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Biology

4차원(x, y, z 및 λ) 하이퍼스펙트럼 FRET 이미징 및 분석을 사용하여 살아있는 세포에서 3차원 cAMP 분포 측정

Published: October 27, 2020 doi: 10.3791/61720
Automatic Translation
1,2, 3, 1, 3, 1,2, 1,2, 1,2,3
1Department of Pharmacology, University of South Alabama, 2Center for Lung Biology, University of South Alabama, 3Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama

Summary

Fónster 공명 에너지 전송 (FRET) 기반 센서의 내재 된 낮은 신호 대 잡음 비율 (SNR)으로 인해, 특히 세 공간 차원에서 cAMP 신호의 측정이 도전하고있다. 여기서는 3개의 공간 차원에서 cAMP 분포를 측정할 수 있는 하이퍼스펙트럼 FRET 이미징 및 분석 방법론을 설명합니다.

Abstract

순환 AMP는 세포 및 생리 활동의 넓은 범위에 관여하는 두 번째 메신저입니다. 몇몇 연구 결과는 cAMP 신호가 구획화되고, 그 구획화가 cAMP 신호 통로 내의 신호 특이성에 기여한다는 것을 건의합니다. F렌스터 공명 에너지 전달(FRET) 기반 바이오 센서의 개발은 세포내 cAMP 신호를 측정하고 시각화하는 능력을 발전시켰습니다. 그러나 이러한 측정은 종종 두 개의 공간 차원으로 제한되어 데이터를 잘못 해석할 수 있습니다. 현재까지, 본질적으로 낮은 신호 대 잡음 비(SNR)를 나타내는 FRET 센서를 사용하는 기술적 한계로 인해 3개의 공간 차원(x, y 및 z)으로 cAMP 신호의 측정이 매우 제한적이었습니다. 또한, 전통적인 필터 기반 이미징 접근법은 스펙트럼 크로스토크, 제한된 신호 강도 및 자동 형광을 포함한 다양한 요인으로 인해 국소화 된 세포 이형 지역에서 cAMP 신호를 정확하게 측정하는 데 효과가 없습니다. 이러한 한계를 극복하고 FRET 기반 바이오 센서를 여러 형광과 함께 사용할 수 있도록 FRET 기반 의 바이오 센서를 여러 형광과 함께 사용할 수 있도록 FRET 효율을 계산하기 위한 스펙트럼 특이성 및 추가 형광 라벨에서 접건 성 자동 형광 및/또는 신호를 반사적으로 분리하는 기능을 제공하는 하이퍼 스펙트럼 FRET 이미징 및 분석 접근 방식을 개발했습니다. 여기서는 하이퍼스펙트럼 FRET 이미징을 구현하기 위한 방법론과 스펙트럼 미혼을 수행하기 위해 샘플링되거나 과샘플링되지 않은 적절한 스펙트럼 라이브러리를 구성할 필요성을 제시합니다. 우리는 폐 미세 혈관 내피 세포 (PMVEC)에서 3 차원 cAMP 분포의 측정을위한이 방법론을 제시하는 동안,이 방법론은 세포 유형의 범위에서 cAMP의 공간 분포를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

Introduction

순환 아데노신 모노인산염(cAMP)은 세포 분열, 칼슘 유입, 유전자 전사 및 신호 변환을 포함한 주요 세포 및 생리적 과정에 관여하는 두 번째 메신저입니다. 증거의 성장 몸은 신호 특이성을 달성하는 세포를 통해 cAMP 구획의 존재를 제안1,2,3,4,5,6,7. 최근까지, cAMP 구획화는 다른 G-결합 수용체작용제에의해 유도된 뚜렷한 생리적 또는 세포 효과에 기초하여 유추되었다8,9,10,11. 최근에는 FRET 기반 형광 이미징 프로브가 세포12,13,14에서cAMP 신호를 직접 측정 및 관찰하기 위한 새로운접근법을제공하고 있다.

Förster 공명 에너지 전달(FRET)은 분자가15,16에근접할 때 비방사적 방식으로 기증자와 수용자 분자 간에 에너지 전달이 발생하는 물리적 현상이다. FRET 기반 형광 지표의 발달과 함께, 이러한 물리적 현상은 단백질-단백질 상호 작용17,단백질 공동 국소화18,Ca+2 신호19,유전자 발현20,세포 부문21 및 순환 뉴클레오티드 신호화를 연구하기 위해 생물학적 응용 분야에서 사용되었습니다. FRET 기반 cAMP 지표는 일반적으로 cAMP 결합 도메인, 기증자 불소 호및 수용자불소호레(22)로구성됩니다. 예를 들어, 이 방법론에 사용되는 H188 cAMP센서(12)22는 에팍으로부터 얻은 cAMP 결합 도메인으로 구성되며, 청록색(기증자)과 금성(수용자) 형광 사이에 끼어 있다. 기저 조건(언바운드)에서 청록색과 금성은 형광류 사이에 FRET가 발생하는 방향으로 있습니다. 바인딩 도메인에 대한 cAMP의 바인딩시, 청록색과 금성이 떨어져 이동하도록 형성 변화가 발생하여 FRET가 감소합니다.

FRET 기반 이미징 접근 방식은 셀 내에서 cAMP 신호를 조사하고 시각화하기 위한 유망한 도구를 제공합니다. 그러나, 현재 FRET 기반 현미경 이미징 기술은 종종 세포 전 세포 공간 선명도로 FRET를 측정하기에 충분한 신호 강도를 달성하는 데 부분적으로만 성공적입니다. 이는 많은 FRET 기자의 제한된 신호 강도, FRET 효율의 변화를 정확하게 정량화하는 데 필요한 높은 수준의 정밀도, 세포 자동불화(23)및24와같은 혼란스러운 요인의 존재를 포함한 여러 가지 요인에 기인한다. 결과는 종종 약한 SNR에 의해 괴롭히는 FRET 이미지, FRET에 있는 세포 극변경의 시각화를 아주 어렵게 만듭니다. 또한, 공간적으로 국소화된 cAMP 신호에 대한 조사는 거의 2개의 공간 차원에서만 거의 독점적으로 수행되었으며 축 cAMP 분포는거의 25로간주되지 않습니다. 이는 SNR이 cAMP 그라데이션을 세 가지 공간 차원으로 측정하고 시각화하는 기능을 방해했기 때문일 수 있습니다. 낮은 SNR을 가진 FRET 센서를 사용하는 한계를 극복하기 위하여는, 우리는 단하나세포25,26,27에서FRET를 측정하기 위하여 하이퍼 스펙트럼 화상 진찰 및 분석 접근법을 구현했습니다.

하이퍼스펙트럼 이미징 접근법은 NASA가 위성 이미지28,29에존재하는 지상파 물체를 차별화하기 위해 개발되었다. 이러한 기술은 이후 형광 현미경 필드(30)로번역되었으며, 스펙트럼 검출기를 제공하는 여러 상용 공초점 현미경 시스템이 있습니다. 기존의 (비 스펙트럼) 형광 이미징에서, 샘플은 밴드 패스 필터 또는 레이저 라인을 사용하여 흥분하고, 방출은 종종 형광의 피크 방출 파장에 맞게 선택된 제2 밴드 패스 필터를 사용하여 수집된다. 대조적으로, hyperspectral 화상 진찰 접근은 특정 파장 간격에 형광 방출26,31,32 또는 여기33,34의 완전한 스펙트럼 단면도를 샘플링하는 것을 추구합니다. 우리의 이전 연구에서, 우리는 Hyperspectral 화상 진찰 및 분석 접근이 전통적인 필터 기지를 둔 FRET 화상 진찰 기술(26)에비교될 때 세포에 있는 FRET 신호의 향상한 정량화를 제공할 수 있다는 것을 보여주었습니다. 여기서는 4차원(x, y, z 및 λ) 하이퍼스펙트럼 FRET 이미징 및 분석을 수행하여 3개의 공간 차원에서 cAMP 분포를 측정하고 시각화하는 방법론을 제시합니다. 이러한 접근법은 단일세포(25)에서작용제 유도 된 cAMP 공간 그라데이션의 시각화를 허용하였다. 흥미롭게도, 고뇌에 따라, cAMP 그라데이션은 세포에서 명백할 수 있습니다. 여기에 제시된 방법론은 FRET 측정의 정확도를 향상시키기 위해 비 균일한 배경 및 세포 자동 형광의 스펙트럼 미혼을 사용합니다. 이 방법론은 cAMP FRET 바이오 센서를 사용하여 폐 미세 혈관 내피 세포 (PMVEC)에서 입증되지만, 방법론은 대체 FRET 기자 또는 대체 세포주와 함께 사용하기 위해 쉽게 수정 될 수 있습니다.

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Protocol

이 프로토콜은 사우스 앨라배마 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회가 승인 한 절차를 따릅니다.

1. 이미징을 위한 세포, 샘플 및 시약 준비

  1. 이전에설명된 바와 같이 쥐 폐 내피 세포(PMVEC)를 분리한다.
    참고: 세포는 100mm 세포 배양 접시에 사우스 앨라배마 대학, 모바일, AL에서 세포 배양 코어에 의해 분리되고 배양되었습니다.
  2. 25mm 원형 유리 커버립에 시드 절연 PMVECs는 세포가 적어도 80 %의 합류 (적어도 24 시간)에 도달 할 때까지 37 ° C에서 인큐베이터에서 성장하게한다.
    참고: 세포 와 세포 유형 연구에서 다양 한 수 있습니다 및 따라서 세포 특정 세포 배양 절차는 씨앗과 성장 세포에 따라야 한다. 이러한 연구에 사용되는 세포 시드 및 배양 프로토콜은 "보충 File_Cell 문화 및 트랜스페션"이라는 파일의 보충 정보로 사용할 수 있습니다.
  3. FRET 바이오 센서를 장착하고 37°C에서 48시간 동안 배양할 수 있는 Transfect PMVECs.
    참고: PMVEC를 횡단하는 프로토콜은 "보충 File_Cell 문화 및 트랜스페션"이라는 보충 정보 파일에도 설명되어 있습니다.
  4. 이미징 당일, 티로드의 버퍼를 수조에서 37°C로 따뜻하게 합니다.
    참고: 티로드의 버퍼는 145mM NaCl, 4mM KCl, 10m HEPES, 10mM 포도당, 1mM MgCl2 및 1 mM CaCl2로 구성됩니다.
  5. 전감염된 세포를 포함하는 커버슬립을 세포 챔버에 장착하고 누출을 방지하기 위해 장착 개스킷으로 상단을 고정합니다.
  6. 커버슬립의 바닥을 섬세한 작업 닦아 여분의 미디어 나 부착 셀을 청소하십시오.
  7. 작업 버퍼 800 μL과 5mM 핵 라벨4μL을 셀 챔버에 넣고 5-10초 동안 부드럽게 흔들십시오.
    참고: 세포 챔버에 장착된 커버립에 버퍼 또는 시약 솔루션을 추가할 때, 부착 세포를 빼내지 않도록 용액을 셀 챔버 의 측면에 부드럽게 추가해야 합니다. 완충제의 800 μL에 5mM 핵 라벨의 4 μL을 추가하면 25 μM최종 핵 라벨 농도가 됩니다. HEK293 세포와 같은 느슨하게 부착된 세포의 경우 핵 라벨과 버퍼를 먼저 유리병에 혼합한 다음 세포챔버에 장착된 커버립에 추가합니다. 이렇게 하면 커버슬립에서 셀을 들어 올리는 것을 방지할 수 있습니다.
  8. 알루미늄 호일로 셀 챔버를 덮고 실온에서 10 분 동안 빛으로부터 보호하고 배양하십시오.
  9. 시약 준비: 버퍼의 199 μL에 50 mM 산림의 1 μL을 추가합니다. 이것은 완충의 800 μL로 제조된 세포에 추가할 때 50 μM의 산림의 최종 농도를 생성합니다. 199μL의 DMSO 1 μL 버퍼도 차량 제어로 사용할 수 있도록 준비해야 합니다.
    참고: 이러한 연구에서, 산림은 cAMP 생산을 자극 하는 아데닐시클라제 활성제로 사용 됩니다. 원하는 경우, 이 방법론은 아데닐시클라아제, 인포디스세라아제 등을 자극하거나 억제하기 위한 대체 시약으로 치료를 쉽게 할 수 있도록 쉽게 수정할 수 있다.

2. 이미지 수집

  1. 스펙트럼 검출기가 장착된 공초점 현미경을 사용하십시오.
    참고: 여기에 설명된 모든 이미지 수집 단계는 시판되는 Nikon A1R 현미경 시스템을 사용하여 개발되었습니다. 이러한 단계는 대체 스펙트럼 현미경을 사용하는 경우 조정해야 할 수 있습니다. 안정적인 작동 조건에 도달할 수 있도록 실험 시작 최소 30분 전에 모든 장비를 켜야 합니다.
  2. 60x 물 침수 목표를 선택하고 목표에 물 한 방울을 추가합니다.
    참고: 고해상도 라이브 셀 이미징의 경우 높은 수치 조리개 목표를 사용하는 것이 좋습니다. 이러한 연구에서 사용되는 목적에 대한 정보는 자료 목록을 참조하십시오.
  3. 적재된 셀 챔버(1.7단계에서)를 현미경 단계에 놓습니다.
  4. 현미경의 오른쪽에 있는 필터 노브를 튜닝하여 설정된 DFT(DAPI/FITC/TRITC) 필터를 선택합니다.
  5. 안구를 이용하여 형광 광야 모드에서 현미경을 조작하여 cAMP FRET 센서를 발현하는 세포를 포함하는 시야를 선택한다.
    참고: 선택한 셀의 기증자 또는 수용자 방출 피크 파장의 FRET 신호의 평균 강도가 적어도 100 강도 단위(A.U.) 또는 발현 세포가 없는 영역의 기준선 신호의 4배 이상인지 확인합니다. NIS Elements 소프트웨어에서 사용할 수 있는 스펙트럼 프로파일 뷰어를 사용하여 확인할 수 있습니다. 좋은 신호와 세포를 찾고 있을 때, 지나치게 밝은 세포를 폐기 하는 것이 좋습니다 (그들은 손상 될 수 있습니다).
  6. NIS 소프트웨어를 열고, 공초점 모드로 전환, 레이저 연동 버튼의 잠금을 해제하고 라이브를 클릭합니다.
  7. 초점 노브를 사용하여 화면의 미리 보기를 보고 셀에 초점을 맞춥니다.
  8. 아래 설명과 같이 소프트웨어에서 장치, 수집 및 z 스택 설정을 구성합니다.
  9. 획득 설정:
    참고: 이전에 획득한 이미지를 사용하여 카메라 및 장치 획득 설정을 적용할 수 있습니다. 이미지를 열고 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 카메라 설정을 다시 사용합니다.
    1. A1 설정 메뉴를 열고 405 nm 및 561 nm 레이저 라인에 해당하는 상자를 선택하고 스펙트럼 검출기에 대한 SD를 선택하고 해상도를 위해 10 개, 채널용 31을 선택합니다.
      참고: A1 설정 메뉴는 A1 Plus 설정 창의 왼쪽 상단 모서리에 작은 기어 아이콘으로 표시됩니다. 405 nm 레이저는 기증자 여기에 사용되며 561 nm 레이저는 핵 라벨 여기에 사용됩니다.
    2. 시작 및 끝 파장 값을 선택하여 파장 범위(410 ~730nm)를 설정합니다.
    3. A1 설정 메뉴에서 비닝/건너뛰기 아이콘을 클릭하고 번호가 15인 상자를 선택한 다음 A1 설정 메뉴에서 확인을 클릭합니다.
      참고: 이것은 561 nm 흥분 레이저에 해당하는 파장 채널을 제거하는 것입니다 (이것은 일반적으로 15파장 채널입니다). 스펙트럼 아티팩트를 만들 수 있는 인위적으로 낮은 신호를 피하기 위해 이 파장 밴드를 사용하지 않는 것이 중요합니다. 레이저 손상으로부터 보호하기 위해 검출기 요소를 덮는 기계식 손가락으로 인해 이 대역에서 신호가 낮습니다.
    4. 레이저 강도를 각각 405nm 및 561 nm 레이저에 대해 8%와 2%로 설정하고, Si Hv(검출기 게인)는 각각 149개, 2.4개의 통풍 디스크 유닛(AU)의 핀홀 반경을 설정한다.
      참고: 레이저 강도는 기기의 나이와 레이저의 상태에 따라 조정해야 할 수 있습니다. 다른 시료 또는 실험 그룹 간의 레이저 강도를 조정하는 경우 동일한 비율의 레이저 강도(예: 8:2)를 유지하는 것이 중요합니다. 또한, 빠른 광표백을 생성하기 위해 너무 밝지 않은 레이저 강도를 선택하는 것이 중요하다. 검출기 게인은 감지기 소음을 최소화하면서 신호 강도를 최대화하도록 조정해야 합니다. 이러한 연구를 위해, 의 이득 149 사용 되었다. 2.4 AU의 핀홀 크기는 충분한 신호 대 노이즈 비(SNR)를 가진 이미지를 획득하고 광학 단면(공초점)을 유지하는 것 사이의 균형으로 선택되었습니다. 핀홀 크기가 증가하면 SNR이 증가하지만 공초점성이 줄어듭니다.
    5. 스캔 속도를 초당 0.25 스펙트럼 프레임으로 설정하고, 검색 방향을 위해 단방향에 해당하는 아이콘을 선택하고, 카운트에 대해 4를 입력하고, 스캔 크기에 대해 1024 x 1024를 설정합니다.
      참고: FRET 신호가 약하며 스캔 속도가 느린 경우가 많습니다. 0.25의 스캔 속도를 사용하여 스펙트럼 z 스택의 획득이 ~3분 만에 완료됩니다. 사용되는 형광에 따라 스캔 속도가 증가하거나 감소할 수 있습니다. 예를 들어 eGFP와 같은 밝은 형광류의 경우 더 빠른 스캔 속도(2프레임/초)를 사용할 수 있습니다. 카운트 아래에 입력된 숫자는 프레임 평균 값 4에 해당하므로 이미지 수집 시 노이즈를 줄이는 데 도움이 됩니다. 매우 안정적인 샘플과 시간이 제약 조건이 아닌 경우 더 높은 평균 값(최대 16개)을 사용하여 향상된 SNR을 사용하여 이미지를 얻을 수 있습니다.
  10. z 스택 획득 매개 변수 정의:
    참고: 2.10 단계에서 입력된 값은 형광 라벨 결합 또는 농도, 라벨 유형, 사용된 라벨 수, 세포주 및 세포 표시 밀도 및/또는 세포 자동 형광에 영향을 줄 수 있는 샘플 준비의 기타 변화를 수용하기 위해 조정해야 할 수 있습니다. 획득 매개 변수를 조정할 때광 표백을 최소화하면서 충분한 SNR을 달성하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 또한 스펙트럼 FRET 분석기를 구성할 때 매개 변수가 모든 치료 그룹에서 잘 작동하는지 확인하기 위해 주의를 기울여야합니다. SNR이 충분하고 광표백이 최소화되도록 제안 된 매개 변수 설정으로 각 치료 그룹의 평가판을 실행하는 것이 좋습니다.
    1. ND 인수 → → 인수 제어 보기를 클릭하여 ND 획득 창을 엽니다.
    2. 팝업 창에 ND 파일을 저장하려면 경로/대상 및 파일 이름을 입력합니다.
    3. z 계열에해당하는 확인란을 선택합니다.
    4. A1 플러스 설정 창에서 라이브를 클릭합니다. 이렇게 하면 라이브 보기 창이 열립니다.
    5. 현미경의 초점 노브를 조정하여 셀의 상단을 선택하고 ND 획득 창에서 위를 클릭하여 현재 위치를 맨 위로 설정합니다.
      참고: 모든 셀이 z 계열에서 샘플링되도록 셀 상단 위에 약간 초점을 맞추는 것이 좋습니다.
    6. 현미경의 초점 노브를 조정하여 셀의 바닥을 선택하고 ND 획득 창의 아래쪽을 클릭하여 현재 위치를 바닥으로 설정합니다.
      참고: 셀 하단 아래에 약간 초점을 맞추어 모든 셀이 샘플링되도록 합니다.
    7. 단계 크기에 대해 1 μm을 입력하고 z 스캔 방향의 위쪽 아래쪽을 선택하고 ND 획득 창에서 실행을 클릭하여 z 스택을 획득합니다.
      참고: 단계 크기는 위쪽 및 하단 위치(예: 이동 거리)에 따라 획득되는 z 슬라이스 수를 결정합니다. 1 μm 스텝 크기는 이미징 속도, z축 샘플링 및 광표백 사이의 손상으로 선택되었습니다. 공초점 핀홀 직경 2.4 AU와 60배 물 침수 목표를 사용하여 광학 단면 두께는 1.73 μm이 되었다. 따라서 1 μm 스텝 크기는 나이퀴스트 샘플링 기준보다 약간 낮지만 z 스택을 획득하는 데 필요한 시간을 줄이기 위해 만들어진 타협입니다. 속도가 중요하지 않은 매우 안정적인 샘플의 경우, 더 작은 z축 단계와 더 작은 공초점 핀홀 직경을 사용하여 z축 해상도를 높일 수 있습니다. 맨 아래 상단은 유사한 결과를 산출해야하며 z 스캔 중에 발생할 수있는 광표백의 효과를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
  11. 가능한 경우 완벽한 초점 시스템(PFS)을 설정합니다.
    참고: PFS를 통해 시스템은 이미지 수집 중 초점 깊이의 변동을 보정할 수 있습니다. 다음 단계는 PFS를 설정하는 데 사용될 수 있으며, 이러한 단계는 니콘 A1R 버전과 사용된 NIS 요소 버전에 따라 약간 다를 수 있습니다.
    1. ND 획득 창의 범위 아이콘에 의해 정의된 대칭 모드를 강조 표시합니다.
    2. 현미경의 전면에 있는 PFS 버튼을 켭니다(샘플 스테이지 아래 섹션에 있는 이색 거울 손잡이가 '인'인지 확인하십시오).
    3. PFS 오프셋 컨트롤러의 전면에 노브를 사용하여 위쪽(시계 반대 방향으로 회전) 및 아래쪽(시계 방향으로 회전)을 재정의합니다.
    4. ND 획득 창에서 '상대적'을 클릭하여 상대 z 위치/z 깊이를 정의합니다.
    5. 소프트웨어가 상대 z 깊이를 기억할 수 있도록 현미경의 전면에 메모리를 클릭합니다.
  12. z 스택 획득이 완료되면 파이펫을 사용하여 원하는 시약(forskolin 또는 차량 제어)을 부드럽게 추가하고 10분 동안 기다립니다.
    참고: 세포를 방해하거나 현미경 XY 단계 내에서 세포 실의 위치를 이동하지 않도록 시약을 매우 부드럽게 추가하십시오. 후속 라이브 뷰 또는 이미지에서 시약 추가 중에 시야가 이동되지 않았는지 확인하는 것이 좋습니다. 10분 대기 시간은 산림 치료가 적용됩니다. 대체 치료를 사용하는 경우 대기 시간을 조정해야 할 수 있습니다.
  13. 10분 후 파일 이름을 변경하고 ND 획득 창에서 실행을 클릭합니다.
  14. 반복 단계 2.11 – 2.13 적어도 에 대해 위에서 설명 한 대로 5 커버립 통계 분석에 대한 충분한 결과를 달성하기 위해 (각 치료 그룹에 대한 n = 5 – 산림 및 차량 제어).
  15. 샘플 및 샘플 공백을 준비하여 스펙트럼 라이브러리를 구성하고 2.9 단계 및 2.10 단계에 설명된 것과 유사한 획득 설정을 사용하여 스펙트럼 이미지를 수집합니다.

3. 이미지 분석

참고: 이러한 이미지는 연구에 존재하는 모든 개별 엔멤버의 순수한 스펙트럼을 포함하는 스펙트럼 라이브러리를 구성하는 데 사용됩니다. 스펙트럼 라이브러리의 엔멤버는 다른 형광을 사용하는 경우 연구마다 다를 수 있습니다. 스펙트럼 라이브러리를 구성하는 자세한 절차는 "보충 File_Spectral 라이브러리"라는 추가 정보 파일에 제공됩니다. 여기에서는 .tiff 파일, 선형 스펙트럼 해제, FRET 효율 측정, 3차원 재구성 및 cAMP 수준 추정으로 데이터를 내보내는 것을 설명합니다. 이미지 분석은 ImageJ, 파이썬, MATLAB 또는 CellProfiler와 같은 다양한 이미지 분석 및 프로그래밍 플랫폼을 사용하여 수행될 수 있습니다. 이러한 연구에서는 MATLAB 스크립트가 사용되었습니다.

  1. 이미지 데이터 내보내기:
    1. 2.13 및 2.14 단계에서 획득한 스펙트럼 z 스택 이미지에 해당하는 동일한 파일 이름으로 새 폴더를 만듭니다.
      참고: 데이터를 내보내기 위해 설명된 다음 단계는 NIS Elements AR 버전 4.30.01에 따라 다릅니다. 이러한 단계는 소프트웨어 버전에 따라 약간 다를 수 있습니다.
    2. 파일 창을 여는 파일을클릭합니다. 2.12 단계에서 획득한 스펙트럼 이미지 파일을 찾아보고 선택하고 열기를 클릭합니다.
    3. 파일이 로드되면 가져오기/내보내기→ → 파일을 클릭합니다.
    4. 팝업 창에서: 3.1.1 단계에서 생성된 폴더를 찾아서 선택하고, 파일 유형에 대해 태그가 지정된 이미지 형식(TIF)을 선택한 다음 각 채널에 대한 모노 이미지를 선택하고 비트 깊이를 유지합니다.
      참고: 파일 접두사는 미리 생성됩니다. 편의를 위해 이 값을 변경합니다. 인덱스 순서는 선택한 채널에 따라 변경되며 z 슬라이스 위치에 따라 인덱싱을 위한 "z, c"를 먼저 표시해야 하며 파장 대역 번호는 두 번째입니다. LUT 또는 삽입 오버레이 또는 점 이름 사용에 해당하는 상자가 선택되지 않았는지 확인합니다.
    5. 티프 파일을 개별 tiff 파일로 대상 폴더로 내보내려면 내보내기를 클릭합니다.
    6. 2.13 단계에서 획득한 스펙트럼 이미지 파일을 내보내기 위해 3.1.2 - 3.1.5 단계를 반복합니다.
  2. 선형 스펙트럼 혼합 해제:
    1. 프로그래밍 소프트웨어를 엽니다.
      참고: 원시 스펙트럼 이미지를 혼합해제하기 위해 사용자 정의 개발 프로그래밍 스크립트는 자원 탭 (https://www.southalabama.edu/centers/bioimaging/resources.html)에서 사우스 앨라배마 바이오 이미징 및 바이오 시스템 즈 웹 사이트에 제공됩니다.
    2. "선형 언믹싱.m"이라고 표시된 파일을 열고 편집기 도구 모음에서 실행 단추를 클릭합니다.
    3. NIS Elements 소프트웨어에서 생성된 내보낸 *.tif 파일 시퀀스가 포함된 폴더를 찾아보고 선택합니다.
    4. 계속하려면 확인을 클릭하여 파장 및 Z-Slice라는새 창을 엽니다.
    5. 3.2.4 단계에서 선택한 폴더에 첫 번째 파일 이름(z-slice 및 채널 번호 없음)을 복사하여 "이미지 이름 입력"이라고 표시된 대화 상자의 첫 번째 단계에 붙여 넣습니다.
    6. "파장 대역 수를 입력"이라고 표시된 두 번째 단계에서 채널 수를 입력하고 "Z 슬라이스 수를 입력"이라고 표시된 세 번째 단계에서 z 슬라이스 수를 입력하고 확인을 클릭합니다.
      참고: 파장 범위 또는 파장 스텝 크기를 조정하는 등 획득 설정이 변경되면 파장 대역 수가 변경될 수 있습니다. Z 슬라이스의 수는 셀의 높이에 따라 변경될 수도 있습니다.
    7. "파장 정보 파일 선택"이라고 표시된 팝업 창에서 "파장.mat"이라는 파장 파일을 찾아보고 선택하고 엽니다.
    8. "스펙트럼 라이브러리 파일 선택"이라는 새 팝업 창에서 "Library.mat" 파일을 찾아보고 선택하고, 열기를 클릭하고 슬라이스의 혼합 해제가 완료될 때까지 기다립니다.
      참고: Library.mat 파일은 셀 자동 불피및 배경 스펙트럼 서명과 함께 각 최종 멤버 형광에 대한 순수한 스펙트럼을 포함하는 파일입니다. 이 경우, 최종 구성원 형광은 청록색, 금성 및 DRAQ5를 포함한다. 배경 스펙트럼 시그니처에는 셀룰러 또는 매트릭스 자동 형광, 커버 슬립 형광 및 커버 슬립 회절이 포함됩니다. wavelength.mat 파일은 스펙트럼 이미지를 획득하는 데 사용되는 파장 채널 정보를 포함하는 파일입니다. 예를 들어 라이브러리 파일 및 파장 파일은 Bioimaging 및 Biosystems 웹 사이트에서 사용할 수 있습니다(3.2.1 미만의 참고 사항 참조). 스펙트럼 라이브러리 및 파장 파일을 생성하는 방법에 대한 자세한 내용은 "보충 File_Spectral 라이브러리"라는 추가 정보 파일을 참조하십시오. 각 z-슬라이스에 해당하는 혼합되지 않은 이미지는 3.2.3 단계에서 선택한 폴더 내의 혼합 해제 프로세스 중에 생성된 "혼합 되지 않은"폴더에 저장됩니다.
  3. FRET 효율성 계산:
    1. "multiFRRCF.m"라는 프로그래밍 스크립트를 열고 실행을 클릭합니다.
      참고: 이 프로그래밍 파일은 사우스 앨라배마 대학교 바이오 이미징 및 바이오 시스템즈 웹 사이트에서 사용할 수 있습니다(3.2.1단계 아래 참고 사항 참조).
    2. "다시 슬라이스할 폴더 수"라는 팝업 대화 상자에서 분석할 실험 시험 수를 입력하고 확인을 클릭합니다.
      참고: 각 실험의 이미지 데이터는 별도의 혼합되지 않은 이미지 폴더에 저장해야 합니다. 이 단계를 사용하면 분석 코드가 시간 절약 단계로 많은 폴더를 반복할 수 있습니다.
    3. 혼합되지 않은 폴더를 찾아서 선택하고 확인을 클릭합니다.
      참고: "폴더 탐색" 팝업 창이 열리는 횟수는 이전 단계에서 "다시 슬라이스할 폴더 수" 대화 상자에 입력된 수에 따라 달라집니다. 폴더를 차례로 찾아보고 선택합니다.
    4. 새로운 팝업 창에서, 각 상자에 다음 정보를 입력: 배율 계수는 12.4, 임계값은 5.6, X, Y 및 Z 주파수는 각각 5, 5, 및 1이며, 스무딩 알고리즘은 가우시안이다.
      참고: 배율 조정 계수는 픽셀/μm의 값이며 Z 방향 샘플링을 XY 방향의 값으로 조정하는 데 사용됩니다. 배율 조정 계수는 이미지 픽셀 크기에서 얻어지며, 이는 일반적으로 대부분의 공초점 현미경 시스템에 대한 이미지의 메타데이터로 제공됩니다. 예를 들어 이미지가 0.08 μm/픽셀 간격으로 획득되는 경우 배율 조정 계수는 12.5픽셀/μm이어야 합니다. 임계값은 이미지를 임계값으로 표시하고 셀의 이진 마스크를 생성하는 데 사용됩니다. 이미지 기증자+수락자 강도에 따라 최적의 값 목록을 만들었습니다. 이미지가 밝은 기증자 +수용자 강도와 낮은 배경이있는 경우 4.5을 임계 값으로 사용, 중간 기증자 + 수락자 강도 및 / 또는 더 높은 배경을 갖는 이미지에 대한 5.6 에서 6.5 사이의 값, 그리고 7.5 이상의 값은 배경보다 낮은 기증자 + 수락자 강도를 갖는 이미지의 경우. 주파수 값은 후속 단계에서 슬라이스가 수행되는 픽셀 수의 간격에 해당합니다. 예를 들어, 셀의 Z 깊이가 1μm 스텝 크기와 12.5 픽셀/μm의 스케일링 계수가 XY 방향으로 사용되는 경우, 3차원 이미지 데이터 세트의 깊이는 212픽셀(Z 방향)에서 다시 샘플링됩니다. 입력된 Z 주파수 값(예: 1픽셀)에 따라 3차원 이미지 데이터 세트는 이미지 데이터 세트의 맨 위에서 다시 슬라이스한 다음 1픽셀 아래쪽으로 이동합니다. 이로 인해 212개의 다시 슬라이스된 이미지가 생성됩니다. Z 주파수에 대해 더 큰 주파수 값 간격을 입력하면 다시 슬라이스된 이미지가 생성됩니다. 다시 슬라이스된 이미지는 후속 단계에서 저장됩니다.
    5. 모든 FRET 측정 및 재칭이 수행될 때까지 실행을 클릭하고 기다립니다.
      참고: 회색 스케일 FRET 효율 이미지와 색상(컬러맵 적용) FRET 효율 이미지가 저장되는 부모 디렉토리 내에서 별도의 폴더가 만들어집니다. 예를 들어 X 방향(YZ 평면)으로 다시 슬라이스된 모든 회색 스케일 및 컬러맵 FRET 이미지는 "Resliced_XFRET"이라는 폴더에 저장됩니다.
    6. 모든 실험에 대해 유사한 설정으로 분석을 반복하십시오 - 포스콜린 치료 및 차량 제어 전후.
      참고: 섹션 3.3에서 언급된 단계는 사용자 지정 FRET 분석 프로그래밍 스크립트에 입력할 값을 설명하여 3차원 FRET 이미지 데이터를 생성합니다. 그러나 이 스크립트는 이미지 데이터 로드, 이미지 스택 생성, 스무딩, FRET 효율성 계산, 셀 테두리 마스크 작성 및 적용, 3차원 이미지 재구성, 지정된 간격(주파수)으로 3차원 이미지 재구성, FRET 변경 시각화를 위한 컬러맵 적용, 동일한 디렉터에 다시 슬라이스된 이미지 데이터 저장 등 여러 작업을 실행합니다. 추가 세부 정보는 프로그램 스크립트의 주석으로 포함되었습니다.

4. CAMP 레벨에 FRET 효율 매핑

  1. 'Mapping_FRET Efficiency_to_cAMP_concentration.m'이라는 프로그래밍 파일을 열고 주 창에서 실행을 클릭합니다.
    참고: 이 파일은 바이오이미징 및 바이오시스템즈 웹사이트에서 확인할 수 있습니다(3.2.1 미만 의 참고 사항 참조). 이 파일은 회색 축척 FRET 효율 이미지를 읽고 특성 곡선을 기반으로 cAMP 수준으로 변환합니다. 이 특성 곡선은 힐 방정식(아래 그림세 방정식)에 의해 설명되는 문헌15,36에 문서화된 cAMP-to-FRET 관계를 사용합니다. 그러나, 그대로 셀에 있는 프로브의 Kd는 추정하기 어렵고 우리는 우리의 계산에 있는 1 μM로 가정했습니다. 따라서 결과는 Kd의함수로 표시됩니다. (즉, [cAMP] = x * Kd). FRET 효율을 측정하고 FRET를 cAMP 수준으로 매핑하는 데 사용되는 방정식은 다음과 같습니다.
    Equation 1
    여기서 E는 FRET 효율이며, 명백하고 명백한것은 각각 수락자와 기증자 이미지의 혼합되지 않은 픽셀 강도입니다.
    Qa 및 Qd는 수용자와 기증자의 양자 수율입니다. Kλ에 대한 방정식이 FRET 효율 방정식에 통합될 때 Qa 및 Qd가 취소되며, kλ는 보정 계수입니다.
    Equation 2
    Equation 3Equation 4기증자의 소멸 계수및 기증자 의 수용자 인경우, i (405nm).
    Equation 5
    E는 FRET 효율및 KD = 해리 상수 = 1 μM입니다.
  2. 첫 번째 회색 축척 FRET 이미지를 탐색하고 선택하고(3.3.5 단계에 저장됨)를 선택하고 확인을 클릭합니다.
  3. FRET/cAMP 이미지를 열어 3차원으로 cAMP 신호 분포를 검사합니다.

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Representative Results

이 프로토콜은 살아있는 세포에 있는 3개의 공간 차원에서 cAMP 그라데이션을 측정하기 위하여 hyperspectral FRET 화상 진찰 및 분석 접근의 사용을 기술합니다. 이러한 결과를 생성하는 데 관련된 몇 가지 주요 단계가 있으며, 데이터를 분석하고 정량화하는 동안 주의 깊게 주의를 기울여야 합니다. 이러한 주요 단계에는 적절한 스펙트럼 라이브러리 구성, 백그라운드 스펙트럼 해제, 셀 테두리 식별을 위한 임계값 지정 및 FRET 효율성 계산이 포함됩니다. 도 1은 살아있는 세포의 FRET 효율 및 cAMP 수준을 측정하는 데 관련된 모든 단계의 회로도 흐름을 보여줍니다. 이러한 이미징 및 분석 단계를 사용하면 FRET 효율을 측정하고 셀의 3차원의 cAMP 공간 그라데이션을 측정하는 동시에 균일하지 않은 배경 신호를 고려할 수 있습니다.

도 2는 기준조건(그림 2A)에서 니콘 A1R 공초점 현미경을 이용하여 획득한 거짓색 원시 하이퍼스펙트럼 이미지 데이터의 3차원 보기를 묘사하고 10분후(그림2B)포스콜린 처리. 유사한 검출기 및 시스템 매개 변수를 사용하여 정량 적 분석을 위해 일관성을 유지하기 위해 처리 이미지 스택 전후를 획득했습니다. 또한 FRET 효율을 계산하기 전에 원시 데이터의 시각화이기 때문에 FRET의 변화는 이 이미지에서 명확하지 않습니다.

원시 스펙트럼 이미지 데이터를 더욱 분석하려면 모든 최종 멤버의 순수한 스펙트럼이 있는 스펙트럼 라이브러리가 필요합니다. 적절한 스펙트럼 라이브러리를 구성하는 것은 FRET 효율성을 적절히 측정할 수 있는 주요 단계 중 하나입니다. 그림 3은 엔멤버의 순수한 스펙트럼을 포함하는 스펙트럼 라이브러리의 건설을 보여줍니다 (이러한 현재 연구에서, 엔멤버는 청록색, 금성, 및 DRAQ5). FRET 효율을 측정하려면 1:1 스토이치오메트리가 있는 샘플을 사용하여 청록색과 금성의 스펙트럼을 얻는 것이 중요합니다. 여기서, 우리는 수용자 불소가 완전히 사진 파괴되는 접근 방식을 제공했으며, 기증자와 수용자의 스펙트럼 서명이 1:1 stoichiometry를 얻을 수 있도록합니다(그림 3A-F). 또한,레이저(보충도 1)간의선형 전력 관계는 기증자 흥분 레이저를 사용하여 흥분될 경우 예상되는 강도로 수용체 스펙트럼을 계산하기 위해 적용되었으며, 이 경우 청록색4nm(도3G). 이것은 FRET가 단일 405 nm 레이저 라인으로 흥분될 때 혼합되지 않은 기증자 및 수용자 신호가 절대 강도에서 비교할 수 있도록 합니다. 핵염으로 표지된 비-전염된 세포, DRAQ5(도3H)는DRAQ5(도3I)의순수한 스펙트럼을 얻기 위해 활용되었다. 기증자의 스펙트럼을 결합하여 청록색(도3F),수용자, 금성(도3G),및 DRAQ5(도3I),3성분 라이브러리(도3J)가만들어졌다.

형광 라벨 이외의 소스로부터의 신호도 샘플에 존재할 수 있다. 이를 고려하기 위해 424nm, 504nm 및 574 nm에서 발생하는 피크를 가진 세 가지 스펙트럼 시그니처가 라벨이 없는 셀룰러 샘플 내에서 확인되었습니다. 우리는 이 스펙트럼 서명이 커버슬립 반사및 세포 매트릭스 또는 세포 자동 형광에 해당한다고 믿습니다. 그림 4는 이 세 가지 배경 스펙트럼 서명의 출처를 묘사합니다. 이러한 신호는 샘플 내에서 균일하게 분산되므로 단순히 빼낼 수 없습니다. 그러나 이러한 신호의 스펙트럼 서명을 스펙트럼 라이브러리에 추가하고 선형 언믹싱을 사용하여 신호를 분리하면 FRET 효율성을 계산하기 전에 기증자 및 수용자 신호에서 이러한 혼란스러운 신호를 제거하는 접근 방식을 제시합니다. 이를 위해 3인조 스펙트럼 시그니처를 3성분 스펙트럼 라이브러리에 추가하여 기증자(청록색), 수락자(금성), DRAQ5 및 3개의 배경 스펙트럼 서명으로 구성된 새로운 6성분 라이브러리를 형성했습니다.

사용자 지정 프로그래밍 스크립트는 스펙트럼 이미지 데이터를 개별 구성원으로 혼합하기 위해 작성되었으며 후속 FRET 효율성 계산을 수행하기 위해 별도의 스크립트가 작성되었습니다. 선형 스펙트럼 언믹싱(도 5에도시됨)은 6성분 스펙트럼 라이브러리를 사용하여 수행하였다. 혼합 해제는 축 이미지 스택의 각 슬라이스에 대해 수행되었으며, z-stack이라고도 합니다(도 5A에서원시 스펙트럼 이미지 데이터의 3차원 시각화를 참조). 이로 인해 z-스택의 각 z-슬라이스에 대해 각 최종 멤버에 대해 별도의 혼합되지 않은 이미지가 생성되었습니다(그림5C-E,배경 혼합되지 않은 이미지가 표시되지 않음). 원하는 경우, 혼합되지 않은 신호는 각 혼합신호(도 5F-H)에할당된 다른 색상으로 시각화를 위해 잘못된 색일 수 있다.

그림 6은 FRET 효율 계산과 관련된 단계뿐만 아니라 FRET 효율을 cAMP 수준으로 매핑하는 단계를 보여 줍니다. 부드러운 혼합되지 않은 기증자 및 수용자 이미지를 사용하여 FRET 효율 이미지가 생성되었습니다. 이진 마스크 이미지는 혼합되지 않은 기증자, 수용자 및 핵 이미지를 사용하여 얻어졌습니다. 마스크는 FRET 효율 이미지에 적용되어 셀 외부의 픽셀에서 기여도를 제거했습니다. 단일 z-슬라이스의 혼합되지 않은 이미지가 FRET 효율 측정의 화보 데모에 사용되었지만 이러한 계산은 3차원 이미지 스택 내의 각 슬라이스에서 수행되었습니다. 그런 다음 3차원 FRET 이미지 데이터 세트를 3개의 직교 평면으로 다시 슬라이스하여 cAMP 신호의 공간 그라데이션을 다른 방향으로 시각화했습니다.

FRET 효율 및 cAMP 수준의 고뇌스트 로 인한 변화 시각화
위에서 설명한 단계는 하이퍼스펙트럼 이미지 데이터에서 FRET 효율 및 cAMP 수준을 세 가지 공간 차원으로 계산하는 방법을 제공합니다. 이러한 단계는 산림과 같은 cAMP 반응을 유도하는 화합물로 치료 전후의 세포 제제에 적용될 수 있다. 여기서는 50μM 포스콜린으로 치료한 후 PMVEC에서 FRET 및 cAMP 분포의 변화를 관찰하기 위해 이 접근법을 사용하는 예를 제공합니다. 도 7은 다양한 XY 평면 슬라이스(z 슬라이스)의 FRET 효율 및 cAMP 수준 변화를 보여 주며, 기저 조건(포스콜린 처리 전)과 10분 후처리를 허용합니다. 본 예에서, FRET 효율이 감소(도 7에서열 1 및 3) 포스콜린 처리시, cAMP 레벨의 증가와 상관관계가 있다(도 7에서2 및 4). 단일 XY 평면 내에서 cAMP의 최소한의 공간 변형이 관찰되었습니다. 그러나, 축(근기-기저) cAMP 공간 그라데이션이 관찰되었으며, 이는 포스콜린 처리 후 의기질 슬라이스(도 7의기둥 4)보다 더 깊은 적색(적용된 색 조회테이블을 통해 더 높은 cAMP 수준을 나타내는)을 가지고 있음을 지적함으로써 관찰될 수 있다. 축 FRET 또는 cAMP 분포는 종종 두 개의 정형 조 공간 평면에서 얻은 이미지를 사용하여 더 나은 시각화 할 수 있습니다 : 그림 8베이스 라인에서 YZ 평면의 FRET 효율과 cAMP 수준을 묘사 (열 1 과 2) 및 10 분 후 forskolin 처리 (열 3 및 4), 보충 도 2는 FRET 효율과 CAMP 레벨의 변화를 묘사하면서 XZ 의 CAMP 수준 변경. 이러한 결과는 FRET를 측정하고 3차원 하이퍼스펙트럼 이미지 데이터에서 cAMP 수준을 추정하는 타당성을 입증하고 FRET 또는 cAMP의 축 분포를 시각화하는 것의 중요성을 입증합니다. 이 방법론 논문의 범위를 넘어서는 동안, 순환 뉴클레오티드의 축 공간 분포가 순환 뉴클레오티드 신호 경로 내의 특이성에 기여할 수 있다.

전술한 방법을 수행할 때, 단계의 정확성을 꼼꼼하게 점검하고 적절한 실험 및 차량 제어를 실행하여 FRET(및 해당 cAMP)의 변화가 기증자 및 수용자 신호의 실제 변경으로 인한 지 확인하고 이미징 아티팩트가 아님을 확인하는 것이 중요합니다. 예를 들어 고려해야 할 중요한 단계는 다음과 같습니다.

필요한 모든 스펙트럼 구성 요소를 포함하는 적절한 스펙트럼 라이브러리 사용
언급했듯이, 세포 자동 형광, 증착 매트릭스 또는 커버 슬립에서 반사 된 빛으로부터 배경 신호의 상당한 기여가있을 수 있습니다 (여기 방출 출혈을 통해 출혈). 도 9는 스펙트럼 데이터를 혼합해제하는 데 3성분(청록색, 금성 및 DRAQ5) 라이브러리를 사용했을 때 배경 신호가 이미지 내에 유지되었다는 것을 보여주는 예제 데이터 집합을 나타냅니다. 대조적으로, 보다 완전하고 적절한 6성분 스펙트럼 라이브러리를 사용할 때 배경 신호가 효과적으로 제거되었습니다.

최적의 임계값을 사용하여 셀 마스크를 생성합니다.
우리가 수행한 많은 실험에서, 배경 신호 강도는 원시 스펙트럼 이미지 데이터 내에 존재하는 FRET 신호 강도의 약 50-60%입니다(즉, 처리되지 않은 스펙트럼 이미지 데이터를 시각화할 때 FRET 신호의 피크는 주변 배경 신호보다 ~2배 더 높습니다). 따라서, 이진 마스크를 얻기 위해 임계 값을 사용하여 전경 신호로부터 배경 신호를 분리하는 것은 민감한 단계이며 분석 아티팩트를 피하기 위해 신중하게 수행해야 한다. 도 10은 셀 의 이진 마스크를 작성하기 위해 셀 세분화에 적용된 다른 임계값값의 효과를 보여 줍니다. 낮은 임계값은 표현 셀의 일부로 배경 신호를 포함할 수 있다. 다른 한편으로는, 지나치게 높은 임계값은 낮은 기증자 +수용자 신호 (FRET 프로브의 낮은 지역 농도가 있을 수 있는 세포의 아주 얇은 부분 또는 부분)를 가진 세포의 낮은 발현 세포 또는 지구에서 FRET의 측정을 배제할 수 있습니다.

기증자+수용자 신호 강도≥ 백그라운드 신호로 감염된 셀 선택
도 11은 선형 스펙트럼 해제를 위한 6성분 스펙트럼 라이브러리를 사용하여 얻은 혼합되지 않은 이미지에서 FRET 효율성 및 해당 수준을 측정한 예제 데이터 집합을 보여 줍니다. 6성분 라이브러리를 사용하여 스펙트럼 이미지 데이터를 혼합하고 세포 테두리및 핵 마스크를 만들기 위한 높은 임계값을 선택했음에도 불구하고 FRET 효율 이미지는 여전히 셀의 기초 측 근처에서 높은 배경 잡음 신호에 취약한 경향이 있었습니다. 이 경우, 배경 잡음의 존재는 FRET 프로브를 약하게 발현한 셀의 선택으로 인한 것이었으며, 기증자+수용자 신호 강도는 혼합 해제 후에도 배경 신호 강도와 거의 동일했다. 따라서, 상술한 정교한 분석 단계를 적용하는 것 외에도, 높은 품질의 결과를 보장하기 위해 수집 시 FRET 프로브의 충분한 발현과 그에 상응하는 충분한 FRET 신호(기증자 및 수용자 신호 이상 동일 또는 소음 신호 이상)를 가진 셀을 선택하는 것도 중요하다.

Figure 1
그림 1: 하이퍼스펙트럼 FRET 이미징 및 분석을 사용하여 3개의 공간 차원에서 FRET 효율성 및 레벨 측정에 관련된 단계를 묘사하는 Flowchart. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
도 2: 세포로부터 cAMP FRET 리포터(green) 및 핵을 발현하는 세포의 3차원 시각화(red). 니콘 A1R 스펙트럼 공초점 현미경을 사용하여 획득한 원시 스펙트럼 이미지 데이터는 파장에 따라 거짓으로 표시되어 있으며 NIS Elements 소프트웨어를 사용하여 3 차원에서 시각화되었습니다. A) 기준선 및 B에서 3차원 영상 데이터) 50 μM 포스콜린 처리 후 10분. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 연구에서 형광 라벨의 순수한 스펙트럼을 포함하는 스펙트럼 라이브러리의 건설(원격 감지 필드에 의한 엔멤버라고 함). A) 405 nm 암초에서 획득 한 FRET 바이오 센서를 표현하는 세포의 거짓 색 이미지 (기증자 여기). B) FRET 신호에 대응하는 스펙트럼: 4개의 상이한 관심 영역(ROI)이 빨간색, 노란색, 파란색 및 녹색 사각형으로 표시된 이미지 A에 그려졌습니다. 선택한 각 ROI에 대한 각 파장의 평균 강도가 내수출되었다. 이들 4개의 ROI에서 평균 강도는 각 방출 파장에서 플롯되었다. 스펙트럼의 방출 피크는 기증자 (청록색) 및 수용자 (금성) 형광모두에 해당합니다. C) 488nm 난로에서 획득한 FRET 바이오센서를 발현하는 세포의 거짓 색 이미지(수락자 여기). D) 평균 스펙트럼은 C의 여러 ROI(A와 동일한 영역)에서 B에서 설명된 바와 같이 추정되었으며, 이는 수용자로만 인한 배출 피크입니다. E) 514 nm 조사에 의해 수용체 형광소의 사진 파괴 후 405 nm 난초에서 획득 된 FRET 바이오 센서를 표현하는 세포의 거짓 색 이미지. F) 평균 스펙트럼은 기증자만으로 인한 배출 피크와 E (A와 동일한 영역)의 여러 ROI에서 B에서 설명 된 것으로 추정되었다. 참고 원래 FRET 신호의 것과 비교했을 때 기증자 강도가 F에서 증가하며, 이는 수용자의 표백 후, 기증자 여기가 직접 기증자 배출로 이어지고 있음을 나타낸다. G) 405 nm 여기를 사용하여 얻을 경우 예상대로 수용자 스펙트럼. 이는 405nm 및 488nm 암내 레이저가 분광계및통합구(보충도 1)와금성의 파장 의존적 멸종 계수를 통합할 수 있는 선형 반응을 갖는다는 사실을 활용하여 추정되었다. 따라서 488nm 암초에서 얻은 금성 스펙트럼은 405nm 암분 H)에서 얻을 경우 예상되는 금성 스펙트럼으로 변환할 수 있으며, 핵 라벨, DRAQ5로 표시된 세포의 거짓 색 이미지이다. I) H. J) 기증자와 DRAQ5의 정규화된 순수 스펙트럼과 수용자의 난리-보정 스펙트럼을 포함하는 결과 스펙트럼 라이브러리의 여러 영역에서의 평균 스펙트럼. 청록색과 금성 스펙트럼은 청록색 + 금성 스펙트럼 데이터의 최대 값으로 정상화되었으며 DRAQ5는 단순히 최대 방출 파장의 값으로 통일로 정상화되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 배경 스펙트럼 서명이 식별되어 혼합 해제 프로세스 중에 배경 형광 신호를 설명하기 위해 스펙트럼 라이브러리에 포함되었습니다. A, B) 샘플 블랭크(레이블이 없는 커버슬립)를 특성화할 때 두 개의 배경 형광 스펙트럼 시그니처가 관찰되었다. 이 스펙트럼 시그니처는 424nm(커버슬립 형광에서) 및 504 nm(반사또는 백 산란가능성이 있음)의 피크 파장에 따라 명명되었습니다. C) 비표지 세포가 분석되었을 때, 잠재적으로 세포 자동 형광 또는 기본 매트릭스의 형광으로부터 분석될 때 제3 배경 스펙트럼 시그니처가 574 nm의 피크 방출 파장을 관찰하였다. D) 이미지 A, B 및 C에서 추출된 배경 스펙트럼. 이러한 세 가지 배경 스펙트럼은 기존의 3성분라이브러리(그림 3J)에첨가되어 6성분 스펙트럼 라이브러리를 개발하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 배경 신호를 차지하는 6성분 스펙트럼 라이브러리를 사용하여 선형 스펙트럼 해제. A) 축 z 스택으로 획득 된 원시 스펙트럼 이미지 데이터. B) 원시 스펙트럼 데이터를 선형으로 혼합하는 데 사용되는 6성분 스펙트럼 라이브러리. C, D 및 E) 회색 스케일비혼합 이미지DRAQ5, 청록색 및 금성, 각각 선형 스펙트럼 언믹스에서 발생. F, G, H) DRAQ5, 청록색 및 금성의 거짓 색 혼합 되지 않은 이미지 각각. 배경 신호의 혼합되지 않은 이미지도 계산되었습니다 (이 방법론에 대한 형광 레이블만 관심을 가지므로 여기에 표시되지 않은 데이터 - 안남데불라의 도 4를 참조, 등. 혼합되지 않은 배경 신호의 예25). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: 혼합되지 않은 스펙트럼 이미지 데이터에서 FRET 및 cAMP 수준을 계산하는 데 관련된 단계를 설명하는 순서도입니다. A) 기증자, 청록색의 대표적인 혼합 이미지. B) 대표 의 혼합 이미지 의 수용자, 금성. C) 핵의 대표적인 혼합 이미지, DRAQ5. D) 이진 세포 마스크는 혼합되지 않은 기증자 +수용자 합계 이미지를 임계값화하여 생성됩니다. E) 핵의 이진 마스크를 만들기 위해 핵 이미지에 임계값이 적용됩니다. F) 픽셀 현명한 FRET 효율은 혼합되지 않은 기증자 및 수용자 이미지에서 계산되었습니다. G) 복합 이진 마스크는 세포 경계와 핵 마스크에서 만들어졌습니다. H) 마스크 FRET 효율 이미지 : 복합 세포 마스크는 세포 외부와 핵 내에서 비 특이적 FRET 신호를 제외하기 위해 FRET 효율 이미지에 적용되었다. I) 마스크 된 FRET 효율 이미지에 컬러 맵을 적용하여 FRET의 공간 변화를 더 잘 시각화했습니다. J) FRET 효율 이미지에서 추정된 cAMP 레벨 이미지입니다. K) 컬러맵이 적용되어 cAMP의 공간 변화를 더 잘 시각화했습니다. 오른쪽에 표시된 컬러바는 FRET 효율(상단 패널) 및 cAMP 수준(하단 패널)을 시각화하는 데 사용되었습니다. 이 그림에 표시된 이미지는 단일 축 z 슬라이스를 나타내지만 이 그림에 설명된 분석 작업은 전체 축 z 스택에서 수행됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
그림 7: PMVECs에서 시각화된 산림 유발 FRET 효율 및 cAMP 공간 그라데이션. XY 평면 이미지는 축(Z) 방향으로 3차원 재구성된 FRET 및 cAMP 이미지 데이터를 세포의 기저 측으로 재구성하여 생성하였다. 5개의 연속 XY 슬라이스가 표시됩니다. 컬럼 1과 3은 각각 50 μM 포스콜린으로 치료 후 기준선및 10분에서 FRET 효율을 나타낸다. 컬럼 2와 4는 기준선에서 의 수준을 나타내고 산림 치료 후 10분 후에 수치를 나타냅니다. 컬러바는 색상맵의 변화를 FRET 효율(상단) 및 cAMP 수준(아래쪽)과 연관하는 데 사용되었습니다. 열 2및 열 4의 이미지에 표시된 흰색 선은 선택한 줄에서 cAMP 신호의 강도 프로파일(라인 스캔 프로파일)을 생성하는 데 사용됩니다. 베이스라인(blue profile)에서 세포의 중간 슬라이스로부터 얻은 강도 프로파일 플롯(blue profile) 및 포스콜린 처리 후(green profile)는 라인 스캔을 통해 cAMP 신호의 공간 분포를 보여 준다. 배율 막대는 20 μm을 나타냅니다.

Figure 8
도 8: 산림 유발 FRET 효율 및 축 방향으로 시각화된 cAMP 공간 그라데이션. YZ 평면 이미지는 측면(X) 방향으로 3차원 재구성된 FRET 및 cAMP 이미지 데이터를 셀의 왼쪽에서 오른쪽으로 재구성하여 생성하였다. 컬럼 1과 3은 각각 50 μM 포스콜린 처리 후 기준선및 10분에서 FRET 효율을 나타낸다. 컬럼 2와 4는 베이스라인에서 cAMP 수준을 나타내고 포스콜린 치료 후 10분 후에. 오른쪽의 컬러바는 색상맵의 변화를 FRET 효율(상단) 및 cAMP 수준(아래쪽)과 관련이 있는 데 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 9
그림 9: FRET 및 cAMP 레벨 이미지를 계산하기 위한 3성분 또는 6성분 스펙트럼 라이브러리를 활용하는 효과의 비교입니다. 배경 스펙트럼 서명을 고려하지 않은 3구성 요소 라이브러리를 사용하여 계산된 이미지에서 비특이적 배경 신호가 관찰되었습니다. 이것은 50 μM 산림 처리 (열 2)를 따르는 세포의 기저 측 부근의 이미지에 특히 사실이었습니다. 대조적으로 배경 신호 아티팩트는 배경 스펙트럼 시그니처가 포함된 6성분 라이브러리를 사용하여 셀을 분할하고 FRET 및 cAMP 신호를 분석하는 기능을 개선할 때 효과적으로 제거되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 10
그림 10: 셀 및 핵 테두리를 묘사하기 위해 적절한 임계값을 선택하지 않으면 이미지 분석 아티팩트를 도입할 수 있습니다. 혼합되지 않은 기증자 및 수락자 이미지는 0.35(열 1as 2), 0.65(열 3 및 4) 및 0.9(열 5 및 6)의 세 가지 임계값을 가진 마스크를 만드는 데 사용되었습니다. 열 1, 3 및 5는 기준선에서 FRET 효율을 표시합니다. 컬럼 2, 4, 6은 50 μM 포스콜린 처리 후 10분 만에 FRET 효율을 표시합니다. 너무 낮은 임계값을 선택하면 배경 또는 세포 외 영역의 일부가 분석을 위해 셀에 포함되고 셀의 일부가 손실되는 임계값을 선택하면 셀의 일부가 손실됩니다(열 3-4에 비해 열 4-5의 apical 슬라이스 참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 11
그림 11: 배경 신호 아티팩트는 배경이 혼합해제되고 이진 마스크를 만드는 동안 적절한 임계값을 선택한 후에도 계속 지속될 수 있습니다. 열 1은 기준선과 열 2에서 대표적인 정맥, 중간 및 기저 슬라이스를 50 μM 포스콜린 처리 후 10분에서 동일하게 나타낸다. 배경 신호를 차지하는 언믹싱을 위한 6성분 라이브러리를 사용하고 이진 마스크 생성을 위해 0.85의 더 높은 임계값을 활용했음에도 불구하고 배경 영역은 여전히 세포의 일부로 확인되었으며, 특히 산림 치료 후. 이 경우, 가능한 설명은 FRET 리포터의 약한 발현을 가진 세포가 이미징을 위해 선택되었다는 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보조 도 1: 소프트웨어에서 레이저 설정의 함수로서 레이저 라인 강도측정. 405nm 레이저 라인과 488nm 레이저 라인에 대한 레이저 강도를 측정하기 위해 광섬유 결합 분광계및 통합 구를 NIST 추적 가능한 램프로 보정하였다. A) 405 nm 레이저의 상이한 레이저 강도에 대응하는 현미경 단계에서 측정된 총 광자 수. B) 488 nm 레이저의 다른 레이저 강도에 대응하는 현미경 단계에서 측정된 광자의 총 수. 레이저 강도의 선형 반응은 현미경 단계에서 측정된 레이저 모두에 대해 관찰되었다. 선형 추세선이 적합하고 각 레이저 라인에 대한 추세선 방정식이 405nm 레이저 라인(기증자 여기)으로 흥분될 경우 예상되는 수용자 스펙트럼을 계산하는 데 사용되었습니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보조 도 2: 산림 유발 FRET 효율 및 축 방향으로 시각화된 cAMP 공간 그라데이션. XZ 평면 이미지는 측면(Y) 방향으로 3차원 재구성된 FRET 및 cAMP 이미지 데이터를 셀의 앞쪽에서 뒤로 재구성하여 생성하였다. 컬럼 1과 3은 각각 50 μM 포스콜린 처리 후 기준선및 10분에서 FRET 효율을 나타낸다. 컬럼 2와 4는 베이스라인에서 cAMP 수준을 나타내고 포스콜린 치료 후 10분 후에. 오른쪽의 색상 막대는 색상맵의 변화를 FRET 효율(상단) 및 cAMP 수준(아래쪽)과 관련이 있는 데 사용되었습니다. YZ평면(도 8)에대해 도시된 결과와 유사하게, FRET 효율 및 cAMP 수준에서 기저 공간 그라데이션에 대한 기준조건(컬럼 1-2의 임의의 슬라이스)과 50 μM 포스콜린 처리(컬럼 3-4) 이후 단일 YZ 슬라이스의 상단에서 바닥으로 색의 변화로 시각화될 수 있다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

FRET 바이오센서의 개발은 단일 세포에서 순환 뉴클레오티드 신호의 측정 및 시각화를 허용하고, 세포 외 신호 이벤트13,22,37,38을시각화하기위한 큰 약속이있다. 그러나 FRET 바이오 센서의 사용은 많은 형광 단백질 계 FRET 리포터의 낮은 신호-잡음 특성 및 FRET 기자의 약한 트랜스퍼션 또는 발현 효율을 포함하여 몇 가지한계를제시한다(이는 PMVEC와 같은 특정 세포주에서 특히 어려울 수 있음)23,24. 약하게 발현된 형광 단백질의 이미징은 비메트릭 FRET 계산과 결합되어 종종 계산된 FRET 효율에서 높은 수준의 불확실성 또는 변동을 초래합니다. FRET 측정의 신뢰성을 향상시키기 위한 노력의 일환으로, 당사와 다른 사람들은 이전에 FRET 신호를 측정하고 형광 라벨과 자동 형광 효과26,31,32,39사이의 형광 신호를 통해 교차토크 또는 출혈을 줄이기 위해 하이퍼스펙트럼 이미징 및 분석의 사용을 입증했습니다. 신호 강도의 한계로 인해 이러한 스펙트럼 FRET 연구는 최근까지 2개의 (X 및 Y) 공간 치수로 제한되었습니다. 따라서 셀 내에서 FRET 변경의 단일 슬라이스 보기를 제공했습니다.

최근 연구에서, 우리는 FRET (및 해당 cAMP 수준)가 XY 평면뿐만 아니라 XZ 및 YZ 비행기(25)를가로 질러 공간적으로 분산된 것으로 나타났다고 지적했습니다. 여기에서 설명한 하이퍼스펙트럼 FRET 화상 진찰 접근은 FRET및 순환 뉴클레오티드 (cAMP)를 3개의 공간 차원으로 시각화하고 측정하는 우리의 기능을 확장하여 신호 구획화를 평가하기위한 새로운 가능성을 열어줍니다. 이 4차원(X, Y, Z 및 λ) 하이퍼스펙트럼 이미징 및 분석 접근 방식을 통해 cAMP 그라데이션을 3개의 공간 차원으로 측정하고 시각화할 수 있으며, 균일하지 않은 배경 신호를 고려합니다. 여기서, 우리는 산림 유도 cAMP 공간 그라데이션의 예를 통해이 접근 방식을 구현하는 방법을 보여 주었다. 후처리 영상 데이터에서, cAMP 공간 그라데이션은 세포의 기저측으로 정포에서 관찰될 수있다(도 7 및 도 8). 산림을 치료할 때 생성된 cAMP는 세포-세포 접합부(도7 및 도 8)에도달하지 못하는 것으로 나타났다.

여기에 설명된 방법론을 활용하여, FRET 효율성의 정확한 추정을 허용하기 위하여 배경 및 자동 형광 신호의 다른 근원을 고려하는 것이 중요했습니다. 선형 언믹싱은 서명이 관심 있는 형광 프로브와 다른 경우 고유한 배경 스펙트럼을 고려할 수 있는 잠재적인 방법을 제공합니다. 특히 선형 언믹싱은 표준 배경 빼기보다 배경 및 자동 형광 신호를 분리하는 데 더 적합합니다. 40,41,42 에 도시된 예에서, 서명의 피크 방출 파장에 기초하여 이름을 세 가지 상이한 스펙트럼 시그니처를 측정하고 할당하였다: 424 nm 배경 스펙트럼(커버슬립 형광에서), 504 nm 배경 스펙트럼(반사 또는 백-산란 광때문일 가능성이 있음), 및 574 nm 배경 스펙트럼(아마도 세포세포 로 인한 세포 형). 이러한 서명을 고려하지 못한 효과를 설명하기 위해 두 개의 스펙트럼 라이브러리가 만들어졌으며 혼합되지 않은 이미지가 비교되었습니다. 첫째, 샘플, 청록색, 금성 및 DRAQ5에 형광 라벨만 포함하는 스펙트럼 라이브러리를 만들고 3성분 라이브러리에 레이블을 지정했습니다. 둘째, 세 가지 배경 스펙트럼 서명이 추가로 포함된 스펙트럼 라이브러리가 생성되어 6구성 요소 라이브러리에 레이블을 지정했습니다. 상기와 같이, 6성분 라이브러리(배경 혼합 해제)와 혼합을 해제하면 배경 신호를 제거할 수 있었지만, 3성분 라이브러리와의 혼합해제는 하지않았다(그림 9). 이전 작업에서는 형광 레이블과 배경 서명을 모두 차지하는 스펙트럼 라이브러리를 사용할 때 선형 언믹싱과 관련된 루트 평균 제곱 오차(RMSE)가 감소하는 것으로 나타났습니다. 배경 형광의 축 분포는 종종 균일하지 않으므로 간단한 배경 빼기가 이미지 데이터를 수정하기 위해 작동하지 않는다는 점에 유의해야합니다. 따라서 정확한 배경 제거 및 신뢰할 수 있는 FRET 측정을 제공하기 위해 스펙트럼 미혼 방식이 필요합니다.

스펙트럼 이미지를 획득할 때 최상의 시스템 및 카메라 설정을 선택하도록 시스템 매개 변수를 최적화하는 것이 중요합니다. 전반적인 목표는 SNR을 최적화하는 동시에 획득 시간을 최소화하고 광표백을 방지하는 것입니다. 43 따라서 이미징 시스템을 최적화할 때 공간, 시간적 및 스펙트럼 해상도 간의 타협이 종종 필요합니다. 이러한 연구에서는 고정 구멍 크기, 레이저 전력, 스캔 속도, 스캔 크기 및 프로토콜 섹션에 설명된 프레임 평균을 포함한 시스템 및 카메라 설정에 대해 최적의 값을 선택했습니다. 이러한 설정을 활용하여 80nm/픽셀의 공간 샘플링, 스펙트럼 z 스택당 ~3분의 시간 샘플링(~10초/XY 이미지) 및 10nm 간격의 스펙트럼 샘플링은 무시할 수 있거나 최소한의 광표백으로 달성된다.

FRET 효율의 정확한 추정을 보장하기 위해 기증자 및 수용자 스펙트럼을 1:1 스토이치오메트리 및 동일한 흥분 파장(그림3)으로예상할 수 있으므로 측정할 필요가 있습니다. 청록색과 금성 스펙트럼은 청록색 피크 방출 파장에 대하여 정상화되었다. 이 스펙트럼 라이브러리를 사용하여 추정된 FRET 효율은 문헌12,22에보고된 것과 유사한 값을 생산했다. 일반적으로 라이브러리의 최종 멤버 스펙트럼은 통합으로 정규화됩니다. 그러나 FRET 효율을 정확하게 계산하려면, 수용자 스펙트럼은 기증자 스펙트럼(즉, 근접 농도 또는 1:1 stoichiometry에서)에 대하여 획득되어야 하며 동일한 흥분 파장을 참조해야 한다. 제대로 구성된 라이브러리를 사용하는 것 외에도 FRET 효율을 적절히 평가하고 분석 아티팩트를 피하는 데 몇 가지 단계가 수반됩니다. 여기에는 적절한 신호강도(도 11)를가진 표현 세포를 선택하는 것이 포함되며, FRET 효율을 추정하기 전에 혼합되지 않은 이미지의 스무딩(Gaussian blur가 이 예에서 적용됨), 적절한 임계값을 사용하여 마스크를 생성하도록(도10),기증자 및 수용자의 소멸 계수를 이용한 교정 계수의 추정(보충 File_Spectral 라이브러리). 이러한 단계를 수행하면 FRET 효율 및 기본 cAMP 수준의 3차원 분포가 단일 셀에서 정확하게 시각화될 수 있습니다.

국소화된 cAMP 신호는 표적 FRET 바이오센서(13,37)를사용하여 2차원으로 추정되었다. 그러나, 특정 세포 구획에 FRET 프로브를 대상으로 (예를 들어, 플라즈마 멤브레인 또는 지질 뗏목) 일반적으로 프로브의 증가 국소 농도 결과. 이로 인해 분자 간 또는 이중 분자 FRET로 인해 측정 아티팩트가 도입될 수 있습니다. 또한, 2018년 안남데불 et.al 에서 발표된 결과, 세포측정A25는 용해성 또는 표적 프로브로부터 FRET의 3차원 측정의 중요성을 입증한다.

3개의 공간 차원에서 cAMP 신호를 측정하는 것이 중요하지만, 이 접근법에는 한계가 있습니다. 가장 제한적인 제한은 스펙트럼 z 스택당 약 3분이라는 긴 획득 시간이 필요합니다. 이 획득 속도는 세포에서 준 이외의 것을 검출하기 위한 이 접근 법을 사용하는 것을 배제합니다 - 세포에 있는 꾸준한 상태 cAMP 분포. 즉, 제시된 결과는 표준 2차원(x, y) 측정에 중요한 보완으로서 준-정상 상태 3차원(x, y, z) cAMP 측정을 포함하는 것의 중요성을 입증합니다. 미래에 는 실험 적인 디자인에 표지된 단백질 및 세포 구조를 통합하는 것이 흥미로할 것입니다. 단백질(및/또는 구조물)을 라벨에 붙이는 데 사용되는 형광의 신중한 선택은 추가적인 획득 속도 손실 없이 표지된 단백질 및 FRET의 3차원 분포에 대한 평가를 허용할 것입니다. 이를 통해 3개의 공간 차원에서 표지된 단백질 근처의 국소화된 cAMP 신호 및 cAMP 신호를 측정할 수 있으므로 표적 cAMP 프로브에 중요한 실험적 보완을 제공하고 살아있는 세포내3차원 cAMP 분포의 하이퍼스펙트럼 측정의 유용성을 더욱 확대할 수 있습니다.

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Disclosures

리프슬리 박사와 리치 박사는 스펙트럼 이미징 기술을 상용화하기 위해 설립된 스타트업 회사인 SpectraCyte, LLC에 대한 재정적 관심을 공개합니다. 그러나 이 프로토콜에 설명된 모든 절차는 SPECtraCyte, LLC와 관련이 없는 상업적으로 이용 가능한 제품을 사용하여 수행되었습니다.

Acknowledgments

저자는 H188 cAMP FRET 바이오 센서와 케니 트린 (사우스 앨라배마 대학)을 제공하는 데 도움이 우리의 사용자 정의 개발 프로그래밍 스크립트를 실행하는 데 걸린 시간을 줄이기 위해 우리에게 제공하는 박사 Kees Jalink (네덜란드 암 연구소 및 고급 현미경 검사법을위한 반 Leeuwenhoek 센터) 인정하고 싶습니다.

저자는 자금 출처를 인정하고 싶습니다: 미국 심장 협회 (16PRE2713004), 국립 과학 재단; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL0666299).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Attofluor Cell Chamber Invitrogen A7816 Attofluor contains steel cell chambers and a rubber O-ring. Cell chamber holds the coverslip and O-ring provides a lock in mechanism to hold the buffer in cell chamber with out leakage
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific BP231-100 Solvent used to prepare stock solution forskolin.
DRAQ5 Fluoroscent Probe Solution Thermo Scientific 62252 Nuclear label
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965-092 Contains nutrients and growth factors for the cells to grow and divide in the culture dishes.
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F6178 Growth factor suppliment that is added to culture medium, DMEM
Forskolin Sigma F3917 Adenyly cyclase activator.
H188 Cyclic AMP FRET biosensor Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink Gift Plasmid encoding Turquoise (donor fluorophore), Venus (acceptor fluorophore), and binding domain obtained from Epac.
Image J image.net Free download Another image processing platform used to extact spectral information and image processing.
Integrating Sphere Ocean Optics FOIS-1 Used to measure illumination intensity of the laser line at different laser intensities (?).
Laminin Mouse Protein, Natural Invitrogen 23017-015 Coverslips are coated with laminin and this helps in cell attachment, growth and motility of the cell.
Lipofectamine 3000 Transfection Kit Invitrogen L3000-015 Transfection reagent used to transfect cells with H188 FRET biosensor
MATLAB Mathworks R2019a Image processing operations (linear unmixing and FRET efficiency calculations) are performed by writing custom programs in MATLAB programming environment
Nikon A1R confocal microscope Nikon Instruments Nikon A1R Spectral image acquisition is performed using confocal microscope.
Nikon Elements Software Nikon Instruments Software dongle used to export and handle nd2 image files (multidimensional image files) that are aquired using Nikon A1R
NIST-Traceable Calibration Lamp Ocean Optics LS-1-CAL-INT A lamp with a known spectrum for use as a standard
PBS pH 7.4 (1X) Gibco 10010-023 coomonly used buffer suring cell culture
Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs) In house - Cell culture core, Univeristy of South Alabama Isolated from Rat pulmonary microvasculature PMVECs form inner lining of a blood vessel.
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Gibco 15140-122 antibiotics are added to culture medum to prevent contamination of the cells.
Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides Clay Adams 3010 Microscope slides used for cell fixation
ProLong Diamond Antifade Mounting Media Invitrogen P36961 If samples are fixed using antifade mountant, then the later protects fluoroscent dyes and chromophores from fading.
Spectrometer Ocean Optics QE65000 Used to measure spectral response of the light source (?)
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200-056 Digests the protein-protein bond between the cell and cell matrix and helps to disscociate and lift the cells during cell plating.
Tyrodes Buffer Made in-house Made in-house Tyrodes buffer is used to make working solutions and to maintain cells in aqueous solution during image acquisition.
6 Well Cell Culture Plate Corning 3506 Laminin coated coverslips are placed in 6-well culture dish (one coverlisps/well). Cells along with medium is added into each well.
25 mm Round Microscope Cover Slips Fisher Scientific 12545102 Cells were grown on round glass coverslips
60X Ojective Nikon Instruments Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 water immersion and commonly used objective for cells

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References

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생물학 문제 164 순환 AMP 공간 FRET 과스펙트럼 현미경 검사법 스펙트럼 FRET
4차원(x, y, z 및 λ) 하이퍼스펙트럼 FRET 이미징 및 분석을 사용하여 살아있는 세포에서 3차원 cAMP 분포 측정
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