Summary
Esta técnica de inculcar medicamentos directamente en la tráquea de roedores neonatales es importante para estudiar el impacto de los medicamentos o biológicos administrados localmente en las enfermedades pulmonares neonatales. Además, este método también se puede utilizar para inducir lesiones pulmonares en modelos animales.
Abstract
El tratamiento de roedores neonatales con medicamentos inculcados directamente en la tráquea podría servir como una herramienta valiosa para estudiar el impacto de un medicamento administrado localmente. Esto tiene un impacto traslacional directo porque el surfactante y los medicamentos se administran localmente en los pulmones. Aunque la literatura tiene muchas publicaciones que describen la intubación transoral mínimamente invasiva de ratones y ratas adultos en experimentos terapéuticos, falta este enfoque en cachorros de ratas neonatales. El pequeño tamaño de la región orotraqueal / faringe en los cachorros dificulta la visualización de la luz laríngea (cuerdas vocales), lo que contribuye a la tasa de éxito variable de la administración intratraqueal de fármacos. Por la presente, demostramos la intubación oral efectiva de cachorro de rata neonatal, una técnica que no es traumática y mínimamente invasiva, por lo que se puede utilizar para la administración en serie de medicamentos. Utilizamos un otoscopio operativo con un sistema de iluminación y una lente de aumento para visualizar la abertura traqueal de los recién nacidos de rata. Luego, el medicamento se instila con una jeringa de 1 ml conectada a una punta de pipeta. La precisión del método de administración se demostró mediante la administración de tinte azul Evans. Este método es fácil de entrenar y podría servir como una forma efectiva de inculcar medicamentos en la tráquea. Este método también podría usarse para la administración de inóculo o agentes para simular condiciones de enfermedad en animales y, también, para estrategias de tratamiento basadas en células para diversas enfermedades pulmonares.
Introduction
Los recién nacidos prematuramente tienen pulmones poco desarrollados que requieren muchas terapias intervencionistas, como la ventilación a largo plazo. Estas intervenciones sitúan a los neonatos supervivientes en un alto riesgo de secuelas posteriores1. Los modelos animales experimentales sirven como una herramienta importante para simular diversas condiciones de enfermedad, estudiar la patobiología de las enfermedades y evaluar las intervenciones terapéuticas. A pesar de que una amplia gama de modelos animales, desde ratones, ratas y conejos hasta corderos y cerdos prematuros están disponibles, los ratones y las ratas son los más utilizados.
La principal ventaja de usar ratones y ratas es el período de gestación relativamente corto y el costo reducido. También están fácilmente disponibles, son fáciles de mantener en entornos libres de enfermedades, genéticamente homogéneos y tienen una preocupación relativamente menos ética 2,3. Otra ventaja importante del modelo de roedor es que al nacer el cachorro neonatal se encuentra en la etapa canalicular tardía / saccular temprana del desarrollo pulmonar, que es morfológicamente equivalente al pulmón de un bebé humano neonatal prematuro de 24 semanas que desarrolla displasia broncopulmonar4. Además, a medida que su desarrollo pulmonar progresa rápidamente hasta su finalización dentro de las primeras 4 semanas de vida, es factible estudiar la maduración pulmonar postnatal en un marco de tiempo razonable4. A pesar de estas ventajas, el pequeño tamaño de los ratones y las crías de rata es una fuente de preocupación para varias intervenciones, lo que obliga a la mayoría de los investigadores a usar animales adultos en lugar de cachorros5. Los pulmones neonatales se encuentran en una etapa de desarrollo y la respuesta de un neonato a un agente incitador difiere de la de un adulto. Esto hace que sea apropiado utilizar modelos animales neonatales para estudiar las condiciones de la enfermedad neonatal humana.
Existen diferentes métodos para administrar medicamentos / agentes biológicos al pulmón. Esto incluye la instilación intranasal 6,7 o intratraqueal 8,9,10, así como la inhalación deaerosoles 11,12. Cada enfoque tiene sus propios desafíos técnicos, ventajas y limitaciones13. Se prefiere la vía intratraqueal de administración de agentes terapéuticos para estudiar el impacto terapéutico directo en el órgano evitando los efectos sistémicos. Esta vía también podría utilizarse para estudiar la patología pulmonar causada por agentes incitadores. Existen técnicas invasivas y mínimamente invasivas para hacer esto y es fácil de realizar en adultos. Sin embargo, en los cachorros, debido al pequeño tamaño del animal, existen desafíos técnicos asociados con el proceso de intubación. El presente estudio presenta un método de instilación intratraqueal (ITI) simple, consistente y no quirúrgico en crías de rata que podría usarse para estudiar la eficacia de diversas intervenciones terapéuticas neonatales, así como para generar modelos animales que simulan enfermedades respiratorias neonatales.
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Protocol
Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (protocolo # 2020-0035) en la Universidad Case Western Reserve. Todos los animales fueron tratados de acuerdo con las directrices de los NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio.
1. Animales
- Obtener comercialmente ratas Sprague Dawley preñadas.
- Mantener a los animales en una instalación veterinaria aprobada con un ciclo de luz-oscuridad de 14 h / 10 h y 45-60% de humedad relativa.
2. Preparación del compuesto de prueba
- Utilice el colorante azul Evans como compuesto de prueba para evaluar la eficacia del procedimiento de instilación intratraqueal.
- Preparar una solución al 0,25% (p/v) del colorante en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,2) y esterilizar con filtro con un filtro de jeringa de 0,45 μm.
3. Administración de anestesia
- Anestesiar a las crías de rata utilizando anestesia gaseosa (3% de isoflurano en oxígeno al 100%), utilizando un sistema de administración modificado adaptado para neonatos de ratas pequeñas.
- Verifique la pérdida de los reflejos de la cola y el pedal y la respiración superficial para garantizar la profundidad adecuada de la anestesia para llevar a cabo el procedimiento.
4. Instilación intratraqueal (ITI)
- Use cachorros de rata en el día 5 postnatal (PN 5) para la ITI. El peso promedio de un cachorro de rata PN 5 es de 12 gramos.
- Sujete al cachorro de rata anestesiado en una plataforma plana inclinada con cinta de etiquetado de laboratorio. El cachorro está sujeto en un ángulo de aproximadamente 45 ° en la posición supina.
- Abra la boca del neonato y tire suavemente de la lengua hacia un lado con una pinza roma.
- Utilice un pequeño espéculo de otoscopio de 2 mm de diámetro conectado al otoscopio para sujetar la lengua suavemente y para una visualización adecuada de la laringe.
- Utilice el sistema iluminador de garganta, es decir, el otoscopio de funcionamiento y la lente de aumento para una visualización adecuada de las cuerdas vocales (Figura 1).
- Coloque a los animales en un ángulo de 45° en un plano inclinado. Se utilizan las tapas de barra con cable de las jaulas de ratón (Figura 2).
NOTA: Posicionar al animal en un ángulo de 45° proporciona una mejor visualización de la abertura traqueal sin la interferencia de la epiglotis. - Tome una punta de pipeta de ángulo largo que se utiliza para cargar geles de western blot. Corte la base de la punta de la pipeta con una cuchilla quirúrgica para que quepa bien en la punta de la jeringa de 1 cc.
- Use la jeringa estéril de 1 ml colocada en una punta de pipeta de ángulo largo para administrar 30-50 μL de la sustancia en el pulmón. Invierta la jeringa y aspire casi 0,9 cc de aire en la jeringa de 1 ml conectada a la punta de la pipeta seguida del tinte o la sustancia que se va a administrar. Esto permite que el aire detrás del tinte se empuje hacia la tráquea después de que se administre el tinte como se muestra en la Figura 3. La administración intratraqueal se logra visualizando la luz laríngea (cuerdas vocales) e insertando la punta de la pipeta ajustada a una jeringa en la luz traqueal.
- Use el espéculo del otoscopio para sostener la lengua y exponer las cuerdas vocales. El espéculo cumple el papel de la hoja de un laringoscopio. Doble la punta de la pipeta a un ángulo de 30° para facilitar la introducción del agente a través del espéculo en forma de cono en la abertura traqueal.
- Introduzca la punta de la pipeta en la abertura traqueal hasta el punto de aproximadamente 2 mm más allá de las cuerdas vocales. Empuje el pistón de la jeringa para administrar el tinte o el fármaco a través del espéculo del otoscopio operativo como se muestra en la Figura 3. La introducción de aire en el pulmón poco después de la administración del agente evita que la sustancia regrese a la cavidad laríngea.
- Después de administrar al cachorro con el tinte o solución salina normal, coloque a los cachorros en una almohadilla térmica de líquido circulante integrada (38 ° C) hasta que sus movimientos respiratorios sean regulares. Después de la recuperación completa de la anestesia, reúna a los cachorros con la presa.
5. Caracterización de la entrega de ITI
- Después de itI, sacrificar a las crías de rata administrando anestesia excesiva (ketamina 100 mg / kg y xilazina 10 mg / kg) / tiopentona seguida de exanguinación en un momento apropiado después de la administración. La eutanasia se realizó como parte del experimento para recolectar tejido pulmonar para demostrar la eficacia.
- Asegure al cachorro de rata sacrificado en una tabla de disección y limpie el pecho y el abdomen con alcohol etílico al 70%.
- Para evaluar la distribución del tinte en todo el pulmón, retire los pulmones del animal mediante la técnica estéril y muestre los pulmones según corresponda para la obtención de imágenes (Figura 4A, B).
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Representative Results
La instilación del azul de Evans reveló la distribución multifocal del colorante que involucra todos los lóbulos pulmonares (Figura 4A, B). Nuestro resultado, como se muestra en la Figura 4 , demuestra la eficacia de la distribución a todos los lóbulos. La imagen se toma inmediatamente después de itI del tinte en la tráquea. Se logró una eficacia del 100% en la inculcación del tinte en la tráquea seguida de su propagación en todos los lóbulos de ambos lados. Se espera que el tinte se extienda aún más dentro del lóbulo del pulmón. Con la administración repetida, hemos podido garantizar el 100% de éxito en la entrega de esto al pulmón tanto a los lóbulos como a todos los lóbulos. Nos hemos asegurado de que ningún tinte llegue al estómago o fuera de los pulmones. Esto atestigua la eficacia de la técnica como la administración del 100% en los pulmones. La anestesia con isoflurano permitió una recuperación más rápida de los cachorros después del procedimiento.
Los cachorros de rata desde el día 5 toleraron este procedimiento y tardaron menos de 5 minutos en llevarse a cabo después de la anestesia. Algunos animales, aunque desarrollaron apnea transitoria, recuperaron el patrón respiratorio normal en pocos minutos.
Figura 1: Componentes del otoscopio. (A) Fuente de alimentación 2.5 V (B) Lente de aumento (C) espéculo transiluminador (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: El posicionamiento del animal. El posicionamiento de los animales en un ángulo de 45° proporcionó una mejor visualización de la abertura traqueal sin la interferencia de la epiglotis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Instilación intratraqueal. Visualización de la abertura traqueal utilizando el sistema de iluminación de garganta / otoscopio para lograr la entrega directa a los pulmones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Instilación ITI y tinción azul Evans. (A) La instilación ITI suministra el tinte a través de los pulmones. El tinte se puede ver distribuido a ambos lóbulos del pulmón como lo indica la flecha negra. La ausencia de tinte en el estómago confirma el éxito de la técnica (flecha roja). (B) Pulmones de crías de rata inculcadas con 50 μL de tinte azul Evans al 0,25%. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La instilación intratraqueal es un método excelente que ofrece varias ventajas sobre los métodos existentes para las intervenciones de enfermedades respiratorias, así como el desarrollo de modelos de enfermedad. Es un método rápido y con experiencia, se puede realizar con una velocidad promedio de 2-3 minutos por animal. Las consideraciones clave para una intubación exitosa son la sedación adecuada del animal, su posicionamiento correcto, especialmente la cabeza, así como la profundidad precisa de colocación / tamaño de los espéculos en la orofaringe. La sedación adecuada permitiría suficiente tiempo de trabajo para los operadores, especialmente los principiantes. El posicionamiento del animal en un ángulo de 45° es importante para la visualización adecuada de las cuerdas vocales. La colocación del espéculo a la profundidad correcta ayuda en la retracción de la lengua durante todo el procedimiento, lo que nuevamente permite una buena visualización de la cuerda vocal. Un equipo de dos personas puede coordinar fácilmente este trabajo. Uno podría coordinar la anestesia y el enjaulamiento de los animales, mientras que el otro podría ocuparse de la instilación. La parte técnicamente más desafiante de ITI es la intubación correcta en la tráquea. El éxito de la técnica se confirma mediante la administración de tinte después de la intubación. Es muy importante confirmar el paso inicial de la intubación correcta, ya que existe una buena probabilidad de que el tubo se deslice hacia el esófago, lo que resulta en la administración de la sustancia en el estómago, en lugar del pulmón.
La única parte que uno debe tener cuidado es el trauma potencial asociado con la desintubación. También se debe ser muy suave y cuidadoso para evitar penetrar a través de la tráquea o el tejido que rodea las cuerdas vocales. También se recomienda no realizar ITI si ha habido 2 o 3 fallos2.
Existen diferentes vías para la administración de fármacos/agentes biológicos y cada una tiene sus propias ventajas y desventajas inherentes. La selección de un método se basa principalmente en los objetivos del estudio y la naturaleza de la intervención. Tanto la instilación intranasal como las técnicas de aerosolización administran agentes al tracto respiratorio superior, así como a los pulmones. Esto beneficia a los estudios que involucran el tracto respiratorio superior13,21 sin embargo, la administración de una sustancia a los pulmones no es confiable. Además, la deglución, los estornudos y las diferentes frecuencias respiratorias pueden provocar inconsistencias en las dosis administradas. Sin embargo, las propiedades fisicoquímicas de algunas sustancias afectan su aerosolización eficiente15. Los investigadores utilizan la inoculación intratraqueal para evitar este problema, que independientemente del tamaño de partícula y la viscosidad, administra inóculo / medicamentos directamente en los pulmones23.
Los dos principales métodos de administración intratraqueal incluyen intratraqueal transoral14,15 e instilación transtraqueal con o sin traqueotomía 16,17. ITI es un procedimiento en el que se puede administrar una amplia gama de dosis de tratamiento a un gran número de animales rápidamente, una vez entrenados18. Si bien la instilación intratraqueal transoral se utiliza de forma rutinaria en ratas adultas, la técnica más invasiva como la incisión quirúrgica fue requerida en neonatos 16,19,20. Los investigadores aún evitan el uso de esta técnica de ITI transoral en cachorros debido a varias razones. El pequeño tamaño del roedor neonatal dificulta la visualización de la luz laríngea junto con un escaso éxito en la intubación. Además, el laringoscopio metálico tradicional utilizado para la ITI en adultos no se puede utilizar en neonatos debido al pequeño tamaño de la cavidad oral y los frágiles tejidos de la mucosa 16,18,10. Se requieren espéculos y catéteres más pequeños para ver la cavidad laríngea y administrar los terapéuticos / agentes en el pulmón. El operador debe estar altamente capacitado para lograr esto. Finalmente, la recuperación de la anestesia, la hipotermia, el rechazo materno y el canibalismo crean problemas adicionales para la recuperación y supervivencia de los neonatosde rata 21,22. Nuestro estudio empleó el uso de anestesia de gas seguido de la recuperación en almohadillas térmicas y la reunión con presas de lactancia. Esto evita problemas asociados con hipotermia, rechazo materno o canibalismo. Muchos de los estudios de intervención no quirúrgicos implican una intubación ciega de la tráquea a través de la cavidad oral. Esto es especialmente inaceptable en el caso de la droga donde el efecto puede pasarse por alto si se inculca erróneamente en el esófago. En este estudio, la abertura traqueal se visualiza utilizando un otoscopio y se inserta una punta de pipeta ligeramente doblada directamente en la tráquea para administrar la sustancia, el tinte en este caso. Nuestra técnica demuestra una forma efectiva de administrar el medicamento en la tráquea de un pequeño cachorro de rata.
El proceso de ITI, es un método confiable cuando se realiza después de un entrenamiento meticuloso. Una vez entrenado se puede hacer de forma rápida y eficaz como en roedores adultos 13,24,25. La instilación endotraqueal correcta se puede confirmar mediante varios métodos, incluido el movimiento de tinte o líquido en un tubo o jeringa 26,27,28. Como es posible visualizar la abertura traqueal en este método, las fallas son muy menores. Se observó apnea en algunos cachorros inmediatamente después de la ITI que se recuperó espontáneamente18,29. El uso del otoscopio junto con el espéculo más pequeño sirvió como un ajuste perfecto para la pequeña cavidad oral de la rata neonatal18. Los resultados de este estudio indicaron que la sustancia se puede administrar consistentemente a todos los lóbulos del pulmón según lo confirmado por la localización del tinte. Este método sería de gran importancia en estudios experimentales en los que se requiere que las ratas neonatales imiten de manera confiable las condiciones pulmonares neonatales 30,31,32. Esta técnica también podría utilizarse para llevar a cabo estudios de función pulmonar33, así como estudios de trasplante de células / células madre 34,35,36 que actualmente emplean intervenciones quirúrgicas y podrían ser angustiantes para los cachorros.
Esta técnica también contribuye a los principios de Refinamiento y Reducción en la investigación con animales. Este método sirve como una alternativa a la inyección intratraqueal directa con una aguja que es una técnica ciega y es invasiva ya que perfora la tráquea causando dolor y sangrado. En completo contraste, esta técnica sirve para reducir el dolor mientras se refina la introducción de un fármaco en la tráquea, logrando la reducción inmediata del dolor y el sufrimiento, y la mejora del bienestar de los animales involucrados en la investigación37. Además, la administración del fármaco en la tráquea se visualiza directamente asegurando la eficacia. Aunque la instilación de drogas en la tráquea se practica ampliamente en animales más grandes, nuestro refinamiento para usar esto en un cachorro de rata de 5 días de edad es la innovación que nos gustaría enfatizar aquí.
Este artículo ofrece un método simple, mínimamente invasivo y reproducible que podría usarse para la administración de agentes nocivos con el fin de simular condiciones patológicas, así como para la administración local de medicamentos, antioxidantes, células / células madre para terapias neonatales.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por R01HD090887-01A1 del NICHD a AH. Los autores también reconocen las instalaciones proporcionadas por el laboratorio del Dr. Peter Mc Farlane, como el sistema de anestesia / almohadilla térmica por inhalación. Se agradece la valiosa asistencia de la Sra. Catherine Mayer en la creación del sistema. El organismo financiador no desempeñó ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación, el análisis y la interpretación de los datos ni en la redacción del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Evans Blue dye | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 314-13-6 | Confirmation of drug administration into lungs |
| Ketamine Hydrochloride | Hospira. Inc, Lake Forest, IL, USA | Dispensed from Animal care facility | For sedation |
| Operating Otoscope | Welch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, USA | 21770- 3.5V | For visualization of vocal cords |
| Otoscope Rechargeable Handle | Welch Allyn, Hillrom, Chicago, IL, USA | 71050-C | |
| Pipette tip (Gel loading) | Fisherbrand | 02-707-139 | Administering the drug |
| Platform for restraining (inclined plane) | Animal care facility | Dispensed from Animal care facility | Wired roof of mice cage can be used |
| 3M Micropore Surgical White Paper (sticking tape) | 3M, St. Paul, MN, USA | 1530-2 | |
| Luer Lock SyringeSyringes (1 ml) | BD Franklin Lakes, NJ , USA | NBD2515 | Administering the drug |
| Xylazine | Hospira. Inc, Lake Forest, IL, USA | For sedation |
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