Biology

Misurazione di distribuzioni cAMP tridimensionali in cellule viventi utilizzando imaging e analisi FRET iperspettrale a 4 dimensioni (x, y, z e λ)

Published: October 27, 2020 doi: 10.3791/61720

Naga S. Annamdevula^1,2, Rachel Sweat³, Hayden Gunn¹, John R. Griswold³, Andrea L. Britain^1,2, Thomas C. Rich^1,2, Silas J. Leavesley^1,2,3

¹Department of Pharmacology, University of South Alabama, ²Center for Lung Biology, University of South Alabama, ³Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama

Summary

A causa del basso rapporto segnale-rumore (SNR) dei sensori basati sul trasferimento di energia di risonanza Fӧrster (FRET), la misurazione dei segnali cAMP è stata impegnativa, specialmente in tre dimensioni spaziali. Qui, descriviamo una metodologia di imaging e analisi FRET iperspettrale che consente la misurazione della distribuzione cAMP in tre dimensioni spaziali.

Abstract

L'AMP ciclico è un secondo messaggero che è coinvolto in una vasta gamma di attività cellulari e fisiologiche. Diversi studi suggeriscono che i segnali cAMP sono compartimentati e che la compartimentazione contribuisce alla specificità della segnalazione all'interno della via di segnalazione cAMP. Lo sviluppo di biosensori basati sul trasferimento di energia di risonanza Fӧrster (FRET) ha favorito la capacità di misurare e visualizzare i segnali cAMP nelle cellule. Tuttavia, queste misurazioni sono spesso limitate a due dimensioni spaziali, il che può comportare un'interpretazione errata dei dati. Ad oggi, ci sono state solo misurazioni molto limitate dei segnali cAMP in tre dimensioni spaziali (x, y e z), a causa delle limitazioni tecniche nell'utilizzo dei sensori FRET che mostrano intrinsecamente un basso rapporto segnale/rumore (SNR). Inoltre, i tradizionali approcci di imaging basati su filtri sono spesso inefficaci per la misurazione accurata dei segnali cAMP nelle regioni subcellulari localizzate a causa di una serie di fattori, tra cui la diafonia spettrale, la potenza limitata del segnale e l'autofluorescenza. Per superare queste limitazioni e consentire l'utilizzo di biosensori basati su FRET con più fluorofori, abbiamo sviluppato approcci di imaging e analisi FRET iperspettrali che forniscono specificità spettrale per il calcolo delle efficienze FRET e la capacità di separare spettralmente i segnali FRET dall'autofluorescenza confondente e / o segnali da etichette fluorescenti aggiuntive. Qui, presentiamo la metodologia per l'implementazione dell'imaging FRET iperspettrale e la necessità di costruire una libreria spettrale appropriata che non sia né sottocampionata né sovracampionata per eseguire l'unmixing spettrale. Mentre presentiamo questa metodologia per la misurazione delle distribuzioni tridimensionali di cAMP nelle cellule endoteliali microvascolari polmonari (PMVEC), questa metodologia potrebbe essere utilizzata per studiare le distribuzioni spaziali di cAMP in una gamma di tipi di cellule.

Introduction

L'adenosina monofosfato ciclico (cAMP) è un secondo messaggero coinvolto nei principali processi cellulari e fisiologici tra cui la divisione cellulare, l'afflusso di calcio, la trascrizione genica e la trasduzione del segnale. Un numero crescente di prove suggerisce l'esistenza di compartimenti cAMP nella cellula attraverso i quali si raggiunge la specificità di segnalazione^1,^2,^3,^4,^5,^6,^7. Fino a poco tempo fa, la compartimentazione cAMP era dedotta sulla base di distinti effetti fisiologici o cellulari indotti da diversi agonisti del recettore accoppiato G⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹. Più recentemente, le sonde di imaging a fluorescenza basate su FRET hanno fornito nuovi approcci per la misurazione diretta e l'osservazione dei segnali cAMP in una cella^12,^13,^14.

Il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) è un fenomeno fisico in cui il trasferimento di energia avviene tra molecole donatrici e accettori in modo non radiativo quando le molecole sono in prossimità¹⁵^,¹⁶. Con lo sviluppo di indicatori fluorescenti basati su FRET, questo fenomeno fisico è stato utilizzato in applicazioni biologiche per studiare le interazioni proteina-proteina¹⁷, co-localizzazione proteica¹⁸, Ca⁺² segnalazione¹⁹, espressione^{genica 20}, divisione cellulare²¹ e segnalazione nucleotidica ciclica. Gli indicatori cAMP basati su FRET sono tipicamente costituiti da un dominio di legame cAMP, un fluoroforo donatore e un fluoroforo accettore²². Ad esempio, il sensore H188 cAMP¹²^,²² utilizzato in questa metodologia è costituito da un dominio di legame cAMP ottenuto da Epac, inserito tra fluorofori Turchese (donatore) e Venere (accettore). In condizioni basali (non legate), Turchese e Venere sono in un orientamento tale che FRET si verifica tra i fluorofori. Al momento del legame di cAMP al dominio di legame, si verifica un cambiamento conformazionale tale che Turchese e Venere si allontanano con conseguente diminuzione di FRET.

Gli approcci di imaging basati su FRET offrono uno strumento promettente per indagare e visualizzare i segnali cAMP all'interno di una cellula. Tuttavia, le attuali tecniche di imaging microscopico basate su FRET hanno spesso solo parzialmente successo nel raggiungere una potenza del segnale sufficiente per misurare FRET con chiarezza spaziale subcellulare. Ciò è dovuto a diversi fattori, tra cui la limitata potenza del segnale di molti reporter FRET, l'alto livello di precisione richiesto per quantificare con precisione i cambiamenti nell'efficienza FRET e la presenza di fattori confondenti, come l'autofluorescenza cellulare²³^,²⁴. Il risultato è spesso un'immagine FRET che è afflitta da SNR debole, rendendo molto difficile la visualizzazione dei cambiamenti subcellulari in FRET. Inoltre, lo studio dei segnali cAMP localizzati spazialmente è stato eseguito quasi esclusivamente in due sole dimensioni spaziali e la distribuzione assiale cAMP è stata raramente^{considerata 25}. Ciò è probabilmente dovuto al fatto che un basso SNR ha impedito la capacità di misurare e visualizzare i gradienti cAMP in tre dimensioni spaziali. Per superare i limiti dell'utilizzo di sensori FRET con basso SNR, abbiamo implementato approcci di imaging e analisi iperspettrali per misurare FRET in singole celle^25,^26,^27.

Gli approcci di imaging iperspettrale sono stati sviluppati dalla NASA per differenziare gli oggetti terrestri presenti nelle immagini^satellitari^28,^29. Da allora queste tecniche sono state tradotte nel campo di microscopia a fluorescenza³⁰, con diversi sistemi di microscopio confocale commerciali che offrono rivelatori spettrali. Nell'imaging a fluorescenza tradizionale (non spettrale), il campione viene eccitato utilizzando un filtro passa-banda o una linea laser e l'emissione viene raccolta utilizzando un secondo filtro passa-banda, spesso selezionato per corrispondere alla lunghezza d'onda di emissione di picco del fluoroforo (s). Al contrario, gli approcci di imaging iperspettrale cercano di campionare un profilo spettrale completo dell'emissione di fluorescenza²⁶^,³¹^,³² o dell'eccitazione³³^,³⁴ a specifici intervalli di lunghezza d'onda. Nei nostri studi precedenti, abbiamo dimostrato che gli approcci di imaging e analisi iperspettrali possono offrire una migliore quantificazione dei segnali FRET nelle cellule rispetto alle tradizionali tecniche di imaging FRET basate su filtro²⁶. Qui presentiamo una metodologia per l'esecuzione di imaging e analisi FRET iperspettrali 4-dimensionali (x, y, z e λ) per misurare e visualizzare le distribuzioni cAMP in tre dimensioni spaziali. Questi approcci hanno permesso la visualizzazione di gradienti spaziali cAMP indotti da agonisti in singole cellule²⁵. È interessante notare che, a seconda dell'agonista, i gradienti cAMP possono essere evidenti nelle cellule. La metodologia qui presentata utilizza l'unmixing spettrale di fondo non uniforme e l'autofluorescenza cellulare per migliorare l'accuratezza delle misurazioni FRET. Mentre questa metodologia è dimostrata nelle cellule endoteliali microvascolari polmonari (PMVEC) utilizzando un biosensore cAMP FRET, la metodologia potrebbe essere facilmente modificata per l'uso con reporter FRET alternativi o linee cellulari alternative.

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Protocol

Questo protocollo segue le procedure approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della University of South Alabama.

1. Preparazione di cellule, campioni e reagenti per l'imaging

Isolare le cellule endoteliali microvascolari polmonari di ratto (PMVEC) come descritto in precedenza³⁵.
NOTA: Le cellule sono state isolate e coltivate dal Cell Culture Core presso la University of South Alabama, Mobile, AL su piatti di coltura cellulare da 100 mm.
Semina PMVEC isolati su coperture di vetro rotonde da 25 mm e lasciale crescere nell'incubatrice a 37 °C fino a quando le cellule raggiungono almeno l'80% di confluenza (almeno 24 ore).
NOTA: Le cellule e il tipo di cellula possono variare da studio a studio e quindi le procedure di coltura cellulare specifiche delle cellule devono essere seguite per seminare e far crescere le cellule. Il protocollo di semina e coltura cellulare utilizzato in questi studi è disponibile come informazione supplementare nel file denominato "Supplemental File_Cell Culture and Transfection".
Trasfettate le PMVEC con un biosensore FRET e incubate per 48 ore a 37 °C.
NOTA: il protocollo per trasfezionare le PMVEC è descritto anche nel file di informazioni supplementari denominato "Supplemental File_Cell Culture and Transfection".
Il giorno dell'imaging, riscaldare il tampone di Tyrode a 37 °C a bagnomaria.
NOTA: il tampone di Tyrode è costituito da 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM Glucosio, 1 mM MgCl₂ e 1 mM CaCl₂
Montare un coperchio contenente celle trasfettate in una camera cellulare e fissare la parte superiore con una guarnizione di montaggio per evitare perdite.
Pulire il fondo della coverslip utilizzando una delicata pulizia per pulire eventuali supporti in eccesso o cellule aderenti.
Aggiungere 800 μL di tampone di lavoro e 4 μL di etichetta nucleare da 5 mM alla camera cellulare e oscillare delicatamente per 5 – 10 secondi.
NOTA: Quando si aggiungono soluzioni tampone o reagenti a coverslip montati nella camera cellulare, assicurarsi di aggiungere la soluzione delicatamente e sul lato della camera cellulare in modo da non rimuovere le cellule aderenti. L'aggiunta di 4 μL di etichetta nucleare da 5 mM a 800 μL di tampone produce una concentrazione finale di 25 μM di etichetta nucleare. Per le cellule vagamente aderenti come le cellule HEK293, mescolare prima l'etichetta nucleare e il tampone in una fiala e quindi aggiungere ai coverslip montati nella camera cellulare. Ciò impedirà di sollevare le cellule dal coverslip.
Coprire la camera cellulare con un foglio di alluminio per proteggerla dalla luce e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
Preparazione del reagente: aggiungere 1 μL di forskolina da 50 mM a 199 μL di tampone. Ciò produrrà una concentrazione finale di forskolina di 50 μM quando aggiunta a cellule preparate con 800 μL di tampone. 1 μL di DMSO in 199 μL di tampone dovrebbero anche essere preparati per essere utilizzati come controllo del veicolo.
NOTA: In questi studi, forskolin è usato come attivatore dell'adenilil ciclasi per stimolare la produzione di cAMP. Se lo si desidera, questa metodologia può essere facilmente modificata per consentire il trattamento con reagenti alternativi per stimolare o inibire l'adenilil ciclasi, le fosfodiesterasi, ecc.

2. Acquisizione di immagini

Utilizzare un microscopio confocale dotato di un rilevatore spettrale.
NOTA: Tutte le fasi di acquisizione delle immagini qui descritte sono state sviluppate utilizzando un sistema di microscopi Nikon A1R disponibile in commercio. Questi passaggi potrebbero dover essere regolati se si utilizza un microscopio spettrale alternativo. Assicurarsi che tutte le apparecchiature siano accese almeno 30 minuti prima dell'inizio dell'esperimento in modo da raggiungere condizioni operative stabili.
Selezionare l'obiettivo di immersione in acqua 60x e aggiungere una goccia d'acqua all'obiettivo.
NOTA: per l'imaging di cellule vive ad alta risoluzione, si consiglia di utilizzare un obiettivo ad alta apertura numerica. Si prega di fare riferimento all'elenco dei materiali per informazioni sull'obiettivo utilizzato in questi studi.
Posizionare la camera cellulare caricata (dal punto 1.7) sullo stadio del microscopio.
Selezionare il set di filtri DFT (DAPI/FITC/TRITC) regolando la manopola del filtro sul lato destro del microscopio.
Azionare il microscopio in modalità widefield a fluorescenza utilizzando gli oculari per selezionare un campo visivo contenente le cellule che esprimono il sensore cAMP FRET.
NOTA: Assicurarsi che l'intensità media del segnale FRET alla lunghezza d'onda di picco dell'emissione del donatore o dell'accettore nella cella selezionata sia di almeno 100 unità di intensità (U.A.) o almeno 4 volte il segnale di base di una regione senza cellule che esprimono. Ciò può essere confermato utilizzando il visualizzatore di profili di spettro disponibile nel software NIS Elements. Quando si cerca una cellula con un buon segnale, è consigliabile scartare le cellule eccessivamente luminose (potrebbero essere compromesse).
Apri il software NIS, passa alla modalità confocale, sblocca il pulsante di interblocco laser e fai clic su Live.
Utilizzare la manopola di messa a fuoco per mettere a fuoco le celle guardando l'anteprima sullo schermo.
Configurare le impostazioni del dispositivo, dell'acquisizione e dello z-stack nel software, come descritto di seguito.
Impostazioni di acquisizione:
NOTA: le impostazioni di acquisizione della fotocamera e del dispositivo possono essere applicate utilizzando un'immagine acquisita in precedenza. Apri l'immagine, fai clic con il pulsante destro del mouse e seleziona Riutilizza impostazioni fotocamera.
1. Aprire il menu delle impostazioni A1, selezionare le caselle corrispondenti alle linee laser a 405 nm e 561 nm, selezionare SD per il rilevatore spettrale, selezionare 10 per la risoluzione e 31 per i canali.
  NOTA: il menu delle impostazioni A1 viene visualizzato come una piccola icona a forma di ingranaggio nell'angolo in alto a sinistra della finestra Impostazioni A1 Plus. Il laser a 405 nm viene utilizzato per l'eccitazione del donatore e il laser a 561 nm viene utilizzato per l'eccitazione dell'etichetta nucleare.
2. Impostare l'intervallo di lunghezze d'onda (410 – 730 nm) selezionando i valori di lunghezza d'onda iniziale e finale.
3. Fare clic sull'icona di binning/skip nel menu delle impostazioni di A1 e selezionare la casella numerato 15, quindi fare clic su OK nel menu delle impostazioni A1.
  NOTA: questo per rimuovere il canale di lunghezza d'onda che corrisponde al laser di eccitazione a 561 nm (questo è in genere il canale di lunghezza d'onda^15th). È importante non utilizzare questa banda di lunghezza d'onda per evitare un segnale artificialmente basso, che può creare un artefatto spettrale. Il segnale è più basso in questa banda a causa del dito meccanico che copre l'elemento del rilevatore per proteggerlo dai danni del laser.
4. Impostare le intensità del laser su 8% e 2% per i laser da 405 nm e 561 nm, rispettivamente, Si Hv (guadagno del rivelatore) a 149 e un raggio stenopeico di 2,4 unità disco arioso (AU).
  NOTA: potrebbe essere necessario regolare le intensità del laser in base all'età dello strumento e alle condizioni dei laser. Se si regolano le intensità del laser tra diversi campioni o gruppi sperimentali, è importante mantenere lo stesso rapporto di intensità laser (ad esempio, 8:2). Inoltre, è importante selezionare un'intensità laser che non sia così luminosa da creare un rapido fotoscilazione. Il guadagno del rilevatore deve essere regolato per massimizzare l'intensità del segnale riducendo al minimo il rumore del rilevatore. Per questi studi, è stato utilizzato un guadagno di 149. È stata selezionata una dimensione stenopeica di 2,4 UA come equilibrio tra l'acquisizione di immagini con un rapporto segnale/rumore (SNR) sufficiente e il mantenimento del sezionamento ottico (confocalità). Un aumento delle dimensioni del foro stenopeico aumenta l'SNR ma diminuisce la confocalità.
5. Impostare la velocità di scansione su 0,25 fotogrammi spettrali al secondo, selezionare l'icona corrispondente a unidirezionale per la direzione di scansione, immettere 4 per il conteggio e impostare 1024 x 1024 per le dimensioni della scansione.
  NOTA: i segnali FRET sono deboli e spesso è necessaria una velocità di scansione lenta. Utilizzando una velocità di scansione di 0,25, l'acquisizione di uno z-stack spettrale viene completata in ~ 3 minuti. La velocità di scansione può essere aumentata o diminuita a seconda dei fluorofori utilizzati. Ad esempio, per fluorofori più luminosi come eGFP, è possibile utilizzare una velocità di scansione più elevata (2 fotogrammi / secondo). Il numero inserito sotto conteggio corrisponde a un valore medio di fotogramma di 4, che aiuta a ridurre il rumore durante l'acquisizione dell'immagine. Per campioni molto stabili e dove il tempo non è un vincolo, è possibile utilizzare valori medi più elevati (fino a 16) per ottenere immagini con SNR migliorato.
Definire i parametri di acquisizione z-stack:
NOTA: i valori immessi nei passaggi 2.10 potrebbero dover essere regolati per adattarsi ai cambiamenti nel legame o nella concentrazione dell'etichetta fluorescente, nel tipo di etichetta, nel numero di etichette utilizzate, nella linea cellulare e in altri cambiamenti nella preparazione del campione che possono influire sulla densità di etichettatura cellulare e/o sull'autofluorescenza cellulare. Quando si regolano i parametri di acquisizione, è necessario prestare attenzione per ottenere un SNR sufficiente riducendo al minimo il fotosableching. Inoltre, quando si configura un test FRET spettrale, è necessario prestare attenzione per garantire che i parametri funzionino bene in tutti i gruppi di trattamento. Si consiglia di eseguire una prova di ciascun gruppo di trattamento con le impostazioni dei parametri proposte per garantire che l'SNR sia sufficiente e che il fotosableaching sia ridotto al minimo.
1. Aprire la finestra di acquisizione ND facendo clic su Visualizza → controllo acquisizione → acquisizione ND.
2. Immettere il percorso/destinazione e un nome file per salvare il file ND nella finestra popup.
3. Selezionare la casella corrispondente alla serie z.
4. Fare clic su live nella finestra Impostazioni A1 Plus. Si aprirà una finestra di visualizzazione dal vivo.
5. Regolare la manopola di messa a fuoco sul microscopio per selezionare la parte superiore della cella e fare clic su Superiore nella finestra di acquisizione ND per impostare la posizione corrente come parte superiore.
  NOTA: si consiglia di mettere a fuoco leggermente sopra la parte superiore della cella per assicurarsi che tutta la cella sia campionata nella serie z.
6. Regolare la manopola di messa a fuoco sul microscopio per selezionare la parte inferiore della cella e fare clic su Inferiore nella finestra di acquisizione ND per impostare la posizione corrente come inferiore.
  NOTA: mettere a fuoco leggermente al di sotto della parte inferiore della cella per assicurarsi che tutta la cella venga campionata.
7. Immettere 1 μm per la dimensione del passo, selezionare in alto in basso per la direzione z-scan e fare clic su Esegui nella finestra acquisizione ND per acquisire uno z-stack.
  NOTA: la dimensione del passo determina il numero di fette z che verranno acquisite in base alle posizioni superiore e inferiore (ovvero la distanza percorsa). È stata selezionata una dimensione del passo di 1 μm come compromesso tra velocità di imaging, campionamento dell'asse z e fotosaguviazione. Utilizzando il diametro del foro stenopeico confocale di 2,4 UA e l'obiettivo di immersione in acqua 60x ha portato a uno spessore della sezione ottica di 1,73 μm. Quindi, una dimensione del passo di 1 μm è leggermente inferiore ai criteri di campionamento di Nyquist, ma questo è un compromesso che è stato fatto per ridurre il tempo necessario per acquisire uno z-stack. Per campioni molto stabili, per i quali la velocità non è critica, è possibile utilizzare un passo dell'asse Z più piccolo e possibilmente un diametro del foro stenopeico confocale più piccolo per aumentare la risoluzione dell'asse z. Bottom-top dovrebbe produrre risultati simili e può essere utilizzato per valutare eventuali effetti del fotosciviazione che possono verificarsi durante la scansione z.
Configurare il Perfect Focus System (PFS), se disponibile:
NOTA: PFS consente al sistema di compensare le fluttuazioni della profondità focale durante l'acquisizione dell'immagine. I seguenti passaggi possono essere utilizzati per configurare PFS e questi passaggi possono variare leggermente a seconda della versione della Nikon A1R e della versione di NIS Elements utilizzata.
1. Evidenziare la modalità simmetrica definita dall'icona dell'intervallo nella finestra di acquisizione ND.
2. Accendere il pulsante PFS sulla faccia anteriore del microscopio (assicurarsi che la manopola dello specchio dicroico situata nella sezione sotto lo stadio del campione sia "in").
3. Ridefinite la parte superiore (ruotare in senso antiorario) e inferiore (ruotare in senso orario) utilizzando la manopola sulla faccia anteriore del controller offset PFS.
4. Definite una posizione z/profondità z relativa facendo clic su 'relativo' nella finestra di acquisizione ND.
5. Fare clic sulla memoria sulla faccia anteriore del microscopio in modo che il software memorizzi la profondità z relativa.
Al termine dell'acquisizione z-stack, aggiungere delicatamente il reagente desiderato (forskolin o controllo del veicolo) utilizzando una pipetta e attendere 10 minuti.
NOTA: Aggiungere il reagente molto delicatamente in modo da non disturbare le cellule o spostare la posizione della camera cellulare all'interno dello stadio XY del microscopio; è utile verificare in una successiva vista dal vivo o immagine che il campo visivo non si sia spostato durante l'aggiunta del reagente. Il tempo di attesa di 10 minuti è per il trattamento forskolin per avere effetto. Se viene utilizzato un trattamento alternativo, potrebbe essere necessario regolare il tempo di attesa.
Dopo 10 minuti, modificare il nome del file e fare clic su Esegui nella finestra di acquisizione ND.
Ripetere i passaggi 2.11 – 2.13 come descritto sopra per almeno 5 coverslips in modo da ottenere risultati sufficienti per l'analisi statistica (n = 5 per ciascun gruppo di trattamento - forskolin e controllo del veicolo).
Preparare campioni e campioni grezzi per costruire la libreria spettrale e acquisire immagini spettrali utilizzando impostazioni di acquisizione simili a quanto descritto nei passaggi 2.9 e 2.10.

3. Analisi delle immagini

NOTA: Queste immagini saranno utilizzate per costruire una libreria spettrale contenente gli spettri puri di tutti i singoli membri finali presenti nello studio. I membri finali nella libreria spettrale potrebbero variare da studio a studio se vengono utilizzati fluorofori diversi. Una procedura dettagliata per costruire la libreria spettrale è fornita in un file di informazioni supplementari denominato "Supplemental File_Spectral Library". Qui, descriviamo l'esportazione dei dati in file .tiff, l'unmixing spettrale lineare, le misurazioni dell'efficienza FRET, la ricostruzione tridimensionale e la stima dei livelli cAMP. L'analisi delle immagini può essere eseguita utilizzando diverse piattaforme di analisi e programmazione delle immagini come ImageJ, Python, MATLAB o CellProfiler. In questi studi sono stati utilizzati script MATLAB.

Esporta i dati dell'immagine:
1. Creare nuove cartelle con lo stesso nome file corrispondente alle immagini spettrali z-stack acquisite nei passaggi 2.13 e 2.14.
  NOTA: i seguenti passaggi descritti per esportare i dati sono specifici per NIS Elements AR versione 4.30.01. Questi passaggi possono variare leggermente a seconda della versione del software.
2. Fare clic su File, che aprirà una finestra di file. Sfogliate e selezionate il file di immagine spettrale acquisito nel passaggio 2.12 e fate clic su Apri.
3. Una volta caricato il file, fare clic su File→ Importa/Esporta→ Esporta documento ND.
4. Nella finestra popup: sfoglia e seleziona la cartella creata nel passaggio 3.1.1, seleziona Formato immagine con tag (TIF) per Tipo di file, quindi seleziona Immagine mono per ciascun canale e Mantieni profondità di bit.
  NOTA: il prefisso File verrà pregenerato; modificare questo valore per comodità. L'ordine dell'indice cambierà a seconda dei canali selezionati e dovrebbe visualizzare "z, c" per l'indicizzazione in base alla posizione z-slice prima e al numero di banda di lunghezza d'onda secondo. Assicurarsi che le caselle corrispondenti a Applica LUT o Inserisci sovrapposizioni o Usa nomi punto siano deselezionate.
5. Fare clic su Esporta per esportare i file tiff in una cartella di destinazione come singoli file tiff.
6. Ripetere i passaggi 3.1.2 – 3.1.5 per esportare i file di immagine spettrale acquisiti nel passaggio 2.13.
Unmixing spettrale lineare:
1. Aprire il software di programmazione.
  NOTA: lo script di programmazione sviluppato su misura per unmix di immagini spettrali grezze è fornito sul sito Web BioImaging e BioSystems della University of South Alabama, nella scheda Risorse (https://www.southalabama.edu/centers/bioimaging/resources.html).
2. Apri il file etichettato "Linear Unmixing.m" e fai clic sul pulsante Esegui nella barra degli strumenti dell'editor.
3. Sfoglia e seleziona la cartella contenente la sequenza di file *.tif esportata generata dal software NIS Elements.
4. Fare clic su OK per continuare, che aprirà una nuova finestra chiamata Lunghezza d'onda e Z-Slice.
5. Copiare il nome del primo file (senza z-slice e numero di canale) nella cartella selezionata nel passaggio 3.2.4 e incollarlo nel primo passaggio della finestra di dialogo denominata "Immettere il nome dell'immagine".
6. Inserisci il numero di canali nel secondo passaggio etichettato "Inserisci il numero di bande di lunghezza d'onda", il numero di z-slice nel terzo passaggio etichettato "Inserisci il numero di Z-slices" e fai clic su OK.
  NOTA: il numero di bande di lunghezze d'onda può cambiare se vengono apportate modifiche alle impostazioni di acquisizione, ad esempio la regolazione dell'intervallo di lunghezze d'onda o della dimensione del gradino della lunghezza d'onda. Il numero di fette Z può anche cambiare a seconda dell'altezza della cella.
7. Sfoglia e seleziona il file di lunghezza d'onda chiamato "Wavelength.mat" nella finestra popup etichettata "Seleziona il file di informazioni sulla lunghezza d'onda" e fai clic su Apri.
8. Sfoglia e seleziona il file "Library.mat" nella nuova finestra popup denominata "Seleziona il file della libreria spettrale", fai clic su Apri e attendi fino al termine della disasmi delle sezioni.
  NOTA: il file Library.mat è un file contenente spettri puri per ogni fluoroforo del membro finale insieme all'autofluorescenza cellulare e alle firme spettrali di sfondo. In questo caso, i fluorofori dei membri finali includono Turchese, Venere e DRAQ5. Le firme spettrali di sfondo includono l'autofluorescenza cellulare o della matrice, la fluorescenza coverslip e la diffrazione coverslip. Il file Wavelength.mat è un file contenente le informazioni sul canale di lunghezza d'onda utilizzato per acquisire l'immagine spettrale. Un file di libreria di esempio e un file di lunghezza d'onda sono disponibili sul sito web bioimaging and Biosystems (vedere la nota al punto 3.2.1). Per ulteriori informazioni su come generare file di libreria spettrale e di lunghezza d'onda, fare riferimento al file di informazioni supplementari denominato "Libreria File_Spectral supplementare". Le immagini non mixate corrispondenti a ciascuna z-slice verranno salvate nella cartella denominata "Unmixed" creata durante il processo di unmixing all'interno della cartella selezionata nel passaggio 3.2.3.
Calcolo dell'efficienza FRET:
1. Aprire lo script di programmazione denominato "multiFRRCF.m" e fare clic su Esegui.
  NOTA: questo file di programmazione è disponibile sul sito Web della University of South Alabama Bioimaging and Biosystems (vedere la nota al passaggio 3.2.1).
2. Inserisci il numero di prove sperimentali da analizzare nella finestra di dialogo popup chiamata "quante cartelle rilice" e fai clic su OK.
  NOTA: i dati immagine di ogni esperimento devono essere salvati in una cartella di immagini non mixata separata. Questo passaggio consente semplicemente al codice di analisi di eseguire il loop su molte cartelle come passaggio per risparmiare tempo.
3. Sfogliare e selezionare le cartelle non mixate e fare clic su OK.
  NOTA: il numero di volte in cui si apre la finestra pop-up "Cerca cartella" dipende dal numero immesso nella finestra di dialogo "Quante cartelle recuperare" nel passaggio precedente. Sfoglia e seleziona le cartelle una dopo l'altra.
4. Nella nuova finestra popup, inserisci le seguenti informazioni nelle rispettive caselle: il fattore di ridimensionamento è 12,4, la soglia è 5,6, X, Y e Z La frequenza sono rispettivamente 5, 5 e 1 e l'algoritmo di smoothing è gaussiano.
  NOTA: il fattore di scala è un valore in pixel/μm e verrà utilizzato per ridimensionare il campionamento in direzione Z a quello della direzione XY. Il fattore di scala è ottenuto dalla dimensione dei pixel dell'immagine, che di solito viene fornita come metadati nell'immagine per la maggior parte dei sistemi di microscopio confocale. Ad esempio, se l'immagine viene acquisita con una spaziatura di 0,08 μm/pixel, il fattore di scala deve essere di 12,5 pixel/μm. Il valore di soglia verrà utilizzato per sogliere le immagini e generare una maschera binaria della cella. Abbiamo creato un elenco di valori ottimali in base all'intensità del donatore+ accettore dell'immagine. Utilizzare 4.5 come valore di soglia se l'immagine ha un'intensità donatore+accettore luminosa e uno sfondo basso, un valore compreso tra 5,6 e 6,5 per le immagini con intensità donatore+accettore moderata e/o sfondo superiore e un valore di 7,5 e superiore per le immagini con un'intensità donatore+accettore inferiore allo sfondo. Il valore di frequenza corrisponde all'intervallo, in numero di pixel, in cui viene eseguita la slicing nei passaggi successivi. Ad esempio, se la profondità Z della cella è di 17 μm con una dimensione del passo di 1 μm e viene utilizzato un fattore di scala di 12,5 pixel/μm nella direzione XY, la profondità del set di dati di immagini tridimensionali verrà ricampionata a 212 pixel (direzione Z). In base al valore di frequenza Z immesso (ad esempio, 1 pixel), il set di dati dell'immagine tridimensionale verrà ri-affettato a partire dalla parte superiore del set di dati dell'immagine e quindi spostato con incrementi di 1 pixel verso il basso. Ciò si traduce in 212 immagini resliced. Se venisse inserito un intervallo di valori di frequenza più grande per la frequenza Z, verrebbero generate meno immagini resliced. Le immagini resliced vengono salvate nei passaggi successivi.
5. Fare clic su Esegui e attendere fino a quando non vengono eseguite tutte le misurazioni FRET e il reslicing.
  NOTA: all'interno della directory padre viene creata una cartella separata in cui vengono salvate le immagini di efficienza FRET in scala di grigi licing e le immagini di efficienza FRET colorate (applicata una mappa a colori). Ad esempio, tutte le immagini FRET in scala di grigi e colormap rilicenze nella direzione X (piano YZ) vengono salvate in una cartella denominata "Resliced_XFRET".
6. Ripetere l'analisi con impostazioni simili per tutti gli esperimenti – prima e dopo i trattamenti con forskolin e i controlli del veicolo.
  NOTA: i passaggi indicati nella sezione 3.3 descrivono i valori da immettere per lo script di programmazione di analisi FRET personalizzato per generare dati di immagine FRET tridimensionali. Tuttavia, questo script esegue diverse operazioni durante l'esecuzione, tra cui: caricamento dei dati dell'immagine, creazione di pile di immagini, smoothing, calcoli di efficienza FRET, creazione e applicazione di una maschera di bordo cellulare, ricostruzione dell'immagine tridimensionale, reslicing di immagini tridimensionali a intervalli specificati (frequenze), applicazione di una mappa colore per visualizzare le modifiche FRET e salvataggio dei dati dell'immagine resliced nella stessa directory. Ulteriori dettagli sono stati inclusi come commenti nello script del programma.

4. Mappatura dell'efficienza FRET ai livelli cAMP

Apri il file di programmazione denominato "Mapping_FRET Efficiency_to_cAMP_concentration.m" e fai clic su Esegui nella finestra principale.
NOTA: il file è disponibile sul sito web bioImaging e BioSystems (vedere la nota al punto 3.2.1). Questo file legge le immagini di efficienza FRET in scala di grigi e le converte in livelli cAMP in base a una curva caratteristica. Questa curva caratteristica utilizza una relazione cAMP-TO-FRET documentata in letteratura¹⁵^,³⁶ che è descritta dall'equazione di Hill (la terza equazione mostrata di seguito). Tuttavia, K_d della sonda in celle intatte è difficile da stimare e abbiamo ipotizzato che sia 1 μM nei nostri calcoli. Quindi, i risultati sono mostrati in funzione di K_d. (cioè , [cAMP] = x * K_d). Le equazioni utilizzate per misurare l'efficienza FRET e mappare FRET ai livelli cAMP sono mostrate di seguito:

Dove E è l'efficienza FRET, e un_apparente e d_apparente sono le intensità dei pixel non mixate delle immagini dell'accettore e del donatore, rispettivamente.
Q_a e Q_d sono rese quantistiche di accettore e donatore. Si noti che Q_a e Q_d si annullano quando l'equazione per k^λ è incorporata nell'equazione di efficienza FRET, k^λ è un fattore di correzione:

e sono coefficienti di estinzione del donatore e dell'accettore alla lunghezza d'onda di eccitazione del donatore, i (405nm).

E è l'efficienza FRET e K_D= costante di dissociazione = 1 μM.
Navigare e selezionare la prima immagine FRET in scala di grigi (salvata nel passaggio 3.3.5) e fare clic su OK.
Aprire le immagini FRET/cAMP per ispezionare la distribuzione dei segnali cAMP in tre dimensioni.

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Representative Results

Questo protocollo descrive l'uso di approcci iperspettrali di imaging e analisi FRET per misurare i gradienti cAMP in tre dimensioni spaziali nelle cellule viventi. Ci sono diversi passaggi chiave coinvolti nella generazione di questi risultati, per i quali è necessaria un'attenta attenzione durante l'analisi e la quantificazione dei dati. Questi passaggi chiave includono la costruzione di una libreria spettrale appropriata, lo smixing spettrale di sfondo, la soglia per identificare i bordi delle celle e i calcoli dell'efficienza FRET. La Figura 1 illustra il flusso schematico di tutti i passaggi coinvolti nella misurazione dell'efficienza FRET e dei livelli di cAMP nelle cellule viventi. Se eseguite correttamente, queste fasi di imaging e analisi consentiranno la misurazione dell'efficienza FRET e la stima dei gradienti spaziali cAMP in 3 dimensioni in una cella, tenendo conto dei segnali di fondo non uniformi.

La Figura 2 illustra le viste tridimensionali dei dati di immagini iperspettrali grezze di falsi colori acquisiti utilizzando un microscopio confocale Nikon A1R in condizioni basali (Figura 2A) e 10 minuti dopo (Figura 2B) trattamento con forskolina. Si noti che parametri di rilevamento e di sistema simili sono stati utilizzati per acquisire pile di immagini prima e dopo il trattamento per mantenere la coerenza per l'analisi quantitativa. Si noti inoltre che i cambiamenti in FRET non sono evidenti in questa immagine, in quanto si tratta puramente di una visualizzazione di dati grezzi, prima di calcolare l'efficienza FRET.

È necessaria una libreria spettrale con spettri puri di tutti i membri finali per analizzare ulteriormente i dati grezzi delle immagini spettrali. La costruzione di una libreria spettrale appropriata è uno dei passaggi chiave per garantire misurazioni appropriate dell'efficienza FRET. La Figura 3 mostra la costruzione di una libreria spettrale contenente gli spettri puri dei membri finali (in questi studi attuali, i membri finali sono Turchese, Venere e DRAQ5). Per misurare l'efficienza fret, è importante ottenere gli spettri di Turchese e Venere utilizzando un campione con stechiometria 1:1. Qui, abbiamo fornito un approccio in cui il fluoroforo accettore è completamente fotodistrutto, consentendo di ottenere firme spettrali del donatore e dell'accettore con stechiometria 1:1 (Figura 3A-F). Inoltre, sono state applicate relazioni di potenza lineari tra i laser (Figura supplementare 1) per calcolare lo spettro accettore con un'intensità che ci si aspetterebbe se fosse eccitato utilizzando il laser di eccitazione del donatore, in questo caso 405 nm per il turchese (Figura 3G). Ciò garantisce che i segnali donatore e accettore non mixati siano comparabili in intensità assoluta quando FRET è eccitato con una singola linea laser a 405 nm. Le cellule non trasfettate etichettate con il colorante nucleare, DRAQ5 (Figura 3H) sono state utilizzate per ottenere lo spettro puro di DRAQ5 (Figura 3I). Combinando gli spettri del donatore, Turquoise (Figura 3F), accettore, Venere (Figura 3G) e DRAQ5 (Figura 3I), è stata creata una libreria a 3 componenti (Figura 3J).

Segnali provenienti da fonti diverse dalle etichette fluorescenti possono anche essere presenti in un campione. Per tenere conto di questi, tre diverse firme spettrali con picchi che si verificano a 424 nm, 504 nm e 574 nm sono state identificate all'interno di campioni cellulari non etichettati. Crediamo che queste firme spettrali corrispondano alla riflettanza del coverslip e alla matrice cellulare o all'autofluorescenza cellulare. La Figura 4 illustra le fonti di queste tre firme spettrali di sfondo. È importante notare che questi segnali sono distribuiti in modo non uniforme all'interno del campione e quindi non possono essere semplicemente sottratti. Tuttavia, l'aggiunta delle firme spettrali di questi segnali alla libreria spettrale e l'utilizzo dell'unmixing lineare per separare i segnali presenta un approccio per rimuovere questi segnali confondenti dai segnali donatore e accettore prima di calcolare le efficienze FRET. Per raggiungere questo obiettivo, le tre firme spettrali di sfondo sono state aggiunte alla libreria spettrale a 3 componenti, formando una nuova libreria a 6 componenti composta da donatore (Turchese), accettore (Venere), DRAQ5 e tre firme spettrali di sfondo.

È stato scritto uno script di programmazione personalizzato per annullare la sincronizzazione dei dati dell'immagine spettrale in singoli membri finali e uno script separato per eseguire i successivi calcoli dell'efficienza FRET. L'unmixing spettrale lineare (illustrato nella Figura 5)è stato eseguito utilizzando la libreria spettrale a 6 componenti. L'unmixing è stato eseguito per ogni slice nello stack di immagini assiali, noto anche come z-stack (fare riferimento alla visualizzazione tridimensionale dei dati dell'immagine spettrale grezza nella Figura 5A). Ciò ha comportato immagini non mixate separate per ogni endmember, per ogni z-slice nello z-stack(Figura 5C–E, le immagini non mixate di sfondo non vengono mostrate). Se lo si desidera, i segnali non mixati possono essere falsi colorati per la visualizzazione con un colore diverso assegnato a ciascun segnale non mixato (Figura 5F-H).

La Figura 6 illustra i passaggi coinvolti nei calcoli dell'efficienza FRET, nonché i passaggi per mappare l'efficienza FRET ai livelli cAMP. Un'immagine di efficienza FRET è stata generata utilizzando immagini di donatori e accettori non mixati levigate. Un'immagine binaria della maschera è stata ottenuta utilizzando immagini non mixate di donatori, accettori e nucleari. La maschera è stata applicata all'immagine di efficienza FRET per rimuovere i contributi dai pixel all'esterno della cella. Sebbene le immagini non mixate di singole z-slice siano state utilizzate per la dimostrazione pittorica delle misurazioni dell'efficienza FRET, questi calcoli sono stati eseguiti su ciascuna fetta all'interno dello stack di immagini tridimensionale. Il set di dati dell'immagine FRET a 3 dimensioni è stato quindi riliced in tre piani ortogonali per visualizzare i gradienti spaziali dei segnali cAMP in direzioni diverse.

Visualizzazione dei cambiamenti indotti da agonisti nell'efficienza FRET e nei livelli di cAMP
I passaggi sopra descritti forniscono un metodo per calcolare l'efficienza FRET e i livelli cAMP dai dati di immagine iperspettrale in tre dimensioni spaziali. Questi passaggi possono essere applicati ai preparati cellulari prima e dopo il trattamento con composti che suscitano una risposta cAMP, come la forskolina. Qui, forniamo un esempio di utilizzo di questo approccio per osservare i cambiamenti nella distribuzione di FRET e cAMP nei PMVEC dopo il trattamento con forskolina da 50 μM. La Figura 7 illustra i cambiamenti nell'efficienza FRET e nei livelli di cAMP in diverse fette del piano XY (fette z), da apicale a basale, consentendo il confronto delle condizioni basali (prima del trattamento con forskolina) e dei 10 minuti dopo il trattamento. In questo esempio illustrativo, l'efficienza fret è diminuita (colonne 1 e 3 nella Figura 7) dopo il trattamento con forskolina, correlata ad un aumento dei livelli di cAMP (colonne 2 e 4 nella Figura 7). È stata osservata una variazione spaziale minima di cAMP all'interno di un singolo piano XY. Tuttavia, sono stati osservati gradienti spaziali cAMP assiali (apicali-basali), come si può supporre osservando che la fetta apicale ha un colore rosso più profondo (che indica livelli di cAMP più elevati attraverso la tabella di ricerca del colore che è stata applicata) rispetto alla fetta basale dopo il trattamento con forskolina (colonna 4 nella Figura 7). Le distribuzioni assiali FRET o cAMP possono spesso essere visualizzate meglio utilizzando immagini ottenute dai due piani spaziali ortogonali: la Figura 8 raffigura l'efficienza FRET e i livelli cAMP nel piano YZ al basale (colonne 1 e 2) e 10 minuti dopo il trattamento con forskolina (colonne 3 e 4), mentre la Figura supplementare 2 raffigura l'efficienza FRET e le variazioni di livello cAMP nel piano XZ. Questi risultati dimostrano la fattibilità della misurazione di FRET e della stima dei livelli di cAMP da dati di immagini iperspettrali tridimensionali e dimostrano anche l'importanza di visualizzare le distribuzioni assiali di FRET o cAMP. Anche se al di là dello scopo di questo documento metodologico, può essere che le distribuzioni spaziali assiali dei nucleotidi ciclici contribuiscano alla specificità all'interno delle vie di segnalazione nucleotidica cicliche.

Quando si eseguono i metodi sopra descritti, è importante controllare meticolosamente l'accuratezza dei passaggi ed eseguire controlli sperimentali e di veicolo appropriati per garantire che i cambiamenti nel FRET (e nel corrispondente cAMP) siano dovuti a cambiamenti effettivi nei segnali del donatore e dell'accettore e non siano artefatti di imaging. Ad esempio, i passaggi importanti da considerare includono:

Utilizzo di una libreria spettrale appropriata che contiene tutti i componenti spettrali necessari
Come accennato, ci può essere un contributo significativo di segnali di fondo dall'autofluorescenza cellulare, dalla matrice depositata o dalla luce riflessa dal coverslip (sanguinamento dell'emissione di eccitazione). La Figura 9 rappresenta un set di dati di esempio che illustra che il segnale di sfondo è stato mantenuto all'interno delle immagini quando è stata utilizzata una libreria a 3 componenti (Turchese, Venere e DRAQ5) per annullare la fusione dei dati spettrali. Al contrario, il segnale di fondo è stato effettivamente rimosso quando è stata utilizzata una libreria spettrale a 6 componenti più completa (e appropriata).

Utilizzo di un valore di soglia ottimale per generare una maschera di cella
In molti degli esperimenti che abbiamo eseguito, l'intensità del segnale di fondo è circa il 50-60% dell'intensità del segnale FRET che è presente all'interno dei dati dell'immagine spettrale grezza (cioè, quando si visualizzano dati di immagini spettrali non elaborati il picco del segnale FRET è solo ~ 2 volte superiore a quello del segnale di sfondo circostante). Pertanto, la separazione del segnale di fondo dal segnale in primo piano utilizzando un valore di soglia per ottenere una maschera binaria è un passaggio sensibile e deve essere eseguito con attenzione per evitare artefatti di analisi. Nella Figura 10 viene illustrato l'effetto dei diversi valori di soglia applicati alla segmentazione cellulare per creare una maschera binaria della cella. Un valore di soglia basso può includere il segnale di fondo come parte della cella di espressione. D'altra parte, un valore di soglia eccessivamente alto può precludere la misurazione di FRET in cellule a bassa espressione o regioni di una cellula con basso segnale donatore + accettore (porzioni molto sottili della cellula o porzioni che possono avere una concentrazione regionale inferiore della sonda FRET).

Selezione di una cellula trasfetta con intensità del segnale donatore+accettore ≥ segnale di fondo
La Figura 11 illustra un set di dati di esempio in cui le efficienze FRET e i livelli corrispondenti sono stati misurati da immagini non mixate ottenute utilizzando una libreria spettrale a 6 componenti per l'unmixing spettrale lineare. Nonostante l'utilizzo della libreria a 6 componenti per disagitare i dati delle immagini spettrali e la selezione di una soglia elevata per la creazione del bordo cellulare e della maschera nucleare, le immagini di efficienza FRET erano ancora soggette a un segnale di rumore di fondo elevato vicino al lato basale della cella. In questo caso, la presenza di rumore di fondo era dovuta alla selezione di una cella che esprimeva solo debolmente la sonda FRET e la potenza del segnale donatore + accettore era approssimativamente uguale alla potenza del segnale di fondo, anche dopo aver smisato. Pertanto, oltre ad applicare le sofisticate fasi di analisi sopra descritte, è anche importante selezionare una cella con sufficiente espressione della sonda FRET e corrispondentemente sufficiente segnale FRET (segnale donatore e accettore almeno uguale o superiore al segnale di rumore) durante l'acquisizione al fine di garantire risultati di alta qualità.

Figura 1: Diagramma di flusso che illustra le fasi coinvolte nell'efficienza FRET e nelle misurazioni di livello in tre dimensioni spaziali utilizzando l'imaging e l'analisi FRET iperspettrale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Una visualizzazione tridimensionale di una cellula che esprime il reporter cAMP FRET (verde) e i nuclei della cellula e delle cellule circostanti non espressive (rosso). I dati delle immagini spettrali grezze acquisite utilizzando un microscopio confocale spettrale Nikon A1R sono stati falsamente colorati in base alla lunghezza d'onda e visualizzati in 3 dimensioni utilizzando il software NIS Elements. A) dati di immagine tridimensionali al basale e B) 10 minuti dopo il trattamento con forskolina da 50 μM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Costruzione di una libreria spettrale contenente gli spettri puri delle etichette fluorescenti nello studio (denominati endmembers dal campo di telerilevamento). A) Un'immagine falsamente colorata di cellule che esprimono il biosensore FRET acquisita all'eccitazione di 405 nm (eccitazione del donatore). B) Spettro corrispondente al segnale FRET: 4 diverse regioni di interesse (ROI) sono state disegnate sull'immagine A mostrata da rettangoli rossi, gialli, blu e verdi. È stata esportata l'intensità media a ciascuna lunghezza d'onda per ogni ROI selezionato. L'intensità media di questi 4 ROI è stata tracciata a ciascuna lunghezza d'onda di emissione. I picchi di emissione dello spettro corrispondono sia ai fluorofori donatori (Turchese) che accettori (Venere). C) Un'immagine falsamente colorata di cellule che esprimono il biosensore FRET acquisita all'eccitazione di 488 nm (eccitazione dell'accettore). D) Lo spettro medio è stato stimato come spiegato in B da diversi ROI in C (le stesse regioni di A) con picco di emissione dovuto solo all'accettore. E) Un'immagine falsamente colorata di cellule che esprimono il biosensore FRET acquisita a 405 nm di eccitazione dopo fotodistruzione del fluoroforo accettore mediante irradiazione a 514 nm. F) Lo spettro medio è stato stimato come spiegato in B da diversi ROI in E (le stesse regioni di A) con picco di emissione dovuto solo al donatore. NOTI che l'intensità del donatore è aumentata in F rispetto a quella del segnale FRET originale, indicando che dopo la fotosciviazione dell'accettore, l'eccitazione del donatore sta portando all'emissione diretta del donatore. G) Lo spettro accettore come ci si aspetterebbe se ottenuto utilizzando l'eccitazione a 405 nm. Ciò è stato stimato utilizzando i fatti che i laser di eccitazione a 405 nm e 488 nm hanno una risposta lineare che può essere caratterizzata utilizzando uno spettrometro e una sfera di integrazione (Figura supplementare 1) e il coefficiente di estinzione dipendente dalla lunghezza d'onda di Venere. Quindi, lo spettro di Venere ottenuto a 488 nm di eccitazione può essere convertito nello spettro di Venere che ci si aspetterebbe se ottenuto a 405 nm eccitazione H) Un'immagine falsamente colorata di cellule etichettate con l'etichetta nucleare, DRAQ5. I) Lo spettro medio di diverse regioni di interesse in H. J) La libreria spettrale risultante contenente gli spettri puri normalizzati del donatore e DRAQ5 e lo spettro corretto della lunghezza d'onda di eccitazione dell'accettore. Si noti che gli spettri turchese e Venere sono stati normalizzati al valore massimo dei dati spettrali combinati turchese + Venere mentre DRAQ5 è stato semplicemente normalizzato all'unità al valore della lunghezza d'onda di emissione di picco. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Le firme spettrali di sfondo sono state identificate e incluse nella libreria spettrale per tenere conto dei segnali di fluorescenza di fondo durante il processo di unmixing. A, B) Due firme spettrali di fluorescenza di fondo sono state osservate quando si caratterizza un campione bianco (coverslip senza etichetta). Queste firme spettrali sono state nominate in base alle loro lunghezze d'onda di picco: una a 424 nm (dalla fluorescenza coverslip) e l'altra a 504 nm (probabilmente dalla riflettanza o dalla diffusione posteriore). C) Una terza firma spettrale di fondo è stata osservata con una lunghezza d'onda di emissione di picco di 574 nm quando sono state analizzate cellule non etichettate, potenzialmente da autofluorescenza cellulare o fluorescenza della matrice sottostante. D) Spettri di sfondo estratti dalle immagini A, B e C. Questi tre spettri di sfondo sono stati aggiunti alla libreria a 3 componenti esistente(Figura 3J)per sviluppare una libreria spettrale a 6 componenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Unmixing spettrale lineare utilizzando una libreria spettrale a 6 componenti che tiene conto dei segnali di fondo. A) Dati grezzi di immagini spettrali acquisiti come z-stack assiale. B) Libreria spettrale a 6 componenti utilizzata per unmix lineare dei dati spettrali grezzi. C, D ed E) Le immagini non mescolate in scala di grigi di DRAQ5, Turchese e Venere, rispettivamente, sono il risultato di unmixing spettrale lineare. F, G e H) False immagini colorate non mescolate di DRAQ5, Turchese e Venere rispettivamente. Sono state calcolate anche immagini non mixate di segnali di sfondo (dati non mostrati qui in quanto solo le etichette fluorescenti sono di interesse per questa metodologia – fare riferimento alla Figura 4 in Annamdevula, et al. per esempi di segnali di sfondo non mescolati²⁵). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Diagramma di flusso che illustra i passaggi coinvolti nel calcolo dei livelli FRET e cAMP da dati di immagini spettrali non mixati. A) Immagine rappresentativa non mixata del donatore, Turchese. B) Immagine rappresentativa non mescolata dell'accettore, Venere. C) Immagine rappresentativa non mixata dei nuclei, DRAQ5. D) La maschera cellulare binaria viene generata soglie di immagine sommata donatore +accettore non mixato. E) Una soglia viene applicata all'immagine nucleare per creare una maschera binaria del nucleo. F) L'efficienza FRET in termini di pixel è stata calcolata da immagini di donatori e accettori non mixati. G) Una maschera binaria composita è stata creata dal bordo cellulare e dalle maschere nucleari. H) Immagine di efficienza FRET mascherata: la maschera cellulare composita è stata applicata all'immagine di efficienza FRET per escludere segnali FRET non specifici all'esterno della cellula e all'interno del nucleo. I) Una colormap è stata applicata all'immagine mascherata dell'efficienza FRET per visualizzare meglio i cambiamenti spaziali in FRET. J) L'immagine dei livelli cAMP che è stata stimata dall'immagine di efficienza FRET. K) Colormap è stata applicata per visualizzare meglio i cambiamenti spaziali in cAMP. Le barre colorate mostrate sul lato destro sono state utilizzate per visualizzare l'efficienza FRET (pannello superiore) e i livelli cAMP (pannello inferiore). Le immagini mostrate in questa figura sono rappresentative di una singola z-slice assiale, ma l'operazione di analisi descritta in questa figura viene eseguita sull'intero z-stack assiale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Efficienza FRET indotta da Forskolin e gradienti spaziali cAMP visualizzati nei PMVEC. Le immagini del piano XY sono state generate rilicenziando i dati di immagine FRET e cAMP ricostruiti a 3 dimensioni nella direzione assiale (Z) dal lato apicale a quello basale della cellula. Vengono visualizzate cinque sezioni XY contigue. Le colonne 1 e 3 rappresentano l'efficienza FRET al basale e 10 minuti dopo il trattamento con forskolina da 50 μM, rispettivamente. Le colonne 2 e 4 indicano i livelli al basale e 10 minuti dopo il trattamento con forskolina. Le barre dei colori sono state utilizzate per correlare i cambiamenti nella mappa dei colori all'efficienza FRET (in alto) e ai livelli cAMP (in basso). Le linee bianche mostrate nelle immagini nelle colonne 2 e 4 vengono utilizzate per generare il profilo di intensità (profilo di scansione della linea) dei segnali cAMP su questa linea selezionata. Il grafico del profilo di intensità ottenuto dalla fetta centrale della cellula al basale (profilo blu) e dopo il trattamento con forskolina (profilo verde) dimostra la distribuzione spaziale dei segnali cAMP attraverso la scansione della linea. La barra della scala indica 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Efficienza FRET indotta da Forskolin e gradienti spaziali cAMP visualizzati nella direzione assiale. Le immagini del piano YZ sono state generate rilicendo i dati dell'immagine FRET e cAMP ricostruiti a 3 dimensioni nella direzione laterale (X) (dal lato sinistro a quello destro della cella). Le colonne 1 e 3 rappresentano l'efficienza FRET al basale e a 10 minuti dopo il trattamento con forskolina da 50 μM, rispettivamente. Le colonne 2 e 4 rappresentano i livelli di cAMP al basale e a 10 minuti dopo il trattamento con forskolina. Le barre di colore a destra sono state utilizzate per correlare i cambiamenti nella mappa dei colori all'efficienza FRET (in alto) e ai livelli cAMP (in basso). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: Confronto dell'efficacia dell'utilizzo di una libreria spettrale a 3 o 6 componenti per il calcolo delle immagini dei livelli FRET e cAMP. Segnali di sfondo non specifici sono stati osservati in immagini calcolate utilizzando una libreria a 3 componenti, che non teneva conto delle firme spettrali di sfondo. Ciò è stato particolarmente vero per le immagini vicino al lato basale della cellula dopo il trattamento con forskolina da 50 μM (colonna 2). Al contrario, gli artefatti del segnale di sfondo sono stati effettivamente rimossi quando si utilizza una libreria a 6 componenti che includeva firme spettrali di sfondo, migliorando la capacità di segmentare la cella e analizzare i segnali FRET e cAMP. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 10: Gli artefatti di analisi delle immagini possono essere introdotti se non viene selezionato un valore di soglia appropriato per delineare i confini della cella e del nucleare. Le immagini di donatori e accettori non mixati sono state utilizzate per creare una maschera con tre diversi valori di soglia: 0,35 (colonne 1 come 2), 0,65 (colonne 3 e 4) e 0,9 (colonne 5 e 6). Le colonne 1, 3 e 5 visualizzano l'efficienza FRET alla linea di base. Le colonne 2, 4 e 6 mostrano l'efficienza FRET a 10 minuti dopo il trattamento con forskolina da 50 μM. La selezione di una soglia troppo bassa ha comportato l'inclusa di porzioni dello sfondo, o regione extracellulare, nella cella per l'analisi, mentre la selezione di una soglia troppo alta ha comportato la perdita di parte della cella (vedere la sezione apicale nelle colonne 4-5 rispetto alle colonne 3-4). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 11: Gli artefatti del segnale di sfondo possono ancora persistere anche dopo l'annullamento della sincronizzazione dello sfondo e la selezione di una soglia appropriata durante la creazione di una maschera binaria. La colonna 1 mostra fette apicali, medie e basali rappresentative al basale e la colonna 2 mostra lo stesso a 10 minuti dopo il trattamento con forskolina da 50 μM. Nonostante l'utilizzo di una libreria a 6 componenti per la disaccolinea che rappresentava i segnali di fondo e l'utilizzo di una soglia più alta di 0,85 per la generazione di maschere binarie, le regioni di sfondo erano ancora identificate come parte della cellula, specialmente dopo il trattamento con forskolina. Se ciò si verifica, una possibile spiegazione potrebbe essere che una cellula con espressione debole del reporter FRET è stata selezionata per l'imaging. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Misurazioni dell'intensità della linea laser in funzione dell'impostazione laser nel software. Uno spettrometro accoppiato a fibra e una sfera di integrazione sono stati calibrati su una lampada tracciabile NIST per misurare l'intensità del laser sia per la linea laser a 405 nm che per la linea laser a 488 nm. A) Numero totale di fotoni misurati allo stadio del microscopio corrispondente alle diverse intensità laser del laser a 405 nm. B) Numero totale di fotoni misurati allo stadio del microscopio corrispondente a diverse intensità laser del laser 488 nm. La risposta lineare nell'intensità del laser è stata osservata per entrambi i laser misurati nella fase del microscopio. Una linea di tendenza lineare è stata adattata e l'equazione della linea di tendenza per ogni linea laser è stata utilizzata per calcolare lo spettro dell'accettore che ci si aspetterebbe se eccitato con la linea laser a 405 nm (eccitazione del donatore). Fare clic qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 2: Efficienza FRET indotta da Forskolin e gradienti spaziali cAMP visualizzati nella direzione assiale. Le immagini del piano XZ sono state generate rilicettando i dati dell'immagine FRET e cAMP ricostruiti a 3 dimensioni nella direzione laterale (Y) (dalla parte anteriore a quella posteriore della cella). Le colonne 1 e 3 rappresentano l'efficienza FRET al basale e a 10 minuti dopo il trattamento con forskolina da 50 μM, rispettivamente. Le colonne 2 e 4 rappresentano i livelli di cAMP al basale e a 10 minuti dopo il trattamento con forskolina. Le barre di colore a destra sono state utilizzate per correlare i cambiamenti nella mappa dei colori all'efficienza FRET (in alto) e ai livelli cAMP (in basso). Analogamente ai risultati mostrati per i piani YZ (Figura 8), i gradienti spaziali da apicale a basale nell'efficienza FRET e nei livelli cAMP possono essere visualizzati come cambiamenti di colore dall'alto verso il basso di una singola fetta YZ, sia in condizioni di base (qualsiasi data fetta nelle colonne 1-2) che dopo il trattamento con forskolina da 50 μM (colonne 3-4). Fare clic qui per scaricare questa figura.

File supplementari. Fare clic qui per scaricare questi file.

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Discussion

Lo sviluppo di biosensori FRET ha permesso la misurazione e la visualizzazione di segnali nucleotidici ciclici in singole cellule, e c'è una grande promessa per la visualizzazione degli eventi di segnalazione subcellulare^13,^22,^37,^38. Tuttavia, l'uso di biosensori FRET presenta diverse limitazioni, tra cui le basse caratteristiche segnale-rumore di molti reporter FRET fluorescenti basati su proteine e la debole efficienza di trasfezione o espressione dei reporter FRET (questo può essere particolarmente impegnativo in alcune linee cellulari, come i PMVEC)²³^,²⁴. L'imaging di proteine fluorescenti debolmente espresse, combinato con calcoli FRET ratiometrici, spesso si traduce in un alto grado di incertezza o fluttuazione nell'efficienza FRET calcolata. Nel tentativo di migliorare l'affidabilità delle misurazioni FRET, noi e altri abbiamo precedentemente dimostrato l'uso dell'imaging e dell'analisi iperspettrale per misurare i segnali FRET e per ridurre la diafonia o il sanguinamento dei segnali di fluorescenza tra etichette fluorescenti ed effetti di autofluorescenza²⁶^,³¹^,³²^,³⁹. A causa delle limitazioni nella potenza del segnale, questi studi spettrali FRET erano limitati a due dimensioni spaziali (X e Y) fino a poco tempo fa. Quindi, hanno fornito una vista a fetta singola delle modifiche FRET all'interno di una cella.

In studi recenti, abbiamo notato che FRET (e i corrispondenti livelli di cAMP) sembravano essere distribuiti spazialmente non solo nel piano XY, ma anche tra i piani XZ e YZ²⁵. L'approccio di imaging FRET iperspettrale qui descritto estende la nostra capacità di visualizzare e misurare i cambiamenti di FRET e nucleotide ciclico (cAMP) in tre dimensioni spaziali, aprendo nuove possibilità per valutare la compartimentazione del segnale. Questo approccio di imaging e analisi iperspettrale a 4 dimensioni (X, Y, Z e λ) consente la misurazione e la visualizzazione di gradienti cAMP in tre dimensioni spaziali tenendo conto dei segnali di sfondo non uniformi. Qui, abbiamo dimostrato come implementare questo approccio attraverso l'esempio dei gradienti spaziali cAMP indotti da forskolin. Nei dati dell'immagine post-trattamento, i gradienti spaziali cAMP possono essere osservati dal lato apicale a quello basale della cellula (Figura 7 e Figura 8). Il cAMP prodotto dopo il trattamento con forskolina non sembra raggiungere le giunzioni cellula-cellula (Figura 7 e Figura 8).

Nell'utilizzare la metodologia qui descritta, era importante tenere conto delle diverse fonti di segnali di fondo e di autofluorescenza per consentire una stima accurata delle efficienze FRET. L'unmixing lineare fornisce una potenziale via per tenere conto di spettri di sfondo unici, se le loro firme sono diverse dalle sonde fluorescenti di interesse. In particolare, l'unmixing lineare è più adatto per separare i segnali di fondo e di autofluorescenza rispetto alla sottrazione di fondo standard. ⁴⁰^,⁴¹^,⁴² Nell'esempio mostrato qui, sono state misurate tre diverse firme spettrali e assegnate un nome in base alla lunghezza d'onda di emissione di picco della firma: lo spettro di fondo di 424 nm (possibilmente dalla fluorescenza coverslip), lo spettro di fondo a 504 nm (probabilmente a causa della luce riflessa o retrodeterusa) e lo spettro di fondo a 574 nm (probabilmente a causa dell'autofluorescenza della matrice cellulare o cellulare). Per illustrare gli effetti della mancata considerazione di queste firme, sono state create due librerie spettrali e sono state confrontate immagini non mixate. In primo luogo, è stata creata una libreria spettrale contenente solo le etichette fluorescenti nel campione, Turchese, Venere e DRAQ5, ed etichettata la libreria a 3 componenti. In secondo luogo, è stata creata una libreria spettrale che conteneva anche le tre firme spettrali di sfondo ed etichettata come libreria a 6 componenti. Come mostrato sopra, l'unmixing con la libreria a 6 componenti (unmixing in background) ha permesso la rimozione dei segnali in background, mentre l'unmixing con la libreria a 3 componenti non lo ha fatto (Figura 9). In lavori precedenti, abbiamo dimostrato che l'errore quadratico medio radice (RMSE) associato all'unmixing lineare è diminuito quando si utilizza una libreria spettrale che tiene conto sia delle etichette fluorescenti che delle firme di sfondo. Va notato che la distribuzione assiale della fluorescenza di fondo è spesso non uniforme e, quindi, una semplice sottrazione di sfondo non funzionerà per correggere i dati dell'immagine. Pertanto, l'approccio di unmixing spettrale è necessario per fornire un'accurata rimozione dello sfondo e misurazioni FRET affidabili.

È importante ottimizzare i parametri di sistema per selezionare le migliori impostazioni possibili del sistema e della telecamera durante l'acquisizione di immagini spettrali. L'obiettivo generale dovrebbe essere quello di ottimizzare l'SNR riducendo al minimo i tempi di acquisizione e prevenendo il fotosableching. ⁴³ Pertanto, quando si ottimizza un sistema di imaging, è spesso necessario un compromesso tra risoluzioni spaziali, temporali e spettrali. In questi studi, sono stati selezionati valori ottimali per le impostazioni del sistema e della fotocamera, tra cui dimensioni stenopeiche, potenza laser, velocità di scansione, dimensioni di scansione e media dei fotogrammi, come descritto nella sezione protocollo. Utilizzando queste impostazioni, il campionamento spaziale di 80 nm / pixel, il campionamento temporale di ~ 3 minuti per z-stack spettrale (~ 10 secondi / immagine XY) e il campionamento spettrale di 10 nm di intervallo si ottengono con fotosciviazione trascurabile o minima.

Per garantire stime accurate dell'efficienza FRET, è necessario misurare gli spettri donatore e accettore come ci si aspetterebbe con stechiometria 1:1 e lunghezze d'onda di eccitazione identiche (Figura 3). Gli spettri turchese e venere sono stati normalizzati rispetto alla lunghezza d'onda di emissione di picco turchese. L'efficienza FRET che è stata stimata utilizzando questa libreria spettrale ha prodotto valori simili a quelli riportati in letteratura^12,^22. In genere, gli spettri dei membri finali nella libreria sono normalizzati all'unità. Tuttavia, per calcolare con precisione l'efficienza FRET, lo spettro accettore deve essere acquisito rispetto allo spettro donatore (cioè a concentrazione equimolare o stechiometria 1:1 e riferito alla stessa lunghezza d'onda di eccitazione). Oltre all'uso di una libreria correttamente costruita, sono coinvolti diversi passaggi nella stima appropriata dell'efficienza FRET e nell'evitare artefatti di analisi. Questi includono la selezione di una cella esprimente con un'adeguata intensità del segnale (Figura 11), l'attenuazione di immagini non mixate prima di stimare l'efficienza FRET (in questo esempio è stata applicata la sfocatura gaussiana), l'utilizzo di un valore di soglia appropriato per creare la maschera (Figura 10) e la stima di un fattore di correzione utilizzando i coefficienti di estinzione del donatore e dell'accettore (Supplemental File_Spectral Library). Quando si seguono questi passaggi, le distribuzioni tridimensionali dell'efficienza FRET e dei livelli cAMP sottostanti possono essere visualizzate con precisione in singole celle.

I segnali cAMP localizzati sono stati stimati in 2 dimensioni spaziali utilizzando biosensori FRET^{mirati 13,}^37. Tuttavia, il targeting delle sonde FRET a specifici compartimenti subcellulari (ad esempio, membrana plasmatica o zattere lipidiche) in genere si traduce in un aumento della concentrazione locale di sonda. Ciò può comportare l'introduzione di artefatti di misurazione a causa del FRET intermolecolare o bimolecolare. Inoltre, i risultati presentati qui e in Annamdevula et.al., 2018, Cytometry A^{25 dimostrano} l'importanza delle misurazioni tridimensionali di FRET da sonde solubili o mirate.

Nonostante l'importanza di misurare i segnali cAMP in tre dimensioni spaziali, ci sono anche limitazioni a questo approccio. La limitazione più restrittiva sono i lunghi tempi di acquisizione richiesti– circa 3 minuti per z-stack spettrale. Questo tasso di acquisizione preclude l'utilizzo di questo approccio per rilevare qualsiasi cosa diversa dalle distribuzioni cAMP quasi-stazionarie nelle celle. Detto questo, i risultati presentati dimostrano l'importanza di includere le misure quasi -stazionarie 3-dimensionali (x, y, z) cAMP come complementi critici alle misurazioni standard a 2 dimensioni (x, y). In futuro sarà interessante incorporare proteine etichettate e strutture cellulari nel disegno sperimentale. Un'attenta scelta dei fluorofori utilizzati per etichettare le proteine (e/o le strutture) consentirebbe di valutare le distribuzioni tridimensionali delle proteine etichettate e del FRET senza ulteriori perdite di velocità di acquisizione. Ciò consentirebbe a sua volta la misurazione di segnali cAMP localizzati e segnali cAMP vicino alle proteine etichettate in tre dimensioni spaziali, offrendo così un importante complemento sperimentale alle sonde cAMP mirate e ampliando ulteriormente l'utilità delle misurazioni iperspettrali delle distribuzioni cAMP 3-dimensionali nelle cellule viventi.

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Disclosures

I dottori Leavesley e Rich rivelano l'interesse finanziario in una start-up, SpectraCyte, LLC, che è stata costituita per commercializzare tecnologie di imaging spettrale. Tuttavia, tutte le procedure descritte in questo protocollo sono state condotte utilizzando prodotti disponibili in commercio non associati a SpectraCyte, LLC.

Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Kees Jalink (The Netherlands Cancer Institute e van Leeuwenhoek Center for Advanced Microscopy, Amsterdam, Paesi Bassi) per averci fornito il biosensore H188 cAMP FRET e Kenny Trinh (College of Engineering, University of South Alabama) per l'aiuto tecnico nel ridurre il tempo impiegato per eseguire i nostri script di programmazione sviluppati su misura.

Gli autori desiderano riconoscere le fonti di finanziamento: American Heart Association (16PRE27130004), National Science Foundation; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Attofluor Cell Chamber	Invitrogen	A7816	Attofluor contains steel cell chambers and a rubber O-ring. Cell chamber holds the coverslip and O-ring provides a lock in mechanism to hold the buffer in cell chamber with out leakage
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100	Solvent used to prepare stock solution forskolin.
DRAQ5 Fluoroscent Probe Solution	Thermo Scientific	62252	Nuclear label
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-092	Contains nutrients and growth factors for the cells to grow and divide in the culture dishes.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	F6178	Growth factor suppliment that is added to culture medium, DMEM
Forskolin	Sigma	F3917	Adenyly cyclase activator.
H188 Cyclic AMP FRET biosensor	Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink	Gift	Plasmid encoding Turquoise (donor fluorophore), Venus (acceptor fluorophore), and binding domain obtained from Epac.
Image J	image.net	Free download	Another image processing platform used to extact spectral information and image processing.
Integrating Sphere	Ocean Optics	FOIS-1	Used to measure illumination intensity of the laser line at different laser intensities (?).
Laminin Mouse Protein, Natural	Invitrogen	23017-015	Coverslips are coated with laminin and this helps in cell attachment, growth and motility of the cell.
Lipofectamine 3000 Transfection Kit	Invitrogen	L3000-015	Transfection reagent used to transfect cells with H188 FRET biosensor
MATLAB	Mathworks	R2019a	Image processing operations (linear unmixing and FRET efficiency calculations) are performed by writing custom programs in MATLAB programming environment
Nikon A1R confocal microscope	Nikon Instruments	Nikon A1R	Spectral image acquisition is performed using confocal microscope.
Nikon Elements Software	Nikon Instruments	Software dongle	used to export and handle nd2 image files (multidimensional image files) that are aquired using Nikon A1R
NIST-Traceable Calibration Lamp	Ocean Optics	LS-1-CAL-INT	A lamp with a known spectrum for use as a standard
PBS pH 7.4 (1X)	Gibco	10010-023	coomonly used buffer suring cell culture
Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs)	In house - Cell culture core, Univeristy of South Alabama	Isolated from Rat pulmonary microvasculature	PMVECs form inner lining of a blood vessel.
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122	antibiotics are added to culture medum to prevent contamination of the cells.
Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides	Clay Adams	3010	Microscope slides used for cell fixation
ProLong Diamond Antifade Mounting Media	Invitrogen	P36961	If samples are fixed using antifade mountant, then the later protects fluoroscent dyes and chromophores from fading.
Spectrometer	Ocean Optics	QE65000	Used to measure spectral response of the light source (?)
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200-056	Digests the protein-protein bond between the cell and cell matrix and helps to disscociate and lift the cells during cell plating.
Tyrodes Buffer	Made in-house	Made in-house	Tyrodes buffer is used to make working solutions and to maintain cells in aqueous solution during image acquisition.
6 Well Cell Culture Plate	Corning	3506	Laminin coated coverslips are placed in 6-well culture dish (one coverlisps/well). Cells along with medium is added into each well.
25 mm Round Microscope Cover Slips	Fisher Scientific	12545102	Cells were grown on round glass coverslips
60X Ojective	Nikon Instruments	Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27	water immersion and commonly used objective for cells

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References

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Biology

Misurazione di distribuzioni cAMP tridimensionali in cellule viventi utilizzando imaging e analisi FRET iperspettrale a 4 dimensioni (x, y, z e λ)

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

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