies führte zu separaten ungemischten Bildern für jedes Endmember, für jedes Z-Slice im Z-Stack(Abbildung 5C–E,ungemischte Hintergrundbilder werden nicht angezeigt). Falls gewünscht, können die ungemischten Signale zur Visualisierung falsch gefärbt sein, wobei jedem ungemischten Signal eine andere Farbe zugewiesen ist (Abbildung 5F-H).

Abbildung 6 veranschaulicht die Schritte der FRET-Effizienzberechnungen sowie die Schritte zur Zuordnung der FRET-Effizienz zu cAMP-Werten. Ein FRET-Effizienzbild wurde mit geglätteten, ungemischten Spender- und Akzeptorbildern erzeugt. Ein binäres Maskenbild wurde mit ungemischten Donor-, Akzeptor- und Kernbildern erhalten. Die Maske wurde auf das FRET-Effizienzbild angewendet, um Beiträge von Pixeln außerhalb der Zelle zu entfernen. Obwohl für die bildliche Demonstration von FRET-Effizienzmessungen ungemischte Bilder aus einzelnen Z-Slices verwendet wurden, wurden diese Berechnungen an jedem Slice innerhalb des 3-dimensionalen Bildstapels durchgeführt. Der 3-dimensionale FRET-Bilddatensatz wurde dann in drei orthogonale Ebenen umgeschnitten, um räumliche Gradienten von cAMP-Signalen in verschiedene Richtungen zu visualisieren.

Visualisierung agonisteninduzierter Veränderungen der FRET-Effizienz und der cAMP-Werte
Die oben beschriebenen Schritte bieten eine Methode zur Berechnung der FRET-Effizienz und der cAMP-Werte aus hyperspektralen Bilddaten in drei räumlichen Dimensionen. Diese Schritte können vor und nach der Behandlung mit Verbindungen, die eine cAMP-Reaktion hervorrufen, wie Forskolin, auf zelluläre Präparate angewendet werden. Hier geben wir ein Beispiel für die Verwendung dieses Ansatzes, um Veränderungen der FRET- und cAMP-Verteilung in PMVECs nach der Behandlung mit 50 μM Forskolin zu beobachten. Abbildung 7 zeigt die Veränderungen der FRET-Effizienz und der cAMP-Spiegel in verschiedenen XY-Ebenenscheiben (Z-Slices), von apikal zu basal, was einen Vergleich der Ausgangsbedingungen (vor der Forskolin-Behandlung) und 10-minütiger Nachbehandlung ermöglicht. In diesem illustrativen Beispiel nahm die FRET-Effizienz (Spalten 1 und 3 in Abbildung 7)nach der Behandlung mit Forskolin ab, was mit einem Anstieg der cAMP-Spiegel korrelierte (Spalten 2 und 4 in Abbildung 7). Es wurde eine minimale räumliche Variation von cAMP innerhalb einer einzelnen XY-Ebene beobachtet. Es wurden jedoch axiale (apikal-basale) cAMP-Raumgradienten beobachtet, wie man vermuten lässt, wenn man feststellt, dass die apikale Scheibe eine tiefere rote Farbe hat (was höhere cAMP-Werte durch die aufgetragene Farbsup-Tabelle anzeigt) als die Basalscheibe nach der Forskolin-Behandlung (Spalte 4 in Abbildung 7). Axiale FRET- oder cAMP-Verteilungen können oft besser mit Bildern aus den beiden orthogonalen Raumebenen visualisiert werden: Abbildung 8 zeigt die FRET-Effizienz und die cAMP-Werte in der YZ-Ebene zu Beginn (Spalten 1 und 2) und 10 Minuten nach der Forskolinbehandlung (Spalten 3 und 4), während die ergänzende Abbildung 2 die FRET-Effizienz und die cAMP-Pegeländerungen in der XZ-Ebene darstellt. Diese Ergebnisse zeigen die Machbarkeit der Messung von FRET und der Schätzung von cAMP-Werten aus 3-dimensionalen hyperspektralen Bilddaten und zeigen auch, wie wichtig es ist, axiale Verteilungen von FRET oder cAMP zu visualisieren. Obwohl es den Rahmen dieser methodischen Arbeit sprengt, kann es sein, dass axiale räumliche Verteilungen von zyklischen Nukleotiden zur Spezifität innerhalb zyklischer Nukleotid-Signalwege beitragen.

Bei der Durchführung der oben beschriebenen Methoden ist es wichtig, die Genauigkeit der Schritte sorgfältig zu überprüfen und geeignete Experimentelle und Fahrzeugkontrollen durchzuführen, um sicherzustellen, dass Änderungen der FRET (und des entsprechenden cAMP) auf tatsächliche Veränderungen der Spender- und Akzeptorsignale zurückzuführen sind und keine bildgebenden Artefakte sind. Zu den wichtigen Schritten, die Sie berücksichtigen sollten, gehören beispielsweise:

Verwendung einer geeigneten Spektralbibliothek, die alle erforderlichen spektralen Komponenten enthält
Wie bereits erwähnt, kann es einen signifikanten Beitrag von Hintergrundsignalen aus zellulärer Autofluoreszenz, abgeschiedener Matrix oder reflektiertem Licht aus dem Coverlip (Anregungs-Emission-Bluted Through) geben. Abbildung 9 stellt einen Beispieldatensatz dar, der zeigt, dass das Hintergrundsignal in den Bildern beibehalten wurde, als eine 3-Komponenten-Bibliothek (Türkis, Venus und DRAQ5) verwendet wurde, um die Spektraldaten zu entmischen. Im Gegensatz dazu wurde das Hintergrundsignal effektiv entfernt, wenn eine vollständigere (und angemessenere) 6-Komponenten-Spektralbibliothek verwendet wurde.

Verwenden eines optimalen Schwellenwerts zum Generieren einer Zellmaske
In vielen der Experimente, die wir durchgeführt haben, beträgt die Hintergrundsignalintensität etwa 50-60% der FRET-Signalintensität, die in den rohen spektralen Bilddaten vorhanden ist (d.h. bei der Visualisierung unverarbeiteter spektraler Bilddaten ist der Peak des FRET-Signals nur ~ 2x höher als der des umgebenden Hintergrundsignals). Daher ist die Trennung des Hintergrundsignals vom Vordergrundsignal unter Verwendung eines Schwellenwerts zur Erteilung einer binären Maske ein sensibler Schritt und muss sorgfältig durchgeführt werden, um Analyseartefakte zu vermeiden. Abbildung 10 veranschaulicht die Auswirkungen verschiedener Schwellenwerte, die für die Zellsegmentierung angewendet werden, um eine binäre Maske der Zelle zu erstellen. Ein niedriger Schwellenwert kann ein Hintergrundsignal als Teil der exprimierenden Zelle enthalten. Auf der anderen Seite kann ein zu hoher Schwellenwert die Messung von FRET in niedrig exprimierenden Zellen oder Regionen einer Zelle mit niedrigem Donor+ Akzeptorsignal ausschließen (entweder sehr dünne Teile der Zelle oder Teile, die eine niedrigere regionale Konzentration der FRET-Sonde aufweisen können).

Auswahl einer transfizierten Zelle mit Donor+Akzeptor-Signalintensität ≥ Hintergrundsignal
Abbildung 11 zeigt einen Beispieldatensatz, in dem FRET-Wirkungsgrade und entsprechende Werte aus ungemischten Bildern gemessen wurden, die mit einer 6-Komponenten-Spektralbibliothek für die lineare spektrale Entmischung erhalten wurden. Trotz der Verwendung der 6-Komponenten-Bibliothek zum Entmischen spektraler Bilddaten und der Auswahl eines hohen Schwellenwerts für die Erstellung des Zellrands und der Kernmaske waren FRET-Effizienzbilder immer noch anfällig für ein hohes Hintergrundrauschsignal in der Nähe der Basalseite der Zelle. In diesem Fall war das Vorhandensein von Hintergrundgeräuschen auf die Auswahl einer Zelle zurückzuführen, die die FRET-Sonde nur schwach exprimierte, und die Signalstärke von Donor + Akzeptor entsprach auch nach dem Entmischen ungefähr der Hintergrundsignalstärke. Daher ist es neben der Anwendung der oben beschriebenen ausgefeilten Analyseschritte auch wichtig, bei der Erfassung eine Zelle mit ausreichender Expression der FRET-Sonde und entsprechend ausreichendem FRET-Signal (Donor- und Akzeptorsignal mindestens gleich oder oberhalb des Rauschsignals) auszuwählen, um qualitativ hochwertige Ergebnisse zu gewährleisten.

Figure 1
Abbildung 1: Flussdiagramm, das die Schritte der FRET-Effizienz- und Füllstandsmessungen in drei räumlichen Dimensionen unter Verwendung hyperspektraler FRET-Bildgebung und -Analyse darstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Eine 3-dimensionale Visualisierung einer Zelle, die den cAMP FRET-Reporter (grün) und Kerne aus der Zelle und umgebenden nicht exprimierenden Zellen (rot) exprimieren. Spektrale Rohbilddaten, die mit einem konfokalen Spektralmikroskop Nikon A1R aufgenommen wurden, wurden je nach Wellenlänge falsch eingefärbt und mit der NIS Elements-Software in 3 Dimensionen visualisiert. A) 3-dimensionale Bilddaten zu Studienbeginn und B) 10 Minuten nach 50 μM Forskolin-Behandlung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Aufbau einer Spektralbibliothek, die die reinen Spektren fluoreszierender Markierungen in der Studie enthält (vom Fernerkundungsfeld als Endmember bezeichnet). A) Ein falschfarbiges Bild von Zellen, die den FRET-Biosensor exprimieren, aufgenommen bei 405 nm Anregung (Spenderanregung). B) Spektrum entsprechend FRET-Signal: Auf Bild A wurden 4 verschiedene Regionen von Interesse (ROIs) gezeichnet, die durch rote, gelbe, blaue und grüne Rechtecke dargestellt sind. Die durchschnittliche Intensität bei jeder Wellenlänge für jeden ausgewählten ROI wurde exportiert. Die durchschnittliche Intensität dieser 4 ROIs wurde bei jeder Emissionswellenlänge dargestellt. Die Emissionsspitzen des Spektrums entsprechen sowohl den Donor- (Türkis) als auch den Akzeptor- (Venus) Fluorophoren. C) Ein falschfarbiges Bild von Zellen, die den FRET-Biosensor exprimieren, aufgenommen bei 488 nm Anregung (Akzeptoranregung). D) Das durchschnittliche Spektrum wurde wie in B erläutert aus mehreren ROIs in C (den gleichen Regionen wie in A) geschätzt, wobei die Emissionsspitze nur auf den Akzeptor zurückzuführen ist. E) Ein falschfarbiges Bild von Zellen, die den FRET-Biosensor exprimieren, der bei 405 nm Anregung nach Photozerstörung des Akzeptorfluorophors durch 514 nm Bestrahlung aufgenommen wurde. F) Das durchschnittliche Spektrum wurde wie in B erläutert aus mehreren ROIs in E (den gleichen Regionen wie A) geschätzt, wobei die Emissionsspitze nur auf den Geber zurückzuführen ist. BEACHTEN Sie, dass die Donorintensität in F im Vergleich zum ursprünglichen FRET-Signal erhöht ist, was darauf hindeutet, dass nach dem Photobleachen des Akzeptors die Anregung des Spenders zu einer direkten Donoremission führt. G) Das Akzeptorspektrum, wie es bei 405 nm Anregung zu erwarten wäre. Dies wurde unter Verwendung der Tatsache geschätzt, dass die 405 nm und 488 nm Anregungslaser eine lineare Reaktion haben, die mit einem Spektrometer und einer Ulbrichtkugel (Ergänzende Abbildung 1) und dem wellenlängenabhängigen Extinktionskoeffizienten der Venus charakterisiert werden kann. Daher kann das Bei 488 nm Anregung erhaltene Venusspektrum in das Venusspektrum umgewandelt werden, das bei 405 nm Anregung zu erwarten wäre H) Ein falschfarbiges Bild von Zellen, die mit dem Kernlabel DRAQ5 markiert sind. I) Das mittlere Spektrum aus mehreren Regionen von Interesse in H. J) Die resultierende Spektralbibliothek, die die normalisierten reinen Spektren des Donors und DRAQ5 und das Anregungswellenlängen-korrigierte Spektrum des Akzeptors enthält. Beachten Sie, dass Türkis- und Venusspektren auf den Maximalwert der kombinierten Turquoise + Venus-Spektraldaten normalisiert wurden, während DRAQ5 einfach auf Einheit am Wert der Spitzenemissionswellenlänge normalisiert wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Spektralsignaturen im Hintergrund wurden identifiziert und in die Spektralbibliothek aufgenommen, um Hintergrundfluoreszenzsignale während des Entmischungsprozesses zu berücksichtigen. A, B) Bei der Charakterisierung eines Probenrohlings (unmarkiertes Coverlip) wurden zwei Spektralsignaturen der Hintergrundfluoreszenz beobachtet. Diese spektralen Signaturen wurden basierend auf ihren Spitzenwellenlängen benannt – eine bei 424 nm (aus Der Coverlip-Fluoreszenz) und die andere bei 504 nm (wahrscheinlich durch Reflexion oder Rückstreuung). C) Eine dritte spektrale Hintergrundsignatur wurde mit einer Spitzenemissionswellenlänge von 574 nm beobachtet, wenn nicht markierte Zellen analysiert wurden, möglicherweise aus zellulärer Autofluoreszenz oder Fluoreszenz der zugrunde liegenden Matrix. D) Hintergrundspektren, die aus den Bildern A, B und C extrahiert wurden. Diese drei Hintergrundspektren wurden der bestehenden 3-Komponenten-Bibliothek (Abbildung 3J) hinzugefügt, um eine 6-Komponenten-Spektralbibliothek zu entwickeln. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Lineare spektrale Entmischung mit einer 6-Komponenten-Spektralbibliothek, die Hintergrundsignale berücksichtigt. A) Spektrale Rohbilddaten, die als axialer Z-Stack erfasst wurden. B) 6-Komponenten-Spektralbibliothek, die verwendet wird, um spektrale Rohdaten linear zu mischen. C, D und E) Graustufen-Ungemischte Bilder von DRAQ5, Türkis und Venus resultierten aus linearer spektraler Entmischung. F, G und H) Falschfarbige, ungemischte Bilder von DRAQ5, Türkis und Venus. Es wurden auch ungemischte Bilder von Hintergrundsignalen berechnet (Daten, die hier nicht gezeigt werden, da nur die fluoreszierenden Markierungen für diese Methodik von Interesse sind – siehe Abbildung 4 in Annamdevula et al. für Beispiele für ungemischten Hintergrundsignale25). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Flussdiagramm, das die Schritte zur Berechnung von FRET- und cAMP-Werten aus ungemischten Spektralbilddaten darstellt. A) Repräsentatives, ungemischter Spender, Türkis. B) Repräsentatives, ungemischtes Bild des Akzeptors, Venus. C) Repräsentatives ungemischtes Bild von Kernen, DRAQ5. D) Binäre Zellmaske wird durch Schwellenwert für ein nicht gemischtes Donor+ Akzeptor summiertes Bild generiert. E) Ein Schwellenwert wird auf das Kernbild angewendet, um eine binäre Maske des Kerns zu erzeugen. F) Die pixelweise FRET-Effizienz wurde aus ungemischten Donor- und Akzeptorbildern berechnet. G) Aus Zellrand- und Kernmasken wurde eine zusammengesetzte binäre Maske erstellt. H) Maskiertes FRET-Effizienzbild: Die zusammengesetzte Zellmaske wurde auf das FRET-Effizienzbild aufgetragen, um unspezifische FRET-Signale außerhalb der Zelle und innerhalb des Zellkerns auszuschließen. I) Eine Farbkarte wurde auf das maskierte FRET-Effizienzbild angewendet, um räumliche Veränderungen in FRET besser zu visualisieren. J) Das cAMP-Level-Bild, das aus dem FRET-Effizienzbild geschätzt wurde. K) Colormap wurde angewendet, um räumliche Veränderungen in cAMP besser zu visualisieren. Die auf der rechten Seite gezeigten Farbbalken wurden verwendet, um die FRET-Effizienz (oberes Panel) und die cAMP-Pegel (unteres Panel) zu visualisieren. Die in dieser Abbildung gezeigten Bilder sind repräsentativ für einen einzelnen axialen Z-Slice, aber der in dieser Abbildung beschriebene Analysevorgang wird am gesamten axialen Z-Stack durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: Forskolin-induzierte FRET-Effizienz und cAMP-Raumgradienten, visualisiert in PMVECs. XY-Ebenenbilder wurden durch Umkappung von 3-dimensional rekonstruierten FRET- und cAMP-Bilddaten in axialer (Z) Richtung von der apikalen zur basalen Seite der Zelle erzeugt. Fünf zusammenhängende XY-Slices werden angezeigt. Die Spalten 1 und 3 stellen die FRET-Effizienz zu Studienbeginn bzw. 10 Minuten nach der Behandlung mit 50 μM Forskolin dar. Die Spalten 2 und 4 geben die Werte zu Studienbeginn und 10 Minuten nach der Behandlung mit Forskolin an. Die Farbbalken wurden verwendet, um Änderungen in der Colormap mit der FRET-Effizienz (oben) und den cAMP-Ebenen (unten) in Beziehung zu setzen. Weiße Linien, die auf Bildern in Spalte 2 und Spalte 4 angezeigt werden, werden verwendet, um das Intensitätsprofil (Zeilenscanprofil) von cAMP-Signalen über diese ausgewählte Linie zu generieren. Das Intensitätsprofildiagramm, das aus der mittleren Scheibe der Zelle zu Studienbeginn (blaues Profil) und nach der Forskolinbehandlung (grünes Profil) erhalten wird, zeigt die räumliche Verteilung der cAMP-Signale über den Zeilenscan. Der Maßstabsbalken zeigt 20 μm an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 8
Abbildung 8: Forskolin-induzierte FRET-Effizienz und cAMP-Raumgradienten, visualisiert in axialer Richtung. YZ-Ebenenbilder wurden durch Umbleiben von 3-dimensional rekonstruierten FRET- und cAMP-Bilddaten in lateraler (X) Richtung (von links nach rechts der Zelle) erzeugt. Die Spalten 1 und 3 stellen die FRET-Effizienz zu Studienbeginn bzw. 10 Minuten nach 50 μM Forskolin-Behandlung dar. Die Spalten 2 und 4 stellen die cAMP-Spiegel zu Studienbeginn und 10 Minuten nach der Forskolin-Behandlung dar. Die Farbbalken rechts wurden verwendet, um Änderungen in der Colormap mit der FRET-Effizienz (oben) und den cAMP-Ebenen (unten) in Beziehung zu setzen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 9
Abbildung 9: Ein Vergleich der Effektivität der Verwendung einer 3-Komponenten- oder einer 6-Komponenten-Spektralbibliothek zur Berechnung von FRET- und cAMP-Pegelbildern. Unspezifische Hintergrundsignale wurden in Bildern beobachtet, die mit einer 3-Komponenten-Bibliothek berechnet wurden, die keine spektralen Hintergrundsignaturen berücksichtigte. Dies galt insbesondere für Bilder in der Nähe der Basalseite der Zelle nach einer 50 μM Forskolin-Behandlung (Spalte 2). Im Gegensatz dazu wurden Hintergrundsignalartefakte effektiv entfernt, wenn eine 6-Komponenten-Bibliothek verwendet wurde, die Hintergrundspektralsignaturen enthielt, wodurch die Fähigkeit verbessert wurde, die Zelle zu segmentieren und FRET- und cAMP-Signale zu analysieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 10
Abbildung 10: Bildanalyseartefakte können eingeführt werden, wenn kein geeigneter Schwellenwert ausgewählt ist, um die Zell- und Kerngrenzen abzugrenzen. Unmischte Spender- und Akzeptorbilder wurden verwendet, um eine Maske mit drei verschiedenen Schwellenwerten zu erstellen: 0,35 (Spalten 1 als 2), 0,65 (Spalten 3 und 4) und 0,9 (Spalten 5 und 6). In den Spalten 1, 3 und 5 wird die FRET-Effizienz zu Beginn angezeigt. Die Spalten 2, 4 und 6 zeigen die FRET-Effizienz nach 10 Minuten nach 50 μM Forskolin-Behandlung an. Die Auswahl eines zu niedrigen Schwellenwerts führte dazu, dass Teile des Hintergrunds oder des extrazellulären Bereichs zur Analyse in die Zelle einbezogen wurden, während die Auswahl eines zu hohen Schwellenwerts zum Verlust eines Teils der Zelle führte (siehe das apikale Segment in den Spalten 4-5 im Vergleich zu den Spalten 3-4). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 11
Abbildung 11: Hintergrundsignalartefakte können auch nach dem Entmischen des Hintergrunds und der Auswahl eines geeigneten Schwellenwerts während der Erstellung einer binären Maske bestehen bleiben. Spalte 1 zeigt repräsentative apikale, mittlere und basale Scheiben zu Studienbeginn und Spalte 2 zeigt dasselbe nach 10 Minuten nach 50 μM Forskolin-Behandlung. Trotz der Verwendung einer 6-Komponenten-Bibliothek für die Entmischung, die Hintergrundsignale berücksichtigte, und der Verwendung eines höheren Schwellenwerts von 0,85 für die binäre Maskengenerierung wurden Hintergrundregionen immer noch als Teil der Zelle identifiziert, insbesondere nach der Behandlung mit Forskolin. In diesem Fall kann eine mögliche Erklärung dafür sein, dass eine Zelle mit schwacher Expression des FRET-Reporters für die Bildgebung ausgewählt wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Messungen der Laserlinienintensität in Abhängigkeit von der Lasereinstellung in der Software. Ein fasergekoppeltes Spektrometer und eine Ulbrichtkugel wurden auf eine NIST-rückführbare Lampe kalibriert, um die Laserintensität sowohl für die 405-nm-Laserlinie als auch für die 488-nm-Laserlinie zu messen. A) Gesamtzahl der im Mikroskopstadium gemessenen Photonen entsprechend den unterschiedlichen Laserdicken des 405-nm-Lasers. B) Gesamtzahl der im Mikroskopstadium gemessenen Photonen entsprechend unterschiedlichen Laserdicken von 488 nm Laser. Für beide Laser wurde eine lineare Reaktion der Laserintensität beobachtet, wie sie im Mikroskopstadium gemessen wurde. Eine lineare Trendlinie war passend und die Trendliniengleichung für jede Laserlinie wurde verwendet, um das Akzeptorspektrum zu berechnen, das bei Anregung mit der 405nm-Laserlinie (Donoranregung) zu erwarten wäre. Bitte klicken Sie hier, um diese Figur herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Forskolin-induzierte FRET-Effizienz und cAMP-Raumgradienten, visualisiert in axialer Richtung. XZ-Ebenenbilder wurden durch Umkappung von 3-dimensional rekonstruierten FRET- und cAMP-Bilddaten in lateraler (Y) Richtung (von vorne nach hinten) der Zelle) erzeugt. Die Spalten 1 und 3 stellen die FRET-Effizienz zu Studienbeginn bzw. 10 Minuten nach 50 μM Forskolin-Behandlung dar. Die Spalten 2 und 4 stellen die cAMP-Spiegel zu Studienbeginn und 10 Minuten nach der Forskolin-Behandlung dar. Die Farbbalken rechts wurden verwendet, um Änderungen in der Colormap mit der FRET-Effizienz (oben) und den cAMP-Ebenen (unten) in Beziehung zu setzen. Ähnlich wie bei den Ergebnissen für die YZ-Ebenen (Abbildung 8) können apikale bis basale räumliche Gradienten in FRET-Effizienz und cAMP-Ebenen als Farbänderungen von oben nach unten eines einzelnen YZ-Slices visualisiert werden, sowohl unter Baseline-Bedingungen (ein beliebiges Slice in den Spalten 1-2) als auch nach 50 μM Forskolin-Behandlung (Spalten 3-4). Bitte klicken Sie hier, um diese Figur herunterzuladen.

Ergänzende Dateien. Bitte klicken Sie hier, um diese Dateien herunterzuladen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Die Entwicklung von FRET-Biosensoren hat die Messung und Visualisierung von zyklischen Nukleotidsignalen in einzelnen Zellen ermöglicht, und es gibt große Vielversprechende für die Visualisierung subzellulärer Signalereignisse13,22,37,38. Die Verwendung von FRET-Biosensoren birgt jedoch mehrere Einschränkungen, darunter die niedrigen Signal-Rausch-Eigenschaften vieler fluoreszierender proteinbasierter FRET-Reporter und die schwache Transfektions- oder Expressionseffizienz der FRET-Reporter (dies kann bei bestimmten Zelllinien wie PMVECs besonders schwierig sein)23,24. Die Abbildung schwach exprimierter fluoreszierender Proteine, kombiniert mit ratiometrischen FRET-Berechnungen, führt oft zu einem hohen Maß an Unsicherheit oder Fluktuation in der berechneten FRET-Effizienz. In dem Bestreben, die Zuverlässigkeit von FRET-Messungen zu verbessern, haben wir und andere zuvor die Verwendung von hyperspektraler Bildgebung und Analyse zur Messung von FRET-Signalen und zur Verringerung des Übersprechens oder Durchblutens von Fluoreszenzsignalen zwischen Fluoreszenzmarkierungen und Autofluoreszenzeffekten demonstriert26,31,32,39. Aufgrund von Einschränkungen in der Signalstärke waren diese spektralen FRET-Studien bis vor kurzem auf zwei (X und Y) räumliche Dimensionen beschränkt. Daher boten sie eine Einzelscheibenansicht der FRET-Änderungen innerhalb einer Zelle.

In neueren Studien stellten wir fest, dass FRET (und entsprechende cAMP-Werte) nicht nur in der XY-Ebene, sondern auch über die XZ- und YZ-Ebenen25räumlich verteilt zu sein schienen. Der hier beschriebene hyperspektrale FRET-Bildgebungsansatz erweitert unsere Fähigkeit, FRET- und cyclische Nukleotidveränderungen (cAMP) in drei räumliche Dimensionen zu visualisieren und zu messen, was neue Möglichkeiten zur Beurteilung der Signalkompartimentierung eröffnet. Dieser 4-dimensionale (X, Y, Z und λ) hyperspektrale Bildgebungs- und Analyseansatz ermöglicht die Messung und Visualisierung von cAMP-Gradienten in drei räumlichen Dimensionen unter Berücksichtigung ungleichmäßiger Hintergrundsignale. Hier haben wir am Beispiel von Forskolin-induzierten cAMP-Raumgradienten gezeigt, wie dieser Ansatz umgesetzt werden kann. In den Bilddaten nach der Behandlung können räumliche cAMP-Gradienten von der apikalen zur basalen Seite der Zelle beobachtet werden (Abbildung 7 und Abbildung 8). Das bei der Behandlung mit Forskolin erzeugte cAMP schien keine Zell-Zell-Verbindungen zu erreichen (Abbildung 7 und Abbildung 8).

Bei der Anwendung der hier beschriebenen Methodik war es wichtig, verschiedene Quellen von Hintergrund- und Autofluoreszenzsignalen zu berücksichtigen, um eine genaue Schätzung der FRET-Wirkungsgrade zu ermöglichen. Die lineare Entmischung bietet einen potenziellen Weg, um einzigartige Hintergrundspektren zu berücksichtigen, wenn sich ihre Signaturen von denen der interessierenden Fluoreszenzsonden unterscheiden. Insbesondere die lineare Entmischung eignet sich besser zur Trennung von Hintergrund- und Autofluoreszenzsignalen als die Standardhintergrundsubtraktion. 40,41,42 Im hier gezeigten Beispiel wurden drei verschiedene spektrale Signaturen gemessen und basierend auf der maximalen Emissionswellenlänge der Signatur ein Name zugewiesen: das 424 nm Hintergrundspektrum (möglicherweise aus der Coverslip-Fluoreszenz), das 504 nm Hintergrundspektrum (wahrscheinlich aufgrund von reflektiertem oder rückgestreutem Licht) und das 574 nm Hintergrundspektrum (möglicherweise aufgrund von Zell- oder Zellmatrix-Autofluoreszenz). Um die Auswirkungen der Nichtberücksichtigung dieser Signaturen zu veranschaulichen, wurden zwei Spektralbibliotheken erstellt und ungemischte Bilder verglichen. Zuerst wurde eine Spektralbibliothek erstellt, die nur die fluoreszierenden Markierungen in der Probe, Türkis, Venus und DRAQ5, enthält und die 3-Komponenten-Bibliothek beschriftet. Zweitens wurde eine Spektralbibliothek erstellt, die zusätzlich die drei Hintergrundspektralsignaturen enthielt und die 6-Komponenten-Bibliothek beschriftet. Wie oben gezeigt, ermöglichte das Entmischen mit der 6-Komponenten-Bibliothek (Background Unmixing) das Entfernen von Hintergrundsignalen, während das Unmixing mit der 3-Komponenten-Bibliothek dies nicht tat (Abbildung 9). In früheren Arbeiten haben wir gezeigt, dass der mit der linearen Entmischung verbundene Root Mean Squared Error (RMSE) verringert wird, wenn eine Spektralbibliothek verwendet wird, die sowohl die fluoreszierenden Markierungen als auch die Hintergrundsignaturen berücksichtigt. Es sollte beachtet werden, dass die axiale Verteilung der Hintergrundfluoreszenz oft ungleichmäßig ist und daher eine einfache Hintergrundsubtraktion nicht funktioniert, um die Bilddaten zu korrigieren. Daher ist der spektrale Unmixing-Ansatz erforderlich, um eine genaue Hintergrundentfernung und zuverlässige FRET-Messungen zu ermöglichen.

Es ist wichtig, die Systemparameter zu optimieren, um bei der Aufnahme von Spektralbildern die bestmöglichen System- und Kameraeinstellungen auszuwählen. Das übergeordnete Ziel sollte es sein, SNR zu optimieren und gleichzeitig die Aufnahmezeit zu minimieren und Photobleaching zu verhindern. 43 Daher ist bei der Optimierung eines Bildgebungssystems häufig ein Kompromiss zwischen räumlichen, zeitlichen und spektralen Auflösungen erforderlich. In diesen Studien wurden optimale Werte für die System- und Kameraeinstellungen ausgewählt, einschließlich Lochgröße, Laserleistung, Scangeschwindigkeit, Scangröße und Frame-Mittelung, wie im Protokollabschnitt beschrieben. Unter Verwendung dieser Einstellungen wird die räumliche Abtastung von 80 nm / Pixel, die zeitliche Abtastung von ~ 3 Minuten pro spektralem z-Stack (~ 10 Sekunden / XY-Bild) und die spektrale Abtastung von 10 nm Intervall mit vernachlässigbarem oder minimalem Photobleaching erreicht.

Um genaue Schätzungen der FRET-Effizienz zu gewährleisten, ist es notwendig, Donor- und Akzeptorspektren so zu messen, wie sie bei 1:1-Stöchiometrie und identischen Anregungswellenlängen zu erwarten wären (Abbildung 3). Türkis- und Venusspektren wurden in Bezug auf die Spitzenemissionswellenlänge Türkis normalisiert. Die FRET-Effizienz, die mit dieser Spektralbibliothek geschätzt wurde, ergab Werte, die denen in Literatur12,22 ähnlich waren. In der Regel werden Endmemberspektren in der Bibliothek auf Einheit normalisiert. Um jedoch die FRET-Effizienz genau zu berechnen, muss das Akzeptorspektrum in Bezug auf das Donorspektrum erfasst werden (d. H. Bei äquimolarer Konzentration oder 1:1-Stöchiometrie und bezogen auf die gleiche Anregungswellenlänge). Neben der Verwendung einer ordnungsgemäß aufgebauten Bibliothek sind mehrere Schritte zur angemessenen Schätzung der FRET-Effizienz und zur Vermeidung von Analyseartefakten erforderlich. Dazu gehören die Auswahl einer exprimierenden Zelle mit ausreichender Signalintensität (Abbildung 11), die Glättung ungemischter Bilder vor der Schätzung der FRET-Effizienz (Gaußsche Unschärfe wurde in diesem Beispiel angewendet), die Verwendung eines geeigneten Schwellenwerts zur Erstellung der Maske (Abbildung 10) und die Schätzung eines Korrekturfaktors unter Verwendung von Extinktionskoeffizienten von Spender und Akzeptor (Supplemental File_Spectral Library). Wenn diese Schritte befolgt werden, können 3-dimensionale Verteilungen der FRET-Effizienz und der zugrunde liegenden cAMP-Werte in einzelnen Zellen genau visualisiert werden.

Lokalisierte cAMP-Signale wurden in 2-räumlichen Dimensionen mit gezielten FRET-Biosensoren13,37geschätzt. Die Ausrichtung von FRET-Sonden auf bestimmte subzelluläre Kompartimente (z. B. Plasmamembran oder Lipidflöße) führt jedoch typischerweise zu einer erhöhten lokalen Konzentration der Sonde. Dies kann zu Messartefakten führen, die durch intermolekulare oder bimolekuläre FRET eingeführt werden. Darüber hinaus zeigen die hier und in Annamdevula et.al., 2018, Cytometry A25 vorgestellten Ergebnisse die Bedeutung von 3-dimensionalen Messungen von FRET an löslichen oder gezielten Sonden.

Trotz der Bedeutung der Messung von cAMP-Signalen in drei räumlichen Dimensionen gibt es auch Einschränkungen für diesen Ansatz. Die restriktivste Einschränkung sind die langen Erfassungszeiten – ca. 3 Minuten pro spektralem z-Stack. Diese Erfassungsrate schließt es aus, diesen Ansatz zur Erkennung von etwas anderem als quasi-stationären cAMP-Verteilungen in Zellen zu verwenden. Die vorgestellten Ergebnisse zeigen jedoch, wie wichtig es ist, quasi-stationäre 3-dimensionale (x, y, z) cAMP-Messungen als kritische Ergänzung zu 2-dimensionalen Standardmessungen (x, y) einzubeziehen. In Zukunft wird es interessant sein, markierte Proteine und Zelluläre Strukturen in das experimentelle Design zu integrieren. Die sorgfältige Auswahl der Fluorophore, die zur Markierung von Proteinen (und/oder Strukturen) verwendet werden, würde es ermöglichen, die 3-dimensionalen Verteilungen der markierten Proteine und FRET ohne zusätzlichen Verlust der Erfassungsgeschwindigkeit zu bewerten. Dies wiederum würde die Messung lokalisierter cAMP-Signale und cAMP-Signale in der Nähe der markierten Proteine in drei räumlichen Dimensionen ermöglichen und damit eine wichtige experimentelle Ergänzung zu gezielten cAMP-Sonden bieten und den Nutzen hyperspektraler Messungen von 3-dimensionalen cAMP-Verteilungen in lebenden Zellen weiter ausbauen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. Leavesley und Rich legen finanzielle Beteiligungen an einem Start-up-Unternehmen, SpectraCyte, LLC, offen, das gegründet wurde, um spektrale Bildgebungstechnologien zu kommerzialisieren. Alle in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren wurden jedoch mit kommerziell erhältlichen Produkten durchgeführt, die nicht mit SpectraCyte, LLC verbunden sind.

Acknowledgments

Die Autoren danken Dr. Kees Jalink (The Netherlands Cancer Institute und van Leeuwenhoek Center for Advanced Microscopy, Amsterdam, Niederlande) für die Bereitstellung des H188 cAMP FRET Biosensors und Kenny Trinh (College of Engineering, University of South Alabama) für die technische Hilfe bei der Reduzierung der Zeit, die für die Ausführung unserer speziell entwickelten Programmierskripte erforderlich ist.

Die Autoren möchten die Finanzierungsquellen anerkennen: American Heart Association (16PRE27130004), National Science Foundation; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Attofluor Cell Chamber Invitrogen A7816 Attofluor contains steel cell chambers and a rubber O-ring. Cell chamber holds the coverslip and O-ring provides a lock in mechanism to hold the buffer in cell chamber with out leakage
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific BP231-100 Solvent used to prepare stock solution forskolin.
DRAQ5 Fluoroscent Probe Solution Thermo Scientific 62252 Nuclear label
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965-092 Contains nutrients and growth factors for the cells to grow and divide in the culture dishes.
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F6178 Growth factor suppliment that is added to culture medium, DMEM
Forskolin Sigma F3917 Adenyly cyclase activator.
H188 Cyclic AMP FRET biosensor Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink Gift Plasmid encoding Turquoise (donor fluorophore), Venus (acceptor fluorophore), and binding domain obtained from Epac.
Image J image.net Free download Another image processing platform used to extact spectral information and image processing.
Integrating Sphere Ocean Optics FOIS-1 Used to measure illumination intensity of the laser line at different laser intensities (?).
Laminin Mouse Protein, Natural Invitrogen 23017-015 Coverslips are coated with laminin and this helps in cell attachment, growth and motility of the cell.
Lipofectamine 3000 Transfection Kit Invitrogen L3000-015 Transfection reagent used to transfect cells with H188 FRET biosensor
MATLAB Mathworks R2019a Image processing operations (linear unmixing and FRET efficiency calculations) are performed by writing custom programs in MATLAB programming environment
Nikon A1R confocal microscope Nikon Instruments Nikon A1R Spectral image acquisition is performed using confocal microscope.
Nikon Elements Software Nikon Instruments Software dongle used to export and handle nd2 image files (multidimensional image files) that are aquired using Nikon A1R
NIST-Traceable Calibration Lamp Ocean Optics LS-1-CAL-INT A lamp with a known spectrum for use as a standard
PBS pH 7.4 (1X) Gibco 10010-023 coomonly used buffer suring cell culture
Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs) In house - Cell culture core, Univeristy of South Alabama Isolated from Rat pulmonary microvasculature PMVECs form inner lining of a blood vessel.
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Gibco 15140-122 antibiotics are added to culture medum to prevent contamination of the cells.
Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides Clay Adams 3010 Microscope slides used for cell fixation
ProLong Diamond Antifade Mounting Media Invitrogen P36961 If samples are fixed using antifade mountant, then the later protects fluoroscent dyes and chromophores from fading.
Spectrometer Ocean Optics QE65000 Used to measure spectral response of the light source (?)
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200-056 Digests the protein-protein bond between the cell and cell matrix and helps to disscociate and lift the cells during cell plating.
Tyrodes Buffer Made in-house Made in-house Tyrodes buffer is used to make working solutions and to maintain cells in aqueous solution during image acquisition.
6 Well Cell Culture Plate Corning 3506 Laminin coated coverslips are placed in 6-well culture dish (one coverlisps/well). Cells along with medium is added into each well.
25 mm Round Microscope Cover Slips Fisher Scientific 12545102 Cells were grown on round glass coverslips
60X Ojective Nikon Instruments Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 water immersion and commonly used objective for cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Corbin, J. D., Sugden, P. H., Lincoln, T. M., Keely, S. L. Compartmentalization of adenosine 3':5'-monophosphate and adenosine 3':5'-monophosphate-dependent protein kinase in heart tissue. The Journal of Biological Chemistry. 252, 3854-3861 (1977).
  2. Terrin, A., et al. PGE1 stimulation of HEK293 cells generates multiple contiguous domains with different [cAMP]: role of compartmentalized phosphodiesterases. The Journal of Cell Biology. 175, 441-451 (2006).
  3. Bacskai, B. J., et al. Spatially resolved dynamics of cAMP and protein kinase A subunits in Aplysia sensory neurons. Science. 260, 222-226 (1993).
  4. Iancu, R. V., Ramamurthy, G., Harvey, R. D. Spatial and temporal aspects of cAMP signalling in cardiac myocytes. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 35, 1343-1348 (2008).
  5. Brunton, L. L., Hayes, J. S., Mayer, S. E. Functional compartmentation of cyclic AMP and protein kinase in heart. Advances in Cyclic Nucleotide Research. 14, 391-397 (1981).
  6. Hohl, C. M., Li, Q. Compartmentation of cAMP in adult canine ventricular myocytes. Relation to single-cell free Ca2+ transients. Circulation Research. 69, 1369-1379 (1991).
  7. Rich, T. C., et al. A uniform extracellular stimulus triggers distinct cAMP signals in different compartments of a simple cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 13049-13054 (2001).
  8. Sayner, S. L., Alexeyev, M., Dessauer, C. W., Stevens, T. Soluble adenylyl cyclase reveals the significance of cAMP compartmentation on pulmonary microvascular endothelial cell barrier. Circulation Research. 98, 675-681 (2006).
  9. Rich, T. C., Tse, T. E., Rohan, J. G., Schaack, J., Karpen, J. W. In vivo assessment of local phosphodiesterase activity using tailored cyclic nucleotide-gated channels as cAMP sensors. The Journal of General Physiology. 118, 63-78 (2001).
  10. Blackman, B. E., et al. PDE4D and PDE4B function in distinct subcellular compartments in mouse embryonic fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 286, 12590-12601 (2011).
  11. Sayner, S. L., et al. Paradoxical cAMP-induced lung endothelial hyperpermeability revealed by Pseudomonas aeruginosa ExoY. Circulation Research. 95, 196-203 (2004).
  12. Klarenbeek, J., Jalink, K. Detecting cAMP with an EPAC-based FRET sensor in single living cells. Methods in Molecular Biology. 1071, 49-58 (2014).
  13. Surdo, N. C., et al. FRET biosensor uncovers cAMP nano-domains at β-adrenergic targets that dictate precise tuning of cardiac contractility. Nature Communications. 8, 15031 (2017).
  14. Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Reports. 5, 1176-1180 (2004).
  15. Vogel, S. S., Thaler, C., Koushik, S. V. Fanciful FRET. Science's STKE. 2006, (2006).
  16. Clegg, R. M. The History of FRET: From conception through the labors of birth. Reviews in Fluorescence. 3, (2006).
  17. Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-224 (2006).
  18. Manzella-Lapeira, J., Brzostowski, J. A. Imaging protein-protein interactions by Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy in live cells. Current Protocols in Protein Science. 93, 58 (2018).
  19. Cooper, D. M. F., Mons, N., Karpen, J. W. Adenylyl cyclases and the interaction between calcium and cAMP signalling. Nature. 374, 421-424 (1995).
  20. Sassone-Corsi, P. Coupling gene expression to cAMP signalling: role of CREB and CREM. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 30, 27-38 (1998).
  21. Rebhun, L. I. Cyclic nucleotides, calcium, and cell division. International Review of Cytology. 49, 1-54 (1977).
  22. Klarenbeek, J., Goedhart, J., Van Batenburg, A., Groenewald, D., Jalink, K. Fourth-generation Epac-based FRET sensors for cAMP feature exceptional brightness, photostability and dynamic range: characterization of dedicated sensors for FLIM, for ratiometry and with high affinity. PLOS ONE. 10, 0122513 (2015).
  23. Leavesley, S. J., Rich, T. C. FRET: signals hidden within the noise. Cytometry Part A. 85, 918-920 (2014).
  24. Rich, T. C., Webb, K. J., Leavesley, S. J. Can we decipher the information content contained within cyclic nucleotide signals. The Journal of General Physiology. 143, 17-27 (2014).
  25. Annamdevula, N. S., et al. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
  26. Leavesley, S. J., Britain, A. L., Cichon, L. K., Nikolaev, V. O., Rich, T. C. Assessing FRET using spectral techniques. Cytometry Part A. 83, 898-912 (2013).
  27. Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming limitations of FRET measurements. Cytometry Part A. 89, 325-327 (2016).
  28. Fink, D. J. Monitoring Earcths Resources from Space. Technology Review. 75, 32-41 (1973).
  29. Goetz, A. F. H., Vane, G., Solomon, J. E., Rock, B. N. Imaging Spectrometry for Earth Remote Sensing. Science. 228, 1147-1153 (1985).
  30. Bücherl, C. A., Bader, A., Westphal, A. H., Laptenok, S. P., Borst, J. W. FRET-FLIM applications in plant systems. Protoplasma. 251, 383-394 (2014).
  31. Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. Journal of Microscopy. 228, 139-152 (2007).
  32. Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Letters. 531, 245-249 (2002).
  33. Griswold, J. R., Annamdevula, N., Deal, J., Rich, T., Leavesley, S. Estimating FRET Efficiency using Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging. Biophysical Journal. 112, 586 (2017).
  34. Favreau, P. F., et al. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19, 046010 (2014).
  35. King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvascular Research. 67, 139-151 (2004).
  36. Thaler, C., Koushik, S. V., Blank, P. S., Vogel, S. S. Quantitative multiphoton spectral imaging and its use for measuring resonance energy transfer. Biophysical Journal. 89, 2736-2749 (2005).
  37. Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Frontiers in Pharmacology. 9, 332 (2018).
  38. Johnstone, T. B., Agarwal, S. R., Harvey, R. D., Ostrom, R. S. cAMP signaling compartmentation: Adenylyl cyclases as anchors of dynamic signaling complexes. Mol Pharmacol. , (2017).
  39. Zhang, J., Li, H., Chai, L., Zhang, L., Qu, J., Chen, T. Quantitative FRET measurement using emission-spectral unmixing with independent excitation crosstalk correction. Journal of Microscopy. 257, 104-116 (2015).
  40. Zhang, J., Lin, F., Chai, L., Wei, L., Chen, T. IIem-spFRET: improved Iem-spFRET method for robust FRET measurement. Journal of Biomedical Optics. 21, 105003 (2016).
  41. Levy, S., et al. SpRET: highly sensitive and reliable spectral measurement of absolute FRET efficiency. Microscopy and Microanalysis. 17, 176-190 (2011).
  42. West, S. J., et al. Hyperspectral Measurements Allow Separation of FRET Signals from Non-Uniform Background Fluorescence. Biophysical Journal. 112, 453 (2017).
  43. Annamdevula, N. S., et al. An approach for characterizing and comparing hyperspectral microscopy systems. Sensors. 13, Basel. 9267-9293 (2013).

Tags

Biologie Ausgabe 164 Zyklische AMP räumlich FRET hyperspektral Mikroskopie spektrale FRET
Messung von 3-dimensionalen cAMP-Verteilungen in lebenden Zellen mittels 4-dimensionaler (x, y, z und λ) hyperspektraler FRET-Bildgebung und -Analyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Annamdevula, N. S., Sweat, R., Gunn, … More

Annamdevula, N. S., Sweat, R., Gunn, H., Griswold, J. R., Britain, A. L., Rich, T. C., Leavesley, S. J. Measurement of 3-Dimensional cAMP Distributions in Living Cells using 4-Dimensional (x, y, z, and λ) Hyperspectral FRET Imaging and Analysis. J. Vis. Exp. (164), e61720, doi:10.3791/61720 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter