Summary
Essa técnica de incutir drogas diretamente na traqueia de roedores neonatais é importante no estudo do impacto de medicamentos ou biológicos administrados localmente em doenças pulmonares neonatais. Além disso, este método também pode ser usado para induzir lesões pulmonares em modelos animais.
Abstract
O tratamento de roedores neonatais com drogas incutidas diretamente na traqueia poderia servir como uma ferramenta valiosa para estudar o impacto de uma droga administrada localmente. Isso tem impacto translacional direto porque surfactante e drogas são administradas localmente nos pulmões. Embora a literatura tenha muitas publicações descrevendo a intubação transoral minimamente invasiva de camundongos e ratos adultos em experimentos terapêuticos, essa abordagem em filhotes de ratos neonatais é escassa. O pequeno tamanho da região orotraqueal/faringe nos filhotes dificulta a visualização de lúmen laríngeo (cordas vocais), contribuindo para a taxa de sucesso variável da entrega de medicamentos intratracheais. Demonstramos uma intubação oral eficaz do filhote de rato neonatal - uma técnica não traumática e minimamente invasiva, para que possa ser usada para administração serial de drogas. Usamos um otoscópio operacional com um sistema de iluminação e uma lente de ampliação para visualizar a abertura traqueal dos recém-nascidos de ratos. A droga é então incutido usando uma seringa de 1 mL conectada a uma ponta de pipeta. A precisão do método de entrega foi demonstrada usando a administração de corante azul Evans. Este método é fácil de ser treinado e pode servir como uma maneira eficaz de incutir drogas na traqueia. Este método também poderia ser usado para a administração de inóculos ou agentes para simular condições da doença em animais e, também, para estratégias de tratamento de base celular para várias doenças pulmonares.
Introduction
Os recém-nascidos prematuramente têm pulmões mal desenvolvidos que requerem muitas terapias intervencionistas, como ventilação a longo prazo. Essas intervenções colocam os recém-nascidos sobreviventes em alto risco de sequelassubsequentes 1. Modelos animais experimentais servem como importante ferramenta na simulação de diversas condições da doença, no estudo da patobiologia das doenças e na avaliação de intervenções terapêuticas. Embora uma ampla gama de modelos animais, desde ratos, ratos e coelhos até cordeiros e porcos pré-termo, são os mais usados.
A principal vantagem do uso de camundongos e ratos é o período de gestação relativamente curto e o custo reduzido. Eles também são prontamente disponíveis, fáceis de manter em ambientes livres de doenças, geneticamente homogêneos e têm relativamente menos preocupação ética 2,3. Outra grande vantagem do modelo de roedor é que ao nascer o filhote neonatal está em estágio canalicular/inicial do desenvolvimento pulmonar que é morfologicamente equivalente ao pulmão de um bebê humano neonatal pré-período de 24 semanas que passa a desenvolver displasia broncopulmonar4. Além disso, à medida que seu desenvolvimento pulmonar avança rapidamente para a conclusão nas primeiras 4 semanas de vida, é viável estudar a maturação pulmonar pós-natal em um período razoávelde tempo 4. Apesar dessas vantagens, o pequeno tamanho dos camundongos e filhotes de ratos é uma fonte de preocupação para várias intervenções, o que obriga a maioria dos pesquisadores a usar animais adultos em vez de filhotes5. Os pulmões neonatais estão em estágio de desenvolvimento e a resposta de um recém-nascido a um agente incitante difere da de um adulto. Isso torna apropriado o uso de modelos neonatais de animais para estudar as condições da doença neonatal humana.
Existem diferentes métodos para administrar drogas/ agentes biológicos para o pulmão. Isso inclui intranasal 6,7 ou intratraqueal 8,9,10 de instilação, bem como inalação de aerossol11,12. Cada abordagem tem seus próprios desafios técnicos, vantagens, bem como limitações13. A via intratraqueal de administração de agentes terapêuticos é preferível estudar o impacto terapêutico direto no órgão contornando os efeitos sistêmicos. Essa rota também pode ser usada para estudar a patologia pulmonar causada por agentes incitantes. Existem técnicas invasivas e minimamente invasivas para fazer isso e é fácil de executar em adultos. No entanto, nos filhotes, devido ao pequeno tamanho do animal, há desafios técnicos associados ao processo de intubação. O presente estudo apresenta um método simples, consistente, não cirúrgico de instilação intratraqueal (ITI) em filhotes de ratos que poderiam ser utilizados para estudar a eficácia de várias intervenções terapêuticas neonatais, bem como para gerar modelos animais simulando doenças respiratórias neonatais.
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Protocol
Todos os experimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (protocolo nº 2020-0035) na Case Western Reserve University. Todos os animais foram tratados de acordo com as diretrizes do NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório.
1. Animais
- Comercialmente obter ratos sprague dawley grávidas.
- Mantenha os animais em uma instalação veterinária aprovada com ciclo claro-escuro de 14h/10 h e umidade relativa de 45-60%.
2. Preparação do composto de teste
- Use corante azul Evans como composto de teste para avaliar a eficácia do procedimento de instilação intratraqueal.
- Prepare uma solução de 0,25% (w/v) do corante em soro fisiológico tamponado com fosfato (pH 7.2) e esterilize o filtro usando um filtro de seringa de 0,45 μm.
3. Administração de anestesia
- Anestesize filhotes de ratos usando anestesia gasosa (3% isoflurane em 100% oxigênio), usando um sistema de entrega modificado adaptado para pequenos recém-nascidos de ratos.
- Verifique se há perda de reflexos da cauda e do pedal e respiração rasa para garantir a profundidade adequada da anestesia para a realização do procedimento.
4. Instilação intratraqueal (ITI)
- Use filhotes de rato no pós-natal dia 5 (PN 5) para o ITI. O peso médio de um filhote de rato PN 5 é de 12 gramas.
- Contenha o filhote de rato anestesiado em uma plataforma plana inclinada usando fita de rotulagem de laboratório. O filhote é contido em um ângulo de cerca de 45° na posição supina.
- Abra a boca do recém-nascido e puxe suavemente a língua para um lado usando um fórceps sem cortes.
- Use um pequeno espectlo otoscópio de 2 mm de diâmetro conectado ao otoscópio para segurar a língua suavemente e para uma visualização adequada da laringe.
- Use o sistema iluminador da garganta, ou seja, o otoscópio operacional e a lente de ampliação para visualização adequada das cordas vocais (Figura 1).
- Posicione os animais em um ângulo de 45° em um plano inclinado. São utilizadas as tampas das barras com fio das gaiolas do mouse (Figura 2).
NOTA: Posicionar o animal em um ângulo de 45° proporciona melhor visualização da abertura traqueal sem a interferência das epiglotes. - Tome uma ponta de pipeta de ângulo longo que é usada para carregar géis de mancha ocidental. Corte a base da ponta da pipeta usando uma lâmina cirúrgica para que ela se encaixe bem na ponta da seringa de 1 cc.
- Use a seringa estéril de 1 mL encaixada em uma ponta de pipeta de ângulo longo para fornecer 30-50 μL da substância no pulmão. Inverta a seringa e aspire quase 0,9 cc de ar na seringa de 1 mL conectada à ponta da pipeta seguida do corante ou da substância a ser entregue. Isso permite que o ar atrás do corante seja empurrado para dentro da traqueia depois que o corante é administrado como mostrado na Figura 3. A administração intratraqueal é alcançada visualizando o lúmen laríngeo (cordas vocais) e inserindo a ponta pipeta instalada em uma seringa no lúmen traqueal.
- Use o espéculo do otoscópio para segurar a língua e expor as cordas vocais. Espélum serve o papel da lâmina de um laringoscópio. Dobre a ponta da pipeta em um ângulo de 30° para facilitar a fácil introdução do agente através do espéculo em forma de cone na abertura traqueal.
- Introduza a ponta da pipeta na abertura traqueal ao ponto de cerca de 2 mm além das cordas vocais. Empurre o pistão da seringa para administrar o corante ou a droga através do espéculo do otoscópio operacional, como mostrado na Figura 3. A introdução do ar no pulmão logo após a administração do agente impede que a substância volte para a cavidade laríngea.
- Depois de administrar o filhote com o corante ou soro fisiológico normal, coloque os filhotes em uma almofada de aquecimento de fluido circulante integrado (38°C) até que seus movimentos respiratórios estejam regulares. Após a completa recuperação da anestesia, reúna os filhotes com a represa.
5. Caracterização da entrega de ITI
- Após o ITI, eutanize os filhotes de rato dando anestesia excessiva (Cetamina 100 mg/kg e Xylazine 10 mg/kg) / tiopentona seguida de exsanguinação em um momento apropriado pós-administração. A eutanásia foi realizada como parte do experimento para coletar tecido pulmonar para demonstrar a eficácia.
- Fixar o filhote de rato eutanizado em uma placa de dissecção e limpar o peito e abdômen com 70% de álcool etílico.
- Para avaliar a distribuição do corante em todo o pulmão, remova os pulmões do animal usando técnica estéril e exiba os pulmões conforme apropriado para a imagem (Figura 4A,B).
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Representative Results
A instilação do azul Evans revelou distribuição multifocal do corante envolvendo todos os lóbulos pulmonares (Figura 4A,B). Nosso resultado, como mostrado na Figura 4, demonstra eficácia de distribuição para todos os lóbulos. A foto é tirada imediatamente após iti do corante na traqueia. 100% de eficácia foi alcançado na instilação do corante na traqueia seguido por sua disseminação em todos os lóbulos de ambos os lados. Espera-se que o corante se espalhe ainda mais dentro do lobule do pulmão. Com a administração repetida, conseguimos garantir 100% de sucesso em entregar isso ao pulmão tanto para lóbulos quanto para todos os lobules. Garantimos que nenhum corante atinja o estômago ou fora dos pulmões. Isso atesta a eficácia da técnica como 100% de administração nos pulmões. A anestesia isoflurane permitiu uma recuperação mais rápida dos filhotes após o procedimento.
Filhotes de ratos do 5º dia toleraram este procedimento e levaram menos de 5 minutos para realizar após a anestesia. Alguns animais, porém, desenvolveram apneia transitória, recuperaram o padrão respiratório normal em poucos minutos.
Figura 1: Componentes otoscópios. (A) fonte de energia 2,5 V (B) lente de luminária transilluminante (D) espéculo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: O posicionamento do animal. O posicionamento dos animais em um ângulo de 45° proporcionou melhor visualização da abertura traqueal sem a interferência das epiglotes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Instilação intratraqueal. Visualização da abertura traqueal usando otoscópio/ sistema iluminador de garganta para obter entrega direta aos pulmões. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Instilação ITI e manchas azuis evans. (A) A instilação ITI fornece o corante em todos os pulmões. O corante pode ser visto distribuído para ambos os lóbulos do pulmão, conforme indicado pela seta negra. A ausência de corante no estômago confirma o sucesso da técnica (seta vermelha). (B) Pulmões de filhotes de rato instilados com 50 μL de corante azul Evans de 0,25%. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A instilação intratracheal é um excelente método que oferece diversas vantagens sobre os métodos existentes para intervenções de doenças respiratórias, bem como o desenvolvimento de modelos de doenças. É um método rápido e com experiência, pode ser realizado com uma velocidade média de 2-3 minutos por animal. As principais considerações para uma intubação bem sucedida são a sedação adequada do animal, é o posicionamento correto, especialmente a cabeça, bem como a profundidade precisa de colocação/tamanho da espécula na orofaringe. A sedação adequada permitiria tempo de trabalho suficiente para os operadores, especialmente os iniciantes. O posicionamento do animal em um ângulo de 45° é importante para a visualização adequada das cordas vocais. A colocação do espéculo na profundidade certa ajuda na retração da língua durante todo o procedimento, o que permite novamente uma boa visualização da corda vocal. Uma equipe de duas pessoas pode facilmente coordenar este trabalho. Um poderia coordenar a anestesia e o caging de animais, enquanto o outro poderia lidar com a instilação. A parte mais tecnicamente desafiadora do ITI é a intubação correta na traqueia. O sucesso da técnica é confirmado pela administração do corante após a intubação. É muito importante confirmar o passo inicial da intubação correta, pois há uma boa chance de a tubulação escorregar no esôfago resultando na entrega da substância no estômago, em vez do pulmão.
A única parte que deve ter cuidado é o trauma potencial associado à má intubação. Deve-se também ser muito gentil e cuidadoso para evitar penetrar através da traqueia ou do tecido ao redor das cordas vocais. Também é recomendável não realizar ITI se houve 2 ou 3 faltas2.
Existem diferentes rotas para a administração de medicamentos/agentes biológicos, com cada um tendo suas próprias vantagens e desvantagens inerentes. A seleção de um método baseia-se principalmente nos objetivos do estudo e na natureza da intervenção. Tanto técnicas de intranasal quanto de aerossolização entregam agentes ao trato respiratório superior, bem como aos pulmões. Isso beneficia estudos envolvendo o trato respiratório superior13,21, no entanto, a entrega de uma substância aos pulmões não é confiável. Além disso, engolir, espirrar e as diferentes taxas de respiração podem levar a inconsistências nas doses entregues. No entanto, as propriedades físico-químicas de algumas substâncias afetam sua eficiente aerossolização15. Os pesquisadores usam a inoculação intratracheal para contornar esse problema, que independentemente do tamanho das partículas e da viscosidade, fornece inóculo/drogas diretamente nos pulmões23.
Os dois principais métodos de entrega intratraqueal incluem intratraqueal transoral14,15 e instilação transtraqueal com ou sem traqueotomia 16,17. O ITI é um procedimento onde uma ampla gama de doses de tratamento pode ser administrada a um grande número de animais rapidamente, uma veztreinados 18. Enquanto a instilação intratraqueal transoral é rotineiramente utilizada em ratos adultos, a técnica mais invasiva como a incisão cirúrgica foi necessária em recém-nascidos 16,19,20. Os pesquisadores ainda evitam o uso dessa técnica de ITI transoral em filhotes por várias razões. O pequeno tamanho do roedor neonatal dificulta a visualização do lúmen laríngeo, juntamente com o baixo sucesso na intubação. Além disso, o tradicional laringoscópio metálico usado para ITI em adultos não pode ser usado em recém-nascidos devido ao pequeno tamanho da cavidade oral e aos frágeis tecidos mucosas 16,18,10. Espéculos menores e cateteres são necessários para visualizar a cavidade laríngea e entregar os terapêuticos/agentes no pulmão. O operador deve ser altamente qualificado para conseguir isso. Finalmente, a recuperação da anestesia, hipotermia, rejeição materna e canibalismo criam problemas adicionais para a recuperação e sobrevivênciade ênatos de ratos 21,22. Nosso estudo utilizou o uso de anestesia gasosa seguida de recuperação em almofadas de aquecimento e reunião com barragens de lactação. Isso evita problemas associados à hipotermia, rejeição materna ou canibalismo. Muitos dos estudos de intervenção não cirúrgica envolvem uma intubação cega da traqueia através da cavidade oral. Isto não é especialmente aceitável no caso de uma droga onde o efeito pode ser perdido se for incutido erroneamente no esôfago. Neste estudo, a abertura traqueal é visualizada usando um otoscópio e uma ponta de pipeta ligeiramente dobrada é inserida diretamente na traqueia para entregar a substância, o corante neste caso. Nossa técnica demonstra uma maneira eficaz de administrar a droga na traqueia de um filhote de rato.
O processo de ITI, é um método confiável quando realizado após treinamento meticuloso. Uma vez treinado, pode ser feito de forma rápida e eficaz, como em roedores adultos 13,24,25. A instilação endotraqueal correta pode ser confirmada por vários métodos, incluindo o movimento de corante ou líquido em tubos ou seringas 26,27,28. Como é possível visualizar a abertura traqueal neste método, as faltas são muito menores. A apneia foi observada em alguns filhotes imediatamente após o ITI, que foi recuperado espontaneamente18,29. O uso de otoscópio junto com o menor espéculo serviu como um ajuste perfeito para a pequena cavidade oral do rato neonatal18. Os resultados deste estudo indicaram que a substância pode ser entregue consistentemente a todos os lóbulos do pulmão, conforme confirmado pela localização do corante. Este método seria de grande importância em estudos experimentais nos quais os ratos neonatais são obrigados a imitar de forma confiável as condições pulmonares neonatais 30,31,32. Essa técnica também poderia ser utilizada para realizar estudos de função pulmonar33, bem como estudos de transplante de células-tronco 34,35,36 que atualmente emprega intervenções cirúrgicas e podem ser angustiantes para filhotes.
Essa técnica também contribui para os princípios do Refinamento e Redução da Pesquisa Animal. Este método serve como uma alternativa à injeção intratraqueal direta com uma agulha que é uma técnica cega e é invasiva, pois perfura a traqueia causando dor e sangramento. Em contraste completo, essa técnica serve para reduzir a dor, refinando a introdução de uma droga na traqueia, alcançando redução imediata da dor e sofrimento, e melhoria do bem-estar dos animais envolvidos na pesquisa37. Além disso, a administração da droga na traqueia é diretamente visualizada garantindo a eficácia. Embora a instilação da droga na traqueia seja amplamente praticada em animais maiores, nosso refinamento para usar isso em um filhote de rato de 5 dias de idade é a inovação que gostaríamos de enfatizar aqui.
Este artigo oferece um método simples, minimamente invasivo e reprodutível que poderia ser usado para a administração de agentes prejudiciais, a fim de simular condições patológicas, bem como para a administração local de drogas, antioxidantes, células/células-tronco para terapias neonatais.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado em parte pelo R01HD090887-01A1 de NICHD para AH. Os autores também reconhecem as instalações fornecidas pelo laboratório do Dr. Peter Mc Farlane, como o sistema de anestesia/aquecimento da inalação. A valiosa ajuda da Srta. Catherine Mayer na criação do sistema é apreciada. Nenhum papel foi desempenhado pelo órgão financiador na concepção do estudo, coleta, análise e interpretação dos dados ou na redação do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Evans Blue dye | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 314-13-6 | Confirmation of drug administration into lungs |
| Ketamine Hydrochloride | Hospira. Inc, Lake Forest, IL, USA | Dispensed from Animal care facility | For sedation |
| Operating Otoscope | Welch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, USA | 21770- 3.5V | For visualization of vocal cords |
| Otoscope Rechargeable Handle | Welch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, USA | 71050-C | |
| Pipette tip (Gel loading) | Fisherbrand | 02-707-139 | Administering the drug |
| Platform for restraining (inclined plane) | Animal care facility | Dispensed from Animal care facility | Wired roof of mice cage can be used |
| 3M Micropore Surgical White Paper (sticking tape) | 3M, St. Paul, MN, USA | 1530-2 | |
| Luer Lock SyringeSyringes (1 ml) | BD Franklin Lakes, NJ , USA | NBD2515 | Administering the drug |
| Xylazine | Hospira. Inc, Lake Forest, IL, USA | For sedation |
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