Summary
신생아 설치류의 기관에 약물을 직접 주입하는이 기술은 국소 투여 약물 또는 생물학이 신생아 폐 질환에 미치는 영향을 연구하는 데 중요합니다. 추가적으로, 이 방법은 또한 동물 모델에서 폐 손상을 유도하는데 사용될 수 있다.
Abstract
신생아 설치류를 기관에 직접 주입 된 약물로 치료하는 것은 국소 투여 약물의 영향을 연구하는 데 유용한 도구가 될 수 있습니다. 이것은 계면활성제와 약물이 폐에 국부적으로 투여되기 때문에 직접적인 번역 영향을 미칩니다. 문헌에는 치료 실험에서 성인 생쥐와 쥐의 최소 침습적 경막 삽관을 설명하는 많은 간행물이 있지만, 신생아 쥐 강아지에서이 접근법은 부족합니다. 새끼의 기관지 영역 / 인두의 크기가 작기 때문에 후두 내강 (성대)의 시각화가 어려워 기관 내 약물 전달의 다양한 성공률에 기여합니다. 우리는 신생아 쥐 강아지의 효과적인 경구 삽관 - 비 외상성 및 최소 침습적 인 기술을 입증하여 약물의 연속 투여에 사용할 수 있습니다. 우리는 조명 시스템과 돋보기 렌즈가있는 운영 이토스코프를 사용하여 쥐 신생아의 기관 개방을 시각화했습니다. 그런 다음 피펫 팁에 연결된 1 mL 주사기를 사용하여 약물을 주입합니다. 전달 방법의 정확성은 에반스 블루 염료 투여를 사용하여 입증되었다. 이 방법은 훈련을 받기 쉽고 기관에 약물을 주입하는 효과적인 방법으로 작용할 수 있습니다. 이 방법은 또한 동물에서 질병 상태를 모사하기 위한 접종제 또는 제제의 투여에 사용될 수 있고, 또한, 다양한 폐 질환에 대한 세포 기반 치료 전략을 위해 사용될 수 있다.
Introduction
조기에 태어난 신생아는 장기 환기와 같은 많은 중재 요법이 필요한 폐가 제대로 발달하지 못했습니다. 이러한 개입은 생존 한 신생아를 후속 후유증1의 높은 위험에 처하게합니다. 실험 동물 모델은 다양한 질병 상태를 시뮬레이션하고, 질병의 병리학을 연구하고, 치료 개입을 평가하는 데 중요한 도구 역할을합니다. 생쥐, 쥐, 토끼에서 조산기 양과 돼지에 이르기까지 광범위한 동물 모델을 사용할 수 있지만 생쥐와 쥐가 가장 많이 사용됩니다.
생쥐와 쥐를 사용하는 주된 이점은 임신 기간이 비교적 짧고 비용이 절감된다는 것입니다. 그들은 또한 쉽게 이용할 수 있고, 질병이없는 환경에서 유지하기가 쉽고, 유전적으로 균질하며, 상대적으로 덜 윤리적 인 관심사를 가지고 있습니다 2,3. 설치류 모델의 또 다른 주요 장점은 출생시 신생아 강아지가 기관지 폐 이형성증을 일으키기 위해 진행되는 24 주 조산 신생아 인간 유아의 폐와 형태 학적으로 동등한 폐 발달의 후기 누소관 / 초기 적색 단계에 있다는 것입니다4. 또한, 폐 발달이 생후 첫 4주 이내에 완료로 급속히 진행됨에 따라, 합리적인 기간4에서 출생 후 폐 성숙을 연구하는 것이 타당하다. 이러한 장점에도 불구하고, 생쥐와 쥐 새끼의 작은 크기는 다양한 개입에 대한 우려의 원천이며, 이는 대부분의 연구자가 새끼5가 아닌 성인 동물을 사용하도록 강요합니다. 신생아 폐는 발달 단계에 있으며 자극제에 대한 신생아의 반응은 성인의 반응과 다릅니다. 이것은 인간 신생아 질병 상태를 연구하기 위해 신생아 동물 모델을 사용하는 것이 적절합니다.
폐에 약물 / 생물학적 제제를 투여하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 여기에는 비강 내6,7 또는 기관 내 8,9,10 점적과 에어로졸 흡입 11,12가 포함됩니다. 각 접근 방식에는 자체 기술적 과제, 장점 및 제한 사항13이 있습니다. 치료제의 기관내 투여 경로는 전신 효과를 우회하는 장기에서의 직접적인 치료 영향을 연구하는 것이 바람직하다. 이 경로는 또한 자극제로 인한 폐 병리학을 연구하는 데 사용될 수 있습니다. 이를 수행하는 침습적 및 최소 침습적 기술이 모두 있으며 성인에서 쉽게 수행 할 수 있습니다. 그러나 강아지에서는 동물의 크기가 작기 때문에 삽관 과정과 관련된 기술적 인 문제가 있습니다. 현재의 연구는 쥐 새끼에서 간단하고 일관성있는 비 외과 적 기관내 점안 (ITI) 방법을 제시하여 다양한 신생아 치료 중재의 효능을 연구하고 신생아 호흡기 질환을 시뮬레이션하는 동물 모델을 생성하는 데 사용할 수 있습니다.
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Protocol
모든 실험은 Case Western Reserve University의 Institutional Animal Care and Use Committee (protocol # 2020-0035)의 승인을 받았습니다. 모든 동물을 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 NIH 지침에 따라 처리하였다.
1. 동물
- 상업적으로 임신 한 Sprague Dawley 쥐를 얻습니다.
- 14 h / 10 h 밝은 어둠주기와 45-60 % 상대 습도로 승인 된 수의학 시설에서 동물을 유지하십시오.
2. 시험 화합물의 제조
- Evans 블루 염료를 시험 화합물로 사용하여 기관내 점안 절차의 효능을 평가하십시오.
- 인산염 완충 식염수 (pH 7.2)에서 염료의 0.25 % (w / v) 용액을 준비하고 0.45 μm 시린지 필터를 사용하여 필터 멸균하십시오.
3. 마취의 투여
- 작은 쥐 신생아에게 적합한 변형 된 전달 시스템을 사용하여 가스 마취 (100 % 산소에서 3 % 이소플루란)를 사용하여 쥐 새끼를 마취하십시오.
- 꼬리와 페달 반사 신경의 손실과 얕은 호흡이 있는지 확인하여 절차를 수행하기위한 마취의 적절한 깊이를 확인하십시오.
4. 기관내 점안 (ITI)
- ITI를 위해 출생 후 5 일째 (PN 5)에 쥐 새끼를 사용하십시오. PN 5 래트 강아지의 평균 체중은 12 그램이다.
- 실험실 라벨링 테이프를 사용하여 기울어 진 평평한 플랫폼에서 마취 된 쥐 강아지를 제지하십시오. 강아지는 수핀 위치에서 약 45 °의 각도로 억제됩니다.
- 신생아의 입을 열고 무딘 포셉을 사용하여 혀를 한쪽으로 부드럽게 당깁니다.
- 이토스코프에 연결된 직경 2mm의 작은 이토스코프 검경을 사용하여 혀를 부드럽게 잡고 후두를 적절하게 시각화하십시오.
- 목구멍 조명기 시스템, 즉 작동 이토스코프와 돋보기 렌즈를 사용하여 성대를 올바르게 시각화하십시오 (그림 1).
- 동물을 경사면에 45° 각도로 배치합니다. 마우스 케이지의 유선 막대 뚜껑이 사용됩니다(그림 2).
참고 : 동물을 45 ° 각도로 배치하면 epiglottis의 간섭없이 기관 개구부를 더 잘 시각화 할 수 있습니다. - 웨스턴 블롯 젤을 로딩하는 데 사용되는 긴 각도의 피펫 팁을 가져 가십시오. 수술 블레이드를 사용하여 피펫 팁의 바닥을 자르면 1cc 주사기 팁에 잘 맞습니다.
- 장각형 피펫 팁에 장착된 멸균 1 mL 주사기를 사용하여 30-50 μL의 물질을 폐로 전달하십시오. 주사기를 반전시키고 거의 0.9 cc 공기를 피펫 팁에 연결된 1 mL 주사기 내로 흡입한 다음, 전달하고자 하는 염료 또는 물질을 첨가한다. 이것은 도 3에 도시된 바와 같이 염료가 투여된 후에 염료 뒤의 공기가 기관 내로 밀려나게 한다. 기관내 투여는 후두 내강(성대)을 시각화하고 주사기에 장착된 피펫 팁을 기관 내강에 삽입함으로써 달성됩니다.
- 이토스코프의 검경을 사용하여 혀를 잡고 성대를 노출시킵니다. 검경은 후두경의 칼날 역할을합니다. 피펫 팁을 30 ° 각도로 구부려 원뿔 모양의 사경을 통해 기관 개구부로 약제를 쉽게 도입 할 수 있습니다.
- 피펫 팁을 기관 개구부에 도입하여 성대를 넘어 약 2mm 지점까지 삽입합니다. 주사기의 피스톤을 밀어 도 3에 도시된 바와 같이 작동 이토스코프의 검경을 통해 염료 또는 약물을 투여한다. 약제 투여 직후에 폐에 공기를 도입하면 물질이 후두강으로 되돌아 오는 것을 방지합니다.
- 강아지를 염료 또는 일반 식염수로 투여 한 후 호흡 운동이 규칙적 일 때까지 강아지를 통합 순환 유체 가열 패드 (38 ° C)에 놓습니다. 마취에서 완전히 회복 된 후, 강아지를 댐과 재결합하십시오.
5. ITI 전달의 특성화
- ITI 후, 과도한 마취 (케타민 100 mg / kg 및 자일라진 10 mg / kg) / 티오펜톤을 투여 후 적절한시기에 삼출시켜 쥐 새끼를 안락사시킵니다. 안락사는 효능을 입증하기 위해 폐 조직을 수집하는 실험의 일부로서 수행되었다.
- 안락사 된 쥐 강아지를 해부 보드에 고정시키고 70 % 에틸 알코올로 가슴과 복부를 닦으십시오.
- 폐 전체에 걸쳐 염료의 분포를 평가하려면 멸균 기술을 사용하여 동물에서 폐를 제거하고 이미징에 적합한 폐를 표시하십시오 (그림 4A, B).
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Representative Results
에반스 블루의 점안은 모든 폐엽을 포함하는 염료의 다초점 분포를 밝혀냈다(그림 4A,B). 도 4에 나타난 바와 같이 우리의 결과는 모든 엽에 대한 분포의 효능을 입증한다. 사진은 염색체의 ITI 직후에 기관으로 촬영됩니다. 100 % 효능은 염료를 기관 내로 주입 한 다음 양쪽의 모든 엽으로 확산시킴으로써 달성되었습니다. 염료가 폐의 소엽 내에서 더 퍼질 것으로 예상됩니다. 반복적 인 투여를 통해 우리는 이것을 폐에 소엽과 모든 소엽에 전달하는 데 100 % 성공을 보장 할 수있었습니다. 우리는 어떤 염료도 위장이나 폐 외부에 도달하지 않도록했습니다. 이것은 폐에 100 % 투여하는 기술의 효능을 증언합니다. isoflurane 마취는 시술 후 새끼의 빠른 회복을 허용했습니다.
5 일째부터 쥐 새끼는이 절차를 용인하고 마취 후 수행하는 데 5 분 미만이 걸렸습니다. 일부 동물은 일시적인 무호흡증을 앓았지만 몇 분 안에 정상적인 호흡 패턴을 회복했습니다.
그림 1: Otoscope 구성 요소 . (A) 전원 2.5V(B) 확대 렌즈(C) 트랜스일루미네이터(D) 투경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 동물의 위치. 45 ° 각도로 동물을 배치하면 epiglottis의 간섭없이 기관 개구부의 더 나은 시각화가 제공되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 기관내 점안. 폐에 직접 전달을 달성하기 위해 이토스코프 / 목구멍 조명기 시스템을 사용하여 기관 개구부의 시각화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: ITI 점안 및 에반스 블루 염색. (A) ITI 점안은 폐 전체에 염료를 전달한다. 염료는 검은 화살표로 표시된 바와 같이 폐의 양쪽 엽에 분포되어 있음을 알 수 있습니다. 위장에 염료가 없으면 기술 (빨간색 화살표)의 성공을 확인합니다. (b) 0.25% 에반스 블루 염료의 50 μL를 주입한 래트 새끼로부터의 폐. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
기관 내 점안은 호흡기 질환 중재 및 질병 모델 개발을위한 기존 방법에 비해 몇 가지 이점을 제공하는 훌륭한 방법입니다. 그것은 빠른 방법이며 경험이 있으면 동물 당 2-3 분의 평균 속도로 수행 할 수 있습니다. 성공적인 삽관을위한 주요 고려 사항은 동물의 적절한 진정, 올바른 위치, 특히 머리뿐만 아니라 구강 인두의 사경의 배치 / 크기의 정확한 깊이입니다. 적절한 진정 작용은 운영자, 특히 초보자에게 충분한 작업 시간을 허용합니다. 45 ° 각도로 동물을 배치하는 것은 성대의 적절한 시각화를 위해 중요합니다. 적절한 깊이에 검경을 배치하면 절차 전반에 걸쳐 혀를 수축시키는 데 도움이되어 성대를 다시 잘 시각화 할 수 있습니다. 두 사람으로 구성된 팀이이 작업을 쉽게 조정할 수 있습니다. 하나는 동물의 마취와 케이징을 조정할 수 있고 다른 하나는 점안을 처리 할 수 있습니다. ITI의 가장 기술적으로 어려운 부분은 기관으로의 올바른 삽관입니다. 이 기술의 성공은 삽관 후 염료의 투여에 의해 확인됩니다. 튜브가 식도로 미끄러져 폐가 아닌 위장으로 물질이 전달 될 가능성이 높기 때문에 올바른 삽관의 초기 단계를 확인하는 것이 매우 중요합니다.
조심해야 할 유일한 부분은 잘못된 삽관과 관련된 잠재적 인 외상입니다. 또한 기관이나 성대를 둘러싼 조직을 관통하지 않도록 매우 부드럽고 조심해야합니다. 또한 2 또는 3 미스2가있는 경우 ITI를 수행하지 않는 것이 좋습니다.
약물 / 생물학적 제제의 투여 경로에는 여러 가지가 있으며 각 항아리에는 고유 한 장점과 단점이 있습니다. 방법의 선택은 주로 연구 목표와 개입의 성격에 기반합니다. 비강 내 점안과 에어로졸화 기술 모두 폐뿐만 아니라 상부 호흡기에 약제를 전달합니다. 이것은 상부 호흡기13,21과 관련된 연구에 도움이되지만 폐에 물질을 전달하는 것은 신뢰할 수 없습니다. 또한, 삼키기, 재채기 및 다양한 호흡률은 전달 된 복용량의 불일치로 이어질 수 있습니다. 그러나, 일부 물질의 물리 화학적 특성은 효율적인 에어로졸화15에 영향을 미친다. 연구자들은 기관 내 접종을 사용하여이 문제를 해결하고, 입자 크기와 점도에 관계없이 폐에 직접 접종 / 약물을 전달합니다23.
두 가지 주요 기관내 전달 방법은 경경구 기관내 14,15 및 기관 절제술 유무에 관계없이 기관내 점안16,17을 포함한다. ITI는 일단 훈련 된18 번 많은 수의 동물에게 광범위한 치료 용량을 신속하게 투여 할 수있는 절차입니다. 경경구 기관내 점안은 성인 쥐에서 일상적으로 사용되지만, 신생아 16,19,20에서는 외과 적 절개와 같은보다 침습적 인 기술이 필요했습니다. 연구자들은 여전히 여러 가지 이유로 강아지에게이 경질 ITI 기술을 사용하지 않습니다. 신생아 설치류의 크기가 작기 때문에 삽관의 성공과 함께 후두 내강의 시각화가 어려워집니다. 또한 성인의 ITI에 사용되는 전통적인 금속 후두경은 구강 크기가 작고 깨지기 쉬운 점막 조직16,18,10 때문에 신생아에서 사용할 수 없습니다. 더 작은 사경과 카테터는 후두강을 관찰하고 치료제 / 제제를 폐로 전달해야합니다. 운영자는이를 달성하기 위해 고도로 숙련되어야합니다. 마지막으로, 마취, 저체온증, 모성 거부 및 식인 풍습으로부터의 회복은 쥐 신생아 회복 및 생존21,22에 추가적인 문제를 야기한다. 우리의 연구는 가스 마취의 사용을 채택 한 다음 가열 패드에서 회복하고 수유중인 댐과 재결합했습니다. 이것은 저체온증, 모성 거부 또는 식인 풍습과 관련된 문제를 피합니다. 많은 비수술적 개입 연구는 구강을 통한 기관의 맹목적인 삽관을 포함한다. 이것은 식도에 잘못 주입 된 경우 효과를 놓칠 수있는 약물의 경우 특히 받아 들일 수 없습니다. 이 연구에서, 기관 개구부는 이토스코프를 사용하여 시각화되고 약간 구부러진 피펫 팁이 기관으로 직접 삽입되어 물질, 염료를 전달합니다. 우리의 기술은 작은 쥐 강아지의 기관으로 약물을 투여하는 효과적인 방법을 보여줍니다.
ITI의 과정은 세심한 훈련을 거쳐 수행 할 때 신뢰할 수있는 방법입니다. 일단 훈련되면 성인 설치류 13,24,25에서와 같이 신속하고 효과적으로 수행 할 수 있습니다. 정확한 기관내 점안은 튜브 또는 주사기26,27,28에서 염료 또는 액체 이동을 포함한 몇 가지 방법에 의해 확인될 수 있다. 이 방법에서 기관 개구부를 시각화 할 수 있기 때문에 그리움이 매우 적습니다. 무호흡증은 ITI 직후 몇몇 새끼에서 관찰되었으며, 이는 자발적으로18,29마리 회복되었다. 가장 작은 검경과 함께 이토스코프를 사용하는 것은 신생아 쥐18의 작은 구강에 완벽하게 적합했습니다. 이 연구의 결과는 물질이 염료 국소화에 의해 확인 된 바와 같이 폐의 모든 엽에 일관되게 전달 될 수 있음을 나타냈다. 이 방법은 신생아 쥐가 신생아 폐 상태30,31,32를 안정적으로 모방해야하는 실험 연구에서 큰 의미가 있습니다. 이 기술은 또한 폐 기능 연구(33)뿐만 아니라 세포 / 줄기 세포 이식 연구34,35,36을 수행하는 데 사용될 수 있으며, 현재 외과 적 개입을 사용하고 강아지에게 고통 스러울 수 있습니다.
이 기술은 또한 동물 연구의 정제 및 감소의 원칙에 기여합니다. 이 방법은 맹검 기술이며 통증과 출혈을 일으키는 기관을 관통 할 때 침습적 인 바늘로 직접 기관 내 주사의 대안으로 사용됩니다. 완전히 대조적으로이 기술은 기관으로의 약물 도입을 정제하면서 통증을 줄이고, 통증과 고통의 즉각적인 감소를 달성하고, 연구37에 관련된 동물의 복지를 향상시키는 역할을합니다. 또한, 기관지로의 약물 투여는 효능 보장을 직접 가시화한다. 기관지로 약물을 주입하는 것이 더 큰 동물에서 널리 시행되고 있지만, 5 일간의 쥐 강아지에서 이것을 사용하는 우리의 세련미는 우리가 여기서 강조하고 싶은 혁신입니다.
이 기사는 병리학 적 상태를 시뮬레이션하기 위해 유해제 투여뿐만 아니라 신생아 치료를위한 약물, 항산화 제, 세포 / 줄기 세포의 국소 투여에 사용할 수있는 간단하고 최소 침습적이며 재현 가능한 방법을 제공합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 NICHD에서 AH까지 R01HD090887-01A1에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 저자들은 또한 Peter Mc Farlane 박사의 실험실에서 흡입 마취 / 가열 패드 시스템과 같은 시설을 제공합니다. 캐서린 메이어 (Catherine Mayer)의 시스템 구축에 대한 귀중한 도움을 주셔서 감사합니다. 연구 설계, 수집, 분석 및 데이터 해석 또는 원고 작성에서 자금 조달 기관이 아무런 역할을하지 않았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Evans Blue dye | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 314-13-6 | Confirmation of drug administration into lungs |
| Ketamine Hydrochloride | Hospira. Inc, Lake Forest, IL, USA | Dispensed from Animal care facility | For sedation |
| Operating Otoscope | Welch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, USA | 21770- 3.5V | For visualization of vocal cords |
| Otoscope Rechargeable Handle | Welch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, USA | 71050-C | |
| Pipette tip (Gel loading) | Fisherbrand | 02-707-139 | Administering the drug |
| Platform for restraining (inclined plane) | Animal care facility | Dispensed from Animal care facility | Wired roof of mice cage can be used |
| 3M Micropore Surgical White Paper (sticking tape) | 3M, St. Paul, MN, USA | 1530-2 | |
| Luer Lock SyringeSyringes (1 ml) | BD Franklin Lakes, NJ , USA | NBD2515 | Administering the drug |
| Xylazine | Hospira. Inc, Lake Forest, IL, USA | For sedation |
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