Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Mätning av 3-dimensionella cAMP-fördelningar i levande celler med 4-dimensionell (x, y, z och λ) hyperspektrala FRET-avbildningar och analyser

Published: October 27, 2020 doi: 10.3791/61720
Automatic Translation
1,2, 3, 1, 3, 1,2, 1,2, 1,2,3
1Department of Pharmacology, University of South Alabama, 2Center for Lung Biology, University of South Alabama, 3Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of South Alabama

Summary

På grund av inneboende låg signal-till-brus-förhållande (SNR) av Fӧrster resonansenergiöverföringsbaserade sensorer (FRET) har mätningen av cAMP-signaler varit utmanande, särskilt i tre rumsliga dimensioner. Här beskriver vi en hyperspektral FRET imaging och analys metodik som möjliggör mätning av cAMP fördelning i tre rumsliga dimensioner.

Abstract

Cyclic AMP är en andra budbärare som är involverad i ett brett spektrum av cellulära och fysiologiska aktiviteter. Flera studier tyder på att cAMP signaler är fackindela, och att compartmentalization bidrar till att signalera specificitet inom cAMP signalering utbildningsavsnittet. Utvecklingen av Fӧrster resonansenergiöverföring (FRET) baserade biosensorer har främjat förmågan att mäta och visualisera cAMP-signaler i celler. Dessa mätningar är dock ofta begränsade till två rumsliga dimensioner, vilket kan leda till feltolkning av data. Hittills har det endast gjorts mycket begränsade mätningar av cAMP-signaler i tre rumsliga dimensioner (x, y och z), på grund av de tekniska begränsningarna vid användning av FRET-sensorer som i sig uppvisar låg signal-till-brusförhållande (SNR). Dessutom är traditionella filterbaserade avbildningsmetoder ofta ineffektiva för noggrann mätning av cAMP-signaler i lokaliserade subcellulära regioner på grund av en rad faktorer, inklusive spektralkors, begränsad signalstyrka och autofluorescens. För att övervinna dessa begränsningar och tillåta FRET-baserade biosensorer att användas med flera fluorforer har vi utvecklat hyperspektrala FRET-avbildnings- och analysmetoder som ger spektralspecifikitet för beräkning av FRET-effektivitet och förmågan att spektroally separera FRET-signaler från förvirrande autofluorescens och / eller signaler från ytterligare fluorescerande etiketter. Här presenterar vi metodiken för att implementera hyperspektrala FRET-avbildningar samt behovet av att konstruera ett lämpligt spektralbibliotek som varken är undersamplat eller översamplat för att utföra spektral-unmixing. Medan vi presenterar denna metod för mätning av tredimensionella cAMP fördelningar i pulmonell microvascular endotelceller (PMVECs), denna metodik kan användas för att studera rumsliga fördelningar av cAMP i en rad celltyper.

Introduction

Cykliskt adenosinmonofofat (cAMP) är en andra budbärare som är involverad i viktiga cellulära och fysiologiska processer inklusive celldelning, kalciumtillströmning, gentranskribering och signaltransduktion. En växande mängd bevis tyder på förekomsten av cAMP-fack i cellen genom vilken signalspecifikitet uppnås1,2,3,4,5,6,7. Fram till nyligen, cAMP compartmentalization härleddes baserat på distinkta fysiologiska eller cellulära effekter framkallas av olika G-kopplade receptor agonister8,9,10,11. På senare tid har FRET-baserade fluorescensavbildningssonder gett nya metoder för direkt mätning och observation av cAMP-signaler i en cell12,13,14.

Förster resonans energiöverföring (FRET) är ett fysiskt fenomen där energiöverföring sker mellan donator- och acceptormolekyler på ett icke-radiativt sätt när molekylerna är i närheten15,16. Med utvecklingen av FRET-baserade fluorescerande indikatorer har detta fysiska fenomen använts i biologiska tillämpningar för att studera proteinproteininteraktioner17, protein samlokalisering18, Ca+2 signalering19, genuttryck20, celldelning21 och cyklisk nukleotid signalering. FRET-baserade cAMP-indikatorer består vanligtvis av en cAMP-bindande domän, en donatorfluorofor och en acceptorfluorfor22. H188 cAMP-sensorn12,22 somanvänds i denna metod består till exempel av en cAMP-bindningsdomän som erhållits från Epac, inklämd mellan turkos (donator) och Venus (acceptor) fluorforer. Vid basala förhållanden (obundna) är turkos och Venus i en orientering så att FRET uppstår mellan fluorforerna. Vid bindning av cAMP till bindningsdomänen sker en konformationsförändring så att turkos och Venus rör sig isär vilket resulterar i en minskning av FRET.

FRET-baserade bildmetoder erbjuder ett lovande verktyg för att undersöka och visualisera cAMP-signaler i en cell. Nuvarande FRET-baserade mikroskopiska bildframställning tekniker är dock ofta bara delvis framgångsrika för att uppnå tillräcklig signal styrka för att mäta FRET med subcellulära rumsliga klarhet. Detta beror på flera faktorer, inklusive den begränsade signalstyrkan hos många FRET-reportrar, den höga precisionsnivå som krävs för att exakt kvantifiera förändringar i FRET-effektivitet och närvaron av förvirrande faktorer, såsom cellulär autofluorescens23,24. Resultatet är ofta en FRET-bild som plågas av svag SNR, vilket gör visualisering av subcellulära förändringar i FRET mycket svårt. Dessutom har undersökning av rumsligt lokaliserade cAMP-signaler nästan uteslutande utförts i endast två rumsliga dimensioner och den axiella cAMP-fördelningen har sällan ansettsvara 25. Detta beror sannolikt på att låg SNR hindrade förmågan att mäta och visualisera cAMP-gradienter i tre rumsliga dimensioner. För att övervinna begränsningarna med att använda FRET-sensorer med låg SNR har vi implementerat hyperspektrala avbildnings- och analysmetoder för att mäta FRET i enstakaceller 25,26,27.

Hyperspektrala avbildningsmetoder utvecklades av NASA för att skilja markbundna objekt som finns i satellitbilder28,29. Dessa tekniker har sedan dess översatts till fluorescensmikroskopifältet30, med flera kommersiella konfokala mikroskopsystem som erbjuder spektraldetektorer. I traditionell (icke-spektral) fluorescensavbildning är provet upphetsad med hjälp av ett bandpassfilter eller en laserlinje, och utsläppet samlas in med hjälp av ett andra bandpassfilter, ofta valt för att matcha fluorforens topputsläppsvåglängd. Däremot försöker hyperspektrala avbildningsmetoder att prova en komplett spektralprofil av antingen fluorescensutsläppet26,31,32 eller excitation33,34 med specifika våglängdsintervall. I våra tidigare studier visade vi att hyperspektral avbildning och analysmetoder kan erbjuda förbättrad kvantifiering av FRET-signaler i celler jämfört med traditionella filterbaserade FRET-bildtekniker26. Här presenterar vi en metodik för att utföra 4-dimensionella (x, y, z och λ) hyperspektrala FRET-avbildning och analys för att mäta och visualisera cAMP-fördelningar i tre rumsliga dimensioner. Dessa metoder har tillåtit visualisering av agonist-inducerad cAMP rumsliga gradienter i enstaka celler25. Intressant, beroende på agonisten, cAMP gradienter kan vara uppenbart i celler. Den metod som presenteras här använder spektral unmixing av icke-enhetlig bakgrund och cellulära autofluorescens för att förbättra noggrannheten i FRET mätningar. Medan denna metod visas i pulmonell microvascular endotelceller (PMVECs) med hjälp av en cAMP FRET biosensor, metoden kan lätt ändras för användning med alternativa FRET reportrar eller alternativa cellinjer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Detta protokoll följer förfaranden som godkänts av University of South Alabama Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Cell-, prov- och reagenspreparat för avbildning

  1. Isolera råtta pulmonell microvascular endotelceller (PMVECs) som beskrivits tidigare35.
    OBS: Celler isolerades och odlades av Cell Culture Core vid University of South Alabama, Mobile, AL på 100 mm cellkulturrätter.
  2. Fröisolerade PMVECs på 25 mm runda glaslock och låt dem växa i inkubatorn vid 37 °C tills cellerna uppnår minst 80% konfluens (minst 24 timmar).
    OBS: Celler och celltyp kan variera från studie till studie och därför bör cellbaserade cellkulturprocedurer följas till frö- och odlingsceller. Cell sådd och odling protokoll som används i dessa studier finns som kompletterande information i filen som heter "Kompletterande File_Cell kultur och transfection".
  3. Transfekt pmvecs med en FRET biosensor och inkubera i 48 timmar vid 37 °C.
    PROTOKOLLET för att transfekt pmvecs beskrivs också i den kompletterande informationsfilen med namnet "Kompletterande File_Cell kultur och transfection".
  4. På avbildningsdagen, värm Tyrodes buffert till 37 °C i ett vattenbad.
    OBS: Tyrodes buffert består av 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM glukos, 1 mM MgCl2 och 1 mM CaCl2
  5. Montera ett täckglas som innehåller transfekterade celler i en cellkammare och fäst toppen med en monteringspackning för att förhindra läckage.
  6. Torka av överdragslocket med hjälp av en delikat uppgiftsrensning för att rengöra överflödiga medier eller vidhäftande celler.
  7. Tillsätt 800 μL arbetsbuffert och 4 μL 5 mM kärnetikett i cellkammaren och vagga försiktigt i 5 – 10 sekunder.
    OBS: När du lägger till buffert- eller reagenslösningar på täcklips monterade i cellkammaren, se till att tillsätta lösningen försiktigt och vid sidan av cellkammaren för att inte lossa vidhäftande celler. Att tillsätta 4 μL 5 mM kärnmärkning till 800 μL buffert ger 25 μM slutlig koncentration av kärnmärkningen. För löst vidhäftande celler som HEK293-celler, blanda först kärnetikett och buffert i en flaska och lägg sedan till täckglas som är monterade i cellkammaren. Detta förhindrar att cellerna lyfts från täcket.
  8. Täck cellkammaren med aluminiumfolie för att skydda mot ljus och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.
  9. Reagenspreparat: Tillsätt 1 μL 50 mM forskolin till 199 μL buffert. Detta kommer att ge en slutlig koncentration av forskolin på 50 μM när den tillsätts till celler som har framställts med 800 μL buffert. 1 μL DMSO i 199 μL buffert bör också beredas för att användas som fordonskontroll.
    OBS: I dessa studier används forskolin som adenylylcyklasaktivator för att stimulera cAMP-produktion. Om så önskas kan denna metod enkelt ändras för att möjliggöra behandling med alternativa reagenser för att stimulera eller hämma adenylylcyklas, fosfodiesteraser etc.

2. Bildförvärv

  1. Använd ett konfektyrmikroskop utrustat med spektraldetektor.
    OBS: Alla steg för bildförvärv som beskrivs här utvecklades med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt Nikon A1R-mikroskopsystem. Dessa steg kan behöva justeras om du använder ett alternativt spektralmikroskop. Se till att all utrustning är påst vid minst 30 minuter före experimentets början för att uppnå stabila driftsförhållanden.
  2. Välj 60x vattensänkningsmål och tillsätt en droppe vatten till målet.
    OBS: För högupplöst livecellsavbildning rekommenderas att använda ett högt numeriskt bländarmål. Se materialförteckningen för information om det mål som används i dessa studier.
  3. Placera den laddade cellkammaren (från steg 1.7) på mikroskopstadiet.
  4. Välj filtret DFT (DAPI/FITC/TRITC) genom att justera filterratten på mikroskopets högra sida.
  5. Använd mikroskopet i fluorescens widefield-läge med hjälp av okularen för att välja ett synfält som innehåller celler som uttrycker cAMP FRET-sensorn.
    OBS: Se till att fret-signalens genomsnittliga intensitet vid donatorns eller acceptorutsläppets toppvåglängd i den valda cellen är minst 100 intensitetsenheter (A.U.) eller minst 4X baslinjesignalen för ett område utan uttrycksceller. Detta kan bekräftas med hjälp av spektrumprofilvisaren som finns i NIS Elements programvara. När du letar efter en cell med bra signal är det lämpligt att kassera alltför ljusa celler (de kan äventyras).
  6. Öppna NIS-programvara, växla till konfokalt läge, lås upp laserlåsknappen och klicka på Live.
  7. Använd fokusknappen för att fokusera på cellerna genom att titta på förhandsgranskningen på skärmen.
  8. Konfigurera inställningar för enhet, förvärv och z-stack i programvaran enligt beskrivningen nedan.
  9. Inställningar för förvärv:
    Inställningar för kamera- och enhetsförvärv kan tillämpas med hjälp av en tidigare förvärvad bild. Öppna bilden, högerklicka och välj Återanvänd kamerainställningar.
    1. Öppna menyn A1-inställningar, markera rutorna motsvarande 405 nm och 561 nm laserlinjer, välj SD för spektraldetektor, välj 10 för upplösning och 31 för kanaler.
      Obs: A1-inställningsmenyn visas som en liten kugghjulsikon längst upp till vänster i fönstret A1 Plus-inställningar. 405 nm laser används för donatorexcitation och 561 nm laser används för upphetsning av kärnetiketter.
    2. Ställ in våglängdsområdet (410 – 730 nm) genom att välja start- och slutvåglängdsvärden.
    3. Klicka på binning/hoppa-ikonen på menyn A1-inställningar och markera rutan som är numrerad 15 och klicka sedan på OK på menyn A1-inställningar.
      OBS: Detta är att ta bort våglängdskanalen som motsvarar 561 nm excitationslasern (detta är vanligtvis den 15:e våglängdskanalen). Det är viktigt att inte använda detta våglängdsband för att undvika en artificiellt låg signal, vilket kan skapa en spektral artefakt. Signalen är lägre i detta band på grund av det mekaniska fingret som täcker detektorelementet för att skydda det från laserskador.
    4. Ställ in laserintensiteterna på 8% respektive 2% för lasern på 405 nm respektive 561 nm Si Hv (detektorförstärkningar) vid 149 och en pinholeradie på 2,4 luftiga diskenheter (AU).
      OBS: Laserintensiteterna kan behöva justeras beroende på instrumentets ålder och laserns skick. Om laserintensiteterna justeras mellan olika prover eller försöksgrupper är det viktigt att bibehålla samma förhållande mellan laserintensiteterna (t.ex. 8:2). Dessutom är det viktigt att välja en laserintensitet som inte är så ljus att den skapar snabb fotoblekning. Detektorökningen bör justeras för att maximera signalintensiteten samtidigt som detektorljudet minimeras. För dessa studier användes en vinst på 149. En pinhole storlek på 2,4 AU valdes som en balans mellan att förvärva bilder med tillräckligt signal-till-brusförhållande (SNR) och upprätthålla optisk sektionering (konokalitet). En ökning av pinhole storlek ökar SNR men minskar konfokalitet.
    5. Ställ in skanningshastigheten på 0,25 spektralramar per sekund, välj ikonen som motsvarar enkelriktad för skanningsriktning, ange 4 för antalet och ställ in 1024 x 1024 för skanningsstorlek.
      OBS: FRET-signalerna är svaga och en långsam skanningshastighet krävs ofta. Med skanningshastigheten 0,25 slutförs förvärvet av en spektral z-stack på ~ 3 minuter. Skanningshastigheten kan ökas eller minskas beroende på vilka fluorforer som används. För ljusare fluorforer som eGFP kan till exempel snabbare skanningshastighet (2 bilder/sekund) användas. Antalet som anges under antal motsvarar ett bildrute medelvärde på 4, vilket hjälper till att minska bruset under bild anskaffningen. För mycket stabila prover och där tiden inte är en begränsning kan högre genomsnittsvärden (upp till 16) användas för att hämta bilder med förbättrad SNR.
  10. Definiera z-stack-anskaffningsparametrar:
    OBS: De värden som anges i steg 2.10 kan behöva justeras för att hantera förändringar i fluorescerande etikettbindning eller koncentration, typ av etikett, antal etiketter som används, cellinje och andra förändringar i provberedningen som kan påverka celletiketttätheten och/eller cellulär autofluorescens. Vid justering av förvärvsparametrar bör man vara noga med att uppnå en tillräcklig SNR samtidigt som fotoblekning minimeras. Vid konfigurering av en spektral FRET-analys bör man dessutom se till att parametrarna fungerar bra i alla behandlingsgrupper. Det är lämpligt att köra en studie av varje behandlingsgrupp med de föreslagna parameterinställningarna för att säkerställa att SNR är tillräckligt och att fotoblekning minimeras.
    1. Öppna ND-anskaffningsfönstret genom att klicka → på → ND-förvärvet.
    2. Ange sökväg/mål och ett filnamn för att spara ND-filen i popup-fönstret.
    3. Markera rutan som motsvarar z-serien.
    4. Klicka på live i fönstret A1 Plus-inställningar. Detta öppnar ett livevisningsfönster.
    5. Justera fokusknappen på mikroskopet för att markera cellens överkant och klicka på Överst i ND-anskaffningsfönstret för att ange den aktuella positionen som överkant.
      Obs: Det föreslås att fokusera något ovanför cellens överkant för att säkerställa att hela cellen provtas i z-serien.
    6. Justera fokusratten på mikroskopet för att markera cellens underkant och klicka på Botten i ND-anskaffningsfönstret för att ställa in den aktuella positionen som botten.
      OBS: Fokusera något under cellens botten för att säkerställa att hela cellen provtas.
    7. Ange 1 μm för stegstorlek, välj överst för z-skanningsriktningen och klicka på kör på ND Acquisition-fönstret för att skaffa en z-stack.
      OBS: Stegstorleken bestämmer antalet z-skivor som kommer att förvärvas beroende på övre och nedre platser (dvs. den tillryggalagda sträckan). En stegstorlek på 1 μm valdes som en kompromiss mellan bildhastighet, z-axelprovtagning och fotoblekning. Användning av den konfokala pinhole diametern 2,4 AU och 60x vatten nedsänkning mål resulterade i optisk sektion tjocklek på 1,73 μm. Därför ligger en stegstorlek på 1 μm något under Nyquists provtagningskriterier, men detta är en kompromiss som gjordes för att minska den tid som behövdes för att förvärva en z-stack. För mycket stabila prover, för vilka hastighet inte är kritisk, kan ett mindre z-axelsteg och eventuellt en mindre konfokal pinhole diameter användas för att öka z-axelupplösningen. Bottentoppen bör ge liknande resultat och kan användas för att utvärdera eventuella effekter av fotobleaching som kan uppstå under z-skanningen.
  11. Konfigurera PFS (Perfect Focus System) om det är tillgängligt:
    OBS: PFS gör det möjligt för systemet att kompensera för fluktuationer i brännvidden under bildförvärv. Följande steg kan användas för att ställa in PFS, och dessa steg kan variera något beroende på vilken version av Nikon A1R och vilken version av NIS Elements som används.
    1. Markera symmetriskt läge som definieras av intervallikonen i ND-anskaffningsfönstret.
    2. Slå på PFS-knappen på mikroskopets framsida (se till att den tärande spegelratten som finns på avsnittet under provsteget är "in").
    3. Omdefiniera toppen (rotera moturs) och botten (rotera medurs) med ratten på PFS-förskjutningsregulatorns framsida.
    4. Definiera en relativ z-position/z-djup genom att klicka på "relativ" i ND-anskaffningsfönstret.
    5. Klicka på minnet på mikroskopets framsida så att programvaran memorerar det relativa z-djupet.
  12. När z-stack-förvärvet är klart, tillsätt försiktigt önskat reagens (forskolin eller fordonsstyrning) med en pipett och vänta i 10 minuter.
    OBS: Tillsätt reagenset mycket försiktigt för att inte störa cellerna eller flytta cellkammarens position inom mikroskopets XY-steg. Det är praktiskt att i en efterföljande livevisning eller bild kontrollera att synfältet inte har skiftat under reagenstillskottet. Den 10 minuter långa väntetiden är att forskolinbehandlingen ska träda i kraft. Om en alternativ behandling används kan väntetiden behöva justeras.
  13. Efter 10 minuter ändrar du filnamnet och klickar på Kör i ND-anskaffningsfönstret.
  14. Upprepa steg 2.11 – 2.13 enligt ovan för minst 5 täckglas för att uppnå tillräckliga resultat för statistisk analys (n=5 för varje behandlingsgrupp – forskolin och fordonsstyrning).
  15. Förbered exempel och exempel på ämnen för att konstruera spektralbiblioteket och hämta spektralbilder med liknande anskaffningsinställningar enligt steg 2.9 och 2.10.

3. Bildanalys

OBS: Dessa bilder kommer att användas för att konstruera ett spektralbibliotek som innehåller det rena spektrat hos alla enskilda endmembers som finns i studien. Slutstrummen i spektralbiblioteket kan variera från studie till studie om olika fluororforer används. Ett detaljerat förfarande för att konstruera spektralbiblioteket finns i en kompletterande informationsfil med namnet "Kompletterande File_Spectral bibliotek". Här beskriver vi export av data till .tiff filer, linjär spektral unmixing, FRET effektivitet mätningar, tredimensionell återuppbyggnad och cAMP nivåer uppskattning. Bildanalys kan utföras med hjälp av olika bildanalys- och programmeringsplattformar som ImageJ, Python, MATLAB eller CellProfiler. I dessa studier användes MATLAB-skript.

  1. Exportera bilddata:
    1. Skapa nya mappar med samma filnamn som motsvarar de spektral-z-stackbilder som förvärvats i steg 2.13 och 2.14.
      Följande steg som beskrivs för att exportera data är specifika för NIS Elements AR version 4.30.01. Dessa steg kan variera något beroende på versionen av programvaran.
    2. Klicka påArkiv , som öppnar ett filfönster. Bläddra och välj den spektralbildfil som köpts i steg 2.12 och klicka på Öppna.
    3. När filen har läses in klickar dupå → importera/exportera→ ND-dokument.
    4. I popup-fönstret: bläddra och välj mappen som skapats i steg 3.1.1, välj TIF (Tagged Image Format) för filtyp och välj sedan Mono-bild för varje kanal och Behåll bitdjup.
      Obs: Filprefixet kommer att förgenereras. ändra detta värde för bekvämlighet. Indexordningen ändras beroende på vilka kanaler som väljs och ska visa "z, c" för indexering enligt Z-segmentplatsen först och våglängdsbandsnumret sekund. Kontrollera att rutorna som motsvarar Använd LUT eller Infoga överlägg eller Använd punktnamn är omarkerade.
    5. Klicka på Exportera om du vill exportera tiff-filerna till en målmapp som enskilda tiff-filer.
    6. Upprepa steg 3.1.2 – 3.1.5 för att exportera spektralbildfiler som förvärvats i steg 2.13.
  2. Linjär spektral unmixing:
    1. Öppna programmeringsprogrammet.
      OBS: Specialutvecklat programmeringsskript för att blanda råa spektralbilder tillhandahålls på University of South Alabama BioImaging and BioSystems webbplats, under fliken Resurser (https://www.southalabama.edu/centers/bioimaging/resources.html).
    2. Öppna filen märkt "Linjär avblandning.m" och klicka på körknappen i redigeringsverktygsfältet.
    3. Bläddra bland och välj mappen som innehåller den exporterade .tif filsekvensen som genereras av NIS Elements-programvaran.
    4. Klicka på OK för att fortsätta, vilket öppnar ett nytt fönster som heter Wavelength och Z-Slice.
    5. Kopiera filnamnet på den första filen (utan z-segment och kanalnummer) i mappen som valts i steg 3.2.4 och klistra in den i det första steget i dialogrutan med namnet "Ange bildnamnet".
    6. Ange antalet kanaler i det andra steget märkt "Ange antalet våglängdsband", antalet z-segment i det tredje steget märkt "Ange antalet Z-segment" och klicka på OK.
      OBS: Antalet våglängdsband kan ändras om ändringar görs i förvärvsinställningarna, till exempel justering av våglängdsområdet eller våglängdsstegets storlek. Antalet Z-segment kan också ändras beroende på cellens höjd.
    7. Bläddra och välj våglängdsfilen "Wavelength.mat" i popup-fönstret märkt "Välj våglängdsinformationsfilen" och klicka på öppna.
    8. Bläddra och välj filen "Library.mat" i det nya popup-fönstret märkt "Välj spektralbiblioteksfilen", klicka på öppna och vänta tills avblandningen av segmenten är klar.
      Obs: Library.mat fil är en fil som innehåller rena spektra för varje endmember fluorophore tillsammans med cell autofluorescens och bakgrund spektral signaturer. I det här fallet inkluderar endmember fluorforer turkos, Venus och DRAQ5. Bakgrund spektral signaturer inkluderar cellulära eller matris autofluorescens, coverslip fluorescens och coverslip diffraktion. Wavelength.mat fil är en fil som innehåller våglängd kanal information som används för att hämta spektral bilden. En exempelbiblioteksfil och våglängdsfil finns på Bioimagings och Biosystems webbplats (se anteckningen under 3.2.1). Mer information om hur du genererar spektralbibliotek och våglängdsfiler finns i den kompletterande informationsfilen "Kompletterande File_Spectral bibliotek". Omixade bilder som motsvarar varje z-segment sparas i mappen "Unmixed" som skapas under avblandningsprocessen i mappen som valdes i steg 3.2.3.
  3. Beräkning av FRET-effektivitet:
    1. Öppna programmeringsskriptet "multiFRRCF.m" och klicka på kör.
      OBS: Denna programmeringsfil är tillgänglig från University of South Alabama Bioimaging and Biosystems webbplats (se anmärkning under steg 3.2.1).
    2. Ange antalet experimentella försök att analysera i popup-dialogrutan som heter "hur många mappar som ska återstolkas" och klicka på OK.
      Bilddata från varje experiment bör sparas i en separat omixad bildmapp. Det här steget gör det helt enkelt möjligt för analyskoden att loopa över många mappar som ett tidsbesparande steg.
    3. Bläddra bland och markera de omixade mapparna och klicka på OK.
      Antalet gånger som popup-fönstret "Bläddra efter mapp" öppnas beror på antalet som anges i dialogrutan "Hur många mappar som ska återstolkas" i föregående steg. Bläddra och markera mapparna en efter en.
    4. I det nya popup-fönstret anger du följande information i respektive rutor: skalningsfaktorn är 12,4, tröskelvärdet är 5,6, X, Yoch Z Frekvensen är 5, 5 respektive 1, och utjämningsalgoritmen är gaussisk.
      OBS: Skalningsfaktorn är ett värde i pixlar/μm och kommer att användas för att skala Z-riktningsprovtagningen till XY-riktningen. Skalningsfaktorn erhålls från bildpixelstorleken, som vanligtvis tillhandahålls som metadata i bilden för de flesta konfokala mikroskopsystem. Om bilden till exempel förvärvas med 0,08 μm/pixelavstånd bör skalningsfaktorn vara 12,5 pixlar/μm. Tröskelvärdet används för att trösklar bilderna och generera en binär mask i cellen. Vi skapade en lista över optimala värden baserat på bilddonatorn + acceptansintensiteten. Använd 4.5 som tröskelvärde om bilden har ljus givar-/acceptorintensitet och låg bakgrund, ett värde mellan 5,6 och 6,5 för bilder med endast måttlig givar-/acceptorintensitet och/eller högre bakgrund och ett värde på 7,5 och högre för bilder med en givar-/acceptorintensitet som är lägre än bakgrunden. Frekvensvärdet motsvarar intervallet, i antal pixlar, där skivningen utförs i de efterföljande stegen. Om cellens Z-djup till exempel är 17 μm med en stegstorlek på 1 μm och en skalningsfaktor på 12,5 pixlar/μm används i XY-riktningen, kommer djupet på den 3-dimensionella bilddatauppsättningen att omfördelas vid 212 pixlar (Z-riktning). Baserat på det A-frekvensvärde som angetts (till exempel 1 pixel) kommer den 3-dimensionella bilddatauppsättningen att segmenterades igen med början högst upp i bilddatauppsättningen och sedan flyttas i steg om 1 bildpunkt nedåt. Detta resulterar i 212 resliced bilder. Om ett större frekvensvärdeintervall angavs för Z Frequency genereras färre reslicerade bilder. Resliced bilder sparas i efterföljande steg.
    5. Klicka på Kör och vänta tills alla FRET-mätningar och reslicing utförs.
      Obs: En separat mapp skapas i den överordnade katalogen som resliced gråskala FRET effektivitetsbilder och färgade (en färgkarta tillämpas) FRET effektivitet bilder sparas. Till exempel sparas alla fret-bilder i gråskala och färgkarta som är omgivna i X-riktningen (YZ-planet) i en mapp som heter "Resliced_XFRET".
    6. Upprepa analysen med liknande inställningar för alla experiment – före och efter forskolinbehandlingar och fordonskontroller.
      Obs: Steg som nämns i avsnitt 3.3 beskriver de värden som ska anges för det anpassade PROGRAMMERINGSSKRIPTET fret-analys för att generera 3-dimensionella FRET-bilddata. Det här skriptet utför dock flera åtgärder medan det körs, inklusive: läsa in bilddata, skapa bildstaplar, jämna ut, FRET-effektivitetsberäkningar, skapa och tillämpa en cellkantmask, 3-dimensionell bildrekonstruktion, återskapa 3-dimensionella bilder med angivna intervall (frekvenser), använda en färgkarta för att visualisera FRET-ändringar och spara de reslicerade bilddata i samma katalog. Ytterligare information har inkluderats som kommentarer i programskriptet.

4. Kartläggning av FRET-effektivitet till cAMP-nivåer

  1. Öppna programmeringsfilen med namnet "Mapping_FRET Efficiency_to_cAMP_concentration.m" och klicka på kör på huvudfönstret.
    Obs: Filen finns tillgänglig på BioImaging och BioSystems webbplats (se anmärkning under 3.2.1). Den här filen läser fret-effektivitetsbilder i gråskala och konverterar dem till cAMP-nivåer baserat på en karakteristisk kurva. Denna karakteristiska kurva använder ett cAMP-till-FRET-förhållande dokumenterati litteratur 15,36 som beskrivs av Hill-ekvationen (den tredje ekvationen som visas nedan). Kd av sonden i intakta celler är dock svår att uppskatta och vi har antagit att det är 1 μM i våra beräkningar. Därför visas resultaten som en funktion av Kd. (dvs. [cAMP] = x* Kd). Ekvationer som används för att mäta FRET-effektivitet och kartlägga FRET till cAMP-nivåer visas nedan:
    Equation 1
    Där E är FRET-effektiviteten, och enuppenbar och duppenbar är omixade pixelintensiteter för acceptor- respektive donatorbilder.
    Qa och Qd är kvantutbyten av acceptor och donator. Observera att Qa och Qd avbryter när ekvationen för kλ ingår i FRET-effektivitetsekvationen, kλ är en korrigeringsfaktor:
    Equation 2
    Equation 3 och Equation 4 är utrotningskoefficienter för donator och acceptor vid donatorns excitationsvåglängd, i (405nm).
    Equation 5
    E är FRET-effektivitet och KD = Dissociationskonstant = 1 μM.
  2. Navigera och markera den första fret-bilden i gråskala (sparad i steg 3.3.5) och klicka på OK.
  3. Öppna FRET/cAMP-bilderna för att inspektera fördelningen av cAMP-signaler i tre dimensioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detta protokoll beskriver användningen av hyperspektrala FRET imaging och analys metoder för att mäta cAMP gradienter i tre rumsliga dimensioner i levande celler. Det finns flera viktiga steg involverade i att generera dessa resultat, för vilka noggrann uppmärksamhet krävs när man analyserar och kvantifierar data. Dessa viktiga steg inkluderar konstruktion av ett lämpligt spektralbibliotek, bakgrundsspektralt unmixing, tröskelvärden för att identifiera cellgränser och FRET-effektivitetsberäkningar. Figur 1 illustrerar det schematiska flödet av alla steg som är involverade i att mäta FRET-effektivitet och cAMP-nivåer i levande celler. När dessa bild- och analyssteg utförs korrekt kommer de att möjliggöra mätning av FRET-effektivitet och uppskattning av cAMP rumsliga gradienter i 3 dimensioner i en cell, samtidigt som de står för icke-enhetliga bakgrundssignaler.

Figur 2 visar 3-dimensionella vyer av falskt färgade obehandlade hyperspektrala bilddata som förvärvats med hjälp av ett konfokalt mikroskop i Nikon A1R vid baslinjeförhållanden (figur 2A) och 10 minuter efter (figur 2B) forskolinbehandling. Observera att liknande detektor- och systemparametrar användes för att förvärva bildstackar före och efter behandlingen för att upprätthålla konsekvens för kvantitativ analys. Observera också att förändringar i FRET inte är uppenbara i den här bilden, eftersom detta bara är en visualisering av rådata innan du beräknar FRET-effektiviteten.

Ett spektralbibliotek med rent spektra av alla slutmedlemmar behövs för att ytterligare analysera råa spektralbilddata. Att konstruera ett lämpligt spektralbibliotek är ett av de viktigaste stegen för att säkerställa lämpliga mätningar av FRET-effektiviteten. Figur 3 visar byggandet av ett spektralbibliotek som innehåller det rena spektrat av endmembers (i dessa aktuella studier är slutmedlemmar turkos, Venus och DRAQ5). För att mäta FRET-effektiviteten är det viktigt att få turkos och Venus spektra med hjälp av ett prov med 1:1-stoichiometry. Här har vi tillhandahållit ett tillvägagångssätt där acceptorfluorforen är helt fotoförstörd, vilket gör det möjligt att få spektralsignaturer av donatorn och acceptorn med 1:1 stoichiometry (Figur 3A-F). Dessutom tillämpades linjära kraftrelationer mellan lasrarna (kompletterande figur 1) för att beräkna acceptorspektrumet med en intensitet som skulle förväntas om det var upphetsad med hjälp av donatorexcitationslasern, i detta fall 405 nm för turkos (Figur 3G). Detta säkerställer att omixade givar- och acceptorsignaler är jämförbara i absolut intensitet när FRET är upphetsad med en enda 405 nm laserlinje. Icke-transfekterade celler märkta med kärnfärgämnet DRAQ5 (Figur 3H) användes för att erhålla det rena spektrumet av DRAQ5 (Figur 3I). Genom att kombinera donatorn Turquoises (figur 3F),acceptorn Venus (Figur 3G) och DRAQ5 (Figur 3I), skapades ett bibliotek med 3 komponenter (figur 3J).

Signaler från andra källor än fluorescerande etiketter kan också finnas i ett prov. För att ta hänsyn till dessa identifierades tre olika spektralsignaturer med toppar som förekommer vid 424 nm, 504 nm och 574 nm inom omärkta cellprover. Vi tror att dessa spektral signaturer motsvarar coverlip reflektans och cell matris eller cellulära autofluorescens. Figur 4 visar källorna till dessa tre bakgrundsspektrala signaturer. Det är viktigt att notera att dessa signaler distribueras ojämnt inom provet och därför inte bara kan subtraheras. Att lägga till spektralsignaturerna för dessa signaler i spektralbiblioteket och använda linjär unmixing för att separera signalerna utgör dock ett tillvägagångssätt för att ta bort dessa förvirrande signaler från givaren och acceptorsignalerna innan FRET-effektivitetsvinster beräknas. För att uppnå detta lades de tre bakgrundsspektrala signaturerna till i 3-komponentsspektrala biblioteket och bildade ett nytt 6-komponentsbibliotek bestående av givare (turkos), acceptor (Venus), DRAQ5 och tre bakgrundsspektrala signaturer.

Ett anpassat programmeringsskript skrevs för att blanda spektralbildsdata i enskilda slutmedlemmar, och ett separat skript skrevs för att utföra efterföljande FRET-effektivitetsberäkningar. Linjär spektralremixning (illustrerad i figur 5) utfördes med hjälp av det 6-komponentiga spektralbiblioteket. Avblandning utfördes för varje segment i den axiella bildstacken, även kallad z-stack (se den 3-dimensionella visualiseringen av råspektrala bilddata i figur 5A). Detta resulterade i separata omixade bilder för varje endmember, för varje z-skiva i z-stacken (Bild 5C-E, bakgrundsmixade bilder visas inte). Om så önskas kan de omixade signalerna vara falskt färgade för visualisering med en annan färg tilldelad varje omixad signal (Figur 5F-H).

Figur 6 illustrerar stegen i fret-effektivitetsberäkningarna, liksom stegen för att mappa FRET-effektivitet till cAMP-nivåer. En FRET effektivitets bild genererades med jämnade unmixed givare och acceptor bilder. En binär mask bild erhölls med hjälp av omixade givare, acceptor och nukleära bilder. Masken tillämpades på FRET-effektivitetsbilden för att ta bort bidrag från pixlar utanför cellen. Även om omixade bilder från enstaka z-skivor användes för bilddemonstration av FRET-effektivitetsmätningar, utfördes dessa beräkningar på varje segment i den 3-dimensionella bildstacken. Den 3-dimensionella FRET-bilddatauppsättningen reslicerades sedan i tre orthogonalplan för att visualisera rumsliga gradienter av cAMP-signaler i olika riktningar.

Visualisera agonistinducerade förändringar i FRET-effektivitet och cAMP-nivåer
Stegen som beskrivs ovan ger en metod för beräkning av FRET-effektivitet och cAMP-nivåer från hyperspektrala bilddata i tre rumsliga dimensioner. Dessa steg kan tillämpas på cellulära preparat före och efter behandling med föreningar som framkallar ett cAMP-svar, såsom forskolin. Här ger vi ett exempel på hur du använder den här metoden för att observera förändringar i FRET- och cAMP-distribution i PMVECs efter behandling med 50 μM forskolin. Figur 7 illustrerar förändringarna i FRET-effektivitet och cAMP-nivåer i olika XY-planskivor (z-skivor), från atiska till basala, vilket möjliggör jämförelse av utgångsförhållanden (före forskolinbehandling) och 10 minuters efterbehandling. I detta belysande exempel minskade FRET-effektiviteten (kolumnerna 1 och 3 i figur 7) vid forskolinbehandling, vilket korrelerade med en ökning av cAMP-nivåerna (kolumnerna 2 och 4 i figur 7). Minimal rumslig variation av cAMP inom ett enda XY-plan observerades. Axiella (apical-to-basal) cAMP rumsliga gradienter observerades dock, vilket kan förmodas genom att observera att den apatiska segmentet har en djupare röd färg (vilket indikerar högre cAMP-nivåer genom färguppslagstabellen som applicerades) än basalskivan efter forskolinbehandling (kolumn 4 i figur 7). Axial FRET- eller cAMP-fördelningar kan ofta visualiseras bättre med hjälp av bilder från de två orthogonala rumsliga planen: Figur 8 visar FRET-effektiviteten och cAMP-nivåerna i YZ-planet vid baslinjen (kolumnerna 1 och 2) och 10 minuter efter forskolinbehandling (kolumnerna 3 och 4), medan kompletterande figur 2 visar FRET-effektivitet och cAMP-nivåförändringar i XZ-planet. Dessa resultat visar genomförbarheten av att mäta FRET och uppskatta cAMP nivåer från 3-dimensionella hyperspektrala bilddata och visar också vikten av att visualisera axiella fördelningar av FRET eller cAMP. Även om det ligger utanför tillämpningsområdet för detta metodologiska papper kan det vara så att axiella rumsliga fördelningar av cykliska nukleotider bidrar till specificitet inom cykliska nukleotidsignaleringsvägar.

När man utför de metoder som beskrivs ovan är det viktigt att noggrant kontrollera stegens noggrannhet och att köra lämpliga experimentella kontroller och fordonskontroller för att säkerställa att förändringar i FRET (och motsvarande cAMP) beror på faktiska förändringar i givar- och acceptorsignaler och inte är avbildningsartefakter. Viktiga steg att tänka på är till exempel:

Använda ett lämpligt spektralbibliotek som innehåller alla nödvändiga spektralkomponenter
Som nämnts kan det finnas betydande bidrag av bakgrundssignaler från cellulär autofluorescens, deponerad matris eller reflekterat ljus från täckglaset (excitation-emission bleed through). Figur 9 representerar ett exempel på datauppsättning som illustrerar att bakgrundssignalen behölls i bilderna när ett bibliotek med 3 komponenter (Turkos, Venus och DRAQ5) användes för att blanda bort spektraldata. Däremot togs bakgrundssignalen effektivt bort när ett mer komplett (och lämpligt) 6-komponentsspektrala bibliotek användes.

Använda ett optimalt tröskelvärde för att generera en cellmask
I många av de experiment som vi har utfört är bakgrundssignalintensiteten cirka 50-60% av FRET-signalintensiteten som finns i de råa spektralbildsdata (dvs. när man visualiserar obearbetade spektralbildsdata är toppen av FRET-signalen bara ~ 2X högre än den omgivande bakgrundssignalen). Således är separation av bakgrundssignal från förgrundssignal med hjälp av ett tröskelvärde för att erhålla en binär mask ett känsligt steg och måste utföras noggrant för att undvika analysartefakter. Figur 10 illustrerar effekten av olika tröskelvärden som tillämpas för cellsegmentering för att skapa en binär mask i cellen. Ett lågt tröskelvärde kan inkludera bakgrundssignal som en del av uttryckscellen. Å andra sidan kan ett alltför högt tröskelvärde utesluta mätning av FRET i lågspräpta celler eller regioner i en cell med låg givar-/acceptorsignal (antingen mycket tunna delar av cellen eller delar som kan ha en lägre regional koncentration av FRET-sonden).

Välja en transfekterad cell med givar-/acceptorsignalintensitet ≥ bakgrundssignal
Figur 11 illustrerar en exempeluppsättning där FRET-effektivitet och motsvarande nivåer mättes från omixade bilder som erhållits med hjälp av ett spektralbibliotek med 6 komponenter för linjär spektralremixning. Trots att man använde 6-komponentsbiblioteket för att blanda spektralbildsdata och välja en hög tröskel för att skapa cellgränsen och kärnmasken, var FRET-effektivitetsbilder fortfarande benägna att hög bakgrundsljudsignal nära cellens basala sida. I det här fallet berodde förekomsten av bakgrundsljud på val av en cell som bara svagt uttryckte FRET-sonden, och donor + acceptor signalstyrka var ungefär lika med bakgrundssignalstyrkan, även efter avblandning. Förutom att tillämpa de sofistikerade analyssteg som beskrivs ovan är det därför också viktigt att välja en cell med tillräckligt uttryck för FRET-sonden och motsvarande tillräcklig FRET-signal (givar- och acceptorsignal minst lika eller ovanför bullersignalen) under förvärvet för att säkerställa högkvalitativa resultat.

Figure 1
Figur 1: Flödesschema som visar stegen i FRET-effektivitet och nivåmätningar i tre rumsliga dimensioner med hyperspektral FRET-avbildning och analys. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: En 3-dimensionell visualisering av en cell som uttrycker cAMP FRET-reportern (grön) och atomkärnor från cellen och omgivande icke-uttryckande celler (röda). Rå spektralbilddata som förvärvats med hjälp av ett Nikon A1R spektral confocal mikroskop har varit falska färgade enligt våglängd och visualiserades i 3 dimensioner med HJÄLP av NIS Elements programvara. A) 3-dimensionella bilddata vid baslinjen och B) 10 minuter efter 50 μM forskolinbehandling. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Konstruktion av ett spektralbibliotek som innehåller det rena spektrat av fluorescerande etiketter i studien (kallas endmembers av fjärranalysfältet). A) En falskfärgad bild av celler som uttrycker FRET biosensor förvärvas vid 405 nm excitation (donator excitation). B) Spektrum som motsvarar FRET-signal: 4 olika intresseområden (ROIs) ritades på bild A som visas av röda, gula, blå och gröna rektanglar. Medelintensiteten vid varje våglängd för varje vald ROI exporterades. Den genomsnittliga intensiteten från dessa 4 ROIs ritades vid varje utsläppsvåglängd. Spektrumets utsläppstoppar motsvarar både donatorn (turkos) och acceptorn (Venus) fluorforer. C) En falskfärgad bild av celler som uttrycker FRET biosensor förvärvas vid 488 nm excitation (acceptor excitation). D) Det genomsnittliga spektrumet uppskattades som förklarat i B från flera roi i C (samma regioner som i A) med utsläppstopp på grund av endast acceptorn. E) En falskfärgad bild av celler som uttrycker FRET biosensor förvärvas vid 405 nm excitation efter foto-förstörelse av acceptor fluorfor med 514 nm bestrålning. F) Det genomsnittliga spektrumet uppskattades som förklarat i B från flera roi i E (samma regioner som A) med utsläppstopp på grund av endast givaren. OBSERVERA att donatorintensiteten ökas i F jämfört med den ursprungliga FRET-signalen, vilket indikerar att efter fotografering av acceptorn leder donatorexcitation till direkta givarutsläpp. G) Acceptorspektrumet som förväntat om det erhålls med hjälp av 405 nm excitation. Detta uppskattades genom att använda fakta om att 405 nm och 488 nm excitationslasrar har ett linjärt svar som kan karakteriseras med hjälp av en spektrometer ochintegrerande sfär( Kompletterande figur 1 ) och venus våglängdsberoende utrotningskoefficient. Därför kan Venusspektrumet som erhålls vid 488 nm excitation omvandlas till Venusspektrumet som skulle förväntas om det erhålls vid 405 nm excitation H) En falskfärgad bild av celler märkta med kärnetiketten DRAQ5. I) Det genomsnittliga spektrumet från flera regioner av intresse för H. J) Det resulterande spektralbiblioteket som innehåller det normaliserade rena spektraet av givaren och DRAQ5 och excitation våglängd-korrigerade spektrumet av acceptorn. Observera att turkos- och Venusspektra normaliserades till det maximala värdet av kombinerade turkosa + Venus spektraldata medan DRAQ5 helt enkelt normaliserades till enhet till värdet av topputsläppsvåglängden. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Bakgrundsspektrala signaturer identifierades och inkluderades i spektralbiblioteket för att ta hänsyn till bakgrundsfluorescenssignaler under avblandningsprocessen. A, B) Två bakgrund fluorescens spektral signaturer observerades när karakterisera ett prov tom (omärkt coverlip). Dessa spektralsignaturer namngavs baserat på deras toppvåglängder - en vid 424 nm (från coverlip fluorescens) och den andra vid 504 nm (sannolikt från reflektans eller ryggspridning). C) En tredje bakgrund spektral signatur observerades med en topp utsläpp våglängd av 574 nm när icke-märkta celler analyserades, potentiellt från cellulära autofluorescens eller fluorescens av den underliggande matrisen. D) Bakgrundsspektra extraherat från bilderna A, B och C. Dessa tre bakgrundsspektra lades till i det befintliga 3-komponentsbiblioteket (figur 3J) för att utveckla ett 6-komponentsspektrabibliotek. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 5
Bild 5: Linjär spektral-unmixing med hjälp av ett 6-komponents spektralbibliotek som står för bakgrundssignaler. A) Rå spektralbilddata som förvärvats som en axiell z-stack. B) 6-komponents spektralbibliotek som används för att linjärt blanda råa spektraldata. C, D och E) Gråskalan omixade bilder av DRAQ5, Turkos respektive Venus berodde på linjär spektral-unmixing. F, G och H) Falska färgade omixade bilder av DRAQ5, Turkos respektive Venus. Omixade bilder av bakgrundssignaler beräknades också (data som inte visas här eftersom endast fluorescerande etiketter är av intresse för denna metodik – se figur 4 i Annamdevula, m.fl. för exempel på omixade bakgrundssignaler25). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 6
Figur 6: Flödesschema som visar stegen för beräkning av FRET- och cAMP-nivåer från omixade spektralbilddata. A) Representativ omixad bild av donator, Turkos. B) Representativ omixad bild av acceptor, Venus. C) Representativ omixad bild av atomkärnor, DRAQ5. D) Binär cellmask genereras genom att tröskelvärden blandas av donor+acceptor summerad bild. E) En tröskel tillämpas på kärnbilden för att skapa en binär mask av kärnan. F) Den pixelvis FRET-effektiviteten beräknades från omixade donator- och acceptorbilder. G) En sammansatt binär mask skapades från cellgränsen och nukleära masker. H) Maskerad FRET effektivitetsbild: sammansatt cell mask tillämpades på FRET effektivitet bild för att utesluta icke-specifika FRET signaler utanför cellen och inom kärnan. I) En färgkarta tillämpades på den maskerade FRET-effektivitetsbilden för att bättre visualisera rumsliga förändringar i FRET. J) CAMP-nivåbilden som uppskattades från FRET-effektivitetsbilden. K) Colormap tillämpades för att bättre visualisera rumsliga förändringar i cAMP. Färglister som visas på höger sida användes för att visualisera FRET-effektivitet (övre panelen) och cAMP-nivåer (nedre panelen). Bilder som visas i den här figuren är representativa för en enda axiell z-skiva, men analysåtgärden som beskrivs i den här figuren utförs på hela den axiella z-stacken. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 7
Figur 7: Forskolin-inducerad FRET-effektivitet och cAMP rumsliga gradienter visualiserade i PMVECs. XY-planbilder genererades av reslicing 3-dimensionella rekonstruerade FRET och cAMP bilddata i axial (Z) riktning från den apatiska till basala sidan av cellen. Fem sammanhängande XY-skivor visas. Kolumnerna 1 och 3 representerar FRET-effektiviteten vid baslinjen och 10 minuter efter behandling med 50 μM forskolin. Kolumnerna 2 och 4 anger nivåerna vid baslinjen och 10 minuter efter forskolinbehandling. Färglisterna användes för att relatera ändringar i färgkartan till FRET-effektivitet (överst) och cAMP-nivåer (nederkant). Vita linjer som visas på bilder i kolumn 2 och kolumn 4 används för att generera intensitetsprofilen (linjeskanningsprofilen) för cAMP-signaler över den här valda linjen. Intensitetsprofildiagram som erhålls från cellens mittsegment vid baslinjen (blå profil) och efter forskolinbehandling (grön profil) visar den rumsliga fördelningen av cAMP-signaler över linjens skanning. Skalstrecket anger 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: Forskolin-inducerad FRET-effektivitet och cAMP rumsliga gradienter visualiserade i axiell riktning. YZ-planbilder genererades genom att reslicing 3-dimensionella rekonstruerade FRET- och cAMP-bilddata i sidled (X) riktning (från vänster till höger om cellen). Kolumnerna 1 och 3 representerar FRET-effektiviteten vid baslinjen respektive 10 minuter efter 50 μM forskolinbehandling. Kolumnerna 2 och 4 representerar cAMP-nivåerna vid baslinjen och 10 minuter efter forskolinbehandling. Färglisterna till höger användes för att relatera ändringar i färgkartan till FRET-effektivitet (överst) och cAMP-nivåer (nederkant). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 9
Figur 9: En jämförelse av effektiviteten av att använda antingen en 3-komponent eller ett 6-komponents spektralbibliotek för beräkning av BILDER av FRET- och cAMP-nivåer. Ospecificerade bakgrundssignaler observerades i bilder beräknade med hjälp av ett 3-komponentsbibliotek, som inte tog hänsyn till bakgrundsspektrala signaturer. Detta gällde särskilt för bilder nära cellens basala sida efter 50 μM forskolinbehandling (kolumn 2). Däremot togs bakgrundssignalartefakter effektivt bort när man använde ett 6-komponentsbibliotek som inkluderade bakgrundsspektrala signaturer, vilket förbättrade förmågan att segmentera cellen och analysera FRET- och cAMP-signaler. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 10
Figur 10: Bildanalysartefakter kan införas om ett lämpligt tröskelvärde inte väljs för att avgränsa cell- och nukleära gränser. Omixade donator- och acceptorbilder användes för att skapa en mask med tre olika tröskelvärden: 0,35 (kolumnerna 1 som 2), 0,65 (kolumnerna 3 och 4) och 0,9 (kolumnerna 5 och 6). Kolumnerna 1, 3 och 5 visar FRET-effektiviteten vid baslinjen. Kolumnerna 2, 4 och 6 visar FRET-effektiviteten 10 minuter efter 50 μM forskolinbehandling. Om du valde ett tröskelvärde som var för lågt resulterade delar av bakgrunden, eller det extracellulära området, i cellen för analys, samtidigt som ett tröskelvärde som är för högt valdes resulterade det i att en del av cellen gick förlorad (se det apatiska segmentet i kolumnerna 4–5 jämfört med kolumnerna 3–4). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 11
Figur 11: Bakgrundssignalartefakter kan fortfarande kvarstå även efter bakgrundsavblandning och val av ett lämpligt tröskelvärde när en binär mask skapas. Kolumn 1 visar representativa apatiska, mellersta och basala skivor vid baslinjen och kolumn 2 visar samma vid 10 minuter efter 50 μM forskolinbehandling. Trots att man använde ett 6-komponentsbibliotek för att blanda bort som stod för bakgrundssignaler och använde en högre tröskel på 0,85 för binär maskgenerering, identifierades bakgrundsregioner fortfarande som en del av cellen, särskilt efter behandling med forskolin. Om detta inträffar kan en möjlig förklaring vara att en cell med svagt uttryck för FRET-reportern valdes för avbildning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Kompletterande figur 1: Mätningar av laserlinjens intensitet som en funktion av laserinställningen i programvaran. En fiberankparerad spektrometer och integrerande sfär kalibrerades till en NIST-spårbar lampa för att mäta laserintensiteten för både 405 nm laserlinjen och laserlinjen på 488 nm. A) Totalt antal fotoner uppmätta i mikroskopstadiet motsvarande olika laserintensiteter för lasern på 405 nm. B) Totalt antal fotoner uppmätta i mikroskopstadiet motsvarande olika laserintensiteter på 488 nm laser. Linjärt svar i laserintensitet observerades för båda lasrarna mätt i mikroskopstadiet. En linjär trendlinje passade och trendlinjeekvationen för varje laserlinje användes för att beräkna det acceptorspektrum som skulle förväntas om den var upphetsad med laserlinjen på 405nm (donatorexcitation). Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Kompletterande figur 2: Forskolin-inducerad FRET-effektivitet och cAMP rumsliga gradienter visualiserade i axiell riktning. XZ-planbilder genererades genom att reslicing 3-dimensionella rekonstruerade FRET och cAMP bilddata i sidled (Y) riktning (framifrån och baksidan av cellen). Kolumnerna 1 och 3 representerar FRET-effektiviteten vid baslinjen respektive 10 minuter efter 50 μM forskolinbehandling. Kolumnerna 2 och 4 representerar cAMP-nivåerna vid baslinjen och 10 minuter efter forskolinbehandling. Färgstaplarna till höger användes för att relatera ändringar i färgkartan till FRET-effektivitet (överst) och cAMP-nivåer (nederkant). I likhet med resultaten för YZ-planen (figur 8) kan aska till basala rumsliga gradienter i FRET-effektivitet och cAMP-nivåer visualiseras som färgförändringar från toppen till botten av en enda YZ-skiva, både vid baslinjeförhållanden (en given sektor i kolumnerna 1-2) och efter 50 μM forskolinbehandling (kolumnerna 3-4). Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Kompletterande filer. Klicka här för att ladda ner dessa filer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Utvecklingen av FRET-biosensorer har gjort det möjligt att mäta och visualisera cykliska nukleotidsignaler i enstaka celler, och det finns ett stort löfte om att visualisera subcellulära signalhändelser13,22,37,38. Användningen av FRET-biosensorer innebär dock flera begränsningar, inklusive de låga signal-till-brus-egenskaperna hos många fluorescerande proteinbaserade FRET-reportrar och fret-reportrarnas svaga transfekt eller uttryckseffektivitet (detta kan vara särskilt utmanande i vissa cellinjer, såsom PMVECs)23,24. Avbildning av svagt uttryckt fluorescerande proteiner, i kombination med ratiometric FRET beräkningar, resulterar ofta i en hög grad av osäkerhet eller fluktuation i den beräknade FRET effektivitet. I ett försök att förbättra tillförlitligheten hos FRET-mätningar har vi och andra tidigare visat användningen av hyperspektrala avbildningar och analyser för att mäta FRET-signaler och för att minska crosstalk eller blödning genom fluorescenssignaler mellan fluorescerande etiketter och autofluorescenseffekter26,31,32,39. På grund av begränsningar i signalstyrka begränsades dessa spektral FRET-studier till två (X och Y) rumsliga dimensioner fram till helt nyligen. Därför gav de en enda segmentvy av FRET-ändringar i en cell.

I nyligen genomförda studier noterade vi att FRET (och motsvarande cAMP-nivåer) verkade vara rumsligt fördelade inte bara i XY-planet utan också över XZ- och YZ-planen25. Den hyperspektrala FRET imaging approach som beskrivs här utökar vår förmåga att visualisera och mäta FRET och cykliska nukleotid (cAMP) förändringar i tre rumsliga dimensioner, vilket öppnar nya möjligheter för att bedöma signal compartmentalization. Denna 4-dimensionella (X, Y, Z och λ) hyperspektrala bildbehandling och analysmetod möjliggör mätning och visualisering av cAMP-gradienter i tre rumsliga dimensioner samtidigt som den står för icke-enhetliga bakgrundssignaler. Här har vi visat hur man implementerar detta tillvägagångssätt genom exemplet med forskolin-inducerade cAMP rumsliga gradienter. I bilddata efter behandlingen kan cAMP rumsliga gradienter observeras från den apatiska till den basala sidan av cellen (figur 7 och figur 8). Den cAMP som producerades vid behandling med forskolin verkade inte nå cellcellskorsningar (figur 7 och figur 8).

Vid användning av den metod som beskrivs här var det viktigt att ta hänsyn till olika källor till bakgrunds- och autofluorescenssignaler för att möjliggöra korrekt uppskattning av FRET-effektivitet. Linjär blandning ger en potentiell väg för att redovisa unika bakgrundsspektra, om deras signaturer skiljer sig från de fluorescerande sonderna av intresse. I synnerhet är linjär remixning bättre lämpad för att separera bakgrunds- och autofluorescenssignaler än standard bakgrundssubtraktion. 40,41,42 I exemplet som visas här mättes tre olika spektralsignaturer och tilldelades ett namn baserat på signaturens topputsläppsvåglängd: bakgrundsspektrumet på 424 nm (eventuellt från täckspannöjorescensen), bakgrundsspektrumet på 504 nm (sannolikt på grund av reflekterat eller ryggspritt ljus) och bakgrundsspektrumet på 574 nm (eventuellt på grund av cell- eller cellcellsmatrisen autofluorescens). För att illustrera effekterna av att inte ta hänsyn till dessa signaturer skapades två spektralbibliotek och omixade bilder jämfördes. Först skapades och märktes ett spektralbibliotek som bara innehöll fluorescerande etiketter i provet, Turkos, Venus och DRAQ5, 3-komponentsbiblioteket. För det andra skapades ett spektralbibliotek som dessutom innehöll de tre bakgrundsspektrala signaturerna och märkts med 6-komponentsbiblioteket. Som visas ovan tillät mixning med biblioteket med 6 komponenter (bakgrundsremixning) avlägsnande av bakgrundssignaler, medan blandning med 3-komponentsbiblioteket inte gjorde det (figur 9). I tidigare arbete har vi visat att rotvärdet kvadratfel (RMSE) som är associerat med linjär avblanding minskar när man använder ett spektralbibliotek som står för både fluorescerande etiketter och bakgrundssignaturer. Det bör noteras att den axiella fördelningen av bakgrundsfluorescens ofta är icke-enhetlig och därför kommer en enkel bakgrundssubtraktion inte att fungera för att korrigera bilddata. Således behövs den spektralremixningsmetoden för att ge korrekt bakgrundsborttagning och tillförlitliga FRET-mätningar.

Det är viktigt att optimera systemparametrarna för att välja bästa möjliga system- och kamerainställningar när du skaffar spektralbilder. Det övergripande målet bör vara att optimera SNR samtidigt som förvärvstiden minimeras och fotografering förhindras. 43 När man optimerar ett bildsystem behövs därför ofta en kompromiss mellan rumsliga, tidsmässiga och spektralupplöstningar. I dessa studier valdes optimala värden för system- och kamerainställningarna inklusive pinhole-storlek, lasereffekt, skanningshastighet, skanningsstorlek och bildruta i genomsnitt enligt beskrivningen i protokollavsnittet. Med hjälp av dessa inställningar uppnås rumslig provtagning av 80 nm/pixel, temporal provtagning på ~ 3 minuter per spektral z-stack (~ 10 sekunder / XY-bild) och spektralprovtagning av 10 nm intervall med försumbar eller minimal fotoblekning.

För att säkerställa exakta uppskattningar av FRET-effektiviteten är det nödvändigt att mäta givar- och acceptorspektra som de kan förväntas med 1:1-stoichiometry och identiska excitationsvåglängder (figur 3). Turkos och Venus spektra normaliserades med avseende på turkos topp utsläpp våglängd. FRET-effektiviteten som uppskattades med hjälp av detta spektralbibliotek producerade värden som liknar de som rapporterats ilitteraturen 12,22. Vanligtvis normaliseras slutmedlemsspektrat i biblioteket till enhet. För att exakt beräkna FRET-effektiviteten måste dock acceptorspektrumet förvärvas med avseende på givarspektrumet (dvs. vid equimolarkoncentration eller 1:1-stoichiometry och hänvisas till samma excitationsvåglängd). Förutom användningen av ett korrekt konstruerat bibliotek är flera steg involverade i lämplig uppskattning av FRET-effektivitet och undvikande av analysartefakter. Dessa inkluderar att välja en uttryckscell med tillräcklig signalintensitet (figur 11), utjämning av omixade bilder innan man uppskattar FRET-effektivitet (Gaussisk oskärpa tillämpades i detta exempel), med hjälp av ett lämpligt tröskelvärde för att skapa masken (figur 10) och uppskattning av en korrigeringsfaktor med hjälp av utrotningskoefficienter för givare och acceptor (Supplemental File_Spectral Library). När dessa steg följs kan 3-dimensionella fördelningar av FRET-effektivitet och underliggande cAMP-nivåer visualiseras exakt i enstaka celler.

Lokaliserade cAMP-signaler har uppskattats i 2-rumsliga dimensioner med hjälp av riktade FRET-biosensorer13,37. Att rikta FRET-sonder till specifika subcellulära fack (till exempel plasmamembran eller lipidflottar) resulterar dock vanligtvis i en ökad lokal koncentration av sonden. Detta kan resultera i mätningar artefakter införs på grund av att intermolecular eller bimolecular FRET. Dessutom visar de resultat som presenteras här och i Annamdevula et.al., 2018, Cytometri A25 vikten av 3-dimensionella mätningar av FRET från antingen lösliga eller riktade sonder.

Trots vikten av att mäta cAMP-signaler i tre rumsliga dimensioner finns det också begränsningar för detta tillvägagångssätt. Den mest restriktiva begränsningen är de långa förvärvstiderna som krävs – cirka 3 minuter per spektral z-stack. Denna förvärvsfrekvens utesluter att använda den här metoden för att upptäcka något annat än kvasi – steady state cAMP-fördelningar i celler. Som sagt, de resultat som presenteras visar vikten av att inkludera kvasi - steady state 3-dimensionella (x, y, z) cAMP-mätningar som kritiska komplement till standard 2-dimensionella (x, y) mätningar. I framtiden blir det intressant att införliva märkta proteiner och cellulära strukturer i den experimentella designen. Ett noggrant val av fluorforer som används för att märka proteiner (och/eller strukturer) skulle göra det möjligt att bedöma de tredimensionella fördelningen av de märkta proteinerna och fret utan ytterligare förlust av förvärvshastigheten. Detta skulle i sin tur möjliggöra mätning av lokaliserade cAMP-signaler och cAMP-signaler nära de märkta proteinerna i tre rumsliga dimensioner, vilket skulle erbjuda ett viktigt experimentellt komplement till riktade cAMP-sonder och ytterligare utöka nyttan av hyperspektrala mätningar av 3-dimensionella cAMP-fördelningar i levande celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Drs. Leavesley och Rich avslöjar ekonomiskt intresse i ett nystartat företag, SpectraCyte, LLC, som bildades för att kommersialisera spektralavbildningsteknik. Alla procedurer som beskrivs i detta protokoll utfördes dock med kommersiellt tillgängliga produkter som inte är associerade med SpectraCyte, LLC.

Acknowledgments

Författarna vill erkänna Dr. Kees Jalink (Nederländerna Cancer Institute och van Leeuwenhoek Center for Advanced Microscopy, Amsterdam, Nederländerna) för att ge oss H188 cAMP FRET biosensor och Kenny Trinh (College of Engineering, University of South Alabama) för teknisk hjälp för att minska den tid det tar att köra våra specialutvecklade programmeringsskript.

Författarna vill erkänna finansieringskällorna: American Heart Association (16PRE27130004), National Science Foundation; (1725937) NIH, S100D020149, S10RR027535, R01HL058506, P01HL066299).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Attofluor Cell Chamber Invitrogen A7816 Attofluor contains steel cell chambers and a rubber O-ring. Cell chamber holds the coverslip and O-ring provides a lock in mechanism to hold the buffer in cell chamber with out leakage
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific BP231-100 Solvent used to prepare stock solution forskolin.
DRAQ5 Fluoroscent Probe Solution Thermo Scientific 62252 Nuclear label
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965-092 Contains nutrients and growth factors for the cells to grow and divide in the culture dishes.
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma F6178 Growth factor suppliment that is added to culture medium, DMEM
Forskolin Sigma F3917 Adenyly cyclase activator.
H188 Cyclic AMP FRET biosensor Netherland Cancer Institute, Dr. K. Jalink Gift Plasmid encoding Turquoise (donor fluorophore), Venus (acceptor fluorophore), and binding domain obtained from Epac.
Image J image.net Free download Another image processing platform used to extact spectral information and image processing.
Integrating Sphere Ocean Optics FOIS-1 Used to measure illumination intensity of the laser line at different laser intensities (?).
Laminin Mouse Protein, Natural Invitrogen 23017-015 Coverslips are coated with laminin and this helps in cell attachment, growth and motility of the cell.
Lipofectamine 3000 Transfection Kit Invitrogen L3000-015 Transfection reagent used to transfect cells with H188 FRET biosensor
MATLAB Mathworks R2019a Image processing operations (linear unmixing and FRET efficiency calculations) are performed by writing custom programs in MATLAB programming environment
Nikon A1R confocal microscope Nikon Instruments Nikon A1R Spectral image acquisition is performed using confocal microscope.
Nikon Elements Software Nikon Instruments Software dongle used to export and handle nd2 image files (multidimensional image files) that are aquired using Nikon A1R
NIST-Traceable Calibration Lamp Ocean Optics LS-1-CAL-INT A lamp with a known spectrum for use as a standard
PBS pH 7.4 (1X) Gibco 10010-023 coomonly used buffer suring cell culture
Pulmonary Microvascular Endothelial Cells (PMVECs) In house - Cell culture core, Univeristy of South Alabama Isolated from Rat pulmonary microvasculature PMVECs form inner lining of a blood vessel.
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Gibco 15140-122 antibiotics are added to culture medum to prevent contamination of the cells.
Pre-Cleaned Gold Seal Micro Slides Clay Adams 3010 Microscope slides used for cell fixation
ProLong Diamond Antifade Mounting Media Invitrogen P36961 If samples are fixed using antifade mountant, then the later protects fluoroscent dyes and chromophores from fading.
Spectrometer Ocean Optics QE65000 Used to measure spectral response of the light source (?)
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200-056 Digests the protein-protein bond between the cell and cell matrix and helps to disscociate and lift the cells during cell plating.
Tyrodes Buffer Made in-house Made in-house Tyrodes buffer is used to make working solutions and to maintain cells in aqueous solution during image acquisition.
6 Well Cell Culture Plate Corning 3506 Laminin coated coverslips are placed in 6-well culture dish (one coverlisps/well). Cells along with medium is added into each well.
25 mm Round Microscope Cover Slips Fisher Scientific 12545102 Cells were grown on round glass coverslips
60X Ojective Nikon Instruments Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 water immersion and commonly used objective for cells

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Corbin, J. D., Sugden, P. H., Lincoln, T. M., Keely, S. L. Compartmentalization of adenosine 3':5'-monophosphate and adenosine 3':5'-monophosphate-dependent protein kinase in heart tissue. The Journal of Biological Chemistry. 252, 3854-3861 (1977).
  2. Terrin, A., et al. PGE1 stimulation of HEK293 cells generates multiple contiguous domains with different [cAMP]: role of compartmentalized phosphodiesterases. The Journal of Cell Biology. 175, 441-451 (2006).
  3. Bacskai, B. J., et al. Spatially resolved dynamics of cAMP and protein kinase A subunits in Aplysia sensory neurons. Science. 260, 222-226 (1993).
  4. Iancu, R. V., Ramamurthy, G., Harvey, R. D. Spatial and temporal aspects of cAMP signalling in cardiac myocytes. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 35, 1343-1348 (2008).
  5. Brunton, L. L., Hayes, J. S., Mayer, S. E. Functional compartmentation of cyclic AMP and protein kinase in heart. Advances in Cyclic Nucleotide Research. 14, 391-397 (1981).
  6. Hohl, C. M., Li, Q. Compartmentation of cAMP in adult canine ventricular myocytes. Relation to single-cell free Ca2+ transients. Circulation Research. 69, 1369-1379 (1991).
  7. Rich, T. C., et al. A uniform extracellular stimulus triggers distinct cAMP signals in different compartments of a simple cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 13049-13054 (2001).
  8. Sayner, S. L., Alexeyev, M., Dessauer, C. W., Stevens, T. Soluble adenylyl cyclase reveals the significance of cAMP compartmentation on pulmonary microvascular endothelial cell barrier. Circulation Research. 98, 675-681 (2006).
  9. Rich, T. C., Tse, T. E., Rohan, J. G., Schaack, J., Karpen, J. W. In vivo assessment of local phosphodiesterase activity using tailored cyclic nucleotide-gated channels as cAMP sensors. The Journal of General Physiology. 118, 63-78 (2001).
  10. Blackman, B. E., et al. PDE4D and PDE4B function in distinct subcellular compartments in mouse embryonic fibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 286, 12590-12601 (2011).
  11. Sayner, S. L., et al. Paradoxical cAMP-induced lung endothelial hyperpermeability revealed by Pseudomonas aeruginosa ExoY. Circulation Research. 95, 196-203 (2004).
  12. Klarenbeek, J., Jalink, K. Detecting cAMP with an EPAC-based FRET sensor in single living cells. Methods in Molecular Biology. 1071, 49-58 (2014).
  13. Surdo, N. C., et al. FRET biosensor uncovers cAMP nano-domains at β-adrenergic targets that dictate precise tuning of cardiac contractility. Nature Communications. 8, 15031 (2017).
  14. Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Reports. 5, 1176-1180 (2004).
  15. Vogel, S. S., Thaler, C., Koushik, S. V. Fanciful FRET. Science's STKE. 2006, (2006).
  16. Clegg, R. M. The History of FRET: From conception through the labors of birth. Reviews in Fluorescence. 3, (2006).
  17. Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312, 217-224 (2006).
  18. Manzella-Lapeira, J., Brzostowski, J. A. Imaging protein-protein interactions by Förster resonance energy transfer (FRET) microscopy in live cells. Current Protocols in Protein Science. 93, 58 (2018).
  19. Cooper, D. M. F., Mons, N., Karpen, J. W. Adenylyl cyclases and the interaction between calcium and cAMP signalling. Nature. 374, 421-424 (1995).
  20. Sassone-Corsi, P. Coupling gene expression to cAMP signalling: role of CREB and CREM. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 30, 27-38 (1998).
  21. Rebhun, L. I. Cyclic nucleotides, calcium, and cell division. International Review of Cytology. 49, 1-54 (1977).
  22. Klarenbeek, J., Goedhart, J., Van Batenburg, A., Groenewald, D., Jalink, K. Fourth-generation Epac-based FRET sensors for cAMP feature exceptional brightness, photostability and dynamic range: characterization of dedicated sensors for FLIM, for ratiometry and with high affinity. PLOS ONE. 10, 0122513 (2015).
  23. Leavesley, S. J., Rich, T. C. FRET: signals hidden within the noise. Cytometry Part A. 85, 918-920 (2014).
  24. Rich, T. C., Webb, K. J., Leavesley, S. J. Can we decipher the information content contained within cyclic nucleotide signals. The Journal of General Physiology. 143, 17-27 (2014).
  25. Annamdevula, N. S., et al. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
  26. Leavesley, S. J., Britain, A. L., Cichon, L. K., Nikolaev, V. O., Rich, T. C. Assessing FRET using spectral techniques. Cytometry Part A. 83, 898-912 (2013).
  27. Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming limitations of FRET measurements. Cytometry Part A. 89, 325-327 (2016).
  28. Fink, D. J. Monitoring Earcths Resources from Space. Technology Review. 75, 32-41 (1973).
  29. Goetz, A. F. H., Vane, G., Solomon, J. E., Rock, B. N. Imaging Spectrometry for Earth Remote Sensing. Science. 228, 1147-1153 (1985).
  30. Bücherl, C. A., Bader, A., Westphal, A. H., Laptenok, S. P., Borst, J. W. FRET-FLIM applications in plant systems. Protoplasma. 251, 383-394 (2014).
  31. Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. Journal of Microscopy. 228, 139-152 (2007).
  32. Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair. FEBS Letters. 531, 245-249 (2002).
  33. Griswold, J. R., Annamdevula, N., Deal, J., Rich, T., Leavesley, S. Estimating FRET Efficiency using Excitation-Scanning Hyperspectral Imaging. Biophysical Journal. 112, 586 (2017).
  34. Favreau, P. F., et al. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19, 046010 (2014).
  35. King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvascular Research. 67, 139-151 (2004).
  36. Thaler, C., Koushik, S. V., Blank, P. S., Vogel, S. S. Quantitative multiphoton spectral imaging and its use for measuring resonance energy transfer. Biophysical Journal. 89, 2736-2749 (2005).
  37. Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Frontiers in Pharmacology. 9, 332 (2018).
  38. Johnstone, T. B., Agarwal, S. R., Harvey, R. D., Ostrom, R. S. cAMP signaling compartmentation: Adenylyl cyclases as anchors of dynamic signaling complexes. Mol Pharmacol. , (2017).
  39. Zhang, J., Li, H., Chai, L., Zhang, L., Qu, J., Chen, T. Quantitative FRET measurement using emission-spectral unmixing with independent excitation crosstalk correction. Journal of Microscopy. 257, 104-116 (2015).
  40. Zhang, J., Lin, F., Chai, L., Wei, L., Chen, T. IIem-spFRET: improved Iem-spFRET method for robust FRET measurement. Journal of Biomedical Optics. 21, 105003 (2016).
  41. Levy, S., et al. SpRET: highly sensitive and reliable spectral measurement of absolute FRET efficiency. Microscopy and Microanalysis. 17, 176-190 (2011).
  42. West, S. J., et al. Hyperspectral Measurements Allow Separation of FRET Signals from Non-Uniform Background Fluorescence. Biophysical Journal. 112, 453 (2017).
  43. Annamdevula, N. S., et al. An approach for characterizing and comparing hyperspectral microscopy systems. Sensors. 13, Basel. 9267-9293 (2013).

Tags

Biologi Utgåva 164 Cyklisk AMP rumslig FRET hyperspektrala mikroskopi spektral FRET
Mätning av 3-dimensionella cAMP-fördelningar i levande celler med 4-dimensionell (x, y, z och λ) hyperspektrala FRET-avbildningar och analyser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Annamdevula, N. S., Sweat, R., Gunn, … More

Annamdevula, N. S., Sweat, R., Gunn, H., Griswold, J. R., Britain, A. L., Rich, T. C., Leavesley, S. J. Measurement of 3-Dimensional cAMP Distributions in Living Cells using 4-Dimensional (x, y, z, and λ) Hyperspectral FRET Imaging and Analysis. J. Vis. Exp. (164), e61720, doi:10.3791/61720 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter