Mesure des distributions cAMP à 3 dimensions dans des cellules vivantes à l’aide de l’imagerie et de l’analyse FRET hyperspectrales en 4 dimensions (x, y, z et λ)

Summary

En raison du faible rapport signal/bruit (SNR) inhérent aux capteurs basés sur le transfert d’énergie par résonance Fӧrster (FRET), la mesure des signaux cAMP a été difficile, en particulier dans trois dimensions spatiales. Nous décrivons ici une méthodologie d’imagerie et d’analyse FRET hyperspectrale qui permet de mesurer la distribution de l’AMPc en trois dimensions spatiales.

Abstract

L’AMP cyclique est un deuxième messager impliqué dans un large éventail d’activités cellulaires et physiologiques. Plusieurs études suggèrent que les signaux cAMP sont compartimentés et que le compartimentation contribue à la spécificité de la signalisation dans la voie de signalisation cAMP. Le développement de biocapteurs basés sur le transfert d’énergie par résonance de Fӧrster (FRET) a renforcé la capacité de mesurer et de visualiser les signaux cAMP dans les cellules. Cependant, ces mesures sont souvent limitées à deux dimensions spatiales, ce qui peut entraîner une mauvaise interprétation des données. À ce jour, il n’y a eu que des mesures très limitées des signaux cAMP dans trois dimensions spatiales (x, y et z), en raison des limitations techniques liées à l’utilisation des capteurs FRET qui présentent intrinsèquement un faible rapport signal/bruit (SNR). En outre, les approches traditionnelles d’imagerie par filtre sont souvent inefficaces pour mesurer avec précision les signaux cAMP dans les régions subcellulaires localisées en raison d’une gamme de facteurs, notamment la diaphonie spectrale, la force limitée du signal et l’autofluorescence. Pour surmonter ces limites et permettre aux biocapteurs à base de FRET d’être utilisés avec plusieurs fluorophores, nous avons développé des approches d’imagerie et d’analyse FRET hyperspectrales qui fournissent une spécificité spectrale pour le calcul des efficacités FRET et la capacité de séparer spectralement les signaux FRET de l’autofluorescence confondante et / ou des signaux d’étiquettes fluorescentes supplémentaires. Nous présentons ici la méthodologie de mise en œuvre de l’imagerie FRET hyperspectrale ainsi que la nécessité de construire une bibliothèque spectrale appropriée qui n’est ni sous-échantillonnée ni suréchantillonnée pour effectuer un démélange spectral. Bien que nous présentions cette méthodologie pour la mesure des distributions tridimensionnelles de l’AMPc dans les cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires (PMVEC), cette méthodologie pourrait être utilisée pour étudier les distributions spatiales de l’AMPc dans une gamme de types de cellules.

Introduction

L’adénosine monophosphate cyclique (AMPc) est un deuxième messager impliqué dans les processus cellulaires et physiologiques clés, notamment la division cellulaire, l’afflux de calcium, la transcription des gènes et la transduction du signal. Un nombre croissant de preuves suggère l’existence de compartiments cAMP dans la cellule à travers lesquels la spécificité de signalisation est atteinte^{1,2,3,4,5,6,7}. Jusqu’à récemment, la compartimentation de l’AMPc était déduite sur la base d’effets physiologiques ou cellulaires distincts induits par différents agonistes des récepteurs couplés G^8,9,10,11. Plus récemment, les sondes d’imagerie de fluorescence basées sur FRET ont fourni de nouvelles approches pour la mesure et l’observation directes des signaux cAMP dans une cellule^12,13,14.

Le transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET) est un phénomène physique dans lequel le transfert d’énergie se produit entre les molécules donneuses et acceptrices de manière non radiative lorsque les molécules sont à proximité^15,16. Avec le développement d’indicateurs fluorescents basés sur FRET, ce phénomène physique a été utilisé dans des applications biologiques pour étudier les interactions protéine-protéine^17,la colocalisation^{protéique 18,}la signalisation Ca^{+2 19,}l’expression^{génique 20,}la division cellulaire²¹ et la signalisation nucléotidique cyclique. Les indicateurs cAMP basés sur FRET se composent généralement d’un domaine de liaison cAMP, d’un fluorophore donneur et d’un fluorophore accepteur²². Par exemple, le capteur H188 cAMP^12,22 utilisé dans cette méthodologie consiste en un domaine de liaison cAMP obtenu à partir d’Epac, pris en sandwich entre les fluorophores Turquoise (donneur) et Vénus (accepteur). Dans des conditions basales (non liées), la Turquoise et Vénus sont dans une orientation telle que fret se produit entre les fluorophores. Lors de la liaison de l’AMPc au domaine de liaison, un changement conformationnel se produit de sorte que turquoise et Vénus se séparent, ce qui entraîne une diminution de FRET.

Les approches d’imagerie basées sur FRET offrent un outil prometteur pour étudier et visualiser les signaux cAMP au sein d’une cellule. Cependant, les techniques actuelles d’imagerie microscopique basées sur FRET ne réussissent souvent que partiellement à obtenir une force de signal suffisante pour mesurer FRET avec une clarté spatiale subcellulaire. Cela est dû à plusieurs facteurs, notamment la force limitée du signal de nombreux rapporteurs FRET, le haut niveau de précision requis pour quantifier avec précision les changements dans l’efficacité FRET et la présence de facteurs de confusion, tels que l’autofluorescence cellulaire^23,24. Le résultat est souvent une image FRET qui est en proie à un faible SNR, ce qui rend la visualisation des changements subcellulaires dans FRET très difficile. En outre, l’étude des signaux cAMP localisés dans l’espace a été presque exclusivement effectuée dans seulement deux dimensions spatiales et la distribution axiale cAMP a rarement été considérée comme²⁵. Cela est probablement dû au fait qu’un faible SNR a entravé la capacité de mesurer et de visualiser les gradients de l’AMPc dans trois dimensions spatiales. Pour surmonter les limites de l’utilisation de capteurs FRET à faible SNR, nous avons mis en œuvre des approches d’imagerie et d’analyse hyperspectrales pour mesurer FRET dans des cellules individuelles^25,26,27.

Des approches d’imagerie hyperspectrale ont été développées par la NASA pour différencier les objets terrestres présents dans les images satellites^28,29. Ces techniques ont depuis été traduites dans le domaine de la microscopie à fluorescence^30,avec plusieurs systèmes de microscope confocal commerciaux offrant des détecteurs spectraux. Dans l’imagerie de fluorescence traditionnelle (non spectrale), l’échantillon est excité à l’aide d’un filtre passe-bande ou d’une ligne laser, et l’émission est collectée à l’aide d’un deuxième filtre passe-bande, souvent sélectionné pour correspondre à la longueur d’onde d’émission maximale du ou des fluorophores. En revanche, les approches d’imagerie hyperspectrale cherchent à échantillonner un profil spectral complet de l’émission de fluorescence^26,31^,32ou de l’excitation^{33 ,34}à des intervalles de longueur d’onde spécifiques. Dans nos études précédentes, nous avons montré que les approches d’imagerie et d’analyse hyperspectrales peuvent offrir une meilleure quantification des signaux FRET dans les cellules par rapport aux techniques traditionnelles d’imagerie FRET basées sur des^{filtres 26}. Nous présentons ici une méthodologie pour effectuer une imagerie et une analyse FRET hyperspectrales en 4 dimensions (x, y, z et λ) afin de mesurer et de visualiser les distributions cAMP en trois dimensions spatiales. Ces approches ont permis de visualiser les gradients spatiaux de l’AMPc induits par les agonistes dans des cellules individuelles²⁵. Fait intéressant, selon l’agoniste, des gradients d’AMPc peuvent être apparents dans les cellules. La méthodologie présentée ici utilise le démélange spectral du fond non uniforme et de l’autofluorescence cellulaire pour améliorer la précision des mesures FRET. Bien que cette méthodologie soit démontrée dans les cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires (PMVEC) à l’aide d’un biocapteur FRET cAMP, la méthodologie pourrait facilement être modifiée pour être utilisée avec d’autres rapporteurs FRET ou des lignées cellulaires alternatives.

Protocol

Ce protocole suit les procédures approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de South Alabama.

1. Préparation des cellules, des échantillons et des réactifs pour l’imagerie

1. Isoler les cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires (PMVEC) du rat comme décrit précédemment³⁵.
   REMARQUE: Les cellules ont été isolées et cultivées par le noyau de culture cellulaire de l’Université de South Alabama, Mobile, AL sur des paraboles de culture cellulaire de 100 mm.
2. Ensemencez les PMVÉC isolés sur des couvercles de verre rond de 25 mm et laissez-les se développer dans l’incubateur à 37 °C jusqu’à ce que les cellules atteignent au moins 80 % de confluence (au moins 24 heures).
   REMARQUE: Les cellules et le type de cellule peuvent varier d’une étude à l’autre et, par conséquent, les procédures de culture cellulaire spécifiques aux cellules doivent être suivies pour ensemencer et cultiver des cellules. Le protocole d’ensemencement et de culture cellulaire utilisé dans ces études est disponible en tant qu’information supplémentaire dans le fichier intitulé « Culture et transfection supplémentaires File_Cell ».
3. Transfecter les PMVEC avec un biocapteur FRET et incuber pendant 48 heures à 37 °C.
   REMARQUE : Le protocole de transfection des PMVÉC est également décrit dans le fichier d’information supplémentaire intitulé « Supplément File_Cell culture et transfection ».
4. Le jour de l’imagerie, réchauffez le tampon de Tyrode à 37 °C au bain-marie.
   REMARQUE: Le tampon de Tyrode se compose de 145 mM naCl, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM glucose, 1 mM MgCl₂ et 1 mM CaCl₂
5. Montez un couvercle contenant des cellules transfectées dans une chambre à cellules et fixez le dessus avec un joint de montage pour éviter les fuites.
6. Essuyez le bas du couvercle à l’aide d’un essuyage de tâche délicate pour nettoyer tout excès de support ou de cellules adhérentes.
7. Ajouter 800 μL de tampon de travail et 4 μL d’étiquette nucléaire de 5 mM à la chambre cellulaire et basculer doucement pendant 5 à 10 secondes.
   REMARQUE: Lorsque vous ajoutez des solutions tampons ou réactives à des couvercles montés dans la chambre cellulaire, assurez-vous d’ajouter la solution doucement et sur le côté de la chambre cellulaire afin de ne pas déloger les cellules adhérentes. L’ajout de 4 μL d’étiquette nucléaire de 5 mM à 800 μL de tampon donne une concentration finale de 25 μM d’étiquette nucléaire. Pour les cellules peu adhérentes telles que les cellules HEK293, mélangez d’abord l’étiquette nucléaire et le tampon dans un flacon, puis ajoutez-les aux couvercles montés dans la chambre cellulaire. Cela empêchera de soulever les cellules du couvercle.
8. Couvrir la chambre cellulaire avec du papier d’aluminium pour protéger de la lumière et incuber pendant 10 minutes à température ambiante.
9. Préparation du réactif : Ajouter 1 μL de forskoline de 50 mM à 199 μL de tampon. Cela produira une concentration finale de forskoline de 50 μM lorsqu’elle sera ajoutée aux cellules préparées avec 800 μL de tampon. 1 μL de DMSO dans 199 μL de tampon doit également être préparé pour être utilisé comme contrôle du véhicule.
   REMARQUE: Dans ces études, la forskoline est utilisée comme activateur de l’adénylyl cyclase pour stimuler la production d’AMPc. Si vous le souhaitez, cette méthodologie peut facilement être modifiée pour permettre un traitement avec des réactifs alternatifs pour stimuler ou inhiber l’adénylyl cyclase, les phosphodiestérases, etc.

2. Acquisition d’images

1. Utilisez un microscope confocal équipé d’un détecteur spectral.
   REMARQUE: Toutes les étapes d’acquisition d’images décrites ici ont été développées à l’aide d’un système de microscope Nikon A1R disponible dans le commerce. Ces étapes peuvent devoir être ajustées si vous utilisez un autre microscope spectral. Assurez-vous que tout l’équipement est allumé au moins 30 minutes avant le début de l’expérience afin d’atteindre des conditions de fonctionnement stables.
2. Sélectionnez l’objectif d’immersion dans l’eau 60x et ajoutez une goutte d’eau à l’objectif.
   REMARQUE: Pour l’imagerie à haute résolution de cellules vivantes, il est recommandé d’utiliser un objectif à ouverture numérique élevée. Veuillez consulter la Liste des matériaux pour obtenir des renseignements sur l’objectif utilisé dans ces études.
3. Placez la chambre à cellules chargée (à partir de l’étape 1.7) sur l’étage du microscope.
4. Sélectionnez le jeu de filtres DFT (DAPI/FITC/TRITC) en réglant le bouton de filtre sur le côté droit du microscope.
5. Utilisez le microscope en mode grand champ de fluorescence à l’aide des oculaires pour sélectionner un champ de vision contenant des cellules exprimant le capteur FRET cAMP.
   REMARQUE: Assurez-vous que l’intensité moyenne du signal FRET à la longueur d’onde maximale d’émission du donneur ou de l’accepteur dans la cellule sélectionnée est d’au moins 100 unités d’intensité (UA) ou d’au moins 4 fois le signal de base d’une région sans cellules d’expression. Cela peut être confirmé à l’aide de la visionneuse de profil de spectre disponible dans le logiciel NIS Elements. Lorsque vous recherchez une cellule avec un bon signal, il est conseillé de se débarrasser des cellules excessivement brillantes (elles peuvent être compromises).
6. Ouvrez le logiciel NIS, passez en mode confocal, déverrouillez le bouton de verrouillage laser et cliquez sur Live.
7. Utilisez le bouton de mise au point pour faire la mise au point sur les cellules en regardant l’aperçu à l’écran.
8. Configurez les paramètres de périphérique, d’acquisition et de pile z dans le logiciel, comme décrit ci-dessous.
9. Paramètres d’acquisition :
   REMARQUE: Les paramètres d’acquisition de l’appareil photo et de l’appareil peuvent être appliqués à l’aide d’une image précédemment acquise. Ouvrez l’image, faites un clic droit et sélectionnez Réutiliser les paramètres de l’appareil photo.
   1. Ouvrez le menu des paramètres A1, cochez les cases correspondant aux lignes laser 405 nm et 561 nm, sélectionnez SD pour le détecteur spectral, sélectionnez 10 pour la résolution et 31 pour les canaux.
      REMARQUE: Le menu des paramètres A1 s’affiche sous la forme d’une petite icône d’engrenage dans le coin supérieur gauche de la fenêtre Paramètres A1 Plus. Le laser 405 nm est utilisé pour l’excitation du donneur et le laser 561 nm est utilisé pour l’excitation de l’étiquette nucléaire.
   2. Définissez la plage de longueurs d’onde (410 – 730 nm) en sélectionnant les valeurs de longueur d’onde de début et de fin.
   3. Cliquez sur l’icône binning/skip dans le menu des paramètres A1 et cochez la case numérotée 15, puis cliquez sur OK dans le menu des paramètres A1.
      REMARQUE: Il s’agit de supprimer le canal de longueur d’onde qui correspond au laser d’excitation de 561 nm (il s’agit généralement du canal de longueur^{d’onde 15).} Il est important de ne pas utiliser cette bande de longueur d’onde pour éviter un signal artificiellement bas, qui peut créer un artefact spectral. Le signal est plus faible dans cette bande en raison du doigt mécanique qui recouvre l’élément détecteur pour le protéger des dommages laser.
   4. Réglez les intensités laser à 8% et 2% pour les lasers 405 nm et 561 nm, respectivement, Si Hv (gain du détecteur) à 149 et un rayon de sténopé de 2,4 unités de disque aéré (UA).
      REMARQUE: Les intensités laser peuvent devoir être ajustées en fonction de l’âge de l’instrument et de l’état des lasers. Si vous ajustez les intensités laser entre différents échantillons ou groupes expérimentaux, il est important de maintenir le même rapport d’intensités laser (p. ex., 8:2). De plus, il est important de sélectionner une intensité laser qui n’est pas autant brillante qu’elle crée un photobleachage rapide. Le gain du détecteur doit être ajusté pour maximiser l’intensité du signal tout en minimisant le bruit du détecteur. Pour ces études, un gain de 149 a été utilisé. Une taille de sténopé de 2,4 UA a été choisie comme équilibre entre l’acquisition d’images avec un rapport signal/bruit (SNR) suffisant et le maintien de la section optique (confocalité). Une augmentation de la taille du sténopé augmente le SNR mais diminue la confocalité.
   5. Réglez la vitesse de balayage sur 0,25 image spectrale par seconde, sélectionnez l’icône correspondant à unidirectionnel pour la direction de numérisation, entrez 4 pour le nombre et définissez 1024 x 1024 pour la taille de numérisation.
      REMARQUE: Les signaux FRET sont faibles et une vitesse de balayage lente est souvent requise. En utilisant une vitesse de balayage de 0,25, l’acquisition d’une pile z spectrale est terminée en ~ 3 minutes. La vitesse de balayage peut être augmentée ou diminuée en fonction des fluorophores utilisés. Par exemple, pour les fluorophores plus brillants comme l’eGFP, une vitesse de balayage plus rapide (2 images / seconde) peut être utilisée. Le nombre saisi sous le nombre correspond à une valeur moyenne d’image de 4, ce qui contribue à la réduction du bruit lors de l’acquisition d’images. Pour les échantillons très stables et où le temps n’est pas une contrainte, des valeurs de moyenne plus élevées (jusqu’à 16) peuvent être utilisées pour obtenir des images avec un SNR amélioré.
10. Définissez les paramètres d’acquisition z-stack :
    REMARQUE : Les valeurs saisies à l’étape 2.10 devront peut-être être ajustées pour tenir compte des changements dans la liaison ou la concentration des étiquettes fluorescentes, le type d’étiquette, le nombre d’étiquettes utilisées, la lignée cellulaire et d’autres changements dans la préparation des échantillons qui peuvent avoir une incidence sur la densité de marquage cellulaire et/ou l’autofluorescence cellulaire. Lors de l’ajustement des paramètres d’acquisition, il faut veiller à obtenir un SNR suffisant tout en minimisant le photobleachage. De plus, lors de la configuration d’un test FRET spectral, il faut veiller à ce que les paramètres fonctionnent bien dans tous les groupes de traitement. Il est conseillé d’effectuer un essai de chaque groupe de traitement avec les paramètres proposés pour s’assurer que le SNR est suffisant et que le photobleachage est minimisé.
    1. Ouvrez la fenêtre d’acquisition ND en cliquant sur Afficher → contrôle d’acquisition → acquisition ND.
    2. Entrez le chemin/la destination et un nom de fichier pour enregistrer le fichier ND dans la fenêtre contextuelle.
    3. Cochez la case correspondant à la série z.
    4. Cliquez sur en direct dans la fenêtre Paramètres A1 Plus. Cela ouvrira une fenêtre de visualisation en direct.
    5. Ajustez le bouton de mise au point du microscope pour sélectionner le haut de la cellule et cliquez sur Haut dans la fenêtre d’acquisition ND pour définir la position actuelle comme étant en haut.
       REMARQUE: Il est suggéré de se concentrer légèrement au-dessus du haut de la cellule pour s’assurer que toute la cellule est échantillonnée dans la série z.
    6. Réglez le bouton de mise au point du microscope pour sélectionner le bas de la cellule et cliquez sur Bas dans la fenêtre d’acquisition ND pour définir la position actuelle en bas.
       REMARQUE: Focalisation légèrement en dessous du bas de la cellule pour s’assurer que toute la cellule est échantillonnée.
    7. Entrez 1 μm pour la taille de l’étape, sélectionnez haut-bas pour la direction z-scan et cliquez sur exécuter dans la fenêtre Acquisition ND pour acquérir une pile z.
       REMARQUE : La taille des étapes détermine le nombre de tranches z qui seront acquises en fonction des emplacements supérieur et inférieur (c.-à-d. la distance parcourue). Une taille de pas de 1 μm a été choisie comme compromis entre la vitesse d’imagerie, l’échantillonnage sur l’axe Z et le photobleachage. L’utilisation du diamètre confocal du sténopé de 2,4 UA et de l’objectif d’immersion dans l’eau 60x a permis d’avoir une épaisseur de section optique de 1,73 μm. Par conséquent, une taille d’étape de 1 μm est légèrement inférieure aux critères d’échantillonnage de Nyquist, mais il s’agit d’un compromis qui a été fait pour réduire le temps nécessaire à l’acquisition d’une pile z. Pour les échantillons très stables, pour lesquels la vitesse n’est pas critique, un pas d’axe z plus petit et éventuellement un diamètre de sténopé confocal plus petit peuvent être utilisés pour augmenter la résolution de l’axe Z. Bottom-top devrait donner des résultats similaires et peut être utilisé pour évaluer les effets du photobleaching qui peuvent se produire pendant le scan z.
11. Configurez le perfect focus system (PFS) si disponible :
    REMARQUE: PFS permet au système de compenser les fluctuations de la profondeur focale lors de l’acquisition de l’image. Les étapes suivantes peuvent être utilisées pour configurer PFS, et ces étapes peuvent varier légèrement en fonction de la version du Nikon A1R et de la version de NIS Elements utilisée.
    1. Mettez en surbrillance le mode symétrique défini par l’icône de plage dans la fenêtre d’acquisition ND.
    2. Allumez le bouton PFS sur la face avant du microscope (assurez-vous que le bouton du miroir dichroïque situé sur la section située sous l’étage d’échantillonnage est « in »).
    3. Redéfinissez le haut (rotation dans le sens inverse des aiguilles d’une montre) et le bas (rotation dans le sens des aiguilles d’une montre) à l’aide du bouton sur la face avant du contrôleur de décalage PFS.
    4. Définissez une position z relative/profondeur z en cliquant sur « relative » dans la fenêtre d’acquisition ND.
    5. Cliquez sur mémoire sur la face avant du microscope afin que le logiciel mémorise la profondeur z relative.
12. Une fois l’acquisition de la pile z terminée, ajoutez doucement le réactif souhaité (forskoline ou contrôle du véhicule) à l’aide d’une pipette et attendez 10 minutes.
    REMARQUE: Ajouter le réactif très doucement afin de ne pas déranger les cellules ou déplacer la position de la chambre cellulaire dans l’étage XY du microscope; il est utile de vérifier dans une vue ou une image en direct ultérieure que le champ de vision ne s’est pas déplacé lors de l’ajout de réactif. Le temps d’attente de 10 minutes est pour que le traitement à la forskoline prenne effet. Si un autre traitement est utilisé, le temps d’attente peut devoir être ajusté.
13. Après 10 minutes, modifiez le nom du fichier et cliquez sur Exécuter dans la fenêtre d’acquisition ND.
14. Répétez les étapes 2.11 à 2.13 comme indiqué ci-dessus pour au moins 5 couvercles afin d’obtenir des résultats suffisants pour l’analyse statistique (n = 5 pour chaque groupe de traitement – forskoline et contrôle du véhicule).
15. Préparer des échantillons et des blancs d’échantillons pour construire la bibliothèque spectrale et acquérir des images spectrales en utilisant des paramètres d’acquisition similaires à ceux décrits aux étapes 2.9 et 2.10.

3. Analyse d’images

REMARQUE: Ces images seront utilisées pour construire une bibliothèque spectrale contenant les spectres purs de tous les membres finaux individuels présents dans l’étude. Les membres finaux de la bibliothèque spectrale peuvent varier d’une étude à l’autre si différents fluorophores sont utilisés. Une procédure détaillée pour construire la bibliothèque spectrale est fournie dans un fichier d’information supplémentaire nommé « Bibliothèque File_Spectral supplémentaire ». Ici, nous décrivons l’exportation de données vers des fichiers .tiff, le démélange spectral linéaire, les mesures d’efficacité FRET, la reconstruction tridimensionnelle et l’estimation des niveaux cAMP. L’analyse d’images peut être effectuée à l’aide de différentes plates-formes d’analyse et de programmation d’images telles que ImageJ, Python, MATLAB ou CellProfiler. Dans ces études, des scripts MATLAB ont été utilisés.

1. Exporter des données d’image :
   1. Créez de nouveaux dossiers avec le même nom de fichier correspondant aux images spectrales z-stack acquises aux étapes 2.13 et 2.14.
      REMARQUE : Les étapes suivantes décrites pour exporter des données sont spécifiques à NIS Elements AR version 4.30.01. Ces étapes peuvent varier légèrement en fonction de la version du logiciel.
   2. Cliquez sur Fichier, ce qui ouvrira une fenêtre de fichier. Parcourez et sélectionnez le fichier d’image spectrale acquis à l’étape 2.12 et cliquez sur Ouvrir.
   3. Une fois le fichier chargé, cliquez sur Fichier→ Importer/Exporter→ Exporter le document ND.
   4. Dans la fenêtre contextuelle : parcourez et sélectionnez le dossier créé à l’étape 3.1.1, sélectionnez Format d’image balisé (TIF) pour Type de fichier, puis sélectionnez Image mono pour chaque canal et Conserver la profondeur de bits.
      REMARQUE : Le préfixe de fichier sera pré-généré ; modifier cette valeur pour plus de commodité. L’ordre d’index changera en fonction des canaux sélectionnés et doit afficher « z, c » pour l’indexation en fonction de l’emplacement de la tranche z en premier et du numéro de bande de longueur d’onde en second. Assurez-vous que les cases correspondant à Appliquer des LUT ou Insérer des superpositions ou Utiliser des noms de points ne sont pas sélectionnées.
   5. Cliquez sur Exporter pour exporter les fichiers tiff vers un dossier de destination en tant que fichiers tiff individuels.
   6. Répétez les étapes 3.1.2 à 3.1.5 pour exporter les fichiers d’images spectrales acquis à l’étape 2.13.
2. Démélange spectral linéaire :
   1. Ouvrez le logiciel de programmation.
      REMARQUE: Un script de programmation développé sur mesure pour démixer des images spectrales brutes est fourni sur le site Web de l’Université de South Alabama BioImaging and BioSystems, sous l’onglet Ressources (https://www.southalabama.edu/centers/bioimaging/resources.html).
   2. Ouvrez le fichier intitulé « Linear Unmixing.m » et cliquez sur le bouton Exécuter dans la barre d’outils de l’éditeur.
   3. Parcourez et sélectionnez le dossier contenant la séquence de fichiers *.tif exporté générée par le logiciel NIS Elements.
   4. Cliquez sur OK pour continuer, ce qui ouvrira une nouvelle fenêtre appelée Longueur d’onde et Z-Slice.
   5. Copiez le nom de fichier du premier fichier (sans tranche z ni numéro de canal) dans le dossier sélectionné à l’étape 3.2.4 et collez-le dans la première étape de la boîte de dialogue intitulée « Entrez le nom de l’image ».
   6. Entrez le nombre de canaux dans la deuxième étape intitulée « Entrez le nombre de bandes de longueur d’onde », le nombre de tranches z dans la troisième étape intitulée « Entrez le nombre de tranches Z » et cliquez sur OK.
      REMARQUE: Le nombre de bandes de longueurs d’onde peut changer si des modifications sont apportées aux paramètres d’acquisition, telles que le réglage de la plage de longueurs d’onde ou de la taille du pas de longueur d’onde. Le nombre de tranches Z peut également changer en fonction de la hauteur de la cellule.
   7. Parcourez et sélectionnez le fichier de longueur d’onde appelé « Wavelength.mat » dans la fenêtre contextuelle intitulée « Sélectionnez le fichier d’informations sur la longueur d’onde » et cliquez sur Ouvrir.
   8. Parcourez et sélectionnez le fichier « Library.mat » dans la nouvelle fenêtre contextuelle intitulée « Sélectionnez le fichier de bibliothèque spectrale », cliquez sur Ouvrir et attendez que le démixage des tranches soit terminé.
      REMARQUE: Le fichier Library.mat est un fichier contenant des spectres purs pour chaque fluorophore d’extrémité ainsi que l’autofluorescence cellulaire et les signatures spectrales de fond. Dans ce cas, les fluorophores des membres finaux comprennent la turquoise, Vénus et DRAQ5. Les signatures spectrales d’arrière-plan comprennent l’autofluorescence cellulaire ou matricielle, la fluorescence du glissement de couverture et la diffraction du glissement de couverture. Le fichier Wavelength.mat est un fichier contenant des informations sur le canal de longueur d’onde utilisé pour acquérir l’image spectrale. Un exemple de fichier de bibliothèque et de fichier de longueur d’onde est disponible sur le site Web de Bioimaging and Biosystems (voir la note sous 3.2.1). Pour plus d’informations sur la façon de générer une bibliothèque spectrale et des fichiers de longueur d’onde, reportez-vous au fichier d’informations supplémentaire nommé « Bibliothèque File_Spectral supplémentaire ». Les images non mélangées correspondant à chaque tranche z seront enregistrées dans le dossier appelé « Unmixed » créé pendant le processus de démixage dans le dossier sélectionné à l’étape 3.2.3.
3. Calcul de l’efficacité FRET :
   1. Ouvrez le script de programmation appelé « multiFRRCF.m » et cliquez sur exécuter.
      REMARQUE: Ce fichier de programmation est disponible sur le site Web de l’Université de South Alabama Bioimaging and Biosystems (voir la note à l’étape 3.2.1).
   2. Entrez le nombre d’essais expérimentaux à analyser dans la boîte de dialogue contextuelle appelée « combien de dossiers à reselicer » et cliquez sur OK.
      REMARQUE: Les données d’image de chaque expérience doivent être enregistrées dans un dossier d’image non mélangé séparé. Cette étape permet simplement au code d’analyse de passer en boucle sur de nombreux dossiers afin de gagner du temps.
   3. Parcourez et sélectionnez le(s) dossier(s) non mélangé(s) et cliquez sur OK.
      REMARQUE: Le nombre de fois que la fenêtre contextuelle « Rechercher un dossier » s’ouvre dépend du nombre entré dans la boîte de dialogue « Combien de dossiers à reslicer » à l’étape précédente. Parcourez et sélectionnez les dossiers l’un après l’autre.
   4. Dans la nouvelle fenêtre contextuelle, entrez les informations suivantes dans les zones respectives: le facteur de mise à l’échelle est de 12,4, le seuil est de 5,6, X, Y et la fréquence Z sont respectivement de 5, 5 et 1, et l’algorithme de lissage est gaussien.
      REMARQUE: Le facteur de mise à l’échelle est une valeur en pixels / μm et sera utilisé pour mettre à l’échelle l’échantillonnage de la direction Z à celle de la direction XY. Le facteur de mise à l’échelle est obtenu à partir de la taille en pixels de l’image, qui est généralement fournie sous forme de métadonnées dans l’image pour la plupart des systèmes de microscope confocal. Par exemple, si l’image est acquise avec un espacement de 0,08 μm/pixel, le facteur de mise à l’échelle doit être de 12,5 pixels/μm. La valeur de seuil sera utilisée pour seuilr les images et générer un masque binaire de la cellule. Nous avons créé une liste de valeurs optimales en fonction de l’intensité du donneur d’image + accepteur. Utilisez 4,5 comme valeur seuil si l’image a une intensité donneur+accepteur lumineuse et un arrière-plan faible, une valeur comprise entre 5,6 et 6,5 pour les images n’ayant qu’une intensité donneur+accepteur modérée et/ou un arrière-plan supérieur, et une valeur de 7,5 et plus pour les images ayant une intensité donneur+accepteur inférieure à l’arrière-plan. La valeur de fréquence correspond à l’intervalle, en nombre de pixels, auquel le découpage est effectué dans les étapes suivantes. Par exemple, si la profondeur Z de la cellule est de 17 μm avec une taille de pas de 1 μm et qu’un facteur d’échelle de 12,5 pixels/μm est utilisé dans la direction XY, la profondeur du jeu de données d’image en 3 dimensions sera rééchantillonnée à 212 pixels (direction Z). En fonction de la valeur de fréquence Z saisie (par exemple, 1 pixel), l’ensemble de données d’image en 3 dimensions sera retranché en commençant par le haut de l’ensemble de données d’image, puis en se déplaçant par incréments de 1 pixel vers le bas. Il en résulte 212 images resélquées. Si un intervalle de valeur de fréquence plus grand était entré pour la fréquence Z, moins d’images resélquées seraient générées. Les images resélquées sont enregistrées dans les étapes suivantes.
   5. Cliquez sur Exécuter et attendez que toutes les mesures FRET et le découpage soient effectués.
      REMARQUE : Un dossier distinct est créé dans le répertoire parent dans lequel sont enregistrées les images d’efficacité FRET en niveaux de gris rééliquées et les images d’efficacité FRET colorées (une carte de couleurs appliquée). Par exemple, toutes les images FRET en niveaux de gris et colormap réélquées dans la direction X (plan YZ) sont enregistrées dans un dossier appelé « Resliced_XFRET ».
   6. Répétez l’analyse avec des paramètres similaires pour toutes les expériences – avant et après les traitements à la forskoline et les commandes du véhicule.
      REMARQUE : Les étapes mentionnées à la section 3.3 décrivent les valeurs à entrer pour le script de programmation d’analyse FRET personnalisé afin de générer des données d’image FRET en 3 dimensions. Toutefois, ce script exécute plusieurs opérations en cours d’exécution, notamment : le chargement des données d’image, la création de piles d’images, le lissage, les calculs d’efficacité FRET, la création et l’application d’un masque de bordure de cellule, la reconstruction d’image en 3 dimensions, le redécoupage d’images en 3 dimensions à des intervalles spécifiés (fréquences), l’application d’une carte couleur pour visualiser les modifications FRET et l’enregistrement des données d’image resélquées dans le même répertoire. Des détails supplémentaires ont été inclus sous forme de commentaires dans le script du programme.

4. Mappage de l’efficacité FRET aux niveaux cAMP

1. Ouvrez le fichier de programmation nommé 'Mapping_FRET Efficiency_to_cAMP_concentration.m' et cliquez sur exécuter dans la fenêtre principale.
   REMARQUE : Le fichier est disponible sur le site Web de BioImaging and BioSystems (voir la note sous 3.2.1). Ce fichier lit les images d’efficacité FRET en niveaux de gris et les convertit en niveaux cAMP en fonction d’une courbe caractéristique. Cette courbe caractéristique utilise une relation cAMP-FRET documentée dans la littérature^15,36 qui est décrite par l’équation de Hill (la troisième équation ci-dessous). Cependant, K_d de la sonde dans des cellules intactes est difficile à estimer et nous avons supposé qu’il était de 1 μM dans nos calculs. Par conséquent, les résultats sont présentés en fonction de K_d. (c.-à-d. [AMPc] = x* K_d). Les équations utilisées pour mesurer l’efficacité fret et mapper fret aux niveaux cAMP sont présentées ci-dessous :
   
   Où E est l’efficacité FRET, et un_apparent et d_apparent sont des intensités de pixels non mélangées d’images accepteurs et donneuses, respectivement.
   Q_a et Q_d sont des rendements quantiques de l’accepteur et du donneur. Notez que Q_a et Qd_s’annulent lorsque l’équation de k^λ est incorporée dans l’équation d’efficacité FRET, k^λ est un facteur de correction :
   
   et sont des coefficients d’extinction du donneur et de l’accepteur à la longueur d’onde d’excitation du donneur, i (405 nm).
   
   E est l’efficacité FRET et K_D = constante de dissociation = 1 μM.
2. Naviguez et sélectionnez la première image FRET en niveaux de gris (enregistrée à l’étape 3.3.5) et cliquez sur OK.
3. Ouvrez les images FRET/cAMP pour inspecter la distribution des signaux cAMP en trois dimensions.

Representative Results

Ce protocole décrit l’utilisation d’approches hyperspectrales d’imagerie et d’analyse FRET pour mesurer les gradients cAMP dans trois dimensions spatiales dans des cellules vivantes. La génération de ces résultats implique plusieurs étapes clés, pour lesquelles une attention particulière est requise lors de l’analyse et de la quantification des données. Ces étapes clés comprennent la construction d’une bibliothèque spectrale appropriée, le démélange spectral de fond, le seuillage pour identifier les frontières cellulaires et les calculs d’efficacité FRET. La figure 1 illustre le flux schématique de toutes les étapes impliquées dans la mesure de l’efficacité FRET et des niveaux d’AMPc dans les cellules vivantes. Lorsqu’elles sont effectuées correctement, ces étapes d’imagerie et d’analyse permettront de mesurer l’efficacité fret et d’estimer les gradients spatiaux cAMP en 3 dimensions dans une cellule, tout en tenant compte des signaux de fond non uniformes.

La figure 2 représente des vues en 3 dimensions de données d’images hyperspectrales brutes faussement colorées acquises à l’aide d’un microscope confocal Nikon A1R dans des conditions de base(Figure 2A)et 10 minutes après(Figure 2B)traitement à la forskoline. Il convient de noter que des paramètres de détecteur et de système similaires ont été utilisés pour acquérir des piles d’images avant et après le traitement afin de maintenir la cohérence pour l’analyse quantitative. Notez également que les changements dans FRET ne sont pas évidents dans cette image, car il s’agit purement d’une visualisation de données brutes, avant de calculer l’efficacité FRET.

Une bibliothèque spectrale avec des spectres purs de tous les membres finaux est nécessaire pour analyser davantage les données d’image spectrale brutes. La construction d’une bibliothèque spectrale appropriée est l’une des étapes clés pour assurer des mesures appropriées de l’efficacité FRET. La figure 3 illustre la construction d’une bibliothèque spectrale contenant les spectres purs des extrémités (dans ces études actuelles, les extrémités sont Turquoise, Vénus et DRAQ5). Pour mesurer l’efficacité fret, il est important d’obtenir les spectres de Turquoise et de Vénus à l’aide d’un échantillon avec une stœchiométrie 1:1. Ici, nous avons fourni une approche où le fluorophore accepteur est complètement photo-détruit, permettant d’obtenir des signatures spectrales du donneur et de l’accepteur avec une stœchiométrie1:1 (Figure 3A-F). De plus, des relations de puissance linéaires entre les lasers (Figure supplémentaire 1) ont été appliquées pour calculer le spectre de l’accepteur avec une intensité à laquelle on s’attendrait s’il était excité à l’aide du laser d’excitation du donneur, dans ce cas 405 nm pour la Turquoise (Figure 3G). Cela garantit que les signaux donneur et accepteur non mélangés sont comparables en intensité absolue lorsque FRET est excité avec une seule ligne laser de 405 nm. Des cellules non transfectées étiquetées avec le colorant nucléaire DRAQ5 (Figure 3H) ont été utilisées pour obtenir le spectre pur de DRAQ5 (Figure 3I). En combinant les spectres du donneur, Turquoise(Figure 3F),accepteur, Vénus(Figure 3G)et DRAQ5(Figure 3I),une bibliothèque à 3 composants a été créée(Figure 3J).

Des signaux provenant de sources autres que les étiquettes fluorescentes peuvent également être présents dans un échantillon. Pour en tenir compte, trois signatures spectrales différentes avec des pics qui se produisent à 424 nm, 504 nm et 574 nm ont été identifiées dans des échantillons cellulaires non marqués. Nous pensons que ces signatures spectrales correspondent à la réflectance de coverslip et à la matrice cellulaire ou à l’autofluorescence cellulaire. La figure 4 illustre les sources de ces trois signatures spectrales de fond. Il est important de noter que ces signaux sont distribués de manière non uniforme dans l’échantillon et ne peuvent donc pas être simplement soustraits. Cependant, l’ajout des signatures spectrales de ces signaux à la bibliothèque spectrale et l’utilisation du démélange linéaire pour séparer les signaux présentent une approche pour éliminer ces signaux confondants des signaux donneur et accepteur avant de calculer les efficacités FRET. Pour ce faire, les trois signatures spectrales de fond ont été ajoutées à la bibliothèque spectrale à 3 composants, formant une nouvelle bibliothèque à 6 composants composée de donneurs (Turquoise), d’accepteurs (Vénus), de DRAQ5 et de trois signatures spectrales de fond.

Un script de programmation personnalisé a été écrit pour décomfondrer les données d’image spectrale en membres finaux individuels, et un script séparé a été écrit pour effectuer des calculs d’efficacité FRET ultérieurs. Le démélange spectral linéaire (illustré à la figure 5)a été effectué à l’aide de la bibliothèque spectrale à 6 composants. Le démélange a été effectué pour chaque tranche de la pile d’images axiales, également appelée pile z (voir la visualisation en 3 dimensions des données d’image spectrale brutes de la figure 5A). Il en est résulté des images non mélangées distinctes pour chaque extrémité, pour chaque tranche z de la pile z(Figure 5C–E,les images non mélangées d’arrière-plan ne sont pas montrées). Si vous le souhaitez, les signaux non mélangés peuvent être faussement colorés pour la visualisation avec une couleur différente attribuée à chaque signal non mélangé (Figure 5F-H).

La figure 6 illustre les étapes impliquées dans les calculs de l’efficacité FRET, ainsi que les étapes de mappage de l’efficacité FRET aux niveaux cAMP. Une image d’efficacité FRET a été générée à l’aide d’images lissées non mélangées du donneur et de l’accepteur. Une image de masque binaire a été obtenue à l’aide d’images non mélangées de donneurs, d’accepteurs et d’images nucléaires. Le masque a été appliqué à l’image d’efficacité FRET pour supprimer les contributions des pixels à l’extérieur de la cellule. Bien que des images non mélangées de tranches z simples aient été utilisées pour la démonstration picturale des mesures d’efficacité FRET, ces calculs ont été effectués sur chaque tranche de la pile d’images en 3 dimensions. L’ensemble de données d’image FRET en 3 dimensions a ensuite été redimensionné en trois plans orthogonaux pour visualiser les gradients spatiaux des signaux cAMP dans différentes directions.

Visualisation des changements induits par les agonistes dans l’efficacité frette et les niveaux d’AMPc
Les étapes décrites ci-dessus fournissent une méthode de calcul de l’efficacité FRET et des niveaux d’AMPc à partir de données d’image hyperspectrale dans trois dimensions spatiales. Ces étapes peuvent être appliquées aux préparations cellulaires avant et après le traitement avec des composés qui provoquent une réponse à l’AMPc, tels que la forskoline. Ici, nous fournissons un exemple d’utilisation de cette approche pour observer les changements dans la distribution frette et cAMP dans les PMVCC après un traitement avec de la forskoline de 50 μM. La figure 7 illustre les changements dans l’efficacité frette et les niveaux d’AMPc dans différentes tranches planes XY (tranches z), de l’apical à la basale, permettant de comparer les conditions de base (avant le traitement à la forskoline) et 10 minutes après le traitement. Dans cet exemple illustratif, l’efficacité fret a diminué (colonnes 1 et 3 de la figure 7) lors du traitement à la forskoline, ce qui correspond à une augmentation des niveaux d’AMPc (colonnes 2 et 4 de la figure 7). Une variation spatiale minimale de l’AMPc au sein d’un seul plan XY a été observée. Cependant, des gradients spatiaux axiaux (apical-basal) de l’AMPc ont été observés, comme on peut le supposer en notant que la tranche apicale a une couleur rouge plus profonde (indiquant des niveaux d’AMPc plus élevés à travers la table de recherche de couleur qui a été appliquée) que la tranche basale après traitement à la forskoline (colonne 4 de la figure 7). Les distributions axiales FRET ou cAMP peuvent souvent être mieux visualisées à l’aide d’images obtenues à partir des deux plans spatiaux orthogonaux : la figure 8 illustre l’efficacité FRET et les niveaux cAMP dans le plan YZ au niveau de référence (colonnes 1 et 2) et 10 minutes après le traitement à la forskoline (colonnes 3 et 4), tandis que la figure supplémentaire 2 illustre l’efficacité FRET et les changements de niveau cAMP dans le plan XZ. Ces résultats démontrent la faisabilité de mesurer fret et d’estimer les niveaux d’AMPc à partir de données d’images hyperspectrales en 3 dimensions et démontrent également l’importance de visualiser les distributions axiales de FRET ou d’AMPc. Bien qu’au-delà de la portée de cet article méthodologique, il se peut que les distributions spatiales axiales des nucléotides cycliques contribuent à la spécificité dans les voies de signalisation des nucléotides cycliques.

Lors de l’exécution des méthodes décrites ci-dessus, il est important de vérifier méticuleusement l’exactitude des étapes et d’exécuter des contrôles expérimentaux et de véhicule appropriés pour s’assurer que les changements dans FRET (et l’AMPc correspondant) sont dus à des changements réels dans les signaux donneurs et accepteurs et ne sont pas des artefacts d’imagerie. Par exemple, les étapes importantes à considérer comprennent :

Utilisation d’une bibliothèque spectrale appropriée qui contient tous les composants spectraux nécessaires
Comme mentionné, il peut y avoir une contribution significative des signaux de fond provenant de l’autofluorescence cellulaire, de la matrice déposée ou de la lumière réfléchie par le couvercle (saignement d’excitation-émission). La figure 9 représente un exemple d’ensemble de données illustrant que le signal d’arrière-plan a été conservé dans les images lorsqu’une bibliothèque à 3 composants (Turquoise, Vénus et DRAQ5) a été utilisée pour décomposant les données spectrales. En revanche, le signal d’arrière-plan a été effectivement supprimé lorsqu’une bibliothèque spectrale à 6 composants plus complète (et appropriée) a été utilisée.

Utilisation d’une valeur seuil optimale pour générer un masque de cellule
Dans de nombreuses expériences que nous avons réalisées, l’intensité du signal de fond est d’environ 50 à 60 % de l’intensité du signal FRET présente dans les données d’image spectrale brutes (c’est-à-dire que lors de la visualisation de données d’image spectrale non traitées, le pic du signal FRET n’est que ~2X plus élevé que celui du signal d’arrière-plan environnant). Ainsi, la séparation du signal d’arrière-plan du signal de premier plan à l’aide d’une valeur seuil pour obtenir un masque binaire est une étape sensible et doit être effectuée avec soin afin d’éviter les artefacts d’analyse. La figure 10 illustre l’effet de différentes valeurs seuils appliquées à la segmentation cellulaire pour créer un masque binaire de la cellule. Une valeur seuil faible peut inclure un signal de fond dans le cadre de la cellule d’expression. D’autre part, une valeur seuil trop élevée peut empêcher la mesure de FRET dans des cellules à faible expression ou des régions d’une cellule avec un faible signal donneur + accepteur (soit des parties très minces de la cellule, soit des parties pouvant avoir une concentration régionale plus faible de la sonde FRET).

Sélection d’une cellule transfectée avec intensité du signal donneur + accepteur ≥ signal d’arrière-plan
La figure 11 illustre un exemple d’ensemble de données où les rendements FRET et les niveaux correspondants ont été mesurés à partir d’images non mélangées obtenues à l’aide d’une bibliothèque spectrale à 6 composants pour le démélange spectral linéaire. Malgré l’utilisation de la bibliothèque à 6 composants pour démixer les données d’image spectrale et la sélection d’un seuil élevé pour créer la bordure cellulaire et le masque nucléaire, les images d’efficacité FRET étaient toujours sujettes à un signal de bruit de fond élevé près du côté basal de la cellule. Dans ce cas, la présence d’un bruit de fond était due à la sélection d’une cellule qui n’exprimait que faiblement la sonde FRET, et la force du signal donneur + accepteur était approximativement égale à la force du signal de fond, même après le démélange. Ainsi, en plus d’appliquer les étapes d’analyse sophistiquées décrites ci-dessus, il est également important de sélectionner une cellule avec une expression suffisante de la sonde FRET et un signal FRET suffisant (signal donneur et accepteur au moins égal ou supérieur au signal de bruit) lors de l’acquisition afin d’assurer des résultats de haute qualité.

Figure 1 : Organigramme illustrant les étapes impliquées dans les mesures d’efficacité et de niveau FRET en trois dimensions spatiales à l’aide de l’imagerie et de l’analyse FRET hyperspectrales. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Visualisation en 3 dimensions d’une cellule exprimant le rapporteur FRET cAMP (vert) et les noyaux de la cellule et des cellules environnantes non exprimantes (rouge). Les données d’image spectrale brutes acquises à l’aide d’un microscope confocal spectral Nikon A1R ont été faussement colorées en fonction de la longueur d’onde et visualisées en 3 dimensions à l’aide du logiciel NIS Elements. A) Données d’image en 3 dimensions au départ et B) 10 minutes après un traitement à la forskoline de 50 μM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Construction d’une bibliothèque spectrale contenant les spectres purs des étiquettes fluorescentes dans l’étude (appelés membres finaux par le champ de télédétection). A) Image en fausses couleurs de cellules exprimant le biocapteur FRET acquis à une excitation de 405 nm (excitation du donneur). B) Spectre correspondant au signal FRET : 4 régions d’intérêt différentes (ROI) ont été dessinées sur l’image A représentées par des rectangles rouges, jaunes, bleus et verts. L’intensité moyenne à chaque longueur d’onde pour chaque retour sur investissement sélectionné a été exportée. L’intensité moyenne de ces 4 ROI a été tracée à chaque longueur d’onde d’émission. Les pics d’émission du spectre correspondent à la fois aux fluorophores donneurs (Turquoise) et accepteurs (Vénus). C) Image en fausses couleurs de cellules exprimant le biocapteur FRET acquis à une excitation de 488 nm (excitation de l’accepteur). D) Le spectre moyen a été estimé comme expliqué en B à partir de plusieurs ROI en C (les mêmes régions qu’en A) avec un pic d’émission dû uniquement à l’accepteur. E) Image en fausse couleur de cellules exprimant le biocapteur FRET acquis à une excitation de 405 nm après photodestruction du fluorophore accepteur par irradiation de 514 nm. F) Le spectre moyen a été estimé, comme expliqué en B, à partir de plusieurs ROI dans E (les mêmes régions que A) avec un pic d’émission dû uniquement au donneur. NOTEZ que l’intensité du donneur est augmentée en F par rapport à celle du signal FRET d’origine, ce qui indique qu’après photobiviation de l’accepteur, l’excitation du donneur conduit à une émission directe du donneur. G) Le spectre de l’accepteur tel que l’on pourrait s’y attendre s’il était obtenu en utilisant une excitation de 405 nm. Ceci a été estimé en utilisant les faits que les lasers d’excitation de 405 nm et 488 nm ont une réponse linéaire qui peut être caractérisée à l’aide d’un spectromètre et d’une sphère d’intégration(Figure supplémentaire 1)et le coefficient d’extinction dépendant de la longueur d’onde de Vénus. Par conséquent, le spectre de Vénus obtenu à une excitation de 488 nm peut être converti en spectre de Vénus qui serait attendu s’il était obtenu à une excitation de 405 nm H) Une image faussement colorée de cellules étiquetées avec l’étiquette nucléaire, DRAQ5. I) Le spectre moyen de plusieurs régions d’intérêt dans H. J) La bibliothèque spectrale résultante contenant les spectres purs normalisés du donneur et du DRAQ5 et le spectre corrigé de la longueur d’onde d’excitation de l’accepteur. Notez que les spectres turquoise et Vénus ont été normalisés à la valeur maximale des données spectrales combinées Turquoise + Vénus tandis que DRAQ5 a simplement été normalisé à l’unité à la valeur de la longueur d’onde d’émission maximale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Les signatures spectrales de fond ont été identifiées et incluses dans la bibliothèque spectrale pour tenir compte des signaux de fluorescence de fond pendant le processus de démélange. A, B) Deux signatures spectrales de fluorescence de fond ont été observées lors de la caractérisation d’un échantillon vierge (couvercle non étiqueté). Ces signatures spectrales ont été nommées en fonction de leurs longueurs d’onde maximales – l’une à 424 nm (à partir de la fluorescence coverslip) et l’autre à 504 nm (probablement à partir de la réflectance ou de la rétrodiffusion). C) Une troisième signature spectrale de fond a été observée avec une longueur d’onde d’émission maximale de 574 nm lorsque des cellules non marquées ont été analysées, potentiellement à partir de l’autofluorescence cellulaire ou de la fluorescence de la matrice sous-jacente. D) Spectres d’arrière-plan extraits des images A, B et C. Ces trois spectres de fond ont été ajoutés à la bibliothèque existante à 3 composants(Figure 3J)pour développer une bibliothèque spectrale à 6 composants. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Démélange spectral linéaire à l’aide d’une bibliothèque spectrale à 6 composants qui tient compte des signaux de fond. A) Données d’images spectrales brutes acquises sous la forme d’une pile z axiale. B) Bibliothèque spectrale à 6 composants utilisée pour démélanger linéairement les données spectrales brutes. C, D et E) Les images non mélangées en échelle de gris de DRAQ5, Turquoise et Vénus, respectivement, résultent d’un démélange spectral linéaire. F, G et H) Images non mélangées de fausses couleurs de DRAQ5, Turquoise et Vénus respectivement. Des images non mélangées de signaux d’arrière-plan ont également été calculées (les données ne sont pas présentées ici car seules les étiquettes fluorescentes présentent un intérêt pour cette méthodologie – voir la figure 4 dans Annamdevula, et al. pour des exemples de signaux de fond non mélangés²⁵). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Organigramme illustrant les étapes du calcul des niveaux de FRET et d’AMPc à partir de données d’images spectrales non mélangées. A) Image représentative non mélangée du donneur, Turquoise. B) Image représentative non mélangée de l’accepteur, Vénus. C) Image représentative non mélangée des noyaux, DRAQ5. D) Le masque de cellule binaire est généré en seuillant l’image sommée donneur + accepteur non mélangée. E) Un seuil est appliqué à l’image nucléaire pour créer un masque binaire du noyau. F) L’efficacité FRET en pixels a été calculée à partir d’images donneuses et acceptatrices non mélangées. G) Un masque binaire composite a été créé à partir de bordures cellulaires et de masques nucléaires. H) Image d’efficacité FRET masquée : un masque de cellule composite a été appliqué à l’image d’efficacité FRET pour exclure les signaux FRET non spécifiques à l’extérieur de la cellule et à l’intérieur du noyau. I) Une carte couleur a été appliquée à l’image d’efficacité FRET masquée pour mieux visualiser les changements spatiaux dans FRET. J) L’image des niveaux cAMP qui a été estimée à partir de l’image d’efficacité FRET. K) Colormap a été appliqué pour mieux visualiser les changements spatiaux dans l’AMPc. Les barres de couleur montrées sur le côté droit ont été utilisées pour visualiser l’efficacité FRET (panneau supérieur) et les niveaux cAMP (panneau inférieur). Les images présentées dans cette figure sont représentatives d’une seule tranche z axiale, mais l’opération d’analyse décrite dans cette figure est effectuée sur l’ensemble de la pile z axiale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Efficacité FRET induite par la forskoline et gradients spatiaux cAMP visualisés dans les PMVÉCs. Les images du plan XY ont été générées en resséchant des données d’image FRET et cAMP reconstruites en 3 dimensions dans la direction axiale (Z) du côté apical au côté basal de la cellule. Cinq tranches XY contiguës sont affichées. Les colonnes 1 et 3 représentent l’efficacité FRET au départ et 10 minutes après le traitement avec 50 μM de forskoline, respectivement. Les colonnes 2 et 4 indiquent les niveaux au départ et 10 minutes après le traitement à la forskoline. Les barres de couleur ont été utilisées pour relier les changements dans la carte de couleurs à l’efficacité FRET (en haut) et aux niveaux d’AMPc (en bas). Les lignes blanches montrées sur les images des colonnes 2 et 4 sont utilisées pour générer le profil d’intensité (profil de balayage de ligne) des signaux cAMP sur cette ligne sélectionnée. Le diagramme de profil d’intensité obtenu à partir de la tranche médiane de la cellule au départ (profil bleu) et après traitement à la forskoline (profil vert) montre la distribution spatiale des signaux cAMP à travers le balayage linéaire. La barre d’échelle indique 20 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.

Figure 8 : Efficacité FRET induite par la forskoline et gradients spatiaux cAMP visualisés dans la direction axiale. Les images planes YZ ont été générées en resséchant des données d’image FRET et cAMP reconstruites en 3 dimensions dans la direction latérale (X) (du côté gauche au côté droit de la cellule). Les colonnes 1 et 3 représentent l’efficacité FRET au départ et 10 minutes après un traitement à la forskoline de 50 μM, respectivement. Les colonnes 2 et 4 représentent les niveaux d’AMPc au départ et 10 minutes après le traitement par la forskoline. Les barres de couleur à droite ont été utilisées pour relier les changements dans la carte de couleurs à l’efficacité FRET (en haut) et aux niveaux cAMP (en bas). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9 : Comparaison de l’efficacité de l’utilisation d’une bibliothèque spectrale à 3 ou 6 composants pour calculer les images des niveaux FRET et cAMP. Des signaux de fond non spécifiques ont été observés dans des images calculées à l’aide d’une bibliothèque à 3 composants, qui ne tient pas compte des signatures spectrales d’arrière-plan. Cela était particulièrement vrai pour les images près de la face basale de la cellule après un traitement à la forskoline de 50 μM (colonne 2). En revanche, les artefacts de signal d’arrière-plan ont été efficacement supprimés lors de l’utilisation d’une bibliothèque à 6 composants qui comprenait des signatures spectrales d’arrière-plan, améliorant ainsi la capacité de segmenter la cellule et d’analyser les signaux FRET et cAMP. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 10 : Des artefacts d’analyse d’image peuvent être introduits si une valeur seuil appropriée n’est pas sélectionnée pour délimiter les bordures cellulaires et nucléaires. Des images non mélangées du donneur et de l’accepteur ont été utilisées pour créer un masque avec trois valeurs seuils différentes : 0,35 (colonnes 1 comme 2), 0,65 (colonnes 3 et 4) et 0,9 (colonnes 5 et 6). Les colonnes 1, 3 et 5 affichent l’efficacité FRET au départ. Les colonnes 2, 4 et 6 affichent l’efficacité FRET à 10 minutes après un traitement à la forskoline de 50 μM. La sélection d’un seuil trop bas a entraîné l’inclus dans des parties de l’arrière-plan, ou région extracellulaire, avec la cellule pour analyse, tandis que la sélection d’un seuil trop élevé a entraîné la perte d’une partie de la cellule (voir la tranche apicale dans les colonnes 4-5 par rapport aux colonnes 3-4). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 11 : Les artefacts de signal d’arrière-plan peuvent persister même après le démélange de l’arrière-plan et la sélection d’un seuil approprié lors de la création d’un masque binaire. La colonne 1 montre des tranches apicales, moyennes et basales représentatives au départ et la colonne 2 montre la même chose à 10 minutes après un traitement à la forskoline de 50 μM. Malgré l’utilisation d’une bibliothèque à 6 composants pour le démélange qui représentait les signaux de fond et l’utilisation d’un seuil plus élevé de 0,85 pour la génération de masques binaires, les régions d’arrière-plan ont toujours été identifiées comme faisant partie de la cellule, en particulier après un traitement à la forskoline. Si cela se produit, une explication possible peut être qu’une cellule avec une faible expression du rapporteur FRET a été sélectionnée pour l’imagerie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Mesures de l’intensité de la ligne laser en fonction du réglage laser dans le logiciel. Un spectromètre couplé à la fibre et une sphère d’intégration ont été calibrés sur une lampe traçable par le NIST pour mesurer l’intensité du laser pour la ligne laser 405 nm et la ligne laser 488 nm. A) Nombre total de photons mesurés au stade du microscope correspondant aux différentes intensités laser du laser 405 nm. B) Nombre total de photons mesurés au stade du microscope correspondant à différentes intensités laser de laser 488 nm. Une réponse linéaire en intensité laser a été observée pour les deux lasers telle que mesurée au stade du microscope. Une courbe de tendance linéaire a été ajustée et l’équation de la courbe de tendance pour chaque ligne laser a été utilisée pour calculer le spectre d’accepteur auquel on s’attendrait en cas d’excitation avec la ligne laser de 405 nm (excitation du donneur). Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 2 : Efficacité FRET induite par la forskoline et gradients spatiaux cAMP visualisés dans la direction axiale. Les images du plan XZ ont été générées en resséchant des données d’image FRET et cAMP reconstruites en 3 dimensions dans la direction latérale (Y) (de l’avant vers l’arrière de la cellule). Les colonnes 1 et 3 représentent l’efficacité FRET au départ et 10 minutes après un traitement à la forskoline de 50 μM, respectivement. Les colonnes 2 et 4 représentent les niveaux d’AMPc au départ et 10 minutes après le traitement par la forskoline. Les barres de couleur à droite ont été utilisées pour relier les changements dans la carte de couleurs à l’efficacité FRET (en haut) et aux niveaux cAMP (en bas). Semblable aux résultats présentés pour les plans YZ(figure 8),les gradients spatiaux apical à basal dans l’efficacité FRET et les niveaux d’AMPc peuvent être visualisés comme des changements de couleur du haut vers le bas d’une seule tranche YZ, à la fois dans les conditions initiales (toute tranche donnée dans les colonnes 1-2) et après un traitement à la forskoline de 50 μM (colonnes 3-4). Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

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Discussion

Le développement des biocapteurs FRET a permis la mesure et la visualisation des signaux nucléotidiques cycliques dans des cellules individuelles, et il existe de grandes promesses pour visualiser les événements de signalisation subcellulaire^13,22,37,38. Cependant, l’utilisation de biocapteurs FRET présente plusieurs limites, notamment les faibles caractéristiques signal-bruit de nombreux rapporteurs FRET à base de protéines fluorescentes et la faible efficacité de transfection ou d’expression des rapporteurs FRET (cela peut être particulièrement difficile dans certaines lignées cellulaires, telles que les PMVEC)^23,24. L’imagerie de protéines fluorescentes faiblement exprimées, combinée à des calculs FRET ratiométriques, entraîne souvent un degré élevé d’incertitude ou de fluctuation de l’efficacité FRET calculée. Dans le but d’améliorer la fiabilité des mesures FRET, nous et d’autres avons déjà démontré l’utilisation de l’imagerie et de l’analyse hyperspectrales pour mesurer les signaux FRET et pour réduire la diaphonie ou le saignement des signaux de fluorescence entre les étiquettes fluorescentes et les effets d’autofluorescence^26,31,32,39. En raison des limites de l’intensité du signal, ces études spectrales FRET étaient limitées à deux dimensions spatiales (X et Y) jusqu’à très récemment. Par conséquent, ils ont fourni une vue en une seule tranche des changements FRET dans une cellule.

Dans des études récentes, nous avons noté que FRET (et les niveaux d’AMPc correspondants) semblaient être répartis spatialement non seulement dans le plan XY, mais aussi sur les plans XZ et YZ^25. L’approche d’imagerie fret hyperspectrale décrite ici étend notre capacité à visualiser et à mesurer les changements FRET et nucléotidiques cycliques (AMPc) en trois dimensions spatiales, ouvrant de nouvelles possibilités pour évaluer la compartimentation du signal. Cette approche d’imagerie et d’analyse hyperspectrale en 4 dimensions (X, Y, Z et λ) permet de mesurer et de visualiser les gradients cAMP en trois dimensions spatiales tout en tenant compte des signaux de fond non uniformes. Ici, nous avons démontré comment mettre en œuvre cette approche à travers l’exemple des gradients spatiaux cAMP induits par la forskoline. Dans les données d’image post-traitement, des gradients spatiaux cAMP peuvent être observés du côté apical au côté basal de la cellule(Figure 7 et Figure 8). L’AMPc produite lors du traitement par la forskoline ne semblait pas atteindre les jonctions cellule-cellule(figure 7 et figure 8).

En utilisant la méthodologie décrite ici, il était important de tenir compte des différentes sources de signaux de fond et d’autofluorescence pour permettre une estimation précise de l’efficacité fret. Le démélange linéaire offre un moyen potentiel de comptabiliser des spectres de fond uniques, si leurs signatures sont différentes de celles des sondes fluorescentes d’intérêt. En particulier, le démélange linéaire est mieux adapté à la séparation des signaux de fond et d’autofluorescence que la soustraction de fond standard. ^40,41,42 Dans l’exemple présenté ici, trois signatures spectrales différentes ont été mesurées et se sont vu attribuer un nom basé sur la longueur d’onde d’émission maximale de la signature: le spectre de fond de 424 nm (éventuellement à partir de la fluorescence coverslip), le spectre de fond de 504 nm (probablement dû à la lumière réfléchie ou rétrodéposée) et le spectre de fond de 574 nm (peut-être dû à l’autofluorescence de la matrice cellulaire ou cellulaire). Pour illustrer les effets de l’absence de prise en compte de ces signatures, deux bibliothèques spectrales ont été créées et des images non mélangées ont été comparées. Tout d’abord, une bibliothèque spectrale contenant uniquement les étiquettes fluorescentes de l’échantillon, Turquoise, Vénus et DRAQ5, a été créée et étiquetée la bibliothèque à 3 composants. Deuxièmement, une bibliothèque spectrale qui contenait en outre les trois signatures spectrales d’arrière-plan a été créée et étiquetée la bibliothèque à 6 composants. Comme indiqué ci-dessus, le démélange avec la bibliothèque à 6 composants (démixage en arrière-plan) a permis de supprimer les signaux d’arrière-plan, alors que le démélange avec la bibliothèque à 3 composants ne l’a pas fait (Figure 9). Dans des travaux antérieurs, nous avons montré que l’erreur quadragénaire moyenne racine (RMSE) associée au démélange linéaire est diminuée lors de l’utilisation d’une bibliothèque spectrale qui tient compte à la fois des étiquettes fluorescentes et des signatures d’arrière-plan. Il convient de noter que la distribution axiale de la fluorescence de fond est souvent non uniforme et que, par conséquent, une simple soustraction d’arrière-plan ne fonctionnera pas pour corriger les données d’image. Ainsi, l’approche de démélange spectrale est nécessaire pour fournir une élimination précise de l’arrière-plan et des mesures FRET fiables.

Il est important d’optimiser les paramètres du système pour sélectionner les meilleurs paramètres possibles du système et de la caméra lors de l’acquisition d’images spectrales. L’objectif global devrait être d’optimiser le SNR tout en minimisant le temps d’acquisition et en prévenant le photobleachage. ^{43 Ainsi,} lors de l’optimisation d’un système d’imagerie, un compromis entre les résolutions spatiales, temporelles et spectrales est souvent nécessaire. Dans ces études, des valeurs optimales ont été sélectionnées pour les paramètres du système et de la caméra, y compris la taille du sténopé, la puissance du laser, la vitesse de balayage, la taille de balayage et la moyenne des images, comme décrit dans la section du protocole. En utilisant ces paramètres, l’échantillonnage spatial de 80 nm / pixel, l’échantillonnage temporel d’environ 3 minutes par pile z spectrale (~ 10 secondes / image XY) et l’échantillonnage spectral d’un intervalle de 10 nm sont obtenus avec un photobleaching négligeable ou minimal.

Pour assurer des estimations précises de l’efficacité FRET, il est nécessaire de mesurer les spectres donneur et accepteur comme on pourrait s’y attendre avec une stœchiométrie 1:1 et des longueurs d’onde d’excitation identiques (Figure 3). Les spectres de turquoise et de Vénus ont été normalisés par rapport à la longueur d’onde d’émission maximale de turquoise. L’efficacité FRET qui a été estimée à l’aide de cette bibliothèque spectrale a produit des valeurs similaires à celles rapportées dans la littérature^12,22. En règle générale, les spectres des membres finaux de la bibliothèque sont normalisés en unité. Cependant, pour calculer avec précision l’efficacité FRET, le spectre accepteur doit être acquis par rapport au spectre donneur (c.-à-d. à concentration équinomolaire ou stœchiométrie 1:1 et référencé à la même longueur d’onde d’excitation). En plus de l’utilisation d’une bibliothèque correctement construite, plusieurs étapes sont impliquées dans l’estimation appropriée de l’efficacité FRET et l’évitement des artefacts d’analyse. Il s’agit notamment de sélectionner une cellule d’expression avec une intensité de signal adéquate(Figure 11),de lisser les images non mélangées avant d’estimer l’efficacité FRET (le flou gaussien a été appliqué dans cet exemple), d’utiliser une valeur seuil appropriée pour créer le masque(Figure 10)et d’estimer un facteur de correction à l’aide des coefficients d’extinction du donneur et de l’accepteur (Bibliothèque File_Spectral supplémentaire). Lorsque ces étapes sont suivies, les distributions en 3 dimensions de l’efficacité FRET et des niveaux cAMP sous-jacents peuvent être visualisées avec précision dans des cellules individuelles.

Les signaux cAMP localisés ont été estimés en dimensions 2-spatiales à l’aide de biocapteurs FRET ciblés^13,37. Cependant, le ciblage des sondes FRET sur des compartiments subcellulaires spécifiques (par exemple, la membrane plasmique ou les radeaux lipidiques) entraîne généralement une augmentation de la concentration locale de la sonde. Cela peut entraîner l’introduction d’artefacts de mesure en raison de FRET intermoléculaires ou bimoléculaires. De plus, les résultats présentés ici et dans Annamdevula et.al., 2018, Cytometry A²⁵ démontrent l’importance des mesures en 3 dimensions du FRET à partir de sondes solubles ou ciblées.

Malgré l’importance de mesurer les signaux cAMP dans trois dimensions spatiales, cette approche présente également des limites. La limitation la plus restrictive est le long temps d’acquisition requis – environ 3 minutes par pile z spectrale. Ce taux d’acquisition empêche l’utilisation de cette approche pour détecter autre chose que des distributions d’AMPc à l’état quasi stable dans les cellules. Cela dit, les résultats présentés démontrent l’importance d’inclure des mesures d’AMPc quasi-stables à 3 dimensions (x, y, z) en tant que compléments critiques aux mesures standard à 2 dimensions (x, y). À l’avenir, il sera intéressant d’incorporer des protéines et des structures cellulaires étiquetées dans la conception expérimentale. Un choix judicieux des fluorophores utilisés pour étiqueter les protéines (et/ou les structures) permettrait d’évaluer les distributions en 3 dimensions des protéines étiquetées et du FRET sans perte supplémentaire de vitesse d’acquisition. Cela permettrait à son tour de mesurer les signaux cAMP localisés et les signaux cAMP à proximité des protéines étiquetées dans trois dimensions spatiales, offrant ainsi un complément expérimental important aux sondes cAMP ciblées et élargissant encore l’utilité des mesures hyperspectrales des distributions cAMP en 3 dimensions dans les cellules vivantes.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Attofluor Cell Chamber	Invitrogen	A7816	Attofluor contains steel cell chambers and a rubber O-ring. Cell chamber holds the coverslip and O-ring provides a lock in mechanism to hold the buffer in cell chamber with out leakage
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100	Solvent used to prepare stock solution forskolin.
DRAQ5 Fluoroscent Probe Solution	Thermo Scientific	62252	Nuclear label
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-092	Contains nutrients and growth factors for the cells to grow and divide in the culture dishes.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	F6178	Growth factor suppliment that is added to culture medium, DMEM
Forskolin	Sigma	F3917	Adenyly cyclase activator.
H188 Cyclic AMP FRET biosensor	Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink	Gift	Plasmid encoding Turquoise (donor fluorophore), Venus (acceptor fluorophore), and binding domain obtained from Epac.
Image J	image.net	Free download	Another image processing platform used to extact spectral information and image processing.
Integrating Sphere	Ocean Optics	FOIS-1	Used to measure illumination intensity of the laser line at different laser intensities (?).
Laminin Mouse Protein, Natural	Invitrogen	23017-015	Coverslips are coated with laminin and this helps in cell attachment, growth and motility of the cell.
Lipofectamine 3000 Transfection Kit	Invitrogen	L3000-015	Transfection reagent used to transfect cells with H188 FRET biosensor
MATLAB	Mathworks	R2019a	Image processing operations (linear unmixing and FRET efficiency calculations) are performed by writing custom programs in MATLAB programming environment
Nikon A1R confocal microscope	Nikon Instruments	Nikon A1R	Spectral image acquisition is performed using confocal microscope.
Nikon Elements Software	Nikon Instruments	Software dongle	used to export and handle nd2 image files (multidimensional image files) that are aquired using Nikon A1R
NIST-Traceable Calibration Lamp	Ocean Optics	LS-1-CAL-INT	A lamp with a known spectrum for use as a standard
PBS pH 7.4 (1X)	Gibco	10010-023	coomonly used buffer suring cell culture
Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs)	In house - Cell culture core, Univeristy of South Alabama	Isolated from Rat pulmonary microvasculature	PMVECs form inner lining of a blood vessel.
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122	antibiotics are added to culture medum to prevent contamination of the cells.
Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides	Clay Adams	3010	Microscope slides used for cell fixation
ProLong Diamond Antifade Mounting Media	Invitrogen	P36961	If samples are fixed using antifade mountant, then the later protects fluoroscent dyes and chromophores from fading.
Spectrometer	Ocean Optics	QE65000	Used to measure spectral response of the light source (?)
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200-056	Digests the protein-protein bond between the cell and cell matrix and helps to disscociate and lift the cells during cell plating.
Tyrodes Buffer	Made in-house	Made in-house	Tyrodes buffer is used to make working solutions and to maintain cells in aqueous solution during image acquisition.
6 Well Cell Culture Plate	Corning	3506	Laminin coated coverslips are placed in 6-well culture dish (one coverlisps/well). Cells along with medium is added into each well.
25 mm Round Microscope Cover Slips	Fisher Scientific	12545102	Cells were grown on round glass coverslips
60X Ojective	Nikon Instruments	Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27	water immersion and commonly used objective for cells