Summary
Fӧrster rezonans enerji transferi (FRET) tabanlı sensörlerin doğal düşük sinyal-gürültü oranı (SNR) nedeniyle, cAMP sinyallerinin ölçümü, özellikle üç uzamsal boyutta zor olmuştur. Burada, cAMP dağılımının üç mekansal boyutta ölçülemesine izin veren hiperspektral FRET görüntüleme ve analiz metodolojisini açıklıyoruz.
Abstract
Siklik AMP, çok çeşitli hücresel ve fizyolojik aktivitelerde yer alan ikinci bir habercidir. Çeşitli çalışmalar, cAMP sinyallerinin bölümlere ayırdığını ve bölümlere ayırmanın cAMP sinyal yolu içindeki sinyal özgüllüğüne katkıda bulunduğunu göstermektedir. Fӧrster rezonans enerji transferi (FRET) bazlı biyosensörlerin geliştirilmesi, hücrelerdeki cAMP sinyallerini ölçme ve görselleştirme yeteneğini daha da ileriye taşıdı. Bununla birlikte, bu ölçümler genellikle verilerin yanlış yorumlanmasına neden olabilecek iki uzamsal boyutla sınırlıdır. Bugüne kadar, doğası gereği düşük sinyal-gürültü oranı (SNR) sergileyen FRET sensörlerinin kullanılmasındaki teknik sınırlamalar nedeniyle, üç uzamsal boyutta (x, y ve z) cAMP sinyallerinin çok sınırlı ölçümleri olmuştur. Buna ek olarak, geleneksel filtre tabanlı görüntüleme yaklaşımları, spektral çapraz konuşma, sınırlı sinyal gücü ve otofluoresans gibi çeşitli faktörler nedeniyle yerelleştirilmiş hücre altı bölgelerdeki cAMP sinyallerinin doğru ölçümü için genellikle etkisizdir. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek ve FRET tabanlı biyosensörlerin birden fazla floresanla kullanılmasına izin vermek için, FRET verimliliklerini hesaplamak için spektral özgüllük ve FRET sinyallerini ek floresan etiketlerden gelen şaşırtıcı otoflüoresan ve/veya sinyallerden spektral olarak ayırma yeteneği sağlayan hiperspektral FRET görüntüleme ve analiz yaklaşımları geliştirdik. Burada, hiperspektral FRET görüntülemenin uygulanması için metodolojinin yanı sıra spektral karıştırma yapmak için ne az örneklenmiş ne de aşırı örneklenmiş uygun bir spektral kütüphane inşa etme ihtiyacını sunuyoruz. Pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde (PMVEC) üç boyutlu cAMP dağılımlarının ölçümü için bu metodolojiyi sunarken, bu metodoloji cAMP'nin çeşitli hücre tiplerindeki mekansal dağılımlarını incelemek için kullanılabilir.
Introduction
Siklik adenozin monofosfat (cAMP), hücre bölünmesi, kalsiyum akışı, gen transkripsiyonu ve sinyal transdüksiyonu dahil olmak üzere önemli hücresel ve fizyolojik süreçlerde yer alan ikinci bir habercidir. Büyüyen bir kanıt gövdesi, hücrede sinyal özgüllüğünün elde edildiği cAMP bölmelerinin varlığını göstermektedir1, 2,3,4,5,6,7. Yakın zamana kadar, cAMP bölmeleme, farklı G bağlantılı reseptör agonistleri 8 ,9, 10,11tarafından indüklenen farklı fizyolojik veya hücresel etkilere dayanarakçıkarılmıştır. Daha yakın zamanda, FRET tabanlı floresan görüntüleme probları,12, 13,14hücresinde cAMP sinyallerinin doğrudan ölçümü ve gözlemlenmesi için yeni yaklaşımlar sağlamıştır.
Förster rezonans enerji transferi (FRET), donör ve alıcı moleküller arasında, moleküller yakın mesafedeyken radyatif olmayan bir şekilde enerji transferinin gerçekleştiği fiziksel bir olgudur15,16. FRET tabanlı floresan göstergelerin geliştirilmesiyle, bu fiziksel fenomen biyolojik uygulamalarda protein-protein etkileşimlerini incelemek için kullanılmıştır17, protein ko-lokalizasyonu18, Ca+2 sinyal19, gen ekspresyasyonu20, hücre bölünmesi21 ve döngüsel nükleotid sinyali. FRET tabanlı cAMP göstergeleri tipik olarak bir cAMP bağlama etki alanı, bir donör floroforu ve bir kabul edici florofor22'denoluşur. Örneğin, bu metodolojide kullanılan H188 cAMP sensör12,22, Turkuaz (donör) ve Venüs (kabul eden) floroforlar arasında sıkışmış, Epac'tan elde edilen bir cAMP bağlama alanından oluşur. Bazal koşullarda (ilişkisiz), Turkuaz ve Venüs, FRET'in floroforlar arasında meydana geldiği bir yönelimdedir. cAMP'nin bağlama alanına bağlanması üzerine, Turkuaz ve Venüs'ün birbirinden uzaklaşması ve FRET'te bir azalmaya neden olması için uygun bir değişiklik meydana gelir.
FRET tabanlı görüntüleme yaklaşımları, bir hücre içindeki cAMP sinyallerini araştırmak ve görselleştirmek için umut verici bir araç sunar. Bununla birlikte, mevcut FRET tabanlı mikroskobik görüntüleme teknikleri genellikle FRET'i hücre altı mekansal netlik ile ölçmek için yeterli sinyal gücü elde etmede kısmen başarılıdır. Bunun nedeni, birçok FRET muhabirinin sınırlı sinyal gücü, FRET verimliliğindeki değişiklikleri doğru bir şekilde ölçmek için gereken yüksek hassasiyet seviyesi ve hücresel otofluoresans23,24gibi şaşırtıcı faktörlerin varlığı da dahil olmak üzere çeşitli faktörlerden kaynaklanmaktadır. Sonuç genellikle zayıf SNR ile boğuşan ve FRET'teki hücre altı değişikliklerin görselleştirilmesini çok zor hale getiren bir FRET görüntüsüdür. Ek olarak, mekansal olarak lokalize cAMP sinyallerinin araştırılması neredeyse sadece iki mekansal boyutta gerçekleştirilmiştir ve eksenel cAMP dağılımı nadiren25olarak kabul edilmiştir. Bunun nedeni, düşük SNR'nin cAMP degradelerini üç uzamsal boyutta ölçme ve görselleştirme yeteneğini engellemesidir. Düşük SNR'li FRET sensörlerini kullanmanın sınırlamalarını aşmak için, FRET'i tek hücrelerde ölçmek için hiperspektral görüntüleme ve analiz yaklaşımları uyguladık25,26,27.
Hiperspektral görüntüleme yaklaşımları NASA tarafından uydu görüntülerinde bulunan karasal nesneleri ayırt etmek için geliştirilmiştir28,29. Bu teknikler o zamandan beri floresan mikroskopi alanı30spektral dedektörler sunan çeşitli ticari konfokal mikroskop sistemleri ile çevrilmiştir. Geleneksel (spektral olmayan) floresan görüntülemede, örnek bir bant geçiş filtresi veya lazer çizgisi kullanılarak heyecanlanır ve emisyon, genellikle floroforların tepe emisyon dalga boylarına uyacak şekilde seçilen ikinci bir bant geçiş filtresi kullanılarak toplanır. Bunun aksine, hiperspektral görüntüleme yaklaşımları, floresanemisyonu 26,31,32veya heyecan33 ,34'üntam bir spektral profilini belirli dalga boyu aralıklarında örneklemeyi amaçlamaktadır. Önceki çalışmalarımızda, hiperspektral görüntüleme ve analiz yaklaşımlarının, geleneksel filtre tabanlı FRET görüntüleme tekniklerine kıyasla hücrelerdeki FRET sinyallerinin daha iyi nicelleştirilmesini sunabileceğini gösterdik26. Burada, cAMP dağılımlarını üç mekansal boyutta ölçmek ve görselleştirmek için 4 boyutlu (x, y, z ve φ) hiperspektral FRET görüntüleme ve analizi yapmak için bir metodoloji sunuyoruz. Bu yaklaşımlar, agonist kaynaklı cAMP uzamsal gradyanlarının tek hücrelerde görselleştirilmesine izin verdi25. İlginçtir ki, agoniste bağlı olarak, hücrelerde cAMP gradyanları belirgin olabilir. Burada sunulan metodoloji, FRET ölçümlerinin doğruluğunu artırmak için tekdüze olmayan arka plan ve hücresel otofluoresans spektral karıştırmayı kullanır. Bu metodoloji pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinde (PMVEC) cAMP FRET biyosensörü kullanılarak gösterilmiş olsa da, metodoloji alternatif FRET muhabirleri veya alternatif hücre hatları ile kullanılmak üzere kolayca değiştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol, Güney Alabama Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan prosedürleri izler.
1. Görüntüleme için hücre, numune ve reaktif hazırlığı
- Daha önce açıklandığı gibi sıçan pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerini (PMVEC) izole edin35.
NOT: Hücreler, Güney Alabama Üniversitesi, Mobile, AL'deki Hücre Kültürü Çekirdeği tarafından 100 mm hücre kültürü yemeklerinde izole edildi ve kültürlendi. - Tohum izole PMVEC'ler 25 mm yuvarlak cam kapak örtüleri üzerinde ve hücreler en az% 80 izdiah elde edene kadar (en az 24 saat) inkübatörde 37 ° C'de büyümelerini sağlar.
NOT: Hücreler ve hücre tipi çalışmadan çalışmaya değişebilir ve bu nedenle hücrelerin tohum ve büyümek için hücreye özgü hücre kültürü prosedürleri takip edilmelidir. Bu çalışmalarda kullanılan hücre tohumlama ve kültleştirme protokolü "Ek File_Cell Kültür ve Transfeksiyon" adlı dosyada ek bilgi olarak mevcuttur. - FRET biyosensörlü PMVEC'leri transfect ve 37 °C'de 48 saat kuluçkaya yatırın.
NOT: PMVEC'leri transfect protokolü ayrıca "Ek File_Cell Kültür ve Transfeksiyon" adlı ek bilgi dosyasında açıklanmıştır. - Görüntüleme gününde, Tyrode'un tamponu bir su banyosunda 37 °C'ye ısıtın.
NOT: Tyrode'un tamponu 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM Glikoz, 1 mM MgCl 2 ve1 mM CaCl2'den oluşur - Transfected hücreler içeren bir kapak kapağını bir hücre odasına monte edin ve sızıntıyı önlemek için üst kısım bir montaj contası ile sabitleyin.
- Fazla medyayı veya yapışık hücreleri temizlemek için hassas bir görev silme kullanarak kapak kılıfının altını silin.
- Hücre odasına 800 μL çalışma tamponu ve 4 μL 5 mM nükleer etiket ekleyin ve 5 - 10 saniye boyunca hafifçe sallayın.
NOT: Hücre odasına monte edilen kapaklara tampon veya reaktif çözeltileri eklerken, yapışık hücreleri yerinden çıkarmak için çözeltiyi yavaşça ve hücre odasının kenarına eklediğinizden emin olun. 800 μL tampona 4 μL 5 mM nükleer etiket eklemek, 25 μM son nükleer etiket konsantrasyonu sağlar. HEK293 hücreleri gibi gevşek yapışan hücreler için, önce bir şişede nükleer etiket ve tamponu karıştırın ve ardından hücre odasına monte edilen kapaklara ekleyin. Bu, hücrelerin kapak kapağından kaldırılmasını önleyecektir. - Işıktan korumak için hücre haznesini alüminyum folyo ile örtün ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatın.
- Reaktif Hazırlama: 199 μL tampona 1 μL 50 mM forskolin ekleyin. Bu, 800 μL tampon ile hazırlanan hücrelere eklendiğinde 50 μM'lik son bir forskolin konsantrasyonu üretecektir. 199 μL tamponda 1 μL DMSO da araç kontrolü olarak kullanılmak üzere hazırlanmalıdır.
NOT: Bu çalışmalarda forskolin, cAMP üretimini teşvik etmek için adenylyl siklaz aktivatörü olarak kullanılmaktadır. İstenirse, bu metodoloji, adenylyl siklaz, fosfoditeraz vb.
2. Görüntü alımı
- Spektral dedektörle donatılmış bir konfokal mikroskop kullanın.
NOT: Burada özetlenen tüm görüntü alma adımları, piyasada bulunan nikon A1R mikroskop sistemi kullanılarak geliştirilmiştir. Alternatif bir spektral mikroskop kullanıyorsanız bu adımların ayarlanması gerekebilir. Kararlı çalışma koşullarına ulaşmak için denemenin başlamasından en az 30 dakika önce tüm ekipmanların açık olduğundan emin olun. - 60x su daldırma hedefini seçin ve hedefe bir damla su ekleyin.
NOT: Yüksek çözünürlüklü canlı hücre görüntüleme için yüksek sayısal diyafram hedefi kullanılması önerilir. Bu çalışmalarda kullanılan amaç hakkında bilgi almak için lütfen Malzeme Listesi'ne bakın. - Yüklenen hücre odasını (adım 1.7'den itibaren) mikroskop aşamasına yerleştirin.
- Mikroskobun sağ tarafındaki filtre düğmesini ayarlayarak DFT (DAPI/FITC/TRITC) filtre kümesini seçin.
- cAMP FRET sensörüyü ifade eden hücreleri içeren bir görüş alanı seçmek için göz merceği kullanarak mikroskobu floresan geniş alan modunda çalıştırın.
NOT: Seçilen hücredeki donör veya kabul eden emisyon tepe dalga boyundaki FRET sinyalinin ortalama yoğunluğunun en az 100 yoğunluk birimi (A.U.) veya ifade hücresi olmayan bir bölgenin temel sinyalinin en az 4 katı olduğundan emin olun. Bu, NIS Elements yazılımında bulunan spektrum profili görüntüleyici kullanılarak onaylanabilir. İyi sinyalli bir hücre ararken, aşırı parlak hücrelerin atılması önerilir (tehlikeye atılabilirler). - NIS yazılımını açın, konfokal moda geçin, lazer kilitleme düğmesinin kilidini açın ve Canlı'ya tıklayın.
- Ekrandaki önizlemeye bakarak hücrelere odaklanmak için odak düğmesini kullanın.
- Yazılımdaki aygıt, edinme ve z yığını ayarlarını aşağıda açıklandığı gibi yapılandırın.
- Alım ayarları:
NOT: Kamera ve cihaz edinme ayarları daha önce edinilmiş bir görüntü kullanılarak uygulanabilir. Resmi açın, sağ tıklatın ve Kamera Ayarlarını Yeniden Kullan 'ıseçin.- A1 ayarları menüsünü açın, 405 nm ve 561 nm lazer hatlarına karşılık gelen kutuları işaretleyin, spektral dedektör için SD'yi seçin, çözünürlük için 10 ve kanallar için 31'i seçin.
NOT: A1 ayarları menüsü, A1 Plus Ayarları penceresinin sol üst köşesinde küçük bir dişli simgesi olarak gösterilir. Donör ekscitasyonu için 405 nm lazer, nükleer etiket ekscitasyonu için 561 nm lazer kullanılmaktadır. - Başlangıç ve bitiş dalga boy değerlerini seçerek dalga boyu aralığını (410 – 730 nm) ayarlayın.
- A1 ayarları menüsündeki binning/skip simgesine tıklayın ve 15 numaralı kutuyu seçin, ardından A1 ayarları menüsünde Tamam'a tıklayın.
NOT: Bu, 561 nm heyecan lazerine karşılık gelen dalga boyu kanalını kaldırmaktır (bu genellikle15. dalga boyu kanalıdır). Spektral bir yapı oluşturabilecek yapay olarak düşük bir sinyali önlemek için bu dalga boyu bandını kullanmamak önemlidir. Lazer hasarından korumak için dedektör elemanını kaplayan mekanik parmak nedeniyle sinyal bu bantta daha düşüktür. - Lazer yoğunluklarını sırasıyla 405 nm ve 561 nm lazerler için %8 ve %2, 149'da Si Hv (dedektör kazancı) ve 2,4 havadar disk ünitesi (AU) iğne deliği yarıçapı olarak ayarlayın.
NOT: Lazer yoğunluklarının cihazın yaşına ve lazerlerin durumuna bağlı olarak ayarlanması gerekebilir. Farklı örnekler veya deney grupları arasında lazer yoğunluklarını ayarlıyorsanız, aynı lazer yoğunluk oranını korumak önemlidir (örneğin, 8:2). Ek olarak, hızlı fotobleaching oluşturmak için çok parlak olmayan bir lazer yoğunluğu seçmek önemlidir. Dedektör kazancı, dedektör gürültüsünü en aza indirirken sinyal yoğunluğunu en üst düzeye çıkaracak şekilde ayarlanmalıdır. Bu çalışmalar için 149 kazanım kullanılmıştır. Yeterli sinyal-gürültü oranına (SNR) sahip görüntülerin alınması ile optik kesitin (konfokalite) korunması arasında denge olarak 2,4 AU'lık bir iğne deliği boyutu seçildi. İğne deliği boyutundaki artış SNR'yı arttırır, ancak konfokaliteyi azaltır. - Tarama hızını saniyede 0,25 spektral kareye ayarlayın, tarama yönü için tek yönlüye karşılık gelen simgeyi seçin, sayım için 4 girin ve tarama boyutu için 1024 x 1024 ayarlayın.
NOT: FRET sinyalleri zayıftır ve genellikle yavaş bir tarama hızı gerekir. 0,25 tarama hızı kullanılarak, spektral z yığınının alınması ~3 dakika içinde tamamlanır. Tarama hızı, kullanılan floroforlara bağlı olarak arttırılabilir veya azaltılabilir. Örneğin, eGFP gibi daha parlak floroforlar için daha hızlı tarama hızı (2 kare/saniye) kullanılabilir. Sayıma girilen sayı, görüntü alma sırasında gürültü azaltmada yardımcı olan 4 çerçeve ortalama değerine karşılık gelir. Çok kararlı numuneler için ve zamanın bir kısıtlama olmadığı durumlarda, geliştirilmiş SNR ile görüntü elde etmek için daha yüksek ortalama değerleri (16'ya kadar) kullanılabilir.
- A1 ayarları menüsünü açın, 405 nm ve 561 nm lazer hatlarına karşılık gelen kutuları işaretleyin, spektral dedektör için SD'yi seçin, çözünürlük için 10 ve kanallar için 31'i seçin.
- z-stack alma parametrelerini tanımla:
NOT: 2.10 adımlarında girilen değerlerin floresan etiket bağlama veya konsantrasyonundaki değişikliklere, etiket türüne, kullanılan etiket sayısına, hücre çizgisine ve hücre etiketleme yoğunluğunu ve/veya hücresel otoflüoresansı etkileyebilecek örnek hazırlamadaki diğer değişikliklere uyum sağlayacak şekilde ayarlanması gerekebilir. Edinme parametrelerini ayarlarken, fotobleaching'i en aza indirirken yeterli bir SNR elde etmeye özen edilmelidir. Ayrıca spektral FRET testini yapılandırırken parametrelerin tüm tedavi gruplarında iyi çalıştığından emin olunmalıdır. SNR'nin yeterli olduğundan ve fotobleachingin en aza indiriltiğinden emin olmak için önerilen parametre ayarlarıyla her tedavi grubunun bir denemesini çalıştırmanız önerilir.- Edinme denetimini görüntüle → ND edinme → tıklatarak ND edinme penceresiniaçın.
- ND dosyasını açılır pencereye kaydetmek için yolu/hedefi ve dosya adını girin.
- z serisinekarşılık gelen kutuyu işaretleyin.
- A1 Plus Ayarları penceresinde canlı olarak tıklayın. Bu, canlı bir görüntüleme penceresi açacaktır.
- Hücrenin üst kısmını seçmek için mikroskoptaki odak düğmesini ayarlayın ve geçerli konumu üst olarak ayarlamak için ND alma penceresinde Üst'ü tıklatın.
NOT: Tüm hücrenin z serisinde örneklenebilmesini sağlamak için hücrenin üst kısmının biraz üstüne odaklanılması önerilir. - Hücrenin altını seçmek için mikroskoptaki odak düğmesini ayarlayın ve geçerli konumu alt olarak ayarlamak için ND alım penceresinde Alt'ı tıklatın.
NOT: Tüm hücrenin örneklenebildiğinden emin olmak için hücrenin alt kısmının biraz altına odaklanın. - Adım boyutu için 1 μm girin, z tarama yönü için üst alt seçin ve z yığını elde etmek için ND Edinme penceresinde çalıştır'ı tıklayın.
NOT: Adım boyutu, üst ve alt konumlara (yani kat edilen mesafeye) bağlı olarak elde edilecek z dilimlerinin sayısını belirler. Görüntüleme hızı, z ekseni örneklemesi ve fotobleaching arasında bir uzlaşma olarak 1 μm adım boyutu seçildi. 2,4 AU'nun konfokal iğne deliği çapı ve 60x su daldırma hedefinin kullanılması, 1,73 μm optik kesit kalınlığı ile sonuçlandı. Bu nedenle, 1 μm adım boyutu Nyquist örnekleme kriterlerinin biraz altındadır, ancak bu, bir z-yığını elde etmek için gereken süreyi azaltmak için yapılmış bir uzlaşmadır. Hızı kritik olmayan çok kararlı numuneler için, z ekseni çözünürlüğünü artırmak için daha küçük bir z ekseni adımı ve muhtemelen daha küçük bir konfokal iğne deliği çapı kullanılabilir. Alt üst benzer sonuçlar vermeli ve z taraması sırasında oluşabilecek fotobleaching etkilerini değerlendirmek için kullanılabilir.
- Varsa Mükemmel Odak Sistemini (PFS) kurun:
NOT: PFS, sistemin görüntü alımı sırasında odak derinliğindeki dalgalanmaları telafi etmesine olanak tanır. PFS'yi kurmak için aşağıdaki adımlar kullanılabilir ve bu adımlar Nikon A1R sürümüne ve kullanılan NIS Öğeleri sürümüne bağlı olarak biraz değişebilir.- ND alma penceresindeki aralık simgesi tarafından tanımlanan simetrik modu vurgulayın.
- Mikroskobun ön yüzündeki PFS düğmesini açın (örnek aşamanın altındaki bölümde bulunan dikroik ayna düğmesinin 'in' olduğundan emin olun).
- PFS ofset denetleyicisinin ön yüzündeki düğmeyi kullanarak üst (saat yönünün tersine döndürün) ve altını (saat yönünde döndürün) yeniden tanımlayın.
- ND edinme penceresinde 'göreli'yi tıklatarak göreli bir z konumu/z derinliği tanımlayın.
- Mikroskobun ön yüzündeki belleğe tıklayın, böylece yazılım göreli z derinliğini ezberler.
- z-yığını alımı tamamlandıktan sonra, bir pipet kullanarak istediğiniz reaktifi (forskolin veya araç kontrolü) hafifçe ekleyin ve 10 dakika bekleyin.
NOT: Hücreleri rahatsız etmemek veya hücre odasının konumunu mikroskop XY aşaması içinde hareket ettirmemek için reaktifi çok nazikçe ekleyin; sonraki canlı görüntüde veya görüntüde, reaktif ekleme sırasında görüş alanının değişmediğini doğrulamak yararlıdır. 10 dakikalık bekleme süresi forskolin tedavisinin etkili olmasıdır. Alternatif bir tedavi kullanılırsa, bekleme süresinin ayarlanması gerekebilir. - 10 dakika sonra dosya adını değiştirin ve ND alma penceresinde çalıştır'ı tıklatın.
- İstatistiksel analiz için yeterli sonuçları elde etmek için en az 5 kapak için yukarıda belirtildiği gibi 2.11 – 2.13 adımlarını tekrarlayın (her tedavi grubu için n=5 – forskolin ve araç kontrolü).
- Spektral kitaplığı oluşturmak ve 2.9 ve 2.10 adımlarında belirtildiği gibi benzer alım ayarlarını kullanarak spektral görüntüler elde etmek için örnekler ve örnek boşluklar hazırlayın.
3. Görüntü analizi
NOT: Bu görüntüler, çalışmada bulunan tüm bireysel endmemberlerin saf spektrumunu içeren bir spektral kütüphane oluşturmak için kullanılacaktır. Spektral kütüphanedeki endmemberler, farklı floroforlar kullanılıyorsa çalışmadan çalışmaya değişebilir. Spektral kütüphaneyi oluşturmak için ayrıntılı bir prosedür "Ek File_Spectral Kütüphanesi" adlı ek bir bilgi dosyasında verilmiştir. Burada, .tiff dosyalarına veri dışa aktarmayı, doğrusal spektral karıştırmayı, FRET verimlilik ölçümlerini, üç boyutlu rekonstrüksiyonu ve cAMP düzeylerini tahmin ediyoruz. Görüntü analizi, ImageJ, Python, MATLAB veya CellProfiler gibi farklı görüntü analizi ve programlama platformları kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu çalışmalarda MATLAB betikleri kullanılmıştır.
- Görüntü verilerini dışarı aktar:
- 2.13 ve 2.14 adımlarında elde edilen spektral z yığını görüntülerine karşılık gelen aynı dosya adına sahip yeni klasörler oluşturun.
NOT: Verileri vermek için özetlenen aşağıdaki adımlar NIS Elements AR sürüm 4.30.01 için özeldir. Bu adımlar yazılımın sürümüne bağlı olarak biraz değişebilir. - DosyaPenceresi açacak olan Dosya 'yi tıklatın. 2.12. adımda alınan spektral görüntü dosyasına göz atın ve seçin ve Aç'ı tıklatın.
- Dosya yüklendikten sonra, Dosya→ ND belgesini → al/ver'i tıklatın.
- Açılır pencerede: 3.1.1 adımında oluşturulan klasöre göz atın ve seçin, Dosya türü için Etiketli Görüntü Biçimi'ni (TIF) seçin, ardından her kanal için Mono görüntü'yü seçin ve Bit derinliğini koru 'ya gidin.
NOT: Dosya öneki önceden oluşturulur; kolaylık sağlamak için bu değeri değiştirin. Dizin sırası seçilen Kanallara bağlı olarak değişir ve önce z dilimi konumuna ve ikinci dalga boyu bant numarasına göre dizin oluşturma için "z, c" görüntülemelidir. LUT'ları Uygula veya Yer Paylaşımları Ekle veya Nokta Adlarını Kullan'a karşılık gelen kutuların seçili olmadığından emin olun. - Tiff dosyalarını hedef klasöre tek tek tiff dosyaları olarak vermek için Dışarı Aktar'ı tıklatın.
- 2.13. adımda alınan spektral görüntü dosyalarını dışa aktarmak için 3.1.2 – 3.1.5 adımlarını yineleyin.
- 2.13 ve 2.14 adımlarında elde edilen spektral z yığını görüntülerine karşılık gelen aynı dosya adına sahip yeni klasörler oluşturun.
- Doğrusal spektral karıştırma:
- Programlama yazılımını açın.
NOT: Ham spektral görüntülerin karıştırılmasını sağlamak için özel olarak geliştirilen programlama komut dosyası, Güney Alabama Üniversitesi BioImaging ve BioSystems web sitesinde, Kaynaklar sekmesi altında (https://www.southalabama.edu/centers/bioimaging/resources.html) sağlanmaktadır. - "Doğrusal Karıştırma.m" etiketli dosyayı açın ve düzenleyici araç çubuğundaki çalıştır düğmesini tıklatın.
- NIS Elements yazılımı tarafından oluşturulan dışa aktarılan *.tif dosya sırasını içeren klasöre göz atın ve seçin.
- Wavelength ve Z-Sliceadlı yeni bir pencere açacak olan devam etmek için Tamam 'ı tıklatın.
- 3.2.4 adımında seçilen klasördeki ilk dosyanın dosya adını (z dilimi ve kanal numarası olmadan) kopyalayın ve "Görüntü Adını Girin" etiketli iletişim kutusunun ilk adımına yapıştırın.
- "Dalga boyu bantlarının sayısını girin" etiketli ikinci adımdaki kanal sayısını, üçüncü adımdaki "Z dilimlerinin sayısını girin" etiketli z dilimlerinin sayısını girin ve Tamam 'ıtıklatın.
NOT: Dalga boyu aralığını veya dalga boyu adım boyutunu ayarlama gibi alma ayarlarında değişiklik yapılırsa dalga boy bantlarının sayısı değişebilir. Z dilimlerinin sayısı da hücrenin yüksekliğine bağlı olarak değişebilir. - "Dalga boyu bilgi dosyasını seçin" etiketli açılır pencerede "Wavelength.mat" adlı dalga boyu dosyasına göz atın ve seçin ve aç'ı tıklatın.
- "Spektral kitaplık dosyasını seçin" etiketli yeni açılır pencerede "Library.mat" dosyasına göz atın ve seçin, aç'ı tıklatın ve dilimlerin karıştırılmama işinin bitmesini bekleyin.
NOT: Library.mat dosya hücre otofluorescence ve arka plan spektral imzaları ile birlikte her endmember fluorophore için saf spektra içeren bir dosyadır. Bu durumda, endmember floroforlar Turkuaz, Venüs ve DRAQ5 içerir. Arka plan spektral imzaları hücresel veya matris otofluoresans, kapaklı floresan ve coverlip kırınımını içerir. Wavelength.mat dosyası spektral görüntüyü elde etmek için kullanılan dalga boyu kanal bilgilerini içeren bir dosyadır. Örnek bir kitaplık dosyası ve dalga boyu dosyası Bioimaging ve Biosystems web sitesinde mevcuttur (3.2.1 altındaki nota bakın). Spektral kitaplık ve dalga boyu dosyalarının nasıl oluşturulacakları hakkında daha fazla bilgi için "Ek File_Spectral Kitaplığı" adlı ek bilgi dosyasına bakın. Her z dilimine karşılık gelen karıştırılmamış görüntüler, 3.2.3 adımında seçilen klasördeki karıştırma işlemi sırasında oluşturulan "Karıştırılmamış" adlı klasöre kaydedilir.
- Programlama yazılımını açın.
- FRET Verimlilik Hesaplaması:
- "multiFRRCF.m" adlı programlama komut dosyasını açın ve çalıştır'ı tıklatın.
NOT: Bu programlama dosyası Güney Alabama Üniversitesi Biyogörüntleme ve Biyosistem web sitesinden edinilebilir (adım 3.2.1 altındaki nota bakın). - "Kaç klasör yeniden kaydırılacağı" adlı açılır iletişim kutusuna çözümlemek için deneysel deneme sayısını girin ve Tamam 'ıtıklatın.
NOT: Her denemedeki görüntü verileri ayrı bir karıştırılmamış görüntü klasörüne kaydedilmelidir. Bu adım, analiz kodunun zaman kazandıran bir adım olarak birçok klasör üzerinde döngüye girmesine izin verir. - Karıştırılmamış klasörlere gözatıp seçin ve Tamam 'ıtıklatın.
NOT: "Klasöre gözat" açılır penceresinin açılma sayısı, önceki adımda "Yeniden kaydırılacağı klasör sayısı" iletişim kutusuna girilen sayıya bağlıdır. Klasörlere birbiri ardına göz atın ve seçin. - Yeni açılır pencerede, ilgili kutulara aşağıdaki bilgileri girin: ölçekleme faktörü 12,4, Eşik 5,6, X, Y ve Z Frekansı sırasıyla 5, 5 ve 1'dir ve yumuşatma algoritması Gauss'tır.
NOT: Ölçekleme faktörü piksel/μm cinsinden bir değerdir ve Z yönü örneklemeyi XY yönününkine ölçeklendirmek için kullanılacaktır. Ölçekleme faktörü, genellikle çoğu konfokal mikroskop sistemi için görüntüde meta veri olarak sağlanan görüntü piksel boyutundan elde edilir. Örneğin, görüntü 0,08 μm/piksel aralığıyla elde edilirse, ölçekleme faktörü 12,5 piksel/μm olmalıdır. Eşik değeri, görüntüleri eşik ve hücrenin ikili maskesini oluşturmak için kullanılır. Görüntü bağışçısı+alıcı yoğunluğuna göre optimum değerlerin bir listesini oluşturduk. Görüntünün parlak donör+alıcı yoğunluğu ve düşük arka planı varsa, yalnızca orta donör+alıcı yoğunluğuna ve/veya daha yüksek arka plana sahip görüntüler için 5,6 ile 6,5 arasında bir değer ve arka plandan daha düşük donör+alıcı yoğunluğuna sahip görüntüler için 7,5 ve üzeri bir değere sahipse, eşik değer olarak 4,5 kullanın. Frekans değeri, sonraki adımlarda dilimlemenin gerçekleştirildiği piksel sayısı aralığına karşılık gelir. Örneğin, hücrenin Z derinliği 1 μm adım boyutuna sahip 17 μm ise ve XY yönünde 12,5 piksel/μm ölçekleme faktörü kullanılıyorsa, 3 boyutlu görüntü veri kümesinin derinliği 212 piksel (Z yönü) olarak yeniden örneklenecektir. Girilen Z frekans değerine (örneğin, 1 piksel) bağlı olarak, 3 boyutlu görüntü veri kümesi, görüntü veri kümesinin en üstünden başlayarak yeniden dilimlenecek ve daha sonra aşağı doğru 1 piksellik artışlarla hareket ettirilir. Bu, 212 yeniden dizili görüntüyle sonuçlanır. Z Frekansı için daha büyük bir frekans değer aralığı girilirse, daha az yeniden dilimlenmiş görüntü oluşturulur. Yeniden kaydedilen görüntüler sonraki adımlarda kaydedilir. - Çalıştır'ı tıklatın ve tüm FRET ölçümleri ve yeniden dilimleme yapılana kadar bekleyin.
NOT: Üst dizinde, yeniden sınıflanmış gri tonlamalı FRET verimlilik görüntülerinin ve renkli (uygulanan bir renk haritası) FRET verimlilik görüntülerinin kaydedildiği ayrı bir klasör oluşturulur. Örneğin, X yönünde (YZ düzlemi) yeniden dizilen tüm gri tonlamalı ve renk haritası FRET görüntüleri "Resliced_XFRET" adlı bir klasöre kaydedilir. - Forskolin tedavileri ve araç kontrolleri öncesi ve sonrası tüm deneyler için benzer ayarlarla analizi tekrarlayın.
NOT: Bölüm 3.3'te belirtilen adımlar, 3 boyutlu FRET görüntü verileri oluşturmak için özel FRET analiz programlama komut dosyası için girilmesi gereken değerleri açıklar. Ancak, bu komut dosyası çalışırken aşağıdakiler de dahil olmak üzere çeşitli işlemler yürütür: görüntü verilerini yükleme, görüntü yığınları oluşturma, düzeltme, FRET verimlilik hesaplamaları oluşturma ve uygulama, hücre kenarlığı maskesi oluşturma ve uygulama, 3 boyutlu görüntü yeniden oluşturma, 3 boyutlu görüntüleri belirli aralıklarla (frekanslar) yeniden sıralama, FRET değişikliklerini görselleştirmek için bir renk haritası uygulama ve yeniden lisanslanan görüntü verilerini aynı dizine kaydetme. Ek ayrıntılar program komut dosyasına açıklama olarak eklenmiştir.
- "multiFRRCF.m" adlı programlama komut dosyasını açın ve çalıştır'ı tıklatın.
4. FRET verimliliğini cAMP seviyelerine eşleme
- 'Mapping_FRET Efficiency_to_cAMP_concentration.m' adlı programlama dosyasını açın ve ana pencerede çalıştır'ı tıklatın.
NOT: Dosya BioImaging ve BioSystems web sitesinde mevcuttur (3.2.1 altındaki nota bakın). Bu dosya gri tonlamalı FRET verimlilik görüntüleri okur ve karakteristik bir eğriye göre cAMP düzeylerine dönüştürür. Bu karakteristik eğri, Hill denklemi (aşağıda gösterilen üçüncü denklem) tarafından açıklanan literatür15,36'da belgelenen bir cAMP-to-FRET ilişkisi kullanır. Bununla birlikte, sağlam hücrelerdeki probun K d'sini tahmin etmek zordur ve hesaplamalarımızda 1 μM olduğunu varsayıyoruz. Bu nedenle, sonuçlar Kd. (yani, [cAMP] = x* Kd). FRET verimliliğini ölçmek ve FRET'i cAMP düzeyleriyle eşlemek için kullanılan denklemler aşağıda gösterilmiştir:
Burada E, FRET verimliliğidir vegörünür ve belirgin olan,sırasıyla alıcı ve donör görüntülerinin karıştırılmemiş piksel yoğunluklarıdır.
Qa ve Qd, kabul edenin ve bağışçının kuantum verimidir. Kφ denklemi FRET verimlilik denklemi içine dahil edildiğinde Qa ve Qd'nin iptal edildiğini unutmayın, kφ bir düzeltme faktörüdür:
ve 
donör ve donör ekscitasyon dalga boyunda, i (405nm) donör ve kabul edenin yok olma katsayılarıdır.
E, FRET verimliliği ve KD = Ayrışma sabiti = 1 μM'dir. - Gezinin ve ilk gri ölçekli FRET görüntüsünü seçin (adım 3.3.5'te kaydedildi) ve Tamam'ı tıklatın.
- cAMP sinyallerinin dağılımını üç boyutta incelemek için FRET/cAMP görüntülerini açın.
ve 
donör ve donör ekscitasyon dalga boyunda, i (405nm) donör ve kabul edenin yok olma katsayılarıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, canlı hücrelerde üç mekansal boyutta cAMP gradyanlarını ölçmek için hiperspektral FRET görüntüleme ve analiz yaklaşımlarının kullanımını açıklamaktadır. Verileri analiz ederken ve ölçerken dikkatli olunmesi gereken bu sonuçların oluşturulmasında birkaç önemli adım vardır. Bu önemli adımlar arasında uygun bir spektral kütüphanenin inşası, arka plan spektral karıştırması, hücre kenarlıklarını tanımlamak için eşik oluşturma ve FRET verimlilik hesaplamaları yer almaktadır. Şekil 1, canlı hücrelerde FRET verimliliğinin ve cAMP seviyelerinin ölçülmesinde yer alan tüm adımların şematik akışını göstermektedir. Düzgün bir şekilde gerçekleştirildiğinde, bu görüntüleme ve analiz adımları, FRET verimliliğinin ölçülmesine ve cAMP uzamsal gradyanlarının bir hücrede 3 boyutta tahmin edilmesine izin verirken, tekdüze olmayan arka plan sinyallerini hesaba katacaktır.
Şekil 2, nikon A1R konfokal mikroskop kullanılarak elde edilen yanlış renkli ham hiperspektral görüntü verilerinin temel koşullarda (Şekil 2A) ve 10 dakika sonra(Şekil 2B) forskolin tedavisinden 3 boyutlu görünümlerini göstermektedir. Nicel analiz için tutarlılığı korumak için tedavi görüntü yığınlarından önce ve sonra elde etmek için benzer dedektör ve sistem parametrelerinin kullanıldığını unutmayın. Ayrıca, FRET verimliliğini hesaplamadan önce, bu tamamen ham verilerin görselleştirilmesi olduğu için FRET'teki değişikliklerin bu görüntüde açık olmadığını unutmayın.
Ham spektral görüntü verilerini daha fazla analiz etmek için tüm son üyelerin saf spektrumlarına sahip bir spektral kütüphaneye ihtiyaç vardır. Uygun bir spektral kütüphane oluşturmak, uygun FRET verimliliği ölçümlerini sağlamak için önemli adımlardan biridir. Şekil 3, endmemberlerin saf spektrumunu içeren bir spektral kütüphanenin inşasını göstermektedir (bu güncel çalışmalarda, endmemberler Turkuaz, Venüs ve DRAQ5'tir). FRET verimliliğini ölçmek için, Turkuaz ve Venüs spektrumlarını 1:1 stoichiometry ile bir örnek kullanarak elde etmek önemlidir. Burada, 1:1 stoichiometry ile donör ve alıcının spektral imzalarının elde edilmesine izin veren, kabul eden floroforun tamamen foto-depre olduğu bir yaklaşım sağladık (Şekil 3A-F). Ek olarak, lazerler arasındaki doğrusal güç ilişkileri (Ek Şekil 1) donör ekscitasyon lazeri kullanılarak heyecanlanırsa beklenen bir yoğunlukta alıcı spektrumunu hesaplamak için uygulanmıştır, bu durumda Turkuaz için 405 nm (Şekil 3G). Bu, FRET tek bir 405 nm lazer hattı ile heyecanlandığında karıştırılmamış donör ve alıcı sinyallerinin mutlak yoğunlukta karşılaştırılabilir olmasını sağlar. Draq5 saf spektrumu elde etmek için nükleer boya ile etiketlenmiş transkrfected olmayan hücreler, DRAQ5 (Şekil 3H) kullanılmıştır. Donörün tayfını birleştiren Turkuaz (Şekil 3F), kabul eden, Venüs (Şekil 3G) ve DRAQ5 (Şekil 3I), 3 bileşenli bir kütüphane oluşturulmuştur (Şekil 3J).
Floresan etiketler dışındaki kaynaklardan gelen sinyaller de bir örnekte bulunabilir. Bunları hesaba katmak için etiketsiz hücresel örneklerde 424 nm, 504 nm ve 574 nm'de meydana gelen tepelere sahip üç farklı spektral imza tespit edildi. Bu spektral imzaların coverlip refleksiyonu ve hücre matrisi veya hücresel otofluoresansa karşılık geldiğine inanıyoruz. Şekil 4, bu üç arka plan spektral imzasının kaynaklarını göstermektedir. Bu sinyallerin numune içinde eşit olmayan şekilde dağıtıldığını ve bu nedenle basitçe çıkarılamayacağını belirtmek önemlidir. Bununla birlikte, bu sinyallerin spektral imzalarını spektral kütüphaneye eklemek ve sinyalleri ayırmak için doğrusal karıştırma kullanmak, FRET verimliliklerini hesaplamadan önce bu kafa karıştırıcı sinyalleri donörden ve alıcı sinyallerden kaldırmak için bir yaklaşım sunar. Bunu başarmak için, üç arka plan spektral imzası 3 bileşenli spektral kütüphaneye eklendi ve donör (Turkuaz), kabul eden (Venüs), DRAQ5 ve üç arka plan spektral imzadan oluşan 6 bileşenli yeni bir kütüphane oluşturuldu.
Spektral görüntü verilerini tek tek uç parçalara ayırmak için özel bir programlama komut dosyası yazıldı ve sonraki FRET verimlilik hesaplamalarını gerçekleştirmek için ayrı bir komut dosyası yazıldı. Doğrusal spektral karıştırma (Şekil 5'tegösterilmiştir) 6 bileşenli spektral kütüphane kullanılarak gerçek yapılmıştır. z yığını olarak da adlandırılan eksenel görüntü yığınındaki her dilim için karıştırma işlemi gerçekleştirildi (Şekil 5A'dakiham spektral görüntü verilerinin 3 boyutlu görselleştirilmesine bakın). Bu, her bir uç parça için, z yığınındaki her z dilimi için ayrı karıştırılmamış görüntülerle sonuçlandı(Şekil 5C–E, arka plan karıştırılmamış görüntüler gösterilmez). İstenirse, karıştırılmamış sinyaller, her karıştırılmamış sinyale atanan farklı bir renkle görselleştirme için yanlış renkli olabilir (Şekil 5F-H).
Şekil 6, FRET verimlilik hesaplamalarında yer alan adımların yanı sıra FRET verimliliğini cAMP seviyeleriyle eşleme adımlarını göstermektedir. Pürüzsüz bir karıştırılmamış donör ve alıcı görüntüleri kullanılarak bir FRET verimlilik görüntüsü oluşturuldu. Karıştırılmemiş donör, kabul eden ve nükleer görüntüler kullanılarak ikili maske görüntüsü elde edildi. Maske, hücre dışındaki piksellerden gelen katkıları kaldırmak için FRET verimlilik görüntüsüne uygulandı. FRET verimlilik ölçümlerinin resimsel gösterimi için tek z dilimlerinden karıştırılmamış görüntüler kullanılsa da, bu hesaplamalar 3 boyutlu görüntü yığını içindeki her dilimde gerçekleştirildi. 3 boyutlu FRET görüntü veri seti daha sonra cAMP sinyallerinin uzamsal gradyanlarını farklı yönlerde görselleştirmek için üç ortogonal düzlemde yeniden düzenlendi.
FRET verimliliği ve cAMP seviyelerinde agonist kaynaklı değişiklikleri görselleştirme
Yukarıda açıklanan adımlar, hiperspektral görüntü verilerinden FRET verimliliğini ve cAMP düzeylerini üç uzamsal boyutta hesaplamak için bir yöntem sağlar. Bu adımlar, forskolin gibi cAMP yanıtı veren bileşiklerle tedavi öncesi ve sonrası hücresel preparatlara uygulanabilir. Burada, 50 μM forskolin ile tedaviden sonra PMVEC'lerde FRET ve cAMP dağılımındaki değişiklikleri gözlemlemek için bu yaklaşımın kullanılmasına bir örnek sunuyoruz. Şekil 7, farklı XY düzlem dilimlerindeki (z dilimleri) FRET verimliliği ve cAMP seviyelerindeki değişiklikleri, apikalden bazal'a kadar göstererek temel koşulların (forskolin tedavisinden önce) ve tedavi sonrası 10 dakikalık karşılaştırmasını sağlar. Bu açıklayıcı örnekte, forskolin tedavisi üzerine FRET verimliliği azaldı (Şekil 7'dekisütun 1 ve 3), cAMP seviyelerindeki artışla ilişkilidir (Şekil 7'dekisütun 2 ve 4). Tek bir XY düzlemi içinde cAMP'nin minimal uzamsal varyasyonu gözlendi. Bununla birlikte, apikal dilimin forskolin tedavisinden sonra bazal dilimden daha derin kırmızı bir renge (uygulanan renk arama tablosu aracılığıyla daha yüksek cAMP seviyelerini gösteren) sahip olduğu belirtilerek tahmin edilebileceği gibi eksenel (apikal-bazal) cAMP uzamsal gradyanları gözlenmiştir (Şekil 7'dekisütun 4). Eksenel FRET veya cAMP dağılımları genellikle iki ortogonal uzamsal düzlemden elde edilen görüntüler kullanılarak daha iyi görselleştirilebilir: Şekil 8, YZ düzleminde FRET verimliliğini ve cAMP seviyelerini gösterir. taban çizgisi (sütun 1 ve 2) ve forskolin tedavisinden 10 dakika sonra (sütun 3 ve 4), Ek Şekil 2 ise XZ düzleminde FRET verimliliğini ve cAMP seviyesi değişikliklerini gösterir. Bu sonuçlar, FRET'in ölçülmesinin ve 3 boyutlu hiperspektral görüntü verilerinden cAMP seviyelerinin tahmin edilmesi fizibilitesini göstermekte ve ayrıca FRET veya cAMP'ın eksenel dağılımlarının görselleştirilmesinin önemini göstermektedir. Bu metodolojik makalenin kapsamı dışında, döngüsel nükleotitlerin eksenel mekansal dağılımları döngüsel nükleotid sinyal yollarında özgüllüğe katkıda bulunabilir.
Yukarıda açıklanan yöntemleri gerçekleştirirken, adımların doğruluğunu titizlikle kontrol etmek ve FRET'teki (ve ilgili cAMP) değişikliklerin donör ve alıcı sinyallerindeki gerçek değişikliklerden kaynaklandığından ve görüntüleme yapıtları olmadığından emin olmak için uygun deneysel ve araç kontrollerinin yapılması önemlidir. Örneğin, göz önünde bulundurulacak önemli adımlar şunlardır:
Gerekli tüm spektral bileşenleri içeren uygun bir spektral kütüphane kullanma
Belirtildiği gibi, hücresel otofluoresans, biriken matris veya kapaklardan yansıyan ışıktan (heyecan-emisyon kanaması) arka plan sinyallerinin önemli katkısı olabilir. Şekil 9, spektral verileri karıştırmak için 3 bileşenli (Turkuaz, Venüs ve DRAQ5) bir kitaplık kullanıldığında arka plan sinyalinin görüntülerde tutulduğunu gösteren örnek bir veri kümesini temsil eder. Bunun aksine, daha eksiksiz (ve uygun) 6 bileşenli bir spektral kütüphane kullanıldığında arka plan sinyali etkili bir şekilde kaldırıldı.
Hücre maskesi oluşturmak için en uygun eşik değerini kullanma
Gerçekleştirdiğimiz deneylerin çoğunda, arka plan sinyal yoğunluğu, ham spektral görüntü verilerinde bulunan FRET sinyal yoğunluğunun yaklaşık% 50-60'ıdır (yani, işlenmemiş spektral görüntü verilerini görselleştirirken, FRET sinyalinin zirvesi çevredeki arka plan sinyalinden sadece ~ 2 kat daha yüksektir). Bu nedenle, ikili maske elde etmek için bir eşik değeri kullanarak arka plan sinyalinin ön plan sinyalinden ayrılması hassas bir adımdır ve analiz yapıtlarını önlemek için dikkatlice yapılmalıdır. Şekil 10, hücrenin ikili maskesini oluşturmak için hücre segmentasyonu için uygulanan farklı eşik değerlerinin etkisini göstermektedir. Düşük eşik değeri, ifade hücresinin bir parçası olarak arka plan sinyali içerebilir. Öte yandan, aşırı yüksek bir eşik değeri, düşük ifade eden hücrelerde veya düşük donör +alıcı sinyaline sahip bir hücrenin bölgelerinde (hücrenin çok ince kısımları veya FRET probunun daha düşük bölgesel konsantrasyonuna sahip olabilecek kısımlar) FRET'in ölçülebini engelleyebilir.
Arka plan sinyali ≥ donör+alıcı sinyal yoğunluğuna sahip transfected bir hücre seçme
Şekil 11, doğrusal spektral karıştırma için 6 bileşenli spektral kütüphane kullanılarak elde edilen karıştırılmamış görüntülerden FRET verimliliklerinin ve karşılık gelen seviyelerin ölçüldüğü örnek bir veri kümesini göstermektedir. Spektral görüntü verilerini karıştırmak için 6 bileşenli kütüphaneyi kullanmasına ve hücre kenarlığı ve nükleer maske oluşturmak için yüksek bir eşik seçmesine rağmen, FRET verimlilik görüntüleri hala hücrenin bazal tarafına yakın yüksek arka plan gürültü sinyaline eğilimliydi. Bu durumda, arka plan gürültüsünün varlığı, FRET probunun sadece zayıf bir şekilde ifade ettiği bir hücrenin seçilmesinden kaynaklandı ve donör + alıcı sinyal gücü, karıştırmadan sonra bile arka plan sinyal gücüne yaklaşık olarak eşitti. Bu nedenle, yukarıda açıklanan sofistike analiz adımlarını uygulamanın yanı sıra, yüksek kaliteli sonuçlar elde etmek için satın alma sırasında FRET probunun yeterli ifadesine ve buna bağlı olarak yeterli FRET sinyaline (donör ve alıcı sinyali en az gürültü sinyaline eşit veya daha yüksek) sahip bir hücre seçmek de önemlidir.
Şekil 1: Hiperspektral FRET görüntüleme ve analizi kullanılarak FRET verimliliği ve seviye ölçümlerinde yer alan adımları üç mekansal boyutta gösteren akış çizelgesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Hücreden ve çevresindeki ifade etmeyen hücrelerden (kırmızı) cAMP FRET muhabirini (yeşil) ve çekirdeği ifade eden bir hücrenin 3 boyutlu görselleştirilmesi. Nikon A1R spektral konfokal mikroskop kullanılarak elde edilen ham spektral görüntü verileri dalga boylarına göre yanlış renklendirilmiş ve NIS Elements yazılımı kullanılarak 3 boyutta görselleştirilmiştir. A) Taban çizgisi ve B'de 3 boyutlu görüntü verileri) 50 μM forskolin tedavisinden 10 dakika sonra. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Çalışmadaki floresan etiketlerin saf spektrumunu içeren bir spektral kütüphanenin inşası (uzaktan algılama alanı tarafından endmembers olarak adlandırılır). A) 405 nm'lik ekscitasyonda (donör ekscitasyonu) elde edilen FRET biyosensörunu ifade eden hücrelerin yanlış renkli bir görüntüsü. B) FRET sinyaline karşılık gelen spektrum: Kırmızı, sarı, mavi ve yeşil dikdörtgenlerle gösterilen A resmine 4 farklı ilgi alanı (ROI) çizildi. Seçilen her yatırım getirisi için her dalga boyundaki ortalama yoğunluk dışa aktarıldı. Bu 4 ROI'den ortalama yoğunluk her emisyon dalga boyunda çizildi. Spektrumun emisyon zirveleri hem donöre (Turkuaz) hem de kabul eden (Venüs) floroforlara karşılık gelir. C) 488 nm ekscitasyonda (kabul edenin çıkarılması) elde edilen FRET biyosensörünü ifade eden hücrelerin yanlış renkli bir görüntüsü. D) Ortalama spektrum, sadece kabul eden nedeniyle emisyon zirvesi ile C'deki birkaç ROI'den (A'dakiyle aynı bölgeler) B'de açıklandığı gibi tahmin edildi. E) 405 nm'lik ekscitasyonda, kabul eden floroforun 514 nm ışınlama ile foto-imha edilmesinden sonra elde edilen FRET biyosensörünü ifade eden hücrelerin yanlış renkli bir görüntüsü. F) Ortalama spektrum, sadece donör nedeniyle emisyon zirvesi olan E'deki birkaç ROI'den (A ile aynı bölgeler) B'de açıklandığı gibi tahmin edildi. Donör yoğunluğunun orijinal FRET sinyali ile karşılaştırıldığında F'de arttığını, bu da alıcının fotobleaching'inden sonra donör ekscitasyonunun doğrudan donör emisyonuna yol ettiğini gösterir. G) 405 nm heyecanlanma kullanılarak elde edilirse beklendiği gibi kabul eden spektrum. Bu, 405 nm ve 488 nm uyarma lazerlerinin bir spektrometre ve entegre küre (Ek Şekil 1) ve Venüs'ün dalga boyu bağımlı yok olma katsayısı kullanılarak karakterize edilebilen doğrusal bir yanıta sahip olduğu gerçeklerden yararlanılarak tahmin edildi. Bu nedenle, 488 nm'lik ekscitasyonda elde edilen Venüs spektrumu, 405 nm'de elde edilirse beklenen Venüs spektrumuna dönüştürülebilir H) Nükleer etiketle etiketlenmiş hücrelerin yanlış renkli bir görüntüsü, DRAQ5. I) H. J'nin ilgi çekici çeşitli bölgelerinden ortalama spektrum) Donörün ve DRAQ5'in normalleştirilmiş saf spektrumunu ve alıcının ekscitasyon dalga boyunu düzeltilmiş spektrumunu içeren sonuç spektral kütüphanesi. Turkuaz ve Venüs spektrumlarının birleşik Turkuaz + Venüs spektral verilerinin maksimum değerine normalleştirildiğini, DRAQ5'in ise zirve emisyon dalga boyu değerinde birlik olmak için normalleştirildiğini unutmayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Arka plan spektral imzaları tespit edildi ve karıştırma işlemi sırasında arka plan floresan sinyallerini hesaba katmak için spektral kütüphaneye dahil edildi. A, B) Örnek boş (etiketsiz kapak) karakterize edilirken iki arka plan floresan spektral imza gözlendi. Bu spektral imzalar, biri 424 nm'de (kapak flüoresansından) diğeri 504 nm'de (muhtemelen reflektör veya sırt saçılımından) tepe dalga boylarına göre adlandırılmıştır. C) Etiketlenmemiş hücreler analiz edildiğinde, potansiyel olarak hücresel otoflüoresans veya alttaki matrisin floresanından kaynaklanan 574 nm'lik bir tepe emisyon dalga boyu ile üçüncü bir arka plan spektral imzası gözlenmiştir. D) A, B ve C görüntülerinden çıkarılan arka plan spektrumları. Bu üç arka plan spektrumları, 6 bileşenli bir spektral kütüphane geliştirmek için mevcut 3 bileşenli kütüphaneye (Şekil 3J) eklendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Arka plan sinyallerini oluşturan 6 bileşenli spektral kütüphane kullanılarak doğrusal spektral karıştırma. A) Eksenel z-yığını olarak elde edilen ham spektral görüntü verileri. B) Ham spektral verileri doğrusal olarak karıştırmak için kullanılan 6 bileşenli spektral kütüphane. C, D ve E) Sırasıyla DRAQ5, Turkuaz ve Venüs'ün gri ölçekli karıştırılmamış görüntüleri doğrusal spektral karıştırmadan kaynaklanandır. F, G ve H) Sırasıyla DRAQ5, Turkuaz ve Venüs'ün yanlış renkli renksiz görüntüleri. Arka plan sinyallerinin karıştırılmamış görüntüleri de hesaplanmıştır (burada sadece floresan etiketler bu metodoloji için ilgi çekici olduğu için gösterilmeyen veriler - Annamdevula'daki Şekil 4'e bakın, vb. karıştırılmamış arka plan sinyalleriörnekleri 25). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Karıştırılmamış spektral görüntü verilerinden FRET ve cAMP seviyelerinin hesaplanmasında yer alan adımları gösteren akış çizelgesi. A) Donörün temsili karıştırılmamış görüntüsü, Turkuaz. B) Temsilci, kabul edenIn karıştırılmemiş görüntüsü, Venüs. C) Temsilci çekirdeklerin karıştırılmamış görüntüsü, DRAQ5. D) İkili hücre maskesi, karıştırılmamış donör+alıcı toplamlı görüntünün eşiklendirilerek oluşturulur. E) Çekirdeğin ikili maskesini oluşturmak için nükleer görüntüye bir eşik uygulanır. F) Piksel açısından FRET verimliliği, karıştırılmemiş donör ve alıcı görüntülerinden hesaplanmıştır. G) Hücre sınırından ve nükleer maskelerden kompozit ikili maske oluşturuldu. H) Maskeli FRET verimlilik görüntüsü: Hücre dışında ve çekirdek içinde spesifik olmayan FRET sinyallerini dışlamak için FRET verimlilik görüntüsüne kompozit hücre maskesi uygulandı. I) FRET'teki mekansal değişiklikleri daha iyi görselleştirmek için maskeli FRET verimlilik görüntüsüne renk haritası uygulandı. J) FRET verimlilik görüntüsünden tahmin edilen cAMP seviyeleri görüntüsü. K) cAMP'deki mekansal değişiklikleri daha iyi görselleştirmek için renk haritası uygulandı. Sağ tarafta gösterilen renk çubukları FRET verimliliğini (üst panel) ve cAMP seviyelerini (alt panel) görselleştirmek için kullanılmıştır. Bu şekilde gösterilen görüntüler tek bir eksenel z dilimini temsil ediyor, ancak bu şekilde açıklanan analiz işlemi tüm eksenel z-yığını üzerinde gerçekleştirilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: PMVEC'lerde görselleştirilen Forskolin kaynaklı FRET verimliliği ve cAMP uzamsal gradyanları. XY düzlem görüntüleri, 3 boyutlu yeniden yapılandırılmış FRET ve cAMP görüntü verilerinin apikalden hücrenin bazal tarafına eksenel (Z) yönde yeniden ayrıştırılarak oluşturulmuştır. Beş bitişik XY dilimi gösterilir. 1 ve 3. sütunlar, FRET verimliliğini temel olarak ve tedaviden 10 dakika sonra sırasıyla 50 μM forskolin ile temsil eder. Sütun 2 ve 4, forskolin tedavisinden 10 dakika sonra ve taban çizgisi seviyelerini gösterir. Renk çubukları, renk haritasındaki değişiklikleri FRET verimliliği (üstte) ve cAMP seviyeleri (altta) ile ilişkilendirmek için kullanılmıştır. Sütun 2 ve sütun 4'teki görüntülerde gösterilen beyaz çizgiler, bu seçili çizgi boyunca cAMP sinyallerinin yoğunluk profilini (çizgi tarama profili) oluşturmak için kullanılır. Hücrenin orta diliminden taban çizgisi (mavi profil) ve forskolin tedavisinden sonra (yeşil profil) elde edilen yoğunluk profili grafiği, cAMP sinyallerinin hat taraması boyunca mekansal dağılımını gösterir. Ölçek çubuğu 20 μm'yi gösterir.
Şekil 8: Forskolin kaynaklı FRET verimliliği ve eksenel yönde görselleştirilmiş cAMP uzamsal gradyanlar. YZ düzlem görüntüleri, 3 boyutlu yeniden yapılandırılmış FRET ve cAMP görüntü verilerinin yanal (X) yönde (hücrenin solundan sağ tarafına) yeniden ayrılmasıyla oluşturulmuştır. Sütun 1 ve 3, FRET verimliliğini temel olarak ve sırasıyla 50 μM forskolin tedavisinden 10 dakika sonra temsil eder. Sütun 2 ve 4, cAMP seviyelerini temel ve forskolin tedavisinden 10 dakika sonra temsil eder. Sağdaki renk çubukları, renk haritasındaki değişiklikleri FRET verimliliği (üstte) ve cAMP seviyeleri (altta) ile ilişkilendirmek için kullanılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 9: FRET ve cAMP düzeylerini hesaplamak için 3 bileşenli veya 6 bileşenli spektral kütüphane kullanmanın etkinliğinin karşılaştırılması. Arka plan spektral imzalarını hesaba katmayan 3 bileşenli bir kitaplık kullanılarak hesaplanan görüntülerde spesifik olmayan arka plan sinyalleri gözlendi. Bu özellikle 50 μM forskolin tedavisini takiben hücrenin bazal tarafına yakın görüntüler için geçerlidir (sütun 2). Bunun aksine, arka plan sinyal yapıtları, arka plan spektral imzaları içeren 6 bileşenli bir kitaplık kullanırken etkili bir şekilde kaldırıldı ve hücreyi segmentlere ayırıp FRET ve cAMP sinyallerini analiz etme yeteneğini geliştirdi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 10: Hücre ve nükleer kenarlıkları tanımlamaya uygun bir eşik değeri seçilmemişse görüntü analizi yapıtları tanıtılabilir. 0,35 (sütun 1 olarak 2), 0,65 (sütun 3 ve 4) ve 0,9 (sütun 5 ve 6) olmak üzere üç farklı eşik değerine sahip bir maske oluşturmak için karıştırılmamış donör ve alıcı görüntüleri kullanılmıştır. Sütun 1, 3 ve 5, FRET verimliliğini temel olarak görüntüler. 2, 4 ve 6 sütunları, 50 μM forskolin tedavisinden sonra FRET verimliliğini 10 dakikada gösterir. Çok düşük bir eşiğin seçilmesi, arka planın bölümlerinin veya hücre dışı bölgenin analiz için hücreye dahil edilmesine neden olurken, çok yüksek bir eşik seçmek hücrenin bir kısmının kaybına neden oldu (bkz. sütunlar 3-4 ile karşılaştırıldığında sütun 4-5'teki apikal dilim). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 11: Arka plan sinyal yapıtları, ikili maske oluşturma sırasında arka plan karıştırılıp uygun bir eşik seçildikten sonra bile devam edebilir. Sütun 1, taban çizgisi ve sütun 2'deki temsili apikal, orta ve bazal dilimleri 50 μM forskolin tedavisinden 10 dakika sonra gösterir. Arka plan sinyallerini oluşturan karıştırma için 6 bileşenli bir kitaplık kullanmasına ve ikili maske üretimi için 0,85'lik daha yüksek bir eşik kullanmasına rağmen, arka plan bölgeleri, özellikle forskolin ile tedavi edildikten sonra hala hücrenin bir parçası olarak tanımlandı. Bu durumda, olası bir açıklama, görüntüleme için FRET muhabirinin zayıf ifadesine sahip bir hücrenin seçilmiş olması olabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 1: Yazılımda lazer ayarının bir fonksiyonu olarak lazer hattı yoğunluğunun ölçüleri. Fiber bağlantılı bir spektrometre ve entegre küre, hem 405 nm lazer hattı hem de 488 nm lazer hattı için lazer yoğunluğunu ölçmek için NIST izlenebilir bir lambaya kalibre edildi. A) 405 nm lazerin farklı lazer yoğunluklarına karşılık gelen mikroskop aşamasında ölçülen toplam foton sayısı. B) 488 nm lazerin farklı lazer yoğunluklarına karşılık gelen mikroskop aşamasında ölçülen toplam foton sayısı. Mikroskop aşamasında ölçülen lazerler için lazer yoğunluğunda doğrusal yanıt gözlendi. Doğrusal bir eğilim çizgisi uygundu ve 405nm lazer hattı (donör uyarlama) ile heyecanlanırsa beklenen alıcı spektrumu hesaplamak için her lazer çizgisi için eğilim çizgisi denklemi kullanıldı. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Şekil 2: Forskolin kaynaklı FRET verimliliği ve eksenel yönde görselleştirilmiş cAMP uzamsal gradyanlar. XZ düzlem görüntüleri, 3 boyutlu yeniden yapılandırılmış FRET ve cAMP görüntü verilerinin yanal (Y) yönde (hücrenin önünden arkasına) yeniden ayrıştırılarak oluşturulmuştır. Sütun 1 ve 3, FRET verimliliğini temel olarak ve sırasıyla 50 μM forskolin tedavisinden 10 dakika sonra temsil eder. Sütun 2 ve 4, cAMP seviyelerini temel ve forskolin tedavisinden 10 dakika sonra temsil eder. Sağdaki renk çubukları, renk haritasındaki değişiklikleri FRET verimliliği (üstte) ve cAMP seviyeleri (altta) ile ilişkilendirmek için kullanılmıştır. YZ düzlemleri için gösterilen sonuçlara benzer şekilde (Şekil 8), FRET verimliliğinde ve cAMP seviyelerinde bazal uzamsal degradelere apikal, hem taban çizgisi koşullarında (sütun 1-2'deki herhangi bir dilim) hem de 50 μM forskolin tedavisinden sonra (sütunlar 3-4) tek bir YZ diliminin üstünden altına renk değişiklikleri olarak görselleştirilebilir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Dosyalar. Bu dosyaları indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FRET biyosensörlerinin gelişimi, döngüsel nükleotid sinyallerinin tek hücrelerde ölçülmesini ve görselleştirilmesini sağladı ve hücre altı sinyal olaylarını görselleştirmek için büyük bir vaat var13,22,37,38. Bununla birlikte, FRET biyosensörlerinin kullanımı, birçok floresan protein bazlı FRET muhabirinin düşük sinyal-gürültü özellikleri ve FRET muhabirlerinin zayıf transfeksiyon veya ifade verimlilikleri de dahil olmak üzere çeşitli sınırlamalar sunar (bu, PMVEC'ler gibi belirli hücre hatlarında özellikle zor olabilir)23,24. Zayıf ifade edilen floresan proteinlerin görüntülenmesi, oranmetrik FRET hesaplamaları ile birlikte, genellikle hesaplanan FRET verimliliğinde yüksek derecede belirsizlik veya dalgalanmaya neden olur. FRET ölçümlerinin güvenilirliğini artırmak amacıyla, biz ve diğerleri daha önce FRET sinyallerini ölçmek ve floresan etiketler ile otoflüoresan etkileri arasındaki floresan sinyalleri ile çapraz konuşma veya kanamayı azaltmak için hiperspektral görüntüleme ve analizin kullanımını gösterdik26,31,32,39. Sinyal gücündeki sınırlamalar nedeniyle, bu spektral FRET çalışmaları çok yakın zamana kadar iki (X ve Y) mekansal boyutla sınırlıydı. Bu nedenle, bir hücre içindeki FRET değişikliklerinin tek dilimli bir görünümünü sağladılar.
Son çalışmalarda, FRET'in (ve buna karşılık gelen cAMP seviyelerinin) sadece XY düzleminde değil, aynı zamanda XZ ve YZ uçakları arasında da mekansal olarak dağıtıldığını gördük25. Burada açıklanan hiperspektral FRET görüntüleme yaklaşımı, FRET ve döngüsel nükleotid (cAMP) değişikliklerini görselleştirme ve ölçme yeteneğimizi üç mekansal boyuta genişleterek sinyal bölmelemenin değerlendirilmesi için yeni olanaklar sunar. Bu 4 boyutlu (X, Y, Z ve φ) hiperspektral görüntüleme ve analiz yaklaşımı, cAMP gradyanlarının üç mekansal boyutta ölçülmesine ve görselleştirilmesine olanak tanırken, tekdüze olmayan arka plan sinyallerini de hesaba katmaktadır. Burada, forskolin kaynaklı cAMP uzamsal gradyanları örneği ile bu yaklaşımın nasıl uygulanacağı konusunda göstermiştik. Tedavi sonrası görüntü verilerinde, cAMP mekansal gradyanlar apikalden hücrenin bazal tarafına kadar gözlenebilir (Şekil 7 ve Şekil 8). Forskolin ile tedavi üzerine üretilen cAMP hücre-hücre birleşimlerine ulaşmamıştır (Şekil 7 ve Şekil 8).
Burada açıklanan metodolojiyi kullanarak, FRET verimliliklerinin doğru tahmin edilmesine izin vermek için farklı arka plan ve otoflüoresans sinyal kaynaklarını hesaba katmak önemliydi. Doğrusal karıştırma, imzaları floresan ilgi problarından farklıysa, benzersiz arka plan spektrumlarını hesaba katmak için potansiyel bir yol sağlar. Özellikle, doğrusal karıştırma, arka plan ve otomatik mağazapsans sinyallerini ayırmak için standart arka plan çıkarmadan daha uygundur. 40,41,42 Burada gösterilen örnekte, üç farklı spektral imza ölçüldü ve imzanın tepe emisyon dalga boyunu temel alan bir isim atandı: 424 nm arka plan spektrumu (muhtemelen kapak flüoresansından), 504 nm arka plan spektrumu (muhtemelen yansıyan veya arkaya dağılmış ışık nedeniyle) ve 574 nm arka plan spektrumu (muhtemelen hücre veya hücresel matris otoflüoresansı nedeniyle). Bu imzaları hesaba katmamanın etkilerini göstermek için iki spektral kitaplık oluşturuldu ve karıştırılmamış görüntüler karşılaştırıldı. İlk olarak, örnekteki floresan etiketleri içeren bir spektral kütüphane oluşturuldu, Turkuaz, Venüs ve DRAQ5, 3 bileşenli kütüphane oluşturuldu ve etiketlendi. İkinci olarak, ek olarak üç arka plan spektral imzasını içeren bir spektral kitaplık oluşturuldu ve 6 bileşenli kitaplık etiketlendi. Yukarıda gösterildiği gibi, 6 bileşenli kitaplığa karıştırma (arka plan karıştırma) arka plan sinyallerinin kaldırılmasına izin verirken, 3 bileşenli kitaplıkla karıştırmadık (Şekil 9). Önceki çalışmada, hem floresan etiketleri hem de arka plan imzalarını oluşturan bir spektral kitaplık kullanırken doğrusal karıştırma ile ilişkili kök ortalama kare hatanın (RMSE) azaldığını göstermiştik. Arka plan floresanının eksenel dağılımının genellikle tekdüze olmadığı ve bu nedenle basit bir arka plan çıkarmanın görüntü verilerini düzeltmek için çalışmayacağı belirtilmelidir. Bu nedenle, doğru arka plan kaldırma ve güvenilir FRET ölçümleri sağlamak için spektral karıştırmama yaklaşımına ihtiyaç vardır.
Spektral görüntüler elde ederken mümkün olan en iyi sistem ve kamera ayarlarını seçmek için sistem parametrelerini optimize etmek önemlidir. Genel amaç, satın alma süresini en aza indirirken ve fotobleaching'i önlerken SNR'yi optimize etmek olmalıdır. 43 Bu nedenle, bir görüntüleme sistemini optimize ederken, mekansal, zamansal ve spektral çözünürlükler arasında bir uzlaşmaya sıklıkla ihtiyaç vardır. Bu çalışmalarda, protokol bölümünde açıklandığı gibi iğne deliği boyutu, lazer gücü, tarama hızı, tarama boyutu ve çerçeve ortalaması dahil olmak üzere sistem ve kamera ayarları için en uygun değerler seçilmiştir. Bu ayarlar kullanılarak, 80 nm / piksel uzamsal örnekleme, spektral z-yığını başına ~3 dakikalık zamansal örnekleme (~ 10 saniye / XY görüntü) ve 10 nm aralıklı spektral örnekleme ihmal edilebilir veya minimum fotobleaching ile elde edilir.
FRET verimliliğinin doğru tahminlerini sağlamak için, donör ve alıcı spektrumlarını 1:1 stoichiometry ve özdeş ekssitasyon dalga boyları ile beklendiği gibi ölçmek gerekir (Şekil 3). Turkuaz ve Venüs spektrası Turkuaz tepe emisyon dalga boyu açısından normalleştirildi. Bu spektral kütüphane kullanılarak tahmin edilen FRET verimliliği, literatürde bildirilenlere benzer değerler üretti12,22. Genellikle, kitaplıktaki endmember spektrumu birliğe normalleştirilir. Bununla birlikte, FRET verimliliğini doğru bir şekilde hesaplamak için, alıcı spektrum donör spektrumuna göre edinilmelidir (yani, equimolar konsantrasyonda veya 1:1 stoichiometry'de ve aynı ekscitasyon dalga boyuna atıfta bulunulmalıdır). Düzgün bir şekilde inşa edilmiş bir kütüphanenin kullanımına ek olarak, FRET verimliliğinin uygun şekilde tahmin edilmesi ve analiz yapıtlarının önlenmesi için çeşitli adımlar yer almaktadır. Bunlar arasında yeterli sinyal yoğunluğuna sahip bir ifade hücresi seçmek (Şekil 11), FRET verimliliğini tahmin etmeden önce karıştırılmamış görüntülerin yumuşatılmış olması (bu örnekte Gauss bulanıklığı uygulanmıştır), maskeyi oluşturmak için uygun bir eşik değeri kullanılması (Şekil 10) ve donör ve alıcının yok olma katsayılarını kullanarak bir düzeltme faktörünün tahmin edilmesi (Ek File_Spectral Kütüphanesi) sayılamaz. Bu adımlar izlendiğinde, FRET verimliliğinin ve alttaki cAMP seviyelerinin 3 boyutlu dağılımları tek hücrelerde doğru bir şekilde görselleştirilebilir.
Yerelleştirilmiş cAMP sinyalleri hedeflenen FRET biyosensörleri kullanılarak 2 uzamsal boyutta tahmin edilmiştir13,37. Bununla birlikte, FRET problarının belirli hücre altı bölmelere (örneğin plazma zarı veya lipid salları) hedeflanması tipik olarak yerel prob konsantrasyonunun artmasına neden olur. Bu, intermoleküler veya bimoleküler FRET nedeniyle kullanıma sunulan ölçüm yapıtlarına neden olabilir. Buna ek olarak, burada ve Annamdevula et.al., 2018'de sunulan sonuçlar, Sitometri A25, çözünür veya hedeflenen problardan FRET'in 3 boyutlu ölçümlerinin önemini göstermektedir.
cAMP sinyallerinin üç mekansal boyutta ölçülmesinin önemine rağmen, bu yaklaşımın sınırlamaları da vardır. En kısıtlayıcı sınırlama, spektral z-yığını başına yaklaşık 3 dakika olmak üzere gerekli uzun alım süreleridir. Bu alım oranı, hücrelerdeki sabit durum cAMP dağılımları dışında bir şeyi algılamak için bu yaklaşımın kullanılmasını önler. Bununla birlikte, sunulan sonuçlar, standart 2 boyutlu (x, y) ölçümlerin kritik tamamlayıcıları olarak quasi - sabit durum 3 boyutlu (x, y, z) cAMP ölçümlerinin dahil edilmesinin önemini göstermektedir. Gelecekte etiketli proteinleri ve hücresel yapıları deneysel tasarıma dahil etmek ilginç olacaktır. Proteinleri (ve/veya yapıları) etiketlemek için kullanılan floroforların dikkatli bir şekilde tercih etmesi, etiketli proteinlerin ve FRET'in 3 boyutlu dağılımlarının ek alım hızı kaybı olmadan değerlendirilmesine izin verecektir. Bu da, etiketli proteinlerin yakınındaki lokalize cAMP sinyallerinin ve cAMP sinyallerinin üç uzamsal boyutta ölçülmasına izin verecek, böylece hedeflenen cAMP problarına önemli bir deneysel tamamlayıcı sunacak ve canlı hücrelerdeki 3 boyutlu cAMP dağılımlarının hiperspektral ölçümlerinin yararını daha da genişletecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Leavesley ve Rich, spektral görüntüleme teknolojilerini ticarileştirmek için kurulan spectracyte, LLC bir start-up şirketine olan finansal ilgilerini açıkladılar. Ancak, bu protokolde açıklanan tüm prosedürler SpectraCyte, LLC ile ilişkili olmayan ticari olarak mevcut ürünler kullanılarak gerçek yapılmıştır.
Acknowledgments
Yazarlar, dr. Kees Jalink'i (Hollanda Kanser Enstitüsü ve van Leeuwenhoek İleri Mikroskopi Merkezi, Amsterdam, Hollanda) bize H188 cAMP FRET biyosensörü ve Kenny Trinh'i (Güney Alabama Mühendislik Fakültesi) özel olarak geliştirilen programlama komut dosyalarımızı çalıştırmak için geçen süreyi azaltmada teknik yardım sağladığı için kabul etmek istiyor.
Yazarlar fon kaynaklarını kabul etmek istiyor: Amerikan Kalp Derneği (16PRE27130004), Ulusal Bilim Vakfı; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Attofluor Cell Chamber | Invitrogen | A7816 | Attofluor contains steel cell chambers and a rubber O-ring. Cell chamber holds the coverslip and O-ring provides a lock in mechanism to hold the buffer in cell chamber with out leakage |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | Solvent used to prepare stock solution forskolin. |
| DRAQ5 Fluoroscent Probe Solution | Thermo Scientific | 62252 | Nuclear label |
| Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-092 | Contains nutrients and growth factors for the cells to grow and divide in the culture dishes. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F6178 | Growth factor suppliment that is added to culture medium, DMEM |
| Forskolin | Sigma | F3917 | Adenyly cyclase activator. |
| H188 Cyclic AMP FRET biosensor | Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink | Gift | Plasmid encoding Turquoise (donor fluorophore), Venus (acceptor fluorophore), and binding domain obtained from Epac. |
| Image J | image.net | Free download | Another image processing platform used to extact spectral information and image processing. |
| Integrating Sphere | Ocean Optics | FOIS-1 | Used to measure illumination intensity of the laser line at different laser intensities (?). |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Invitrogen | 23017-015 | Coverslips are coated with laminin and this helps in cell attachment, growth and motility of the cell. |
| Lipofectamine 3000 Transfection Kit | Invitrogen | L3000-015 | Transfection reagent used to transfect cells with H188 FRET biosensor |
| MATLAB | Mathworks | R2019a | Image processing operations (linear unmixing and FRET efficiency calculations) are performed by writing custom programs in MATLAB programming environment |
| Nikon A1R confocal microscope | Nikon Instruments | Nikon A1R | Spectral image acquisition is performed using confocal microscope. |
| Nikon Elements Software | Nikon Instruments | Software dongle | used to export and handle nd2 image files (multidimensional image files) that are aquired using Nikon A1R |
| NIST-Traceable Calibration Lamp | Ocean Optics | LS-1-CAL-INT | A lamp with a known spectrum for use as a standard |
| PBS pH 7.4 (1X) | Gibco | 10010-023 | coomonly used buffer suring cell culture |
| Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs) | In house - Cell culture core, Univeristy of South Alabama | Isolated from Rat pulmonary microvasculature | PMVECs form inner lining of a blood vessel. |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | antibiotics are added to culture medum to prevent contamination of the cells. |
| Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides | Clay Adams | 3010 | Microscope slides used for cell fixation |
| ProLong Diamond Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36961 | If samples are fixed using antifade mountant, then the later protects fluoroscent dyes and chromophores from fading. |
| Spectrometer | Ocean Optics | QE65000 | Used to measure spectral response of the light source (?) |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 | Digests the protein-protein bond between the cell and cell matrix and helps to disscociate and lift the cells during cell plating. |
| Tyrodes Buffer | Made in-house | Made in-house | Tyrodes buffer is used to make working solutions and to maintain cells in aqueous solution during image acquisition. |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3506 | Laminin coated coverslips are placed in 6-well culture dish (one coverlisps/well). Cells along with medium is added into each well. |
| 25 mm Round Microscope Cover Slips | Fisher Scientific | 12545102 | Cells were grown on round glass coverslips |
| 60X Ojective | Nikon Instruments | Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 | water immersion and commonly used objective for cells |
References
- Corbin, J. D., Sugden, P. H., Lincoln, T. M., Keely, S. L. Compartmentalization of adenosine 3':5'-monophosphate and adenosine 3':5'-monophosphate-dependent protein kinase in heart tissue. The Journal of Biological Chemistry. 252, 3854-3861 (1977).
- Terrin, A., et al. PGE1 stimulation of HEK293 cells generates multiple contiguous domains with different [cAMP]: role of compartmentalized phosphodiesterases. The Journal of Cell Biology. 175, 441-451 (2006).
- Bacskai, B. J., et al. Spatially resolved dynamics of cAMP and protein kinase A subunits in Aplysia sensory neurons. Science. 260, 222-226 (1993).
- Iancu, R. V., Ramamurthy, G., Harvey, R. D. Spatial and temporal aspects of cAMP signalling in cardiac myocytes. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 35, 1343-1348 (2008).
- Brunton, L. L., Hayes, J. S., Mayer, S. E. Functional compartmentation of cyclic AMP and protein kinase in heart. Advances in Cyclic Nucleotide Research. 14, 391-397 (1981).
- Hohl, C. M., Li, Q. Compartmentation of cAMP in adult canine ventricular myocytes. Relation to single-cell free Ca2+ transients. Circulation Research. 69, 1369-1379 (1991).
- Rich, T. C., et al. A uniform extracellular stimulus triggers distinct cAMP signals in different compartments of a simple cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 13049-13054 (2001).
- Sayner, S. L., Alexeyev, M., Dessauer, C. W., Stevens, T. Soluble adenylyl cyclase reveals the significance of cAMP compartmentation on pulmonary microvascular endothelial cell barrier. Circulation Research. 98, 675-681 (2006).
- Rich, T. C., Tse, T. E., Rohan, J. G., Schaack, J., Karpen, J. W. In vivo assessment of local phosphodiesterase activity using tailored cyclic nucleotide-gated channels as cAMP sensors. The Journal of General Physiology. 118, 63-78 (2001).
- Blackman, B. E., et al. PDE4D and PDE4B function in distinct subcellular compartments in mouse embryonic fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 286, 12590-12601 (2011).
- Sayner, S. L., et al. Paradoxical cAMP-induced lung endothelial hyperpermeability revealed by Pseudomonas aeruginosa ExoY. Circulation Research. 95, 196-203 (2004).
- Klarenbeek, J., Jalink, K. Detecting cAMP with an EPAC-based FRET sensor in single living cells. Methods in Molecular Biology. 1071, 49-58 (2014).
- Surdo, N. C., et al. FRET biosensor uncovers cAMP nano-domains at β-adrenergic targets that dictate precise tuning of cardiac contractility. Nature Communications. 8, 15031 (2017).
- Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Reports. 5, 1176-1180 (2004).
- Vogel, S. S., Thaler, C., Koushik, S. V. Fanciful FRET. Science's STKE. 2006, (2006).
- Clegg, R. M. The History of FRET: From conception through the labors of birth. Reviews in Fluorescence. 3, (2006).
- Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-224 (2006).
- Manzella-Lapeira, J., Brzostowski, J. A. Imaging protein-protein interactions by Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy in live cells. Current Protocols in Protein Science. 93, 58 (2018).
- Cooper, D. M. F., Mons, N., Karpen, J. W. Adenylyl cyclases and the interaction between calcium and cAMP signalling. Nature. 374, 421-424 (1995).
- Sassone-Corsi, P. Coupling gene expression to cAMP signalling: role of CREB and CREM. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 30, 27-38 (1998).
- Rebhun, L. I. Cyclic nucleotides, calcium, and cell division. International Review of Cytology. 49, 1-54 (1977).
- Klarenbeek, J., Goedhart, J., Van Batenburg, A., Groenewald, D., Jalink, K. Fourth-generation Epac-based FRET sensors for cAMP feature exceptional brightness, photostability and dynamic range: characterization of dedicated sensors for FLIM, for ratiometry and with high affinity. PLOS ONE. 10, 0122513 (2015).
- Leavesley, S. J., Rich, T. C. FRET: signals hidden within the noise. Cytometry Part A. 85, 918-920 (2014).
- Rich, T. C., Webb, K. J., Leavesley, S. J. Can we decipher the information content contained within cyclic nucleotide signals. The Journal of General Physiology. 143, 17-27 (2014).
- Annamdevula, N. S., et al. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
- Leavesley, S. J., Britain, A. L., Cichon, L. K., Nikolaev, V. O., Rich, T. C. Assessing FRET using spectral techniques. Cytometry Part A. 83, 898-912 (2013).
- Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming limitations of FRET measurements. Cytometry Part A. 89, 325-327 (2016).
- Fink, D. J. Monitoring Earcths Resources from Space. Technology Review. 75, 32-41 (1973).
- Goetz, A. F. H., Vane, G., Solomon, J. E., Rock, B. N. Imaging Spectrometry for Earth Remote Sensing. Science. 228, 1147-1153 (1985).
- Bücherl, C. A., Bader, A., Westphal, A. H., Laptenok, S. P., Borst, J. W. FRET-FLIM applications in plant systems. Protoplasma. 251, 383-394 (2014).
- Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. Journal of Microscopy. 228, 139-152 (2007).
- Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Letters. 531, 245-249 (2002).
- Griswold, J. R., Annamdevula, N., Deal, J., Rich, T., Leavesley, S. Estimating FRET Efficiency using Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging. Biophysical Journal. 112, 586 (2017).
- Favreau, P. F., et al. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19, 046010 (2014).
- King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvascular Research. 67, 139-151 (2004).
- Thaler, C., Koushik, S. V., Blank, P. S., Vogel, S. S. Quantitative multiphoton spectral imaging and its use for measuring resonance energy transfer. Biophysical Journal. 89, 2736-2749 (2005).
- Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Frontiers in Pharmacology. 9, 332 (2018).
- Johnstone, T. B., Agarwal, S. R., Harvey, R. D., Ostrom, R. S. cAMP signaling compartmentation: Adenylyl cyclases as anchors of dynamic signaling complexes. Mol Pharmacol. , (2017).
- Zhang, J., Li, H., Chai, L., Zhang, L., Qu, J., Chen, T. Quantitative FRET measurement using emission-spectral unmixing with independent excitation crosstalk correction. Journal of Microscopy. 257, 104-116 (2015).
- Zhang, J., Lin, F., Chai, L., Wei, L., Chen, T. IIem-spFRET: improved Iem-spFRET method for robust FRET measurement. Journal of Biomedical Optics. 21, 105003 (2016).
- Levy, S., et al. SpRET: highly sensitive and reliable spectral measurement of absolute FRET efficiency. Microscopy and Microanalysis. 17, 176-190 (2011).
- West, S. J., et al. Hyperspectral Measurements Allow Separation of FRET Signals from Non-Uniform Background Fluorescence. Biophysical Journal. 112, 453 (2017).
- Annamdevula, N. S., et al. An approach for characterizing and comparing hyperspectral microscopy systems. Sensors. 13, Basel. 9267-9293 (2013).
