Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Måling av 3-dimensjonale cAMP-distribusjoner i levende celler ved hjelp av 4-dimensjonale (x, y, z og λ) Hyperspektral FRET-avbildning og -analyse

Published: October 27, 2020 doi: 10.3791/61720
Automatic Translation
1,2, 3, 1, 3, 1,2, 1,2, 1,2,3
1Department of Pharmacology, University of South Alabama, 2Center for Lung Biology, University of South Alabama, 3Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama

Summary

På grunn av iboende lavt signal-til-støy-forhold (SNR) av Fӧrster resonansenergioverføringssensorer (FRET), har måling av cAMP-signaler vært utfordrende, spesielt i tre romlige dimensjoner. Her beskriver vi en hyperspektral FRET-avbildnings- og analysemetodikk som tillater måling av cAMP-distribusjon i tre romlige dimensjoner.

Abstract

Syklisk AMP er en annen budbringer som er involvert i et bredt spekter av cellulære og fysiologiske aktiviteter. Flere studier tyder på at cAMP-signaler er inndelt, og at oppdeling bidrar til å signalisere spesifisitet innenfor cAMP-signalveien. Utviklingen av Fӧrster resonansenergioverføring (FRET) basert biosensorer har fremmet evnen til å måle og visualisere cAMP-signaler i celler. Disse målingene er imidlertid ofte begrenset til to romlige dimensjoner, noe som kan føre til feiltolkning av data. Til dags dato har det bare vært svært begrensede målinger av cAMP-signaler i tre romlige dimensjoner (x, y og z), på grunn av de tekniske begrensningene ved bruk av FRET-sensorer som iboende viser lavt signal-til-støy-forhold (SNR). I tillegg er tradisjonelle filterbaserte avbildningsmetoder ofte ineffektive for nøyaktig måling av cAMP-signaler i lokaliserte subcellulære områder på grunn av en rekke faktorer, inkludert spektral krysstale, begrenset signalstyrke og autofluorescens. For å overvinne disse begrensningene og la FRET-baserte biosensorer brukes med flere fluoroforer, har vi utviklet hyperspektrale FRET-avbildnings- og analysetilnærminger som gir spektral spesifisitet for beregning av FRET-effektivitet og evnen til å skille FRET-signaler fra forvirrende autofluorescens og/eller signaler fra ekstra fluorescerende etiketter. Her presenterer vi metodikken for implementering av hyperspektral FRET-avbildning samt behovet for å konstruere et passende spektralbibliotek som verken er undersamplet eller oversamplet for å utføre spektral unmixing. Mens vi presenterer denne metoden for måling av tredimensjonale cAMP-distribusjoner i pulmonale mikrovaskulære endotelceller (PMVEC), kan denne metoden brukes til å studere romlige fordelinger av cAMP i en rekke celletyper.

Introduction

Syklisk adenosinmonofosfat (cAMP) er en annen budbringer involvert i viktige cellulære og fysiologiske prosesser, inkludert celledeling, kalsiumtilstrømning, gentranskripsjon og signaltransduksjon. En voksende mengde bevis antyder eksistensen av cAMP-rom i cellen der signal spesifisitet oppnås1,2,3,4,5,6,7. Inntil nylig ble cAMP-oppdeling utledet basert på distinkte fysiologiske eller cellulære effekter indusert av forskjellige G-koblede reseptoragonister8,9,10,11. Mer nylig har FRET-baserte fluorescensavbildningssonder gitt nye tilnærminger for direkte måling og observasjon av cAMP-signaler i en celle12,13,14.

Förster resonans energioverføring (FRET) er et fysisk fenomen der energioverføring skjer mellom donor og akseptormolekyler på en ikke-radiativ måte når molekylene er i nærheten15,16. Med utviklingen av FRET-baserte fluorescerende indikatorer har dette fysiske fenomenet blitt brukt i biologiske applikasjoner for å studere proteinproteininteraksjoner17, proteinkolokalisering18, Ca+2 som signaliserer19, genuttrykk20, celledeling21 og syklisk nukleotidsignalering. FRET-baserte cAMP-indikatorer består vanligvis av et cAMP-bindingsdomene, en donorfluofor og en akseptorfluofor22. For eksempel består H188 cAMP-sensoren12,22 som brukes i denne metoden av et cAMP-bindingsdomene hentet fra Epac, smurt mellom turkis (donor) og Venus (akseptor) fluoroforer. Ved basale forhold (ubundet) er Turkis og Venus i en orientering slik at FRET oppstår mellom fluoroforene. Ved binding av cAMP til bindingsdomenet oppstår en konformasjonsendring slik at Turkis og Venus beveger seg fra hverandre, noe som resulterer i en reduksjon i FRET.

FRET-baserte bildemetoder tilbyr et lovende verktøy for å undersøke og visualisere CAMP-signaler i en celle. Imidlertid er nåværende FRET-baserte mikroskopiske avbildningsteknikker ofte bare delvis vellykkede med å oppnå tilstrekkelig signalstyrke til å måle FRET med subcellulær romlig klarhet. Dette skyldes flere faktorer, inkludert den begrensede signalstyrken til mange FRET-reportere, det høye presisjonsnivået som kreves for å nøyaktig kvantifisere endringer i FRET-effektivitet, og tilstedeværelsen av forvirrende faktorer, for eksempel cellulær autofluorescence23,24. Resultatet er ofte et FRET-bilde som er plaget av svak SNR, noe som gjør visualisering av subcellulære endringer i FRET svært vanskelig. I tillegg har undersøkelse av romlig lokaliserte cAMP-signaler nesten utelukkende blitt utført i bare to romlige dimensjoner, og den aksiale cAMP-fordelingen har sjelden blitt vurdert som25. Dette skyldes sannsynligvis at lav SNR hindret muligheten til å måle og visualisere cAMP-graderinger i tre romlige dimensjoner. For å overvinne begrensninger ved bruk av FRET-sensorer med lav SNR, har vi implementert hyperspektral avbildning og analysetilnærminger for å måle FRET i enkeltceller25,26,27.

Hyperspektral avbildning tilnærminger ble utviklet av NASA for å skille terrestriske objekter til stede i satellittbilder28,29. Disse teknikkene har siden blitt oversatt til fluorescensmikroskopifeltet30, med flere kommersielle konfektmikroskopsystemer som tilbyr spektraldetektorer. I tradisjonell (ikke-spektral) fluorescensavbildning er prøven spent ved hjelp av et båndpassfilter eller en laserlinje, og utslippet samles ved hjelp av et annet båndpassfilter, ofte valgt for å matche topputslippsbølgelengden til fluorofor(e). Til sammenligning søker hyperspektrale avbildningsmetoder å prøve en komplett spektralprofil av enten fluorescensutslippet26,31,32 eller eksitasjon33,34 ved bestemte bølgelengdeintervaller. I våre tidligere studier viste vi at hyperspektral avbildning og analyse tilnærminger kan tilby forbedret kvantifisering av FRET-signaler i celler sammenlignet med tradisjonelle filterbaserte FRET-avbildningsteknikker26. Her presenterer vi en metodikk for å utføre 4-dimensjonale (x, y, z og λ) hyperspektral FRET-avbildning og analyse for å måle og visualisere cAMP-distribusjoner i tre romlige dimensjoner. Disse metodene har tillatt visualisering av agonistinduserte cAMP-romlige gradienter i enkeltceller25. Interessant, avhengig av agonisten, kan cAMP-gradienter være tydelige i celler. Metodikken som presenteres her benytter spektral unmixing av ikke-jevn bakgrunn og cellulær autofluorescence for å forbedre nøyaktigheten av FRET-målingene. Mens denne metodikken er demonstrert i lungemikrovaskulære endotelceller (PMVEC) ved hjelp av en cAMP FRET biosensor, kan metodikken enkelt endres for bruk med alternative FRET-reportere eller alternative cellelinjer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokollen følger prosedyrer godkjent av University of South Alabama Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Celle-, prøve- og reagensforberedelse for avbildning

  1. Isoler rotte lungemikrovaskulære endotelceller (PMVEC) som beskrevet tidligere35.
    MERK: Celler ble isolert og dyrket av Cell Culture Core ved University of South Alabama, Mobile, AL på 100 mm cellekulturretter.
  2. Frøisolerte PMVECer på 25 mm runde glassdeksler og la dem vokse i inkubatoren ved 37 °C til cellene oppnår minst 80 % samløp (minst 24 timer).
    MERK: Celler og celletype kan variere fra studie til studie, og derfor bør cellespesifikke cellekulturprosedyrer følges for å frø og dyrke celler. Cellesåing og culturing protokoll som brukes i disse studiene er tilgjengelig som supplerende informasjon i filen som heter "Supplemental File_Cell Culture and Transfection".
  3. Transfekt PMVECs med en FRET biosensor og inkubere i 48 timer ved 37 °C.
    MERK: Protokollen for å transfektere PMVECer er også beskrevet i den ekstra informasjonsfilen "Supplemental File_Cell Culture and Transfection".
  4. På dagen for avbildning, varm Tyrodes buffer til 37 °C i et vannbad.
    MERK: Tyrodes buffer består av 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM glukose, 1 mM MgCl2 og 1 mM CaCl2
  5. Monter en dekslelip som inneholder transfekterte celler i et cellekammer og fest toppen med en monteringspakning for å forhindre lekkasje.
  6. Tørk av bunnen av dekslene ved hjelp av en delikat oppgaveserviett for å rengjøre overflødige medier eller adherentceller.
  7. Tilsett 800 μL arbeidsbuffer og 4 μL 5 mM kjernefysisk etikett til cellekammeret og rock forsiktig i 5 - 10 sekunder.
    MERK: Når du legger til buffer- eller reagensløsninger på deksler montert i cellekammeret, må du sørge for å legge til løsningen forsiktig og på siden av cellekammeret for ikke å løsne tilhengerceller. Ved å tilsette 4 μL 5 mM kjernefysisk etikett til 800 μL buffer, får 25 μM endelig konsentrasjon av kjernefysisk etikett. For løst tilhengerceller som HEK293-celler, bland kjernefysisk etikett og buffer i et hetteglass først, og legg deretter til deksler montert i cellekammeret. Dette vil forhindre å løfte cellene av dekslene.
  8. Dekk cellekammeret med aluminiumsfolie for å beskytte mot lys og inkubere i 10 minutter ved romtemperatur.
  9. Reagensforberedelse: Tilsett 1 μL 50 mM forskolin til 199 μL buffer. Dette vil produsere en endelig konsentrasjon av forskolin på 50 μM når den legges til celler som ble tilberedt med 800 μL buffer. 1 μL DMSO i 199 μL buffer bør også være forberedt på å brukes som en kjøretøykontroll.
    MERK: I disse studiene brukes forskolin som adenylcyklaseaktivator for å stimulere cAMP-produksjonen. Om ønskelig kan denne metoden enkelt modifiseres for å tillate behandling med alternative reagenser for å stimulere eller hemme adenylcyklase, fosfodiesteraser, etc.

2. Bildeoppkjøp

  1. Bruk et konfokalt mikroskop utstyrt med en spektraldetektor.
    MERK: Alle bildeinnhentingstrinnene som er skissert her, ble utviklet ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig Nikon A1R mikroskopsystem. Disse trinnene må kanskje justeres hvis du bruker et alternativt spektralmikroskop. Forsikre deg om at alt utstyr er slått på minst 30 minutter før starten av eksperimentet for å nå stabile driftsforhold.
  2. Velg målet om 60x vann nedsenking og legg til en dråpe vann til målet.
    MERK: For levende cellebilder med høy oppløsning anbefales det å bruke et høyt numerisk blendermål. Se materiallisten for informasjon om formålet som brukes i disse studiene.
  3. Plasser det lastede cellekammeret (fra trinn 1.7) på mikroskopstadiet.
  4. Velg DFT-filter (DAPI/FITC/TRITC) ved å stille inn filterknappen på høyre side av mikroskopet.
  5. Bruk mikroskopet i fluorescensmodus ved hjelp av okularene for å velge et synsfelt som inneholder celler som uttrykker cAMP FRET-sensoren.
    MERK: Forsikre deg om at den gjennomsnittlige intensiteten til FRET-signalet hos donoren eller akseptorens toppbølgelengde i den valgte cellen er minst 100 intensitetsenheter (A.U.) eller minst 4 ganger basissignalet til et område uten uttrykksceller. Dette kan bekreftes ved hjelp av spektrumprofilviseren som er tilgjengelig i NIS Elements-programvaren. Når du leter etter en celle med godt signal, anbefales det å kaste bort for lyse celler (de kan bli kompromittert).
  6. Åpne NIS-programvare, bytt til konfektmodus, lås opp laserlåsknappen og klikk på Live.
  7. Bruk fokusknappen til å fokusere på cellene ved å se på forhåndsvisningen på skjermen.
  8. Konfigurer innstillinger for enhet, anskaffelse og z-stakk i programvaren, som beskrevet nedenfor.
  9. Innstillinger for anskaffelse:
    MERK: Innstillinger for kamera- og enhetsanskaffelse kan brukes ved hjelp av et tidligere anskaffet bilde. Åpne bildet, høyreklikk og velg Bruk kamerainnstillinger på nytt.
    1. Åpne A1-innstillingsmenyen, merk av i boksene som tilsvarer 405 nm og 561 nm laserlinjer, velg SD for spektraldetektor, velg 10 for oppløsning og 31 for kanaler.
      MERK: A1-innstillingsmenyen vises som et lite tannhjulikon øverst til venstre i A1 Plus Settings-vinduet. 405 nm laser brukes til donoreksitasjon og 561 nm laser brukes til kjernefysisk etiketteksitasjon.
    2. Angi bølgelengdeområdet (410 – 730 nm) ved å velge start- og sluttbølgelengdeverdier.
    3. Klikk på ikonet for binning/hopp over på A1-innstillingsmenyen og merk av i boksen som er nummerert 15, og klikk deretter OK på A1-innstillingsmenyen.
      MERK: Dette er for å fjerne bølgelengdekanalen som tilsvarer 561 nm eksitasjonslaseren (dette er vanligvis den15. bølgelengdekanalen). Det er viktig å ikke bruke dette bølgelengdebåndet for å unngå et kunstig lavt signal, noe som kan skape en spektralartefakt. Signalet er lavere i dette båndet på grunn av den mekaniske fingeren som dekker detektorelementet for å beskytte det mot laserskader.
    4. Sett laserintensitetene til henholdsvis 8 % og 2 % for 405 nm- og 561 nm-laserne, Si Hv (detektorforsterkning) ved 149, og en radius på 2,4 luftige diskenheter (AU).
      MERK: Laserintensiteter må kanskje justeres avhengig av instrumentets alder og tilstand. Hvis du justerer laserintensiteter mellom ulike prøver eller eksperimentelle grupper, er det viktig å opprettholde det samme forholdet mellom laserintensiteter (f.eks. 8:2). I tillegg er det viktig å velge en laserintensitet som ikke er så lys som å skape rask fotobleaching. Detektorforsterkningen bør justeres for å maksimere signalintensiteten samtidig som detektorstøyen minimeres. For disse studiene ble det brukt en gevinst på 149. En pinhole-størrelse på 2,4 AU ble valgt som en balanse mellom å skaffe bilder med tilstrekkelig signal-til-støy-forhold (SNR) og opprettholde optisk seksjonering (konfokalitet). En økning i pinhole størrelse øker SNR, men reduserer confocality.
    5. Sett skannehastigheten til 0,25 spektralrammer per sekund, velg ikonet som tilsvarer enveis for skanneretning, angi 4 for tellingen og sett 1024 x 1024 for skannestørrelse.
      MERK: FRET-signaler er svake, og en langsom skannehastighet er ofte nødvendig. Ved hjelp av skannehastigheten på 0,25 fullføres oppkjøpet av en spektral z-stack på ~ 3 minutter. Skannehastigheten kan økes eller reduseres avhengig av fluoroforene som brukes. For eksempel, for lysere fluoroforer som eGFP, kan raskere skannehastighet (2 bilder / sekund) brukes. Tallet som er angitt under telling tilsvarer en rammegjennomsnittsverdi på 4, noe som bidrar til støyreduksjon under bildeanskaffelse. For svært stabile prøver og der tiden ikke er en begrensning, kan høyere gjennomsnittsverdier (opptil 16) brukes til å hente bilder med forbedret SNR.
  10. Definer z-stack-anskaffelsesparametere:
    MERK: Verdiene som er angitt i trinn 2.10, må kanskje justeres for å imøtekomme endringer i fluorescerende etikettbinding eller konsentrasjon, type etikett, antall etiketter som brukes, cellelinje og andre endringer i prøvepreparering som kan påvirke cellemerkingstetthet og/ eller cellulær autofluorescence. Ved justering av anskaffelsesparametere bør det utvises forsiktighet for å oppnå en tilstrekkelig SNR samtidig som fotobleaching minimeres. I tillegg, når du konfigurerer en spektral FRET-analyse, bør det tas hensyn til at parametrene fungerer godt på tvers av alle behandlingsgrupper. Det anbefales å kjøre en studie av hver behandlingsgruppe med de foreslåtte parameterinnstillingene for å sikre at SNR er tilstrekkelig og fotobleaching minimeres.
    1. Åpne ND-anskaffelsesvinduet ved å klikke vis → anskaffelseskontroll → ND-anskaffelse.
    2. Skriv inn banen/målet og et filnavn for å lagre ND-filen i popup-vinduet.
    3. Merk av i boksen som tilsvarer z-serien.
    4. Klikk på live i A1 Plus Settings-vinduet. Dette vil åpne et live visningsvindu.
    5. Juster fokusknappen på mikroskopet for å velge toppen av cellen, og klikk øverst i ND-oppkjøpsvinduet for å angi gjeldende posisjon som øverst.
      MERK: Det anbefales å fokusere litt over toppen av cellen for å sikre at hele cellen er samplet i z-serien.
    6. Juster fokusknappen på mikroskopet for å velge bunnen av cellen og klikk på Bunn i ND-oppkjøpsvinduet for å angi gjeldende posisjon som bunn.
      MERK: Fokuser litt under bunnen av cellen for å sikre at hele cellen er samplet.
    7. Skriv inn 1 μm for trinnstørrelse, velg top-bottom for z-scan-retningen og klikk kjør i ND Acquisition-vinduet for å skaffe en z-stack.
      MERK: Trinnstørrelsen bestemmer antall z-skiver som skal anskaffes avhengig av topp- og bunnplasseringer (dvs. tilbakelagt distanse). En trinnstørrelse på 1 μm ble valgt som et kompromiss mellom bildehastighet, z-akseprøvetaking og fotobleaching. Bruk av den kondokale pinhole diameteren på 2,4 AU og 60x vann nedsenking mål resulterte i optisk seksjon tykkelse på 1,73 μm. Derfor er en trinnstørrelse på 1 μm litt under Nyquist-prøvetakingskriteriene, men dette er et kompromiss som ble gjort for å redusere tiden som trengs for å skaffe seg en z-stabel. For svært stabile prøver, for hvilken hastighet ikke er kritisk, kan et mindre z-aksetrinn og muligens en mindre konfokal pinhole diameter brukes til å øke z-akseoppløsningen. Bottom-top bør gi lignende resultater og kan brukes til å evaluere eventuelle effekter av photobleaching som kan oppstå under z-skanningen.
  11. Konfigurer Perfect Focus System (PFS) hvis tilgjengelig:
    MERK: PFS gjør det mulig for systemet å kompensere for svingninger i brennvidden under bildeanskaffelse. Følgende trinn kan brukes til å konfigurere PFS, og disse trinnene kan variere noe avhengig av versjonen av Nikon A1R og versjonen av NIS Elements som brukes.
    1. Uthev symmetrisk modus definert av områdeikonet i ND-anskaffelsesvinduet.
    2. Slå på PFS-knappen på forsiden av mikroskopet (sørg for at den dikroiske speilknappen på avsnittet under prøvetrinnet er "in").).
    3. Omdefiner toppen (roter mot klokken) og bunnen (roter med klokken) ved hjelp av knotten på forsiden av PFS-offset-kontrolleren.
    4. Definer en relativ z-posisjon/z-dybde ved å klikke på 'relativ' i ND-anskaffelsesvinduet.
    5. Klikk på minnet på forsiden av mikroskopet slik at programvaren husker den relative z-dybden.
  12. Etter at z-stack oppkjøpet er fullført, legg forsiktig til ønsket reagens (forskolin eller kjøretøykontroll) ved hjelp av en pipette og vent i 10 minutter.
    MERK: Tilsett reagenset veldig forsiktig for ikke å forstyrre cellene eller flytte posisjonen til cellekammeret i mikroskopet XY-scenen; Det er nyttig å bekrefte i en etterfølgende live view eller et senere bilde at synsfeltet ikke har forskjøvet seg under reagenstillegg. Ventetiden på 10 minutter er at forskolinbehandlingen trer i kraft. Hvis en alternativ behandling brukes, kan ventetiden måtte justeres.
  13. Etter 10 minutter endrer du filnavnet og klikker kjør i ND-anskaffelsesvinduet.
  14. Gjenta trinn 2.11 – 2.13 som beskrevet ovenfor for minst 5 deksler for å oppnå tilstrekkelige resultater for statistisk analyse (n = 5 for hver behandlingsgruppe - forskolin og kjøretøykontroll).
  15. Klargjør prøver og eksempelemner for å konstruere spektralbiblioteket og anskaffe spektralbilder ved hjelp av lignende anskaffelsesinnstillinger som beskrevet i trinn 2.9 og 2.10.

3. Bildeanalyse

MERK: Disse bildene vil bli brukt til å konstruere et spektralbibliotek som inneholder det rene spektraet til alle individuelle sluttmedlemmer som er tilstede i studien. Endmembers i spektralbiblioteket kan variere fra studie til studie hvis forskjellige fluoroforer brukes. En detaljert prosedyre for å konstruere spektralbiblioteket er gitt i en supplerende informasjonsfil med navnet "Supplemental File_Spectral Library". Her beskriver vi eksport av data til .tiff filer, lineær spektral unmixing, FRET effektivitet målinger, tredimensjonal rekonstruksjon, og cAMP nivåer estimering. Bildeanalyse kan utføres ved hjelp av forskjellige bildeanalyse- og programmeringsplattformer som ImageJ, Python, MATLAB eller CellProfiler. I disse studiene ble MATLAB-skript brukt.

  1. Eksporter bildedata:
    1. Opprett nye mapper med samme filnavn som tilsvarer spektral z-stack-bildene som er anskaffet i trinn 2.13 og 2.14.
      MERK: Følgende trinn som er beskrevet for å eksportere data, er spesifikke for NIS Elements AR versjon 4.30.01. Disse trinnene kan variere noe avhengig av versjonen av programvaren.
    2. Klikk fil, som åpner et filvindu. Bla gjennom og velg spektralbildefilen som ble anskaffet i trinn 2.12, og klikk Åpne.
    3. Når filen er lastet inn, klikker du Fil→ Importer/eksporter→ Eksporter ND-dokument.
    4. I popup-vinduet: Bla gjennom og velg mappen som ble opprettet i trinn 3.1.1, velg Tagged Image Format (TIF) for Filtype, og velg deretter Monobilde for hver kanal og Behold bitdybde.
      MERK: Filprefikset blir forhåndsgenerert. endre denne verdien for enkelhets skyld. Indeksrekkefølgen endres avhengig av kanalene som er valgt, og skal vise "z, c" for indeksering i henhold til z-stykkeplassering først og bølgelengdebånd nummer to. Kontroller at det ikke er merket av for boksene som tilsvarer Bruk LUT-er eller Sett inn overlegg eller Bruk punktnavn.
    5. Klikk Eksporter for å eksportere TIFF-filene til en målmappe som individuelle TIFF-filer.
    6. Gjenta trinn 3.1.2 – 3.1.5 for å eksportere spektralbildefiler som er anskaffet i trinn 2.13.
  2. Lineær spektral unmixing:
    1. Åpne programmeringsprogramvaren.
      MERK: Spesialutviklet programmeringsskript til unmix raw spektralbilder finnes på nettstedet til University of South Alabama BioImaging and BioSystems, under Ressurser-fanen (https://www.southalabama.edu/centers/bioimaging/resources.html).
    2. Åpne filen merket "Linear Unmixing.m" og klikk på kjør-knappen på redigeringsverktøylinjen.
    3. Bla gjennom og velg mappen som inneholder den eksporterte *.tif filsekvensen som genereres av NIS Elements-programvaren.
    4. Klikk OK for å fortsette, som åpner et nytt vindu kalt Bølgelengde og Z-Slice.
    5. Kopier filnavnet til den første filen (uten z-stykke og kanalnummer) i mappen som ble valgt i trinn 3.2.4, og lim det inn i det første trinnet i dialogboksen merket "Skriv inn bildenavnet".
    6. Skriv inn antall kanaler i det andre trinnet merket "Angi antall bølgelengdebånd", antall z-stykker i det tredje trinnet merket "Skriv inn antall Z-stykker" og klikk OK.
      MERK: Antallet bølgelengdebånd kan endres hvis det gjøres endringer i anskaffelsesinnstillingene, for eksempel justering av bølgelengdeområdet eller bølgelengden. Antallet Z-stykker kan også endres avhengig av høyden på cellen.
    7. Bla gjennom og velg bølgelengdefilen kalt "Wavelength.mat" i popup-vinduet merket "Velg informasjonsfilen for bølgelengde" og klikk åpne.
    8. Bla gjennom og velg "Library.mat" -filen i det nye popup-vinduet merket "Velg spektralbibliotekfilen", klikk åpne og vent til unmixing av stykkene er ferdig.
      MERK: Library.mat fil er en fil som inneholder ren spektra for hver endmember fluorophore sammen med celle autofluorescence og bakgrunn spektral signaturer. I dette tilfellet inkluderer endmember fluoroforer Turkis, Venus og DRAQ5. Bakgrunnsspektral signaturer inkluderer cellulær eller matrise autofluorescence, coverlip fluorescence, og coverlip diffraksjon. Wavelength.mat-filen er en fil som inneholder bølgelengdekanalinformasjon som brukes til å hente spektralbildet. Et eksempel på bibliotekfil og wavelength-fil er tilgjengelig på Bioimaging and Biosystems nettsted (se notatet under 3.2.1). Hvis du vil ha mer informasjon om hvordan du genererer spektralbibliotek- og bølgelengdefiler, kan du se tilleggsinformasjonsfilen Supplemental File_Spectral Library. Umiksede bilder som tilsvarer hver z-sektor, lagres i mappen "Unmixed" som ble opprettet under unmixing-prosessen i mappen som ble valgt i trinn 3.2.3.
  3. Beregning av FRET-effektivitet:
    1. Åpne programmeringsskriptet kalt "multiFRRCF.m" og klikk kjør.
      MERK: Denne programmeringsfilen er tilgjengelig fra nettstedet til University of South Alabama Bioimaging and Biosystems (se merknad under trinn 3.2.1).
    2. Skriv inn antall eksperimentelle forsøk som skal analyseres i popup-dialogboksen kalt "hvor mange mapper som skal reslice" og klikk OK.
      MERK: Bildedata fra hvert eksperiment bør lagres i en egen umikset bildemappe. Dette trinnet lar ganske enkelt analysekoden sløyfe over mange mapper som et tidsbesparende trinn.
    3. Bla gjennom og velg de umiksede mappene, og klikk OK.
      MERK: Antall ganger popup-vinduet "Bla gjennom etter mappe" åpnes, avhenger av nummeret som er angitt i dialogboksen "Hvor mange mapper som skal videreselges" i forrige trinn. Bla gjennom og velg mappene etter hverandre.
    4. I det nye popup -vinduet skriver du inn følgende informasjon i de respektive boksene: Skaleringsfaktoren er henholdsvis 12,4, Terskelverdi er 5,6, X, Y og Z-frekvens er henholdsvis 5, 5 og 1, og utjevningsalgoritmen er gaussisk.
      MERK: Skaleringsfaktoren er en verdi i piksler/μm og vil bli brukt til å skalere Z-retningsprøven til den i XY-retningen. Skaleringsfaktoren er hentet fra bildepikselstørrelsen, som vanligvis leveres som metadata i bildet for de fleste konfiskeringsmikroskopsystemer. Hvis bildet for eksempel er oppnådd med avstand på 0,08 μm/piksel, må skaleringsfaktoren være 12,5 piksler/μm. Terskelverdi brukes til å terskeltegne bildene og generere en binær maske for cellen. Vi opprettet en liste over optimale verdier basert på bildet donor + akseptor intensitet. Bruk 4,5 som en terskelverdi hvis bildet har lys donor+akseptorintensitet og lav bakgrunn, en verdi mellom 5,6 og 6,5 for bilder som bare har moderat donor+akseptorintensitet og/eller høyere bakgrunn, og en verdi på 7,5 og høyere for bilder som har en donor+akseptorintensitet som er lavere enn bakgrunnen. Frekvensverdien tilsvarer intervallet, i antall piksler, hvor kuttingen utføres i de påfølgende trinnene. Hvis for eksempel Z-dybden i cellen er 17 μm med en trinnstørrelse på 1 μm og en skaleringsfaktor på 12,5 piksler/μm brukes i XY-retningen, brukes dybden på det tredimensjonale bildedatasettet på nytt med 212 bildepunkter (Z-retning). Basert på Z-frekvensverdien som er angitt (for eksempel 1 piksel), blir det tredimensjonale bildedatasettet kuttet på nytt fra toppen av bildedatasettet og deretter beveger seg i trinn på 1 piksel nedover. Dette resulterer i 212 resliced bilder. Hvis det ble angitt et større frekvensverdiintervall for Z-frekvens, genereres færre resliced bilder. Resliced bilder lagres i de påfølgende trinnene.
    5. Klikk på kjør og vent til alle FRET-målingene og reslicing er utført.
      MERK: En egen mappe opprettes i den overordnede katalogen som resliced gråtone FRET effektivitet bilder og farget (en fargekart anvendt) FRET effektivitet bilder lagres. Alle FRET-bilder i gråtoner og fargekart som er videreslicert i X-retningen (YZ-plan), lagres for eksempel i en mappe kalt "Resliced_XFRET".
    6. Gjenta analysen med lignende innstillinger for alle forsøkene – før og etter forskolinbehandlinger og kjøretøykontroller.
      MERK: Trinn som er nevnt i avsnitt 3.3, beskriver verdiene som skal angis for det egendefinerte FRET-analyseprogrammeringsskriptet for å generere tredimensjonale FRET-bildedata. Dette skriptet utfører imidlertid flere operasjoner mens du kjører, inkludert: laste inn bildedata, opprette bildestakker, utjevning, FRET-effektivitetsberegninger, opprette og bruke en cellekantmaske, 3-dimensjonal bilderekonstruksjon, replisere tredimensjonale bilder med bestemte intervaller (frekvenser), bruke et fargekart for visualisering av FREKVENS-endringer og lagre de resliced bildedataene i samme mappe. Flere detaljer er inkludert som kommentarer i programskriptet.

4. Kartlegging av FRET-effektivitet til cAMP-nivåer

  1. Åpne programmeringsfilen med navnet 'Mapping_FRET Efficiency_to_cAMP_concentration.m' og klikk kjør i hovedvinduet.
    MERK: Filen er tilgjengelig på BioImaging and BioSystems nettsted (se merknad under 3.2.1). Denne filen leser gråtone FRET effektivitet bilder og konverterer dem til cAMP nivåer basert på en karakteristisk kurve. Denne karakteristiske kurven bruker et cAMP-til-FRET-forhold dokumentert i litteratur15,36 som er beskrevet av Hill-ligningen (den tredje ligningen vist nedenfor). Imidlertid er Kd av sonden i intakte celler vanskelig å estimere, og vi har antatt at den er 1 μM i våre beregninger. Resultatene vises derfor som en funksjon av Kd. (dvs. [cAMP] = x* Kd). Ligninger som brukes til å måle FRET-effektivitet og tilordne FRET til cAMP-nivåer, vises nedenfor:
    Equation 1
    Der E er FRET-effektiviteten, og entilsynelatende og tydeliger umiksede pikselintensiteter av henholdsvis akseptor- og donorbilder.
    Qa og Qd er kvanteutbytter av akseptor og donor. Merk at Qa og Qd avbryter når ligningen for kλ er innlemmet i FRET-effektivitetsligningen, kλ er en korreksjonsfaktor:
    Equation 2
    Equation 3 og Equation 4 er utryddelseskoeffisienter av donor og akseptor ved donoreksitasjonsbølgelengden, i (405nm).
    Equation 5
    E er FRET effektivitet og KD = Dissosiasjon konstant = 1 μM.
  2. Naviger og velg det første FRET-bildet med grå skala (lagret i trinn 3.3.5), og klikk OK.
  3. Åpne FRET/cAMP-bildene for å inspisere distribusjonen av cAMP-signaler i tre dimensjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne protokollen beskriver bruken av hyperspektrale FRET-avbildnings- og analysemetoder for å måle cAMP-gradienter i tre romlige dimensjoner i levende celler. Det er flere viktige trinn som er involvert i å generere disse resultatene, som det kreves nøye oppmerksomhet for mens du analyserer og kvantifiserer dataene. Disse viktige trinnene inkluderer bygging av et passende spektralbibliotek, bakgrunnsspektral unmixing, terring for å identifisere cellekantlinjer og FRET-effektivitetsberegninger. Figur 1 illustrerer den skjematiske flyten i alle trinnene som er involvert i måling av FRET-effektivitet og cAMP-nivåer i levende celler. Når disse bilde- og analysetrinnene utføres riktig, vil de tillate måling av FRET-effektivitet og estimering av cAMP-romlige gradienter i 3 dimensjoner i en celle, samtidig som de tar hensyn til ikke-ensartede bakgrunnssignaler.

Figur 2 viser tredimensjonale visninger av falske, rå hyperspektrale bildedata som er samlet inn ved hjelp av et Nikon A1R-konfokalt mikroskop ved grunnlinjeforhold (figur 2A) og 10 minutter etter (figur 2B) forskolinbehandling. Merk at lignende detektor- og systemparametere ble brukt til å skaffe bildestakker før og etter behandling for å opprettholde konsistens for kvantitativ analyse. Vær også oppmerksom på at endringer i FRET ikke er åpenbare i dette bildet, da dette bare er en visualisering av rådata, før du beregner FRET-effektiviteten.

Et spektralbibliotek med ren spektra av alle sluttmedlemmer er nødvendig for å analysere rå spektralbildedata ytterligere. Å konstruere et passende spektralbibliotek er et av de viktigste trinnene for å sikre passende målinger av FRET-effektivitet. Figur 3 viser byggingen av et spektralbibliotek som inneholder det rene spektraet av endmembers (i disse nåværende studiene er sluttmedlemmene turkis, Venus og DRAQ5). For å måle FRET effektivitet, er det viktig å oppnå spektra av Turkis og Venus ved hjelp av en prøve med 1:1 stisiometri. Her har vi gitt en tilnærming der akseptorfluoforen er fullstendig fotodestruert, slik at donorens spektrale signaturer og akseptor med 1:1-stoichiometri kan fås (Figur 3A-F). I tillegg ble lineære kraftforhold mellom laserne (Tilleggsfigur 1) brukt til å beregne akseptorspekteret med en intensitet som ville forventes hvis det var begeistret ved hjelp av donoreksitasjonslaseren, i dette tilfellet 405 nm for Turkis (Figur 3G). Dette sikrer at unmixed donor- og akseptorsignaler er sammenlignbare i absolutt intensitet når FRET er spent med en enkelt 405 nm laserlinje. Ikke-transfekerte celler merket med kjernefysisk fargestoff, DRAQ5 (figur 3H) ble brukt til å oppnå det rene spekteret av DRAQ5 (figur 3I). Ved å kombinere spektraet til giveren, Turkis (figur 3F), akseptor, Venus (figur 3G) og DRAQ5 (figur 3I), ble det opprettet et bibliotek med tre komponenter (figur 3J).

Signaler fra andre kilder enn fluorescerende etiketter kan også være til stede i en prøve. For å gjøre rede for disse ble tre forskjellige spektralsignaturer med topper som forekommer ved 424 nm, 504 nm og 574 nm identifisert i umerkede cellulære prøver. Vi tror at disse spektralsignaturene tilsvarer coverlip-refleks og cellematrise eller cellulær autofluorescens. Figur 4 viser kildene til disse tre bakgrunnsspektralsignaturene. Det er viktig å merke seg at disse signalene distribueres ikke-ensartet i prøven og derfor ikke bare kan trekkes ut. Men å legge til spektralsignaturene til disse signalene i spektralbiblioteket og bruke lineær unmixing for å skille signalene, presenterer en tilnærming for å fjerne disse forvirrende signalene fra donor- og akseptorsignalene før du beregner FRET-effektivitet. For å oppnå dette ble de tre bakgrunnsspektralsignaturene lagt til i 3-komponent spektralbiblioteket, som danner et nytt 6-komponent bibliotek bestående av donor (Turkis), akseptor (Venus), DRAQ5 og tre bakgrunnsspektrale signaturer.

Et egendefinert programmeringsskript ble skrevet for å unmixe spektralbildedataene til individuelle endmembers, og et eget skript ble skrevet for å utføre påfølgende FRET-effektivitetsberegninger. Lineær spektral unmixing (illustrert i figur 5) ble utført ved hjelp av 6-komponent spektralbiblioteket. Unmixing ble utført for hvert stykke i den aksiale bildestakken, også kalt z-stack (se den tredimensjonale visualiseringen av rå spektralbildedata i figur 5A). Dette resulterte i separate umiksede bilder for hvert endmember, for hver z-sektor i z-stabelen (Figur 5C–Evises ikke bakgrunnsbilder med umiksede bakgrunner). Hvis ønskelig, kan de umiksede signalene være falske farger for visualisering med en annen farge tilordnet hvert umiksede signal (Figur 5F-H).

Figur 6 illustrerer trinnene som er involvert i FRET-effektivitetsberegningene, i tillegg til trinnene for å tilordne FRET-effektivitet til cAMP-nivåer. Et FRET-effektivitetsbilde ble generert ved hjelp av utjevnede umiksede donor- og akseptorbilder. Et binært maskebilde ble oppnådd ved hjelp av umikset donor, akseptor og kjernefysiske bilder. Masken ble brukt på FRET-effektivitetsbildet for å fjerne bidrag fra bildepunkter utenfor cellen. Selv om umiksede bilder fra enkle z-stykker ble brukt til billeddemonstrasjonen av FRET-effektivitetsmålinger, ble disse beregningene utført på hvert stykke i den tredimensjonale bildestakken. Det tredimensjonale FRET-bildedatasettet ble deretter resliced i tre ortogonale plan for å visualisere romlige gradienter av cAMP-signaler i forskjellige retninger.

Visualisere agonistinduserte endringer i FRET-effektivitet og cAMP-nivåer
Trinnene beskrevet ovenfor gir en metode for beregning av FRET-effektivitet og cAMP-nivåer fra hyperspektrale bildedata i tre romlige dimensjoner. Disse trinnene kan brukes på cellulære preparater før og etter behandling med forbindelser som fremkaller en cAMP-respons, for eksempel forskolin. Her gir vi et eksempel på å bruke denne tilnærmingen til å observere endringer i FRET- og cAMP-distribusjon i PMVEC etter behandling med 50 μM forskolin. Figur 7 illustrerer endringene i FRET-effektivitet og cAMP-nivåer i forskjellige XY-planskiver (z-skiver), fra apikale til basale, noe som muliggjør sammenligning av baseline-tilstander (før forskolinbehandling) og 10 minutter etter behandling. I dette illustrasjonseksemplet ble FRET-effektiviteten redusert (kolonne 1 og 3 i figur 7) ved forskolinbehandling, noe som korrelerer med en økning i cAMP-nivåene (kolonne 2 og 4 i figur 7). Minimal romlig variasjon av cAMP i et enkelt XY-plan ble observert. Imidlertid ble aksiale (apikale til basale) cAMP-romlige gradienter observert, som det kan antas ved å merke seg at det apikale stykket har en dypere rød farge (indikerer høyere cAMP-nivåer gjennom fargeoppslagstabellen som ble brukt) enn basalskiven etter forskolinbehandling (kolonne 4 i figur 7). Aksiale FRET- eller cAMP-distribusjoner kan ofte visualiseres bedre ved hjelp av bilder hentet fra de to ortogonale romlige flyene: Figur 8 viser FRET-effektivitets- og cAMP-nivåene i YZ-planet ved baseline (kolonne 1 og 2) og 10 minutter etter forskolinbehandling (kolonne 3 og 4), mens supplerende figur 2 viser FRET-effektiviteten og cAMP-nivåendringene i XZ-planet. Disse resultatene viser muligheten for å måle FRET og estimere cAMP-nivåer fra 3-dimensjonale hyperspektrale bildedata og også demonstrere viktigheten av å visualisere aksiale distribusjoner av FRET eller cAMP. Mens det er utenfor omfanget av dette metodologiske papiret, kan det være at aksiale romlige fordelinger av sykliske nukleotider bidrar til spesifisitet innen sykliske nukleotidsignalveier.

Når du utfører metodene beskrevet ovenfor, er det viktig å nøye sjekke nøyaktigheten av trinnene og kjøre passende eksperimentelle og kjøretøykontroller for å sikre at endringer i FRET (og tilsvarende cAMP) skyldes faktiske endringer i donor- og akseptorsignaler og ikke forestiller seg artefakter. Viktige trinn du bør vurdere, er for eksempel:

Bruke et passende spektralbibliotek som inneholder alle nødvendige spektralkomponenter
Som nevnt kan det være betydelig bidrag av bakgrunnssignaler fra cellulær autofluorescens, avsatt matrise eller reflektert lys fra dekslene (eksitasjonsutslipp blødde gjennom). Figur 9 representerer et eksempeldatasett som illustrerer at bakgrunnssignalet ble beholdt i bildene da et 3-komponents (Turkis, Venus og DRAQ5) bibliotek ble brukt til å unmix spektraldataene. Bakgrunnssignalet ble derimot effektivt fjernet da et mer komplett (og hensiktsmessig) 6-komponent spektralbibliotek ble brukt.

Bruke en optimal terskelverdi til å generere en cellemaske
I mange av eksperimentene vi har utført, er bakgrunnssignalintensiteten omtrent 50-60% av FRET-signalintensiteten som er til stede i de rå spektralbildedataene (dvs. når du visualiserer ubehandlede spektralbildedata, er toppen av FRET-signalet bare ~ 2 ganger høyere enn det omkringliggende bakgrunnssignalet). Separasjon av bakgrunnssignal fra forgrunnssignal ved hjelp av en terskelverdi for å få en binær maske er derfor et følsomt trinn og må utføres nøye for å unngå analyseartefakter. Figur 10 illustrerer effekten av forskjellige terskelverdier som brukes for cellesegmentering for å opprette en binær maske av cellen. En lav terskelverdi kan inneholde bakgrunnssignal som en del av den uttrykkende cellen. På den annen side kan en altfor høy terskelverdi utelukke måling av FRET i celler eller regioner med lav donor+akseptor (enten svært tynne deler av cellen eller deler som kan ha en lavere regional konsentrasjon av FRET-sonden).

Velge en transfektert celle med donor+akseptorsignalintensitet ≥ bakgrunnssignal
Figur 11 illustrerer et eksempeldatasett der FRET-effektivitet og tilsvarende nivåer ble målt fra umiksede bilder oppnådd ved hjelp av et 6-komponent spektralbibliotek for lineær spektral unmixing. Til tross for at du brukte 6-komponentbiblioteket til å unmix spektral bildedata og velge en høy terskel for å lage cellekantlinjen og kjernefysisk maske, var FRET-effektivitetsbilder fortsatt utsatt for høyt bakgrunnsstøysignal nær basalsiden av cellen. I dette tilfellet skyldtes tilstedeværelsen av bakgrunnsstøy valg av en celle som bare svakt uttrykte FRET-sonden, og donor + akseptorsignalstyrken var omtrent lik bakgrunnssignalstyrken, selv etter unmixing. I tillegg til å bruke de sofistikerte analysetrinnene beskrevet ovenfor, er det derfor også viktig å velge en celle med tilstrekkelig uttrykk for FRET-sonden og tilsvarende tilstrekkelig FRET-signal (donor- og akseptorsignal minst lik eller over støysignalet) under oppkjøpet for å sikre resultater av høy kvalitet.

Figure 1
Figur 1: Flytskjema som viser trinnene som er involvert i FRET-effektivitet og nivåmålinger i tre romlige dimensjoner ved hjelp av hyperspektral FRET-avbildning og -analyse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: En 3-dimensjonal visualisering av en celle som uttrykker cAMP FRET-reporteren (grønn) og kjerner fra cellen og omkringliggende ikke-uttrykkende celler (rød). Rå spektral bildedata samlet inn ved hjelp av et Nikon A1R spektral konfektmikroskop har blitt falskt farget i henhold til bølgelengde og visualisert i 3 dimensjoner ved hjelp av NIS Elements programvare. A) 3-dimensjonale bildedata ved baseline og B) 10 minutter etter 50 μM forskolin behandling. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Bygging av et spektralbibliotek som inneholder det rene spektraet av fluorescerende etiketter i studien (referert til som sluttmedlemmer av fjernmålingsfeltet). A) Et falskt farget bilde av celler som uttrykker FRET biosensor oppnådd ved 405 nm eksitasjon (donoreksitasjon). B) Spektrum som tilsvarer FRET-signal: 4 forskjellige interesseområder (ROIer) ble tegnet på bilde A vist av røde, gule, blå og grønne rektangler. Gjennomsnittlig intensitet ved hver bølgelengde for hver valgte avkastning ble eksportert. Den gjennomsnittlige intensiteten fra disse 4 ROIene ble plottet inn ved hver utslippsbølgelengde. Utslippstoppene i spekteret tilsvarer både donor (Turkis) og akseptor (Venus) fluoroforer. C) Et falskt farget bilde av celler som uttrykker FRET biosensor ervervet ved 488 nm eksitasjon (akseptoreksitasjon). D) Det gjennomsnittlige spekteret ble anslått som forklart i B fra flere ROIer i C (de samme regionene som i A) med utslippstopp bare på grunn av akseptøren. E) Et falskt farget bilde av celler som uttrykker FRET biosensor ervervet ved 405 nm eksitasjon etter foto-ødeleggelse av akseptor fluorophore ved 514 nm bestråling. F) Det gjennomsnittlige spekteret ble anslått som forklart i B fra flere ROIer i E (de samme regionene som A) med utslippstopp på grunn av donoren. MERK at donorintensiteten økes i F sammenlignet med det opprinnelige FRET-signalet, noe som indikerer at etter fotobleaching av akseptoren fører donoreksitasjon til direkte donorutslipp. G) Akseptorspekteret som forventet hvis det oppnås ved bruk av 405 nm eksitasjon. Dette ble estimert ved å bruke fakta om at 405 nm og 488 nm eksitasjonslasere har en lineær respons som kan karakteriseres ved hjelp av et spektrometer og integrere sfære (Supplerende figur 1) og den bølgelengdeavhengige utryddelseskoeffisienten til Venus. Derfor kan Venus-spekteret oppnådd ved 488 nm eksitasjon konverteres til Venus-spekteret som forventes hvis det oppnås ved 405 nm eksitasjon H) Et falskt farget bilde av celler merket med atometiketten DRAQ5. I) Det gjennomsnittlige spekteret fra flere regioner av interesse for H. J) Det resulterende spektralbiblioteket som inneholder det normaliserte rene spektraet til donoren og DRAQ5 og det eksitasjonsbølgelengdekorrigerte spekteret av akseptoren. Legg merke til at Turkis og Venus spektra ble normalisert til maksimumsverdien av kombinerte Turkis + Venus spektraldata mens DRAQ5 bare ble normalisert til enhet til verdien av topputslippsbølgelengden. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Bakgrunnsspektralsignaturer ble identifisert og inkludert i spektralbiblioteket for å ta høyde for bakgrunnsfluorescenssignaler under unmixing-prosessen. A, B) To bakgrunnsfluorescens spektral signaturer ble observert ved karakterisering av en prøve blank (unlabeled coverlip). Disse spektralsignaturene ble navngitt basert på deres toppbølgelengder - den ene på 424 nm (fra coverlip fluorescens) og den andre ved 504 nm (sannsynligvis fra refleksjon eller ryggspredning). C) En tredje bakgrunnsspektral signatur ble observert med en topp utslipp bølgelengde på 574 nm når ikke-merkede celler ble analysert, potensielt fra cellulær autofluorescence eller fluorescens av den underliggende matrisen. D) Bakgrunnsspektra hentet fra bilde A, B og C. Disse tre bakgrunnsspektraene ble lagt til i det eksisterende 3-komponentbiblioteket (Figur 3J) for å utvikle et 6-komponent spektralbibliotek. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Lineær spektral unmixing ved hjelp av et 6-komponent spektralbibliotek som står for bakgrunnssignaler. A) Rå spektral bildedata anskaffet som en aksial z-stack. B) 6-komponent spektral bibliotek som brukes til lineært unmix rå spektraldata. C, D og E) Gråtone umiksede bilder av henholdsvis DRAQ5, Turkis og Venus er et resultat av lineær spektral unmixing. F, G og H) Falske fargede umiksede bilder av henholdsvis DRAQ5, Turkis og Venus. Umiksede bilder av bakgrunnssignaler ble også beregnet (data som ikke vises her, da bare fluorescerende etiketter er av interesse for denne metodikken - se figur 4 i Annamdevula, et al. for eksempler på umiksede bakgrunnssignaler25). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Flytskjema som viser trinnene som er involvert i beregning av FRET- og cAMP-nivåer fra umiksede spektralbildedata. A) Representativt umikset bilde av donor, Turkis. B) Representativt umikset bilde av akseptor, Venus. C) Representativt umikset bilde av kjerner, DRAQ5. D) Binær cellemaske genereres ved å terskelstille umikset donor + akseptor oppsummert bilde. E) En terskel påføres atombildet for å skape en binær maske av kjernen. F) Pikselvis FRET-effektivitet ble beregnet fra unmixed donor- og akseptorbilder. G) En sammensatt binær maske ble opprettet fra cellekant og atommasker. H) Maskert FRET effektivitet bilde: sammensatt cellemaske ble brukt på FRET effektivitet bilde for å utelukke ikke-spesifikke FRET signaler utenfor cellen og i kjernen. I) Et fargekart ble brukt på det maskerte FRET-effektivitetsbildet for bedre å visualisere romlige endringer i FRET. J) Bildet av cAMP-nivåene som ble estimert ut fra FRET-effektivitetsbildet. K) Fargekart ble brukt for bedre å visualisere romlige endringer i cAMP. Fargestolper vist på høyre side ble brukt til å visualisere FRET-effektivitet (topppanel) og cAMP-nivåer (nederste panel). Bilder vist i denne figuren er representative for ett enkelt aksial z-stykke, men analyseoperasjonen som er beskrevet i denne figuren, utføres på hele aksial z-stakken. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Forskolin-indusert FRET-effektivitet og cAMP-romlige gradienter visualisert i PMVECer. XY-planbilder ble generert ved å reslicing 3-dimensjonale rekonstruerte FRET- og cAMP-bildedata i aksialretningen (Z) fra den apikale til basale siden av cellen. Fem sammenhengende XY-stykker vises. Kolonne 1 og 3 representerer FRET-effektiviteten ved baseline og 10 minutter etter behandling med henholdsvis 50 μM forskolin. Kolonne 2 og 4 indikerer nivåene ved baseline og 10 minutter etter forskolinbehandling. Fargestolpene ble brukt til å relatere endringer i fargekartet til FRET-effektivitetsnivåer (øverst) og cAMP-nivåer (nederst). Hvite linjer som vises på bilder i kolonne 2 og kolonne 4, brukes til å generere intensitetsprofilen (linjeskanningsprofilen) for cAMP-signaler på tvers av denne valgte linjen. Intensitetsprofilplott hentet fra midten av cellen ved baseline (blå profil) og etter forskolinbehandling (grønn profil) demonstrerer romlig fordeling av cAMP-signaler over linjeskanningen. Skalalinjen indikerer 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Forskolin-indusert FRET-effektivitet og cAMP-romlige gradienter visualisert i aksialretningen. YZ-planbilder ble generert ved å reslicing 3-dimensjonale rekonstruerte FRET- og cAMP-bildedata i sideretningen (X) (fra venstre til høyre side av cellen). Kolonne 1 og 3 representerer FRET-effektiviteten ved baseline og ved henholdsvis 10 minutter etter 50 μM forskolinbehandling. Kolonne 2 og 4 representerer cAMP-nivåene ved baseline og ved 10 minutter etter forskolinbehandling. Fargestolpene til høyre ble brukt til å relatere endringer i fargekartet til FRET-effektivitetsnivåer (øverst) og cAMP-nivåer (nederst). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: En sammenligning av effektiviteten ved bruk av enten en 3-komponent eller et 6-komponent spektralbibliotek for beregning av FRET- og cAMP-nivåbilder. Ikke-spesifikke bakgrunnssignaler ble observert i bilder beregnet ved hjelp av et bibliotek med tre komponenter, som ikke utgjorde bakgrunnsspektralsignaturer. Dette gjaldt spesielt for bilder nær basalsiden av cellen etter 50 μM forskolinbehandling (kolonne 2). Bakgrunnssignalartefakter ble derimot effektivt fjernet ved bruk av et bibliotek med seks komponenter som inkluderte bakgrunnsspektralsignaturer, noe som forbedret muligheten til å segmentere cellen og analysere FRET- og cAMP-signaler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 10
Figur 10: Bildeanalyseartefakter kan innføres hvis en passende terskelverdi ikke velges for å avgrense celle- og atomgrensene. Umiksede donor- og akseptorbilder ble brukt til å opprette en maske med tre forskjellige terskelverdier: 0,35 (kolonne 1 som 2), 0,65 (kolonne 3 og 4) og 0,9 (kolonne 5 og 6). Kolonne 1, 3 og 5 viser FRET-effektiviteten ved grunnlinjen. Kolonne 2, 4 og 6 viser FRET-effektiviteten etter 10 minutter etter 50 μM forskolinbehandling. Hvis du valgte en terskelverdi som var for lav, førte det til at deler av bakgrunnen, eller det ekstracellulære området, ble inkludert i cellen for analyse, mens valg av en terskelverdi som er for høy, førte til tap av en del av cellen (se det apikale stykket i kolonne 4-5 sammenlignet med kolonne 3-4). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 11
Figur 11: Bakgrunnssignalartefakter kan fortsatt vedvare selv etter at bakgrunnen er umikset og valgt en passende terskel under oppretting av en binær maske. Kolonne 1 viser representative apikale, midtre og basale skiver ved baseline og kolonne 2 viser det samme på 10 minutter etter 50 μM forskolinbehandling. Til tross for bruk av et 6-komponent bibliotek for unmixing som utgjorde bakgrunnssignaler og utnyttet en høyere terskel på 0,85 for binær maskegenerering, ble bakgrunnsregioner fortsatt identifisert som en del av cellen, spesielt etter behandling med forskolin. Hvis dette skjer, kan en mulig forklaring være at en celle med svakt uttrykk for FRET-reporteren ble valgt for avbildning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende figur 1: Målinger av laserlinjeintensitet som en funksjon av laserinnstilling i programvaren. Et fiber koblet spektrometer og integrerende sfære ble kalibrert til en NIST-sporbar lampe for å måle laserintensiteten for både 405 nm laserlinje og 488 nm laserlinje. A) Totalt antall fotoner målt ved mikroskopstadiet som tilsvarer forskjellige laserintensiteter av 405 nm laser. B) Totalt antall fotoner målt ved mikroskopstadiet tilsvarende forskjellige laserintensiteter på 488 nm laser. Lineær respons i laserintensitet ble observert for begge laserne målt ved mikroskopstadiet. En lineær trendlinje var i form, og trendlinjeligningen for hver laserlinje ble brukt til å beregne akseptorspekteret som ville forventes hvis det var begeistret med 405nm laserlinjen (donoreksitasjon). Klikk her for å laste ned denne figuren.

Supplerende figur 2: Forskolin-indusert FRET-effektivitet og cAMP-romlige gradienter visualisert i aksialretningen. XZ-planbilder ble generert ved å reslicing 3-dimensjonale rekonstruerte FRET- og cAMP-bildedata i sideretningen (Y) (fra forsiden til baksiden av cellen). Kolonne 1 og 3 representerer FRET-effektiviteten ved baseline og ved henholdsvis 10 minutter etter 50 μM forskolinbehandling. Kolonne 2 og 4 representerer cAMP-nivåene ved baseline og ved 10 minutter etter forskolinbehandling. Fargestolpene til høyre ble brukt til å relatere endringer i fargekartet til FRET-effektivitetsnivåer (øverst) og cAMP-nivåer (nederst). I likhet med resultatene som vises for YZ-flyene (figur 8), kan apikale til basale romlige gradienter i FRET-effektivitet og cAMP-nivåer visualiseres som fargeendringer fra topp til bunn av en enkelt YZ-skive, både ved referanseforhold (en gitt skive i kolonne 1-2) og etter 50 μM forskolinbehandling (kolonne 3-4). Klikk her for å laste ned denne figuren.

Tilleggsfiler. Klikk her for å laste ned disse filene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Utviklingen av FRET biosensorer har tillatt måling og visualisering av sykliske nukleotidsignaler i enkeltceller, og det er stort løfte om å visualisere subcellulære signalhendelser13,22,37,38. Bruken av FRET biosensorer presenterer imidlertid flere begrensninger, inkludert de lave signal-til-støy-egenskapene til mange fluorescerende proteinbaserte FRET-reportere og de svake transfeksjons- eller uttrykkseffektivitetene til FRET-reporterne (dette kan være spesielt utfordrende i visse cellelinjer, for eksempel PMVEC)23,24. Avbildning av svakt uttrykte fluorescerende proteiner, kombinert med ratiometriske FRET-beregninger, resulterer ofte i en høy grad av usikkerhet eller svingninger i den beregnede FRET-effektiviteten. I et forsøk på å forbedre påliteligheten til FRET-målinger har vi og andre tidligere demonstrert bruken av hyperspektral avbildning og analyse for å måle FRET-signaler og for å redusere krysstale eller blødning gjennom fluorescenssignaler mellom fluorescensetiketter og autofluorescenseffekter26,31,32,39. På grunn av begrensninger i signalstyrke var disse spektrale FRET-studiene begrenset til to (X og Y) romlige dimensjoner inntil nylig. Derfor ga de en enkeltsektorvisning av FRET-endringer i en celle.

I nyere studier bemerket vi at FRET (og tilsvarende cAMP-nivåer) så ut til å være romlig distribuert ikke bare i XY-flyet, men også over XZ- og YZ-flyene25. Den hyperspektrale FRET-avbildningsmetoden som er beskrevet her, utvider vår evne til å visualisere og måle FRET- og syklisk nukleotid (cAMP) endres til tre romlige dimensjoner, og åpner nye muligheter for å vurdere signalromalisering. Denne 4-dimensjonale (X, Y, Z og λ) hyperspektrale bildebehandlings- og analysetilnærmingen gjør det mulig å måle og visualisere cAMP-gradienter i tre romlige dimensjoner mens de står for ikke-ensartede bakgrunnssignaler. Her har vi demonstrert hvordan du implementerer denne tilnærmingen gjennom eksempelet på forskolininduserte cAMP-romlige gradienter. I bildedataene etter behandling kan cAMP-romlige gradienter observeres fra den apikale til basale siden av cellen (figur 7 og figur 8). CAMP produsert ved behandling med forskolin så ikke ut til å nå cellecellekryss (Figur 7 og Figur 8).

Ved bruk av metodikken som er beskrevet her, var det viktig å redegjøre for ulike kilder til bakgrunns- og autofluorescenssignaler for å muliggjøre nøyaktig estimering av FRET-effektivitet. Lineær unmixing gir en potensiell mulighet for å ta hensyn til unike bakgrunnsspektra, hvis deres signaturer er forskjellige fra de fluorescerende sondene av interesse. Spesielt er lineær unmixing bedre egnet for separering av bakgrunns- og autofluorescenssignaler enn standard bakgrunnsdelsnitt. 40,41,42 I eksemplet som vises her, ble tre forskjellige spektralsignaturer målt og tildelt et navn basert på topputslippsbølgelengden til signaturen: 424 nm bakgrunnsspekter (muligens fra coverlip fluorescens), 504 nm bakgrunnsspekter (sannsynligvis på grunn av reflektert eller tilbakespredning av lys), og 574 nm bakgrunnsspekter (muligens på grunn av celle- eller cellulær matrise autofluorescens). For å illustrere effekten av å unnlate å gjøre rede for disse signaturene, ble to spektralbiblioteker opprettet, og umiksede bilder sammenlignet. Først ble et spektralt bibliotek som bare inneholder fluorescerende etiketter i prøven, Turkis, Venus og DRAQ5, opprettet og merket 3-komponentbiblioteket. For det andre ble et spektralbibliotek som i tillegg inneholdt de tre bakgrunnsspektralsignaturene opprettet og merket 6-komponentbiblioteket. Som vist ovenfor tillot unmixing med 6-komponentbiblioteket (bakgrunn unmixing) fjerning av bakgrunnssignaler, mens unmixing med 3-komponentbiblioteket ikke gjorde det (Figur 9). I tidligere arbeid har vi vist at rotgjennomsnittet kvadrert feil (RMSE) forbundet med lineær unmixing reduseres ved bruk av et spektralbibliotek som står for både fluorescerende etiketter og bakgrunnssignaturer. Det skal bemerkes at den aksiale fordelingen av bakgrunnsfluorescens ofte er ikke-ensartet, og derfor vil en enkel bakgrunnsdeltraksjon ikke fungere for å korrigere bildedataene. Dermed er den spektrale unmixing tilnærmingen nødvendig for å gi nøyaktig bakgrunnsfjerning og pålitelige FRET-målinger.

Det er viktig å optimalisere systemparametere for å velge best mulig system- og kamerainnstillinger når du skaffer deg spektralbilder. Det overordnede målet bør være å optimalisere SNR samtidig som anskaffelsestiden minimeres og fotobleaching forhindres. 43 Når du optimaliserer et bildebehandlingssystem, er det derfor ofte nødvendig med et kompromiss mellom romlige, tidsmessige og spektrale oppløsninger. I disse studiene ble optimale verdier valgt for system- og kamerainnstillingene, inkludert pinhole-størrelse, lasereffekt, skannehastighet, skannestørrelse og rammegjennomsnitt som beskrevet i protokolldelen. Ved hjelp av disse innstillingene oppnås den romlige prøvetakingen på 80 nm/pixel, tidsprøvetaking på ~3 minutter per spektral z-stack (~10 sekunder/XY-bilde) og spektral prøvetaking på 10 nm intervall med ubetydelig eller minimal fotobleaching.

For å sikre nøyaktige estimater av FRET-effektivitet, er det nødvendig å måle donor- og akseptorspektra som de forventes med 1:1-stoichiometri og identiske eksitasjonsbølgelengder (figur 3). Turkis og Venus spektra ble normalisert med hensyn til den turkise topputslippsbølgelengden. FRET-effektiviteten som ble estimert ved hjelp av dette spektralbiblioteket produserte verdier som ligner de som er rapportert i litteratur12,22. Vanligvis normaliseres endmember-spektra i biblioteket til enhet. For å beregne FRET-effektiviteten nøyaktig, må imidlertid akseptorspekteret anskaffes med hensyn til donorspekteret (dvs. ved equimolar konsentrasjon eller 1:1 stoichiometri og referert til samme eksitasjonsbølgelengde). I tillegg til bruk av et riktig konstruert bibliotek, er flere trinn involvert i riktig estimering av FRET-effektivitet og unngåelse av analyseartefakter. Disse omfatter valg av en uttrykkscelle med tilstrekkelig signalintensitet (figur 11), utjevning av umiksede bilder før estimering av FRET-effektivitet (gaussisk uskarphet ble brukt i dette eksemplet), bruk av en passende terskelverdi for å opprette masken (Figur 10), og estimering av en korreksjonsfaktor ved hjelp av utryddelseskoeffisienter av donor og akseptor (Supplemental File_Spectral Library). Når disse trinnene følges, kan tredimensjonale fordelinger av FRET-effektivitet og underliggende cAMP-nivåer visualiseres nøyaktig i enkeltceller.

Lokaliserte cAMP-signaler er estimert i 2-romlige dimensjoner ved hjelp av målrettede FRET biosensorer13,37. Men målretting av FRET-sonder mot spesifikke subcellulære rom (for eksempel plasmamembran eller lipidflåter) resulterer vanligvis i en økt lokal konsentrasjon av sonde. Dette kan føre til at måleartefakter innføres på grunn av intermolekylær eller bimolekylær FRET. I tillegg viser resultatene som presenteres her og i Annamdevula et.al., 2018, Cytometry A25 viktigheten av 3-dimensjonale målinger av FRET fra enten løselige eller målrettede sonder.

Til tross for viktigheten av å måle cAMP-signaler i tre romlige dimensjoner, er det også begrensninger i denne tilnærmingen. Den mest restriktive begrensningen er de lange anskaffelsestidene som kreves - omtrent 3 minutter per spektral z-stack. Denne anskaffelsesraten utelukker bruk av denne tilnærmingen for å oppdage noe annet enn kvasi - steady state cAMP-distribusjoner i celler. Når det er sagt, viser resultatene som presenteres viktigheten av å inkludere kvasi - steady state 3-dimensjonale (x, y, z) cAMP-målinger som kritiske komplementer til standard 2-dimensjonale (x, y) målinger. I fremtiden vil det være interessant å innlemme merkede proteiner og cellulære strukturer i eksperimentell design. Nøye valg av fluoroforer som brukes til å merke proteiner (og / eller strukturer) vil tillate vurdering av de 3-dimensjonale fordelingene av de merkede proteinene og FRET uten ytterligere tap av oppkjøpshastighet. Dette vil igjen tillate måling av lokaliserte cAMP-signaler og cAMP-signaler nær de merkede proteinene i tre romlige dimensjoner, og dermed tilby et viktig eksperimentelt supplement til målrettede cAMP-sonder og ytterligere utvide nytten av hyperspektrale målinger av 3-dimensjonale cAMP-distribusjoner i levende celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Drs. Leavesley og Rich avslører økonomisk interesse i et oppstartsselskap, SpectraCyte, LLC, som ble dannet for å kommersialisere spektral bildeteknologier. Imidlertid ble alle prosedyrer beskrevet i denne protokollen utført ved hjelp av kommersielt tilgjengelige produkter som ikke er knyttet til SpectraCyte, LLC.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne anerkjenne Dr. Kees Jalink (The Netherlands Cancer Institute og van Leeuwenhoek Center for Advanced Microscopy, Amsterdam, Nederland) for å gi oss H188 cAMP FRET biosensor og Kenny Trinh (College of Engineering, University of South Alabama) for teknisk hjelp til å redusere tiden det tar å kjøre våre spesialutviklede programmeringsskript.

Forfatterne ønsker å anerkjenne finansieringskildene: American Heart Association (16PRE27130004), National Science Foundation; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Attofluor Cell Chamber Invitrogen A7816 Attofluor contains steel cell chambers and a rubber O-ring. Cell chamber holds the coverslip and O-ring provides a lock in mechanism to hold the buffer in cell chamber with out leakage
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific BP231-100 Solvent used to prepare stock solution forskolin.
DRAQ5 Fluoroscent Probe Solution Thermo Scientific 62252 Nuclear label
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965-092 Contains nutrients and growth factors for the cells to grow and divide in the culture dishes.
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F6178 Growth factor suppliment that is added to culture medium, DMEM
Forskolin Sigma F3917 Adenyly cyclase activator.
H188 Cyclic AMP FRET biosensor Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink Gift Plasmid encoding Turquoise (donor fluorophore), Venus (acceptor fluorophore), and binding domain obtained from Epac.
Image J image.net Free download Another image processing platform used to extact spectral information and image processing.
Integrating Sphere Ocean Optics FOIS-1 Used to measure illumination intensity of the laser line at different laser intensities (?).
Laminin Mouse Protein, Natural Invitrogen 23017-015 Coverslips are coated with laminin and this helps in cell attachment, growth and motility of the cell.
Lipofectamine 3000 Transfection Kit Invitrogen L3000-015 Transfection reagent used to transfect cells with H188 FRET biosensor
MATLAB Mathworks R2019a Image processing operations (linear unmixing and FRET efficiency calculations) are performed by writing custom programs in MATLAB programming environment
Nikon A1R confocal microscope Nikon Instruments Nikon A1R Spectral image acquisition is performed using confocal microscope.
Nikon Elements Software Nikon Instruments Software dongle used to export and handle nd2 image files (multidimensional image files) that are aquired using Nikon A1R
NIST-Traceable Calibration Lamp Ocean Optics LS-1-CAL-INT A lamp with a known spectrum for use as a standard
PBS pH 7.4 (1X) Gibco 10010-023 coomonly used buffer suring cell culture
Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs) In house - Cell culture core, Univeristy of South Alabama Isolated from Rat pulmonary microvasculature PMVECs form inner lining of a blood vessel.
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Gibco 15140-122 antibiotics are added to culture medum to prevent contamination of the cells.
Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides Clay Adams 3010 Microscope slides used for cell fixation
ProLong Diamond Antifade Mounting Media Invitrogen P36961 If samples are fixed using antifade mountant, then the later protects fluoroscent dyes and chromophores from fading.
Spectrometer Ocean Optics QE65000 Used to measure spectral response of the light source (?)
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200-056 Digests the protein-protein bond between the cell and cell matrix and helps to disscociate and lift the cells during cell plating.
Tyrodes Buffer Made in-house Made in-house Tyrodes buffer is used to make working solutions and to maintain cells in aqueous solution during image acquisition.
6 Well Cell Culture Plate Corning 3506 Laminin coated coverslips are placed in 6-well culture dish (one coverlisps/well). Cells along with medium is added into each well.
25 mm Round Microscope Cover Slips Fisher Scientific 12545102 Cells were grown on round glass coverslips
60X Ojective Nikon Instruments Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 water immersion and commonly used objective for cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Corbin, J. D., Sugden, P. H., Lincoln, T. M., Keely, S. L. Compartmentalization of adenosine 3':5'-monophosphate and adenosine 3':5'-monophosphate-dependent protein kinase in heart tissue. The Journal of Biological Chemistry. 252, 3854-3861 (1977).
  2. Terrin, A., et al. PGE1 stimulation of HEK293 cells generates multiple contiguous domains with different [cAMP]: role of compartmentalized phosphodiesterases. The Journal of Cell Biology. 175, 441-451 (2006).
  3. Bacskai, B. J., et al. Spatially resolved dynamics of cAMP and protein kinase A subunits in Aplysia sensory neurons. Science. 260, 222-226 (1993).
  4. Iancu, R. V., Ramamurthy, G., Harvey, R. D. Spatial and temporal aspects of cAMP signalling in cardiac myocytes. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 35, 1343-1348 (2008).
  5. Brunton, L. L., Hayes, J. S., Mayer, S. E. Functional compartmentation of cyclic AMP and protein kinase in heart. Advances in Cyclic Nucleotide Research. 14, 391-397 (1981).
  6. Hohl, C. M., Li, Q. Compartmentation of cAMP in adult canine ventricular myocytes. Relation to single-cell free Ca2+ transients. Circulation Research. 69, 1369-1379 (1991).
  7. Rich, T. C., et al. A uniform extracellular stimulus triggers distinct cAMP signals in different compartments of a simple cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 13049-13054 (2001).
  8. Sayner, S. L., Alexeyev, M., Dessauer, C. W., Stevens, T. Soluble adenylyl cyclase reveals the significance of cAMP compartmentation on pulmonary microvascular endothelial cell barrier. Circulation Research. 98, 675-681 (2006).
  9. Rich, T. C., Tse, T. E., Rohan, J. G., Schaack, J., Karpen, J. W. In vivo assessment of local phosphodiesterase activity using tailored cyclic nucleotide-gated channels as cAMP sensors. The Journal of General Physiology. 118, 63-78 (2001).
  10. Blackman, B. E., et al. PDE4D and PDE4B function in distinct subcellular compartments in mouse embryonic fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 286, 12590-12601 (2011).
  11. Sayner, S. L., et al. Paradoxical cAMP-induced lung endothelial hyperpermeability revealed by Pseudomonas aeruginosa ExoY. Circulation Research. 95, 196-203 (2004).
  12. Klarenbeek, J., Jalink, K. Detecting cAMP with an EPAC-based FRET sensor in single living cells. Methods in Molecular Biology. 1071, 49-58 (2014).
  13. Surdo, N. C., et al. FRET biosensor uncovers cAMP nano-domains at β-adrenergic targets that dictate precise tuning of cardiac contractility. Nature Communications. 8, 15031 (2017).
  14. Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Reports. 5, 1176-1180 (2004).
  15. Vogel, S. S., Thaler, C., Koushik, S. V. Fanciful FRET. Science's STKE. 2006, (2006).
  16. Clegg, R. M. The History of FRET: From conception through the labors of birth. Reviews in Fluorescence. 3, (2006).
  17. Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-224 (2006).
  18. Manzella-Lapeira, J., Brzostowski, J. A. Imaging protein-protein interactions by Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy in live cells. Current Protocols in Protein Science. 93, 58 (2018).
  19. Cooper, D. M. F., Mons, N., Karpen, J. W. Adenylyl cyclases and the interaction between calcium and cAMP signalling. Nature. 374, 421-424 (1995).
  20. Sassone-Corsi, P. Coupling gene expression to cAMP signalling: role of CREB and CREM. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 30, 27-38 (1998).
  21. Rebhun, L. I. Cyclic nucleotides, calcium, and cell division. International Review of Cytology. 49, 1-54 (1977).
  22. Klarenbeek, J., Goedhart, J., Van Batenburg, A., Groenewald, D., Jalink, K. Fourth-generation Epac-based FRET sensors for cAMP feature exceptional brightness, photostability and dynamic range: characterization of dedicated sensors for FLIM, for ratiometry and with high affinity. PLOS ONE. 10, 0122513 (2015).
  23. Leavesley, S. J., Rich, T. C. FRET: signals hidden within the noise. Cytometry Part A. 85, 918-920 (2014).
  24. Rich, T. C., Webb, K. J., Leavesley, S. J. Can we decipher the information content contained within cyclic nucleotide signals. The Journal of General Physiology. 143, 17-27 (2014).
  25. Annamdevula, N. S., et al. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
  26. Leavesley, S. J., Britain, A. L., Cichon, L. K., Nikolaev, V. O., Rich, T. C. Assessing FRET using spectral techniques. Cytometry Part A. 83, 898-912 (2013).
  27. Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming limitations of FRET measurements. Cytometry Part A. 89, 325-327 (2016).
  28. Fink, D. J. Monitoring Earcths Resources from Space. Technology Review. 75, 32-41 (1973).
  29. Goetz, A. F. H., Vane, G., Solomon, J. E., Rock, B. N. Imaging Spectrometry for Earth Remote Sensing. Science. 228, 1147-1153 (1985).
  30. Bücherl, C. A., Bader, A., Westphal, A. H., Laptenok, S. P., Borst, J. W. FRET-FLIM applications in plant systems. Protoplasma. 251, 383-394 (2014).
  31. Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. Journal of Microscopy. 228, 139-152 (2007).
  32. Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Letters. 531, 245-249 (2002).
  33. Griswold, J. R., Annamdevula, N., Deal, J., Rich, T., Leavesley, S. Estimating FRET Efficiency using Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging. Biophysical Journal. 112, 586 (2017).
  34. Favreau, P. F., et al. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19, 046010 (2014).
  35. King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvascular Research. 67, 139-151 (2004).
  36. Thaler, C., Koushik, S. V., Blank, P. S., Vogel, S. S. Quantitative multiphoton spectral imaging and its use for measuring resonance energy transfer. Biophysical Journal. 89, 2736-2749 (2005).
  37. Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Frontiers in Pharmacology. 9, 332 (2018).
  38. Johnstone, T. B., Agarwal, S. R., Harvey, R. D., Ostrom, R. S. cAMP signaling compartmentation: Adenylyl cyclases as anchors of dynamic signaling complexes. Mol Pharmacol. , (2017).
  39. Zhang, J., Li, H., Chai, L., Zhang, L., Qu, J., Chen, T. Quantitative FRET measurement using emission-spectral unmixing with independent excitation crosstalk correction. Journal of Microscopy. 257, 104-116 (2015).
  40. Zhang, J., Lin, F., Chai, L., Wei, L., Chen, T. IIem-spFRET: improved Iem-spFRET method for robust FRET measurement. Journal of Biomedical Optics. 21, 105003 (2016).
  41. Levy, S., et al. SpRET: highly sensitive and reliable spectral measurement of absolute FRET efficiency. Microscopy and Microanalysis. 17, 176-190 (2011).
  42. West, S. J., et al. Hyperspectral Measurements Allow Separation of FRET Signals from Non-Uniform Background Fluorescence. Biophysical Journal. 112, 453 (2017).
  43. Annamdevula, N. S., et al. An approach for characterizing and comparing hyperspectral microscopy systems. Sensors. 13, Basel. 9267-9293 (2013).

Tags

Biologi utgave 164 syklisk AMP romlig FRET hyperspektral mikroskopi spektral FRET
Måling av 3-dimensjonale cAMP-distribusjoner i levende celler ved hjelp av 4-dimensjonale (x, y, z og λ) Hyperspektral FRET-avbildning og -analyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Annamdevula, N. S., Sweat, R., Gunn, … More

Annamdevula, N. S., Sweat, R., Gunn, H., Griswold, J. R., Britain, A. L., Rich, T. C., Leavesley, S. J. Measurement of 3-Dimensional cAMP Distributions in Living Cells using 4-Dimensional (x, y, z, and λ) Hyperspectral FRET Imaging and Analysis. J. Vis. Exp. (164), e61720, doi:10.3791/61720 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter