Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

MS2-تقارب تنقية مقرونة تسلسل الحمض النووي الريبي في البكتيريا إيجابية الغرام

Published: February 23, 2021 doi: 10.3791/61731
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 1, 1
1Université de Strasbourg, CNRS, 2Department of Biochemistry, Université de Sherbrooke

Summary

وقد تم تطوير تكنولوجيا MAPS للتدقيق في الهدف من الحمض النووي الريبي التنظيمية محددة في الجسم الحي. يتم وضع علامة على الحمض النووي الريبي من الفائدة مع aptamer MS2 تمكين تنقية مشتركة من شركائها الجيش الملكي النيبالي وتحديدها عن طريق تسلسل الجيش الملكي النيبالي. هذا البروتوكول المعدل مناسب بشكل خاص للبكتيريا إيجابية الغرام.

Abstract

على الرغم من أن الحمض النووي الريبي التنظيمي الصغير منتشر على نطاق واسع بين مجال الحياة البكتيري ، إلا أن وظائف العديد منها لا تزال سيئة الخصائص بشكل ملحوظ بسبب صعوبة تحديد أهدافها من الحمض النووي الريبي. هنا ، وصفنا بروتوكولا معدلا لتنقية MS2-Affinity إلى جانب تقنية تسلسل الحمض النووي الريبي (MAPS) ، بهدف الكشف عن جميع شركاء الحمض النووي الريبي من الحمض النووي الريبي المحدد في الجسم الحي. على نطاق واسع ، يتم دمج MS2 aptamer إلى أقصى 5 'من الحمض النووي الريبي من الفائدة. ثم يتم التعبير عن هذا البناء في الجسم الحي ، مما يسمح ل MS2-sRNA بالتفاعل مع شركائها الخلويين. بعد الحصاد البكتيري ، يتم الخلايا ميكانيكيا. يتم تحميل استخراج الخام في عمود الكروماتوغرافيا القائمة على الأميلوز المغلفة سابقا مع البروتين MS2 تنصهر على البروتين ملزمة maltose. وهذا يتيح التقاط محددة من MS2-sRNA والتفاعل RNAs. بعد التحلل، يتم تحديد الحمض النووي الريبي المنقى من خلال تسلسل الحمض النووي الريبي عالي الإنتاجية والتحليل المعلوماتي الحيوي اللاحق. وقد تم تنفيذ البروتوكول التالي في المكورات العنقودية العنقودية المسببة للأمراض البشرية إيجابية الغرام، وهو، من حيث المبدأ، قابلة للانقل إلى أي بكتيريا إيجابية الغرام. وخلاصة القول ، تشكل تكنولوجيا MAPS طريقة فعالة لاستكشاف الشبكة التنظيمية ل sRNA معين بعمق ، وتقدم لقطة من الهدف بأكمله. ومع ذلك، من المهم أن نضع في اعتبارنا أن الأهداف المفترضة التي حددتها الخرائط لا تزال بحاجة إلى التحقق من صحتها من خلال نهج تجريبية تكميلية.

Introduction

وقد تم تحديد المئات، وربما حتى الآلاف من الرنانات التنظيمية الصغيرة (sRNAs) في معظم الجينوم البكتيري، ولكن وظائف الغالبية العظمى منهم لا تزال غير مطهرة. عموما، SRNAs هي جزيئات قصيرة غير الترميز، ولعب أدوار رئيسية في علم وظائف الأعضاء البكتيرية والتكيف مع البيئات المتقلبة1،2،3. والواقع أن هذه الجزيئات الكبيرة هي في قلب العديد من الشبكات التنظيمية المعقدة، مما يؤثر على المسارات الأيضية، والاستجابات الإجهادية، ولكن أيضا فيوعة ومقاومة المضادات الحيوية. منطقيا، يتم تشغيل توليفها من قبل محفزات بيئة محددة (على سبيل المثال، المجاعة الغذائية، والأكسدة أو ضغوط الغشاء). وتنظم معظم الرنانات المريبة متعددة الأهداف على مستوى ما بعد النسخ من خلال الاقتران القاعدي القصير وغير المتجاور. وعادة ما تمنع بدء الترجمة من خلال التنافس مع الريبوسومات لمناطق بدء الترجمة4. تشكيل sRNA:mRNA دوبلس أيضا غالبا ما يؤدي إلى تدهور نشط من مرنا الهدف عن طريق تجنيد RNases محددة.

إن توصيف هدف الحمض النووي الريبي (أي المجموعة الكاملة من الحمض النووي الريبي المستهدف) يسمح بتحديد المسارات الأيضية التي يتدخل فيها والإشارة المحتملة التي يستجيب لها. وبالتالي، يمكن الاستدلال على وظائف الحمض النووي الريبي محددة عموما من targetome لها. لهذا الغرض، وقد وضعت عدة في أدوات التنبؤ سيليكو مثل IntaRNA وCopraRNA5،6،7. وهي تعتمد بشكل خاص على تكامل التسلسل، واقتران الطاقة وإمكانية الوصول إلى موقع التفاعل المحتمل لتحديد شركاء الحمض النووي الريبي المفترضين. ومع ذلك ، فإن خوارزميات التنبؤ لا تدمج جميع العوامل التي تؤثر على الاقتران الأساسي في الجسم الحي مثل مشاركة مرافقي الحمض النووي الريبي8 الذين يفضلون التفاعلات دون المستوى الأمثل أو التعبير المشترك لكلا الشريكين. ونظرا للقيود المتأصلة في هذه الأدوات، فإن المعدل الإيجابي الزائف لأدوات التنبؤ لا يزال مرتفعا. وتستند معظم النهج التجريبية على نطاق واسع على تنقية مشتركة من الأزواج sRNA:mRNA التفاعل مع بروتين ملزم الحمض النووي الريبي الموسومة (RBP)6,9. على سبيل المثال، التفاعل RNA عن طريق الربط والتسلسل (RIL-seq) طريقة تحديد الدوبلس الجيش الملكي النيبالي شارك في تنقيتها مع مرافقين الجيش الملكي النيبالي مثل Hfq و ProQ في الإشريكية القولونية10،11. تم تطبيق تقنية مماثلة تسمى UV-Crosslinking، ربط وتسلسل الهجينة (CLASH) على RNase E- وHFQ المرتبطة sRNAs في E. coli12،13. على الرغم من الأدوار الموصوفة جيدا من Hfq و ProQ في تنظيم SRNA بوساطة في البكتيريا المتعددة8،14،15، يبدو أن التنظيم القائم على الحمض النووي الريبي هو مرافق الحمض النووي الريبي المستقل في العديد من الكائنات الحية مثل S. aureus16،17،18. حتى لو كان تنقية الدوبلس الحمض النووي الريبي بالاشتراك مع RNases ممكن كما يتضح من ووترز وزملاء العمل13، وهذا لا يزال صعبا كما RNases تؤدي إلى تدهورها السريع. وبالتالي ، فإن تنقية MS2-Affinity إلى جانب نهج تسلسل الحمض النووي الريبي (MAPS)19،20 يشكل بديلا صلبا في مثل هذه الكائنات الحية.

على عكس الأساليب المذكورة أعلاه ، يستخدم MAPS حمضRNA محدد كطعم لالتقاط جميع الحمض النووي الريبي المتفاعل وبالتالي لا يعتمد على مشاركة RBP. يتم تصوير العملية بأكملها في الشكل 1. باختصار، يتم وضع علامة على الحمض النووي الريبي في 5 'مع APTAMER RNA MS2 التي يتم التعرف عليها على وجه التحديد من قبل بروتين معطف MS2. يتم دمج هذا البروتين مع البروتين ملزمة مالتوس (MBP) أن شلت على راتنج اميلوز. لذلك ، يتم الاحتفاظ MS2 - SRNA وشركائها الجيش الملكي النيبالي على العمود الكروماتوغرافي تقارب. بعد elution مع مالتوز، يتم تحديد الحمض النووي الريبي المنقى باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي عالية الإنتاجية تليها التحليل المعلوماتية الحيوية(الشكل 2). ترسم تقنية MAPS في نهاية المطاف خريطة تفاعلية لجميع التفاعلات المحتملة التي تحدث في الجسم الحي.

تم تنفيذ تكنولوجيا MAPS في الأصل في البكتيريا غير المسببة للأمراض الغرام السلبية E. القولونية21. ومن اللافت للنظر أن MAPS ساعدت في تحديد جزء مشتق من الحمض النووي الريبي يتفاعل على وجه التحديد مع كل من RyhB وRybB sRNAs ويمنع أي ضوضاء نسخية من الحمض النووي الريبي لتنظيم أهداف الحمض النووي الريبي في ظروف غير محفزة. بعد ذلك، تم تطبيق MAPS بنجاح على غيرها من E. coli sRNAs مثل DsrA22، RprA23، CyaR23 و GcvB24 (الجدول 1). وبالإضافة إلى تأكيد الأهداف المعروفة سابقا، وسعت الخرائط الهدف من هذه الرنانات المعروفة. في الآونة الأخيرة، وقد تم تنفيذ MAPS في السالمونيلا تيفيموريوم وكشفت أن SraL SRNA يربط إلى رو مرنا، والترميز لعامل إنهاء النسخ25. من خلال هذا الاقتران، SraL يحمي رو مرنا من إنهاء النسخ المبكر الناجم عن رو نفسها. ومن المثير للاهتمام أن هذه التكنولوجيا لا تقتصر على الحمض النووي الريبي ويمكن تطبيقها على أي نوع من الحمض النووي الريبي الخلوي كما يتضح من استخدام جزء مشتق من الحمض النووي الريبي26 ومنطقة غير مترجمة من 5'untranslated من مرنا22 (الجدول 1).

وقد تم تكييف طريقة MAPS أيضا إلى البكتيريا المسببة للأمراض إيجابية الغرام S. أوريوس19. على وجه التحديد ، تم تعديل بروتوكول التحلل على نطاق واسع لكسر الخلايا بكفاءة بسبب جدار خلية أكثر سمكا من البكتيريا السلبية الغرام والحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. هذا البروتوكول تكييفها كشف بالفعل interactome من RsaA27، RsaI28 و RsaC29. أعطى هذا النهج رؤى حول الدور الحاسم لهذه الرنانات في الآليات التنظيمية لخصائص سطح الخلية ، وامتصاص الجلوكوز ، والاستجابات للإجهاد التأكسدي.

وقد وصف مؤخرا البروتوكول الذي تم تطويره وتنفيذه في الإشريكية القولونية في عام 2015 بتفصيل كبير30. هنا، ونحن نقدم بروتوكول MAPS المعدلة، والتي هي مناسبة بشكل خاص لدراسة الشبكات التنظيمية الحمض النووي الريبي في البكتيريا إيجابية غرام (جدار الخلية سمكا) سواء كانت غير مسببة للأمراض أو المسببة للأمراض (احتياطات السلامة).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. المخازن المؤقتة ووسائل الإعلام

  1. بالنسبة لتجارب MAPS، قم بإعداد المخازن المؤقتة والوسائط التالية:
    - العازلة A (150 MM KCl، 20 mM تريس-HCl pH 8، 1 م م MgCl2 و 1 MM DTT)
    - المخزن المؤقت E (250 mM KCl، 20 mM Tris-HCl pH 8، 12 mM maltose، 0.1٪ تريتون، 1 مللي متر ملغكل2 و 1 mM DTT)
    - مخزن تحميل الحمض النووي الريبي (0.025٪ xylene سيانول و 0.025٪ بروموفينول الأزرق في 8 M اليوريا)
    - الدماغ ضخ القلب (BHI) المتوسطة (12.5 غرام من الدماغ العجل، 10 غرام من بيبتون، 5 غرام من قلب لحم البقر، 5 غرام من NaCl، 2.5 غرام منNa 2HPO4 و 2 غرام من الجلوكوز ل 1 لتر)
    - مرق الليوجيني (LB) متوسط (10 غرام من البيبتون، 5 غرام من مستخلص الخميرة و 10 غرام من NaCl ل 1 لتر)
  2. بالنسبة إلى المقايسات لطخة الشمالية، قم بإعداد المخازن المؤقتة التالية:
    - حل الحجب (حمض ماليك 1x و 1٪ كاشف مانع)
    - حل التهجين (50٪ فورماميد، 5x SSC، 7٪ SDS، 1٪ حل الحجب و 0.2٪ N-لوريل ساركوسين، 50 مليون فوسفات الصوديوم). الحرارة مع التحريض على حل.
    تنبيه: اتبع بعناية احتياطات السلامة المتعلقة بكل منتج.
    - 1 م فوسفات الصوديوم (58 مليون فوسفات الصوديوم ديباسيك و 42 مليون فوسفات الصوديوم أحادية القاروص)
    - المالحة، سيترات الصوديوم (SSC) العازلة، 20x التركيز (3 م NaCl و 300 m تريزوديوم سيترات)

2. قضايا السلامة

  1. تنفيذ جميع الخطوات التي تنطوي على البكتيريا المسببة للأمراض قابلة للحياة في مختبر احتواء المستوى 2.
    ملاحظة: يمكن أخذ مستخلصات الخلايا فقط للخارج بعد التحلل (الخطوة 5).
  2. ضع معطف المختبر والقفازات.
  3. تأكد من تغطية المعصمين.
  4. تنظيف خزانة السلامة البيولوجية (الفئة الثانية) بمحلول مطهر.
  5. التخلص من النفايات الصلبة المعرضة للبكتيريا في سلة الطب الحيوي المناسبة.
  6. علاج قوارير تحتوي على السوائل الملوثة مع محلول مطهر. ثم، تجاهلها في بالوعة.
  7. اغسل اليدين والمعصمين بالصابون بعناية وأزل معطف المختبر قبل مغادرة مختبر الاحتواء من المستوى 2.

3. البناء البلازميد

ملاحظة: لأغراض الاستنساخ، من المهم تحديد حدود الحمض النووي الريبي الداخلي أولا. يتم وصف pCN51-P3 و pCN51-P3-MS2 البلازميدات في توماسيني وآخرون (2017)27. يسمح المروج P3 بالتعبير العالي عن الحمض النووي الريبي بطريقة تعتمد على كثافة الخلية (أي عندما تدخل البكتيريا مرحلة النمو الثابتة). تتراكم العديد من الرنانات العنقودية خلال هذه المرحلة من النمو.

  1. تضخيم تسلسل الحمض النووي الريبي عن طريق PCR باستخدام بوليمرات الحمض النووي عالية الدقة وآلة PCR. اتبع بعناية تعليمات الشركة المصنعة وقراءة غاريبيان وأفاشيا (2013)31 لمزيد من التفاصيل.
  2. استخدم القوالب التالية لتصميم التمهيديات المحددة:
    Equation 1
    و5'-CGCGGATCC(N)-3' للأمام وعكس التمهيديات، على التوالي.
    ملاحظة: هذه oligonucleotides تمكين لدمج تسلسل MS2 (في جريئة) إلى نهاية 5 'من الحمض النووي الريبي من الفائدة. توقيت المحيط الهادي أنا وبامHI مواقع تقييد (مسطر) تضاف في 5 'و 3' أطراف بناء MS2-SRNA لاستنساخ amplicon في pCN51-P3 plasmid27. (N) يتوافق مع تسلسل الجينات محددة (15-20 النيوكليوتيدات).
  3. هضم 1 ميكروغرام من pCN51-P3 plasmid و 1 ميكروغرام من المنتج PCR MS2-sRNA مع 2 U من PstI و 1 U من بامHI في المخزن المؤقت المناسب وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
  4. احتضان 1 ساعة عند 37 درجة مئوية وتنقية الحمض النووي باستخدام عدة تنقية PCR (انظر جدول المواد).
  5. اخلط البلازميد pCN51-P3 المهضوم (300 نانوغرام) و أمبليكون MS2-sRNA (نسبة الضرس للمتجه: إدراج = 1:3) في أنبوب 1.5 مل. انظر Revie et al. (1988)32 لزيادة كفاءة الربط إلى أقصى حد. إضافة 1 ميكرولتر من المخزن المؤقت ليغانس و 10 U من T4 Ligase في كل أنبوب. ضبط مستوى الصوت إلى 10 ميكرولتر مع المياه فائقة النبور.
  6. حضانة عند 22 درجة مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل.
  7. أضف 5 ميكرولتر من خليط الربط إلى 50 ميكرولتر من خلايا الإشريكية القولونية DH5α المجمدة المختصة كيميائيا. اقرأ سيدمان وآخرون (2001)33 لمعرفة المزيد عن تحول البلازميد والخلايا المختصة كيميائيا.
  8. احتضان 30 دقيقة على الجليد.
  9. صدمة حرارية (45 s في 42 °C) أنبوب التحويل باستخدام كتلة الحرارة أو حمام مائي.
  10. إضافة 900 ميكرولتر من LB المتوسطة واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  11. لوحة 100 ميكرولتر من التعليق البكتيري على لوحة أجار LB تكملها أمبيسلين (100 ميكروغرام / ميكرولتر).
    ملاحظة: يقوم المتجه pCN51-P3 بترميز جين مقاومة أمبيسلين، والذي يمكن من تحديد استنساخ الإشريكية القولونية فقط الذي يحمل pCN51-P3-MS2-sRNA plasmid.
  12. استخراج pCN51-P3-MS2-sRNA plasmid من ثقافة بكتيرية بين عشية وضحاها (5 مل) نمت في وجود أمبيسلين (100 ميكروغرام / ميكرولتر) باستخدام مجموعة صغيرة من الحمض النووي البلازميد (انظر جدول المواد).
  13. تحقق من البناء بواسطة تسلسل سانجر34 باستخدام التمهيدي التالي، 5'-TCTCGAAAATAATAGAGGG-3'.
  14. تحويل pCN51-P3-MS2-sRNA plasmid إلى DC10B خلايا الإشريكية القولونية المختصة كيميائيا. كرر الخطوات من 3.7 إلى 3.11.
  15. استخراج pCN51-P3-MS2-sRNA plasmid (انظر الخطوة 3.12) وتحويل 1-5 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد إلى HG001 ΔsRNA الكهربائية S. خلايا الحالب باستخدام جهاز كهربية. اتبع بعناية تعليمات الشركة المصنعة. اقرأ غروسر وريتشاردسون (2016)35 لمعرفة المزيد عن طرق إعداد المنافس الكهربائي S. aureus.
    تنبيه: تتضمن هذه الخطوة التعامل مع البكتيريا المسببة للأمراض (انظر الخطوة 2).
  16. إضافة 900 ميكرولتر من BHI المتوسطة واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعة.
  17. جهاز طرد مركزي 1 دقيقة في 16،000 x ز. تجاهل الناتنات الفائق.
  18. Resuspend بيليه في 100 ميكرولتر من BHI ولوحة تعليق البكتيرية على لوحات أجار BHI تستكمل مع الاريثروميسين (10 ميكروغرام / ميكرولتر).
    ملاحظة: يقوم المتجه pCN51-P3 أيضا بترميز جين مقاومة الإريثروميسين، والذي يمكنه من تحديد الحيوانات المستنسخة S. aureus فقط التي تحمل pCN51-P3-MS2-sRNA plasmid.

4. حصاد البكتيريا

تنبيه: تتضمن هذه الخطوة التعامل مع البكتيريا المسببة للأمراض (انظر الخطوة 2).

  1. تنمو مستعمرة واحدة من سلالات تحمل إما pCN51-P3-MS2-sRNA أو pCN51-P3-MS227 البلازميدات في 3 مل من BHI المتوسطة تكملها الاريثروميسين (10 ميكروغرام / ميكرولتر) في التكرارات.
  2. تمييع كل ثقافة بين عشية وضحاها في 50 مل (≈1/100) من BHI المتوسطة الطازجة تكملها الاريثروميسين (10 ميكروغرام / ميكرولتر) للوصول إلى OD600nm من 0.05. استخدم قارورة معقمة سعة 250 مل (نسبة قارورة إلى متوسطة 5:1).
    ملاحظة: يجب تعيين الظروف المتوسطة والنمو وفقا لنمط التعبير من SRNA درس.
  3. تنمو الثقافات عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز في 180 دورة في الدقيقة لمدة 6 ساعة.
  4. نقل كل ثقافة إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل.
  5. جهاز طرد مركزي عند 2,900 x g خلال 15 دقيقة عند 4 °C. تجاهل الناتنات الفائق.
  6. الحفاظ على الكريات على الجليد وأداء مباشرة تحلل الخلية الميكانيكية (الخطوة 5) أو تجميد وتخزين الكريات في -80 درجة مئوية.

5. تحلل الخلايا الميكانيكية

تنبيه: يجب تنفيذ الخطوات التالية على الجليد ويجب أن تكون المخازن المؤقتة عند 4 درجات مئوية. استخدام قفازات واتخاذ جميع الاحتياطات لحماية العينات من RNases.

  1. الكريات ريسوسبند (الخطوة 4.6) في 5 مل من العازلة A.
  2. نقل الخلايا التي أعيد إنفاقها في أنابيب الطرد المركزي 15 مل مع 3.5 غرام من حبات السيليكا (0.1 ملم).
  3. إدراج أنابيب في أداة تحلل الخلايا الميكانيكية (انظر جدول المواد). تشغيل دورة من 40 ق في 4.0 م / ث.
    ملاحظة: إذا كانت دورة واحدة غير كافية لكسر الخلايا، دع الجهاز يبرد لمدة 5 دقائق مع الاحتفاظ بالعينات على الجليد. ثم كرر دورة أخرى من 40 ثانية في 4.0 م / ث. يمكن اختبار كفاءة تحلل الخلية عن طريق طلاء الفائق على لوحة BHI-agar.
  4. جهاز طرد مركزي عند 15,700 x g لمدة 15 دقيقة. استعادة supernatant ويبقيه على الجليد.

6. إعداد العمود

تنبيه: يجب الحرص على عدم السماح لراتنج الأميلوز بالجفاف. إذا لزم الأمر، فقم بإغلاق العمود بغطاء نهاية. إعداد جميع الحلول قبل البدء في تنقية تقارب.

  1. وضع عمود كروماتوغرافيا في رف عمود (انظر جدول المواد).
  2. قم بإزالة طرف العمود واغسل العمود بالماء فائق النحافة.
  3. إضافة 300 ميكرولتر من راتنج اميلوز.
  4. اغسل العمود ب 10 مل من المخزن المؤقت A.
  5. تمييع 1200 pmol من البروتين MBP-MS2 في 6 مل من العازلة A وتحميله في العمود.
  6. اغسل العمود ب 10 مل من المخزن المؤقت A.

7. MS2-تقارب تنقية (الشكل 1)

  1. تحميل الخلية lysate في العمود.
    ملاحظة: احتفظ ب 1 مل من lysate الخلية (استخراج الخام، CE) لاستخراج إجمالي الحمض النووي الريبي (الخطوة 8) وإجراء لطخة الشمالية (الخطوة 9) وتحليل النسخ (الخطوة 10).
  2. جمع كسر التدفق من خلال (FT) في أنبوب جمع نظيفة.
  3. اغسل العمود 3 مرات مع 10 مل من المخزن المؤقت A. جمع كسر الغسيل (W).
  4. Elute العمود مع 1 مل من المخزن المؤقت E وجمع جزء elution (E) في 2 مل microtube.
  5. احتفظ بجميع الكسور التي تم جمعها على الجليد حتى استخراج الحمض النووي الريبي (الخطوة 8) أو قم بتجميدها عند -20 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.

8. استخراج الحمض النووي الريبي من الكسور التي تم جمعها (CE، FT، W و E)

  1. استخدام 1 مل من كل كسر (بما في ذلك FT و W) لاستخراج الحمض النووي الريبي.
  2. إضافة 1 حجم الفينول. تخلط بقوة.
    تحذير: الفينول متقلبة وتآكل، وإيلاء الاهتمام والعمل بأمان تحت غطاء الدخان.
  3. جهاز طرد مركزي عند 16,000 x g لمدة 10 دقائق عند 20 درجة مئوية.
  4. نقل المرحلة العليا في نظيفة 2 مل ميكروتوب.
  5. أضف 1 حجم من الكحول الكلوروفورم / isoamyl (24:1) وكرر الخطوات 8.3 إلى 8.4.
    تنبيه: اعمل بأمان تحت غطاء الدخان.
  6. إضافة 2.5 مجلدات من الإيثانول البارد 100٪ وحجم 1/10 من خلات الصوديوم 3 M (NaOAc) pH 5,2.
  7. يعجل بين عشية وضحاها في -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن أيضا هطول الأمطار في حمام الإيثانول / الجليد الجاف خلال 20 دقيقة أو في -80 درجة مئوية خلال 2 ساعة.
  8. جهاز طرد مركزي عند 16,000 x g لمدة 15 دقيقة عند 4°C. إزالة الإيثانول ببطء مع ماصة مع الحرص على عدم تعكير صفو بيليه.
    تنبيه: بيليه الحمض النووي الريبي ليست دائما مرئية وفضفاضة في بعض الأحيان في وجود الإيثانول.
  9. إضافة 500 ميكرولتر من الإيثانول البارد 80٪.
  10. جهاز طرد مركزي عند 16,000 x g لمدة 5 دقائق عند 4 °C.
  11. تجاهل الإيثانول عن طريق الأنابيب ببطء. الجافة بيليه باستخدام فراغ المكثف، 5 دقائق على وضع التشغيل.
  12. Resuspend بيليه في حجم مناسب (15-50 ميكرولتر) من المياه فائقة النبور. تجميد بيليه في -20 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق.
  13. تقييم كمية الحمض النووي الريبي (260 نانومتر) والجودة (نسب الطول الموجي 260/280 و 260/230) باستخدام مطياف/مقياس الفلور (انظر جدول المواد). اتبع بعناية تعليمات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: يتم الحصول على 3-4 ميكروغرام بشكل عام في كسر الإلتواء (E). هذا يعتمد أساسا على الظروف التي تم اختبارها.

9. تحليل تنقية MS2-تقارب من قبل لطخة الشمالية36

  1. تمييع 5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي من CE، FT، W كسور و 500 نانوغرام من كسر E في 10 ميكرولتر من المياه فائقة الشراء وتخلط مع 10 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي تحميل العازلة.
  2. حضانة 3 دقائق عند 90 درجة مئوية.
  3. تحميل عينات في آبار هلام agarose 1٪ تكملها مع 20 mM من ثيوسيانات جوانيديوم وتشغيل هلام في 100-150 الخامس في TBE 1x العازلة في 4 درجة مئوية. اقرأ كونتز (2013)37 لمزيد من التفاصيل.
  4. نقل RNAs على غشاء النيتروسليلوز عن طريق نقل فراغ لنقل 1h أو الشعيرات الدموية بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: أسلوب الشعيرات الدموية أكثر فعالية ل RNAs كبيرة.
  5. الأشعة فوق البنفسجية عبر الارتباط RNAs على الغشاء (120 mJ في 254 نانومتر) باستخدام وصلة عرضية فوق البنفسجية.
  6. أدخل الغشاء في زجاجة تهجين مع الجانب الجيش الملكي النيبالي التي تواجه ما يصل.
  7. إضافة 10-20 مل من محلول التهجين مسخن. حضانة 30 دقيقة في 68 درجة مئوية.
  8. تجاهل الحل وإضافة 10-20 مل من محلول التهجين الطازجة تكملها 1 ميكرولتر من المسبار الخاص ب SRNA. حضانة بين عشية وضحاها في 68 °C.
    ملاحظة: يتم توليف مسبار الحمض النووي الريبي المسمى DIG باستخدام مجموعة وضع العلامات DIG RNA واتباع تعليمات الشركة المصنعة. بدلا من ذلك، يمكن استخدام مسبار معبز إشعاعي.
  9. غسل الغشاء مع 10-20 مل من محلول الغسيل 1 (2x SSC و 0.1٪ SDS) لمدة 5 دقائق عند 20 درجة مئوية. كرر مرة واحدة.
  10. غسل الغشاء مع 10-20 مل من محلول الغسيل 2 (0.2x SSC و 0.1٪ SDS) لمدة 15 دقيقة عند 68 درجة مئوية. كرر مرة واحدة.
  11. احتضان مع 10-20 مل من حل حجب لمدة 30 دقيقة على الأقل في 20 درجة مئوية.
  12. تجاهل الحل وإضافة 10-20 مل من حل حظر تستكمل مع الأجسام المضادة للديجوكسيجينين متعدد النسيلة (1/1000)، المقترنة فوسفاتاز القلوية. حضانة 30 دقيقة في 20 درجة مئوية.
  13. غسل الغشاء مع 10-20 مل من محلول الغسيل 3 (1x حمض ماليك و 0.3٪ توين 20) لمدة 15 دقيقة في 20 درجة مئوية. كرر مرة واحدة.
  14. احتضان الغشاء مع 10-20 مل من حل الكشف (0.1 M تريس HCl و 0.1 M NaCl pH 9.5) 5 دقيقة في 20 درجة مئوية.
  15. وضع الغشاء على فيلم من البلاستيك ونقع مع الركيزة (انظر جدول المواد). احتضان 5 دقائق في الظلام.
  16. ختم الغشاء في فيلم من البلاستيك. ضع الغشاء في كاسيت الأشعة الذاتية.
  17. يعرض الغشاء لفيلم الأشعة الذاتية في الغرفة المظلمة المخصصة.
    ملاحظة: يعتمد وقت العرض على قوة الإشارة، من بضع ثوان إلى دقائق.
  18. الكشف عن الفيلم المكشوف في جهاز تطوير تلقائي.

10. إعداد العينات لتسلسل الحمض النووي الريبي

ملاحظة: هذه الخطوة فقط تتعلق RNAs المستخرجة من الكسور E و CE.

  1. إضافة إلى كل عينة 10 ميكرولتر من 10x DNase العازلة وDNase I (1 U / ميكروغرام من RNAs المعالجة). أضف الماء لحجم نهائي قدره 100 ميكرولتر.
  2. حضانة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  3. استخراج وتنقية RNAs كما هو موضح سابقا (الخطوات 8.2 إلى 8.11).
  4. Resuspend بيليه الجيش الملكي النيبالي في 20 ميكرولتر من المياه فائقة الشراء.
    ملاحظة: يمكن التحقق من وجود الحمض النووي المتبقي باستخدام PCR ومبرمجات محددة (على سبيل المثال، جين 16S).
  5. تقييم كمية الحمض النووي الريبي وجودته باستخدام نظام تحليل الكهروفلوريس القائم على microfluidics (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: يتم الحصول على 1 ميكروغرام عموما في كسر الغضوء (ه) بعد العلاج DNase.
  6. إزالة الحمض النووي الريبي الريبوسومي مع عدة استنفاد الحمض النووي الريبي البكتيرية.
    ملاحظة: تميل RNAs كبيرة وفيرة (أي rRNAs) إلى التفاعل بشكل غير محدد مع عمود التقارب. مطلوب 500 نانوغرام من الحمض النووي الريبي المستخرج لأداء هذه الخطوة.
  7. مرة أخرى تقييم كمية الحمض النووي الريبي وجودته باستخدام نظام تحليل الكهروفلوريس القائم على microfluidics.
  8. إعداد مكتبات cDNA مع 10-20 نانوغرام من الحمض النووي الريبي ريبودكالد باستخدام مجموعة إعداد مكتبة cDNA واتباع تعليمات الشركة المصنعة.
  9. تسلسل المكتبات التي تم الحصول عليها باستخدام أداة التسلسل (على سبيل المثال، طرف واحد، 150 نقطة أساس؛ انظر جدول المواد).
    ملاحظة: 5-10 مليون قراءة لكل عينة كافية بشكل عام.

11. تحليل البيانات RNAseq (الشكل 2)

  1. تحميل ملفات تسلسل FastQ من النظام الأساسي التسلسل.
  2. الوصول إلى مثيل المجرة من محطة روسكوف البيولوجية(https://galaxy.sb-roscoff.fr/)وتسجيل الدخول.
    ملاحظة: يمكن العثور على كل خوارزمية المذكورة بسهولة باستخدام شريط البحث. يتم توفير دليل المستخدم لكل أداة.
    تنبيه: قد يختلف إصدار الأدوات المطلوبة عن خادم Galaxy38العام.
  3. انقر على الحصول على رمز البيانات ومن ثم تحميل ملف من جهاز الكمبيوتر الخاص بك. تحميل FastQ ملف التسلسل من كل عنصر تحكم MS2 وعينات MS2-sRNA. تحميل أيضا ملف الجينوم مرجع FASTA وملف الشرح GFF.
  4. تشغيل FastQC قراءة تقارير الجودة (غالاكسي الإصدار 0.69).
    ملاحظة: توفر هذه الأداة تقييم جودة التسلسلات الخام (على سبيل المثال، نقاط الجودة، وجود تسلسلات المحول).
  5. تشغيل أداة تشذيب قراءة مرنة Trimmomatic (Galaxy Version 0.36.6) لإزالة تسلسلات المحولات والقراءات ذات الجودة الرديئة بشكل ملحوظ. الإشارة إلى تسلسلات المحول المستخدمة لإعداد المكتبة (على سبيل المثال، TruSeq 3، أحادية النهاية). إضافة العمليات Trimmomatic التالية: SLIDINGWINDOW (عدد القواعد = 4; متوسط الجودة = 20) وMINLEN (الحد الأدنى لطول القراءة = 20).
  6. تشغيل تقارير جودة قراءة FastQC مرة أخرى (الإصدار 0.69 غالاكسي).
  7. تشغيل Bowtie2 - يقرأ الخريطة ضد الجينوم المرجعي (غالاكسي الإصدار 2.3.2.2). استخدم ملف GENOME REFERENCE FASTA من التاريخ لتعيين القراءات مع الإعدادات الافتراضية (محلية حساسة جدا).
    ملاحظة: يمكن تصور ملف BAM الذي تم إنشاؤه بواسطة أداة Bowtie2 باستخدام عارض الجينوم التكاملي (IGV). كما سيطلب ملف BAI المقترن.
  8. اختياريا، تشغيل Flagstat الذي يجمع إحصائيات مجموعة بيانات BAM (الإصدار 2.0 غالاكسي).
  9. تشغيل htseq-count - عدد (الإصدار غالاكسي 0.6.1) الذي محاذاة يقرأ ميزات متداخلة في ملف التعليق التوضيحي GFF. استخدم وضع التقاطع (غير فارغ).
  10. أرشفة كافة ملفات التهم الخام من تحليل عدد htseq في ملف Zip واحد.
  11. تشغيل SARTools DESeq2 لمقارنة البيانات (غالاكسي الإصدار 1.6.3.0). توفير ملف Zip الذي يحتوي على ملفات تعداد أولية وملف التصميم، وهو ملف محدد علامة تبويب يصف التجربة. اتبع بعناية الإرشادات المقدمة لإنشاء ملف التصميم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

النتائج التمثيلية تنشأ من دراسة RsaC targetome في S. أوريوس29. RsaC هو غير تقليدية 1116 NT طويلة SRNA. نهاية 5 'يحتوي على عدة مناطق متكررة في حين أن نهاية 3 '(544 NT) مستقلة هيكليا ويحتوي على جميع مواقع التفاعل المتوقعة مع أهدافها مرنا. يتم تحريض التعبير عن هذا الحمض النووي الريبي عندما المنغنيز (Mn) نادرة، والتي غالبا ما تواجه في سياق الاستجابة المناعية المضيف. باستخدام تكنولوجيا MAPS، حددنا العديد من mRNAs التفاعل مباشرة مع RsaC، والكشف عن دورها الحاسم في الإجهاد التأكسدي(سودا، ldh1 وسارا)والمعادن ذات الصلة (znuBC-zur وsufCDSUB) الردود.

التحقق من صحة بناء MS2-sRNA والظروف التجريبية
قبل إجراء تجارب MAPS ، من المهم تحديد الظروف المثلى للتعبير عن الحمض النووي الريبي المدروس. إذا تم استخدام مروج غير أصلي ، فسيساعد بشكل نهائي في إنتاج بناء MS2-sRNA عندما تكون أهدافه موجودة. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي التحقق بعناية من بناء MS2-sRNA فيما يتعلق بالحجم والاستقرار والتعبير والوظيفة. تم دمج aptamer MS2 إلى نهاية 5 'إما RsaC كامل الطول (MS2-RsaC1116)أو النموذج الأقصر (MS2-RsaC544)المقابل للجزء 3 'من RsaC. وأعرب عن كل من البنى في الجسم الحي تحت سيطرة النصاب القانوني الاستشعار تعتمد P3 المروج في S. أوريوس HG001 ΔrsaC. حذف الجينات rsaC يتجنب المنافسة بين RsaC الذاتية وMS2-RsaC. تم استخدام سلالة البرية التي تحتوي على نفس المتجه مع علامة MS2 وحدها كعنصر تحكم. يسمح عنصر التحكم هذا بطرح تفاعلات غير محددة تحدث مع علامة MS2.

لتأكيد البنى وتصور نمط التعبير، تم حصاد الخلايا البكتيرية بعد 2 ساعة و 4 ساعة و 6 ساعة من النمو في المتوسط BHI عند 37 درجة مئوية. بعد استخراج الحمض النووي الريبي، تم إجراء تحليل لطخة الشمالية باستخدام مسبار DIG RsaC محددة (الشكل 3A). ارتفع مستوى RsaC الذاتية (الممرات 1-3) بشكل كبير بعد 6 ساعة من النمو ، مما يبرر اختيار هذه النقطة الزمنية لتجارب MAPS. والأهم من ذلك أن مستويات MS2-RsaC544 (الممرات 7-9) وMS2-RsaC1116 (الممرات 10-12) كانت مماثلة ل RsaC الذاتية عند 6 ساعة. وبالتالي ، ينبغي أن تحاكي نمط التعبير الداخلي من RsaC. شكل أكبر ولكن طفيفة من RsaC كان مميزا ويمكن أن يكون بسبب نهاية غير فعالة للنسخ. ويلاحظ في كثير من الأحيان هذه الظاهرة عندما يتم التعبير عن MS2-sRNA تحت سيطرة مروج قوي منplasmid 21. ولم تلاحظ أية استمارات أقصر ناتجة عن إنهاء النسخ المنحرف أو تدهوره.

إضافة APTAMER MS2 في 5 'من sRNAs يمكن أيضا تعطيل للطي السليم وتؤثر على وظائفهم. هذه الخطوة حاسمة بالنسبة ل sRNAs عالية التنظيم مثل RsaC. ومن ثم ينبغي اختبار نشاط MS2-sRNA ومقارنتها مع الحمض النووي الريبي الداخلي عندما يكون ذلك ممكنا. يمكن أن يساعد الهدف المعروف سابقا أو النمط الظاهري الملاحظ في مراقبته. على سبيل المثال، تم استخدام تأثير RsaC على تراكم ROS داخل الخلايا للتحقق من صحة MS2-RsaC544 وMS2-RsaC1,116 يبني29.

تحليل الكسور التي تم جمعها أثناء تنقية التقارب
تم استخراج RNAs من CE، FT و E كسور في سلالة WT التعبير عن علامة MS2 وحدها وسلالةRSAC التعبير عن MS2-RsaC544 بناء. أظهرنا باستخدام تحليل لطخة الشمالية أن 1,116 NT طويلة RsaC الذاتية تم إثراء في كسر elution ولكن تبين أن تتفاعل بشكل غير محدد مع عمود تقارب(الشكل 3B, حارات 2-3). لاحظنا نفس الظاهرة مع MS2-RsaC1,116 (البيانات غير مبينة). ويرجع ذلك بالتأكيد إلى طوله وبنيته الثانوية المعقدة. لذلك ، تم استخدام نموذج أقل تنظيما وأقصر (544 nt) من RsaC المقابل لجزءه 3 لإجراء تجارب MAPS. في الشكل 3B، تم إثراء MS2-RsaC544 بشكل كبير في كسر elution مما يدل على أنه تم الاحتفاظ به بنجاح من قبل بروتين الاندماج MS2-MBP (lane 6). لوحظ شكل أكبر ولكنه بسيط من MS2-RsaC544 كما هو الحال في الشكل 3A. هنا، يمكن تعديل الصرامة وعدد الغسيل إما للحد من الربط غير المحدد أو، على العكس من ذلك، للحد من فقدان الشركاء التفاعل الحقيقي.

التحقق من أهداف الحمض النووي الريبي المفترضة بعد تحليل MAPS
بعد التحليل المعلوماتي الحيوي، يتم سرد أهداف الحمض النووي الريبي المفترضة وفقا للتغيير أضعاف بين MS2-SRNA وMS2 السيطرة، التي تم الحصول عليها باستخدام DeSeq2 (الشكل 2). على سبيل المثال، MS2-RsaC544 MAPS البيانات29 اقترح أن sodA مرنا، الترميز لdismutase أكسيد فائق في S. أوريوس،هو الهدف الرئيسي (أفضل ضرب، أعلى أضعاف التغيير). تحليل لطخة الشمالية، التي أجريت مع التحقيق DIG sodAمحددة بعد تنقية MS2-تقارب، ويبين أن سودا كان بكفاءة شارك في إثراء مع MS2-RsaC544 مقارنة مع التحكم MS2 (الشكل 3C).

يتم إجراء تحليل نسخ عالمي بشكل منهجي على كسر CE. تساعد مقارنة بيانات MAPS وهذا التحليل النسخي على ضبط نسبة الإثراء وتكشف عن تسلسل هرمي مستهدف محتمل. في الواقع ، فإن الحمض النووي الريبي الضعيف التعبير ، والذي يتم إثراءه للغاية بعد تنقية MS2 -affinity له بالتأكيد تقارب ملزم أكبر من الحمض النووي الريبي عالي الإثراء والتعبير عنه.

من المهم ملاحظة أنه يجب التحقق من صحة جميع المرشحين الذين تم تحديدهم من قبل MAPS بشكل فردي باستخدام تجارب المختبر و / أو في الجسم الحي مثل مقايسات التحول الحركي الكهربائي (EMSA) أو المقايسات الجينية للمراسل (انظر Jagodnik وآخرون (2017)39 لمزيد من التفاصيل).

Figure 1
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 رسم تخطيطي لبروتوكول MAPS مكيف مع S. aureus. من بناء البلازميد إلى تحليل البيانات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم سير عمل تحليل MAPS والبيانات المعالجة. يتم تمثيل كل خطوة ونقطة تحقق وتنسيق ملف (انظر أيضا الخطوة 11). تنسيق FastQ هو ملف نصي يتكون من تسلسل الحمض النووي ودرجات الجودة المقابلة. تنسيق BAM هو ملف مضغوط يحتوي على تسلسلات محاذاة. التنسيق الجدولي هو ملف نصي محدد بعلامات جدولة مع عدد لكل جين. يوضح مخطط النتائج نوع البيانات التي تم الحصول عليها بعد التحليل المعلوماتي الحيوي. النتائج المعروضة وهمية ولا تنشأ من أي دراسة. لمزيد من التفاصيل، تتوفر الدروس الأساسية على موقع مشروع غالاكسي (https://galaxyproject.org/). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: إنشاءات التحقق من الصحة وضوابط MAPS. A.تحليل لطخة الشمالية من RSAC sRNA الذاتية وبنى MS2 ذات الصلة. WT سلالة يحمل pCN51-P3-MS2 (السيطرة) و ΔrsaC سلالة متحولة تحمل إما pCN51-P3-MS2، pCN51-P3-MS2-RsaC544 أو pCN51-P3-MS2-RsaC1,116. أخذت عينات بعد 2 ساعة و 4 ساعة و 6 ساعة من النمو في BHI عند 37 درجة مئوية. تم إجراء المقايسات لطخة الشمالية باستخدام مسبار DIG RsaC محددة. B.تحليل لطخة الشمالية من MS2-تقارب تنقية الكسور باستخدام مسبار DIG RsaC محددة. تم تنفيذ التطهير المشترك باستخدام سلالة WT + pCN51-P3-MS2 (التحكم)وسلالة متحولة RSAC + pCN51-P3-MS2-RsaC544. تم حصاد الخلايا بعد 6 ساعة من النمو في BHI عند 37 درجة مئوية. استخراج النفط الخام (CE)، التدفق من خلال (FT)، elution (E). C. تحليل لطخة الشمالية من MS2-تقارب تنقية كسور (CE و E) باستخدام مسبار DIG sodAمحددة. انظر (ب) للحصول على التفاصيل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

حمض الريبونوكلييك (RNA) نوع مرجع
الإشريكية القولونية
ريهب سرنا لالاونة وآخرون (2015)21
ريبب سرنا لالونة وآخرون. (2015) 21
3'ETSليوز جزء مشتق من الحمض النووي الريبي لالاونا وماسي (2015)26
DsrA سرنا لالونة وآخرون. (2015) 22
hns مرنا (5'UTR) لالونة وآخرون. (2015) 22
سيار سرنا لالونة وآخرون. (2018) 23
RprA سرنا لالونة وآخرون. (2018) 23
GcvB سرنا لالونة وآخرون. (2019) 24
السالمونيلا تيفيموريوم
SraL سرنا سيلفا وآخرون. (2019) 25
المكورات العنقودية أوريوس
RsaA سرنا توماسيني وآخرون. (2017) 27
RsaC سرنا لالونة وآخرون. (2019) 29
RsaI سرنا برونسكي وآخرون. (2019) 28

الجدول 1 - الجداول وكشفت تكنولوجيا MAPS عن الهدف من العديد من الرنانات في مختلف الكائنات الحية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بروتوكول معدل للبكتيريا إيجابية الغرام
تم تطوير البروتوكول الأولي لل MAPS لدراسة تفاعل الحمض النووي الريبي في الكائن الحي النموذجي E. coli20،30. هنا، ونحن نصف بروتوكول المعدلة التي هي مناسبة لتوصيف الشبكات التنظيمية التي تعتمد على الحمض النووي الريبي في مسببات الأمراض البشرية الانتهازية S. أوريوس وبالتأكيد يمكن نقلها إلى البكتيريا الأخرى إيجابية غرام، المسببة للأمراض أم لا.

وأولي اهتمام خاص لخطوة تحلل الخلية. تم استبدال الصحافة الفرنسية بأداة تحلل الخلايا الميكانيكية. هذه الطريقة فعالة لكسر الخلايا إيجابية الغرام والحد من المخاطر المرتبطة بالتعامل مع السلالات المسببة للأمراض. لتحسين العائد من تنقية MS2-affinity، تم زيادة كمية MS2-MBP شلت على راتنج اميلوز بشكل كبير. وقد تطلب هذا لضبط stringency وعدد من يغسل.

على عكس البروتوكول الأولي ، يتم تنفيذ MAPS هنا في تكرار ، من نسختين بيولوجيتين. تم تطوير سير عمل لتنفيذ التحليل الإحصائي(الشكل 2)،مما يزيد بشكل نهائي من قوة البيانات التي تم الحصول عليها.

بناء MS2 وتعبيره
تم إنشاء بروتوكول MAPS هذا لتحديد الهدف من sRNAs المكورات العنقودية. ويعبر عن بناء MS2-sRNA من البلازميد منخفض النسخ (pCN51، 20 إلى 25 نسخة / خلية) وتحت سيطرة المروج P3 التابع لاستشعار النصاب القانوني، الذي يتم تحريضه بشكل رئيسي خلال المرحلة الثابتة. هذا النمط التعبير يتوافق مع sRNAs درس في S. أوريوس (أي RsaA، RsaI و RsaC) ويضمن توليف MS2-sRNA قوية نوعا ما. ومع ذلك ، لا يمكننا استبعاد أنه في حالات أخرى ، قد لا يكون مروج P3 مناسبا ولا يعكس الحالة الفسيولوجية الطبيعية للبكتيريا عندما يتم تحريض الحمض النووي الريبي. وهناك طريقة أخرى للسيطرة على إنتاج MS2-sRNA هي استخدام المروجين غير القابلين للاختزال كيميائيا (على سبيل المثال، المروجين غير القابلين للانزدحام بالتتراسيكلين). تسمح هذه الأدوات بتعبير نبضي عن بناء MS2-sRNA ، ولكن هذا الإعداد لا يضمن أن أهداف الحمض النووي الريبي سيتم التعبير عنها بتزامن. عيب آخر هو أن التعبير من البلازميد يمكن أن يؤدي إلى الإفراط في إنتاج الحمض النووي الريبي المدروس ، بل وأكثر التأكيد مع ناقلات عدد النسخ العالية. قد يؤدي هذا إلى تفاعلات يدوية أو تعطيل وظائف مرافق الحمض النووي الريبي المرتبطة به. البديل الأنسب هو إدراج علامة MS2 في نهاية 5 'من الجين الحمض النووي الريبي الذاتية. وهكذا، فإن MS2-sRNA تكون مشفرة كروموسوميا وتحت سيطرة المروج الأصلي. هذا ينبغي أن تحاكي بشكل أفضل التعبير الذاتية من درس الحمض النووي الريبي وتجنب التحيز بسبب الإفراط في إنتاج الحمض النووي الريبي درس. على أي حال، فإن الخطوة الحاسمة هي التحقق بعناية من طول واستقرار ووظائف بناء MS2-sRNA، لا سيما باستخدام المقايسات لطخة الشمالية مع إجمالي الحمض النووي الريبي المستخرجة من الثقافات التي تزرع في ظل الظروف التي تؤدي إلى إنتاج الحمض النووي الريبي الذاتية وظيفة. لا يمكن إنكار أن استخدام بناء MS2-sRNA غير صحيح / غير وظيفي يمكن أن يؤثر بشكل كبير على النتائج الناتجة ، مما يدعم أهمية الضوابط الموصوفة أعلاه. وأخيرا، يتم إنتاج MS2-sRNA دائما في خلفيةالجيش الملكي النيبالي لتعظيم إثراء أهداف مرنا. وعلاوة على ذلك، يمكن إجراء تجارب في سلالات المضيف مع طفرات محددة في RNases (على سبيل المثال، المسوخ الحذف أو المسوخ الحساسة لدرجة الحرارة) لتجنب أهداف مرنا تدهور عن طريق تجنيد RNases تعتمد على الحمض النووي الريبي.

لا يزال التحقق التجريبي من المرشحين الذين حددتهم MAPS مطلوبا
نقطة واحدة التي تحتاج إلى النظر فيها هو أن MAPS يوفر قائمة من الأهداف المفترضة الجيش الملكي النيبالي. ومع ذلك، قد يتم إثراء بعض الحمض النووي الريبي بشكل غير مباشر عن طريق التفاعل مع هدف الحمض النووي الريبي المشترك أو بروتين ملزم الحمض النووي الريبي. وبالتالي، يجب تأكيد المرشحين الذين تم الكشف عنهم من خلال نهج تجريبية أخرى. وتستخدم عادة EMSA والتجارب البصمة لتصور الربط المباشر للجيش الملكي النيبالي لأهداف الحمض النووي الريبي المفترضة في المختبر. ثم تساعد فحوصات طباعة بصمات الأصابع في المختبر على مراقبة تأثير الحمض النووي الريبي على بدء الترجمة لهدفه من الحمض النووي الريبي. وأخيرا، فإن فحوصات المراسل الشمالي و/أو الجينات(lacZ أو gfp)تكمل هذا التحقق التجريبي في الجسم الحي. كل هذه المناهج موصوفة في جاغودنيك وآخرون (2017)39.

على عكس تقنيات RIL-seq و CLASH ، لا توفر MAPS معلومات مباشرة عن مواقع التفاعل. ومع ذلك، لوحظت في كثير من الأحيان ذروة قراءات مخططة في منطقة محظورة من الهدف الجيش الملكي النيبالي (على سبيل المثال، 3' نهاية glyW-cysT-leuZ operon21)،مما يسهل تحديد موقع الاقتران. بدلا من ذلك، يمكن استخدام العديد من أدوات التنبؤ للتنبؤ بموقع الربط المفترض على الهدف المحدد مثل IntaRNA40.

MAPS يدقق في الهدف من sRNA معينة
MAPS التكنولوجيا مناسبة لدراسة الهدف الحمض النووي الريبي في البكتيريا السلبية غرام مثل القولونية وS. تيفيموريوم, ولكن أيضا الآن مع هذا البروتوكول المعدل في البكتيريا إيجابية الغرام مثل S. أوريوس. في الأساس ، MAPS يقدم لقطة من RNA : sRNA دوبلس شكلت في وقت معين وفي ظروف نمو محددة. لسوء الحظ، قائمة أهداف الجيش الملكي النيبالي يمكن أن تكون غير مكتملة. على سبيل المثال، يمكن أن يغيب عن الهدف مرنا cognate بسبب ظروف تجريبية غير ملائمة، مما يبرر الاحتياطات المذكورة أعلاه.

بالمقارنة مع غيرها من الأساليب الشائعة الاستخدام مثل RIL-seq أو CLASH ، يستخدم MAPS RNA محددة للمساعدة في تنقية جميع أهداف الحمض النووي الريبي المتفاعلة. هنا ، لا يتم تخفيف تفاعل الحمض النووي الريبي بين الدوبلس الأخرى المرتبطة ب RBP ، مما يسمح نظريا بتوصيف targetome بشكل أعمق. ومع ذلك، يبدو أن أساليب RIL-seq/CLASH و MAPS كشفت عن مجموعات مختلفة من أهداف الحمض النووي الريبيالمفترضة 12،41، مما يشير إلى أن هذه النهج التجريبية مكملة. ويمكن تفسير هذا التباين بالاختلافات في ظروف النمو و/أو التحيز الناجم عن كل طريقة.

وبناء على ذلك، ينبغي أن يؤثر الغرض من الدراسة على اختيار الطريقة. لإجراء تحليل عالمي للهدفات SRNA وعندما تشارك RBP في التنظيم بوساطة الجيش الملكي النيبالي، ينبغي تفضيل أساليب RIL-seq و CLASH. ويقدم كلا النهجين نظرة عامة على الشبكات التنظيمية التي تعتمد على برنامج تشغيلي معين، وبالتالي يكشفان عن طائفة واسعة من الممارسات المتعلقة بالرنانات الريبية والأهداف المرتبطة بها. بل على العكس من ذلك، بالنسبة لدراسة الحمض النووي الريبي المحدد أو عندما لا يكون هناك أي RBP معروف / المعنية، MAPS يمثل خيارا مناسبا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل "وكالة الأنباء الوطنية للريتشرش" (ANR، غرانت ANR-16-CE11-0007-01، RIBOSTAPH، و ANR-18-CE12-0025-04، كونوكو، للعلاقات العامة). كما تم نشره في إطار labEx NetRNA ANR-10-LABX-0036 و ANR-17-EURE-0023 (للعلاقات العامة) ، كتمويل من الدولة التي تديرها ANR كجزء من الاستثمارات للبرنامج المستقبلي. تم دعم DL من قبل برنامج أبحاث وابتكار أفق 2020 التابع للاتحاد الأوروبي بموجب اتفاقية منحة ماري سكلودوسكا كوري رقم 753137-SaRNAReg. وقد تم دعم العمل في مختبر E. Massé من خلال المنح التشغيلية من المعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR) ، ومجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة الكندي (NSERC) ، والمعاهد الوطنية للصحة NIH فريق منحة R01 GM092830-06A1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Sarstedt 72.690.001
15 mL centrifuge tubes Falcon 352070
2 mL microcentrifuge tube Starstedt 72.691
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent G2939BA RNA quantity and quality
250 mL culture flask Dominique Dutscher 2515074 Bacterial cultures
50 mL centrifuge tubes Falcon 352051 Culture centrifugation
Absolute ethanol VWR Chemicals 20821.321 RNA extraction and purification
Allegra X-12R Centrifuge Beckman Coulter Bacterial pelleting
Ampicilin (amp) Sigma-Aldrich A9518-5G Growth medium
Amylose resin New England BioLabs E8021S MS2-affinity purification
Anti-dioxigenin AP Fab fragment Sigma Aldrich 11093274910 Northern blot assays
Autoradiography cassette ThermoFisher Scientific 50-212-726 Northern blot assays
BamHI ThermoFisher Scientific ER0051 Plasmid construction
BHI (Brain Heart Infusion) Broth Sigma-Aldrich 53286 Growth medium
Blocking reagent Sigma Aldrich 11096176001 Northern blot assays
CDP-Star Sigma Aldrich 11759051001 Northern blot assays (substrate)
Centrifuge 5415 R Eppendorf RNA extraction and purification
Chloroform Dominique Dutscher 508320-CER RNA extraction and purification
DIG-RNA labelling mix Sigma-Aldrich 11277073910 Northern blot assays
DNase I Roche 4716728001 DNase treatment
Erythromycin (ery) Sigma-Aldrich Fluka 45673 Growth medium
FastPrep device MP Biomedicals 116004500 Mechanical lysis
Guanidium Thiocyanate Sigma-Aldrich G9277-250G Northern blot assays
Hybridization Hoven Hybrigene Techne FHB4DD Northern blot assays
Hybridization tubes Techne FHB16 Northern blot assays
Isoamyl alcohol Fisher Scientific A/6960/08 RNA extraction and purification
LB (Lysogeny Broth) Sigma-Aldrich L3022 Growth medium
Lysing Matrix B Bulk MP Biomedicals 6540-428 Mechanical lysis
MicroPulser Electroporator BioRad 1652100 Plasmid construction
Milli-Q water device Millipore Z00QSV0WW Ultrapure water
NanoDrop spectrophotometer ThermoFisher Scientific RNA/DNA quantity and quality
Nitrocellulose membrane Dominique Dutsher 10600002 Northern blot assays
Phembact Neutre PHEM Technologies BAC03-5-11205 Cleaning and decontamination
Phenol Carl Roth 38.2 RNA extraction and purification
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530 Plasmid construction
pMBP-MS2 Addgene 65104 MS2-MBP production
Poly-Prep chromatography column BioRad 7311550 MS2-affinity purification
PstI ThermoFisher Scientific ER0615 Plasmid construction
Qubit 3 Fluorometer Invitrogen 15387293 RNA quantity
RNAPro Solution MP Biomedicals 6055050 Mechanical lysis
ScriptSeq Complete Kit Illumina BB1224 Preparation of cDNA librairies
Spectrophotometer Genesys 20 ThermoFisher Scientific 11972278 Bacterial cultures
SpeedVac Savant vacuum device ThermoFisher Scientific DNA120 RNA extraction and purification
Stratalinker UV Crosslinker 1800 Stratagene 400672 Northern blot assays
T4 DNA ligase ThermoFisher Scientific EL0014 Plasmid construction
TBE (Tris-Borate-EDTA) Euromedex ET020-C Northern blot assays
ThermalCycler T100 BioRad 1861096 Plasmid construction
Tween 20 Sigma Aldrich P9416-100ML Northern blot assays
X-ray film processor hu.q HQ-350XT Northern blot assays
X-ray films Super RX-N FujiFilm 4741019318 Northern blot assays

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carrier, M. C., Lalaouna, D., Masse, E. Broadening the Definition of Bacterial Small RNAs: Characteristics and Mechanisms of Action. Annual Review of Microbiology. 72, 141-161 (2018).
  2. Hör, J., Matera, G., Vogel, J., Gottesman, S., Storz, G. Trans-Acting Small RNAs and Their Effects on Gene Expression in Escherichia coli and Salmonella enterica. EcoSal Plus. 9 (1), (2020).
  3. Desgranges, E., Marzi, S., Moreau, K., Romby, P., Caldelari, I. Noncoding RNA. Microbiology Spectrum. 7 (2), (2019).
  4. Adams, P. P., Storz, G. Prevalence of small base-pairing RNAs derived from diverse genomic loci. Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (7), 194524 (2020).
  5. Pain, A., et al. An assessment of bacterial small RNA target prediction programs. RNA Biology. 12 (5), 509-513 (2015).
  6. Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S., Lalaouna, D. Navigation through the twists and turns of RNA sequencing technologies: Application to bacterial regulatory RNAs. Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. , 194506 (2020).
  7. Wright, P. R., et al. CopraRNA and IntaRNA: predicting small RNA targets, networks and interaction domains. Nucleic Acids Research. 42, Web Server issue 119-123 (2014).
  8. Smirnov, A., Schneider, C., Hor, J., Vogel, J. Discovery of new RNA classes and global RNA-binding proteins. Current Opinion in Microbiology. 39, 152-160 (2017).
  9. Saliba, A. E., Santos, S., Vogel, J. New RNA-seq approaches for the study of bacterial pathogens. Current Opinion in Microbiology. 35, 78-87 (2017).
  10. Melamed, S., Adams, P. P., Zhang, A., Zhang, H., Storz, G. RNA-RNA Interactomes of ProQ and Hfq Reveal Overlapping and Competing Roles. Molecular Cell. 77 (2), 411-425 (2020).
  11. Melamed, S., et al. Global Mapping of Small RNA-Target Interactions in Bacteria. Molecular Cell. 63 (5), 884-897 (2016).
  12. Iosub, I. A., et al. Hfq CLASH uncovers sRNA-target interaction networks linked to nutrient availability adaptation. Elife. 9, (2020).
  13. Waters, S. A., et al. Small RNA interactome of pathogenic E. revealed through crosslinking of RNase E. The EMBO Journal. 36 (3), 374-387 (2017).
  14. Dos Santos, R. F., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. New molecular interactions broaden the functions of the RNA chaperone Hfq. Current Genetics. , (2019).
  15. Kavita, K., de Mets, F., Gottesman, S. New aspects of RNA-based regulation by Hfq and its partner sRNAs. Current Opinion in Microbiology. 42, 53-61 (2018).
  16. Bohn, C., Rigoulay, C., Bouloc, P. No detectable effect of RNA-binding protein Hfq absence in Staphylococcus aureus. BMC Microbiology. 7, 10 (2007).
  17. Jousselin, A., Metzinger, L., Felden, B. On the facultative requirement of the bacterial RNA chaperone, Hfq. Trends in Microbiology. 17 (9), 399-405 (2009).
  18. Olejniczak, M., Storz, G. ProQ/FinO-domain proteins: another ubiquitous family of RNA matchmakers. Molecular Microbiology. 104 (6), 905-915 (2017).
  19. Lalaouna, D., Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S. Chapter Sixteen - MS2-Affinity Purification Coupled With RNA Sequencing Approach in the Human Pathogen Staphylococcus aureus. Methods in Enzymology. 612, 393-411 (2018).
  20. Lalaouna, D., Prevost, K., Eyraud, A., Masse, E. Identification of unknown RNA partners using MAPS. Methods. 117, 28-34 (2017).
  21. Lalaouna, D., et al. A 3' external transcribed spacer in a tRNA transcript acts as a sponge for small RNAs to prevent transcriptional noise. Molecular Cell. 58 (3), 393-405 (2015).
  22. Lalaouna, D., Morissette, A., Carrier, M. C., Masse, E. DsrA regulatory RNA represses both hns and rbsD mRNAs through distinct mechanisms in Escherichia coli. Molecular Microbiology. 98 (2), 357-369 (2015).
  23. Lalaouna, D., Prevost, K., Laliberte, G., Houe, V., Masse, E. Contrasting silencing mechanisms of the same target mRNA by two regulatory RNAs in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 46 (5), 2600-2612 (2018).
  24. Lalaouna, D., Eyraud, A., Devinck, A., Prevost, K., Masse, E. GcvB small RNA uses two distinct seed regions to regulate an extensive targetome. Molecular Microbiology. 111 (2), 473-486 (2019).
  25. Silva, I. J., et al. SraL sRNA interaction regulates the terminator by preventing premature transcription termination of rho mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3042-3051 (2019).
  26. Lalaouna, D., Masse, E. Identification of sRNA interacting with a transcript of interest using MS2-affinity purification coupled with RNA sequencing (MAPS) technology. Genomics Data. 5, 136-138 (2015).
  27. Tomasini, A., et al. The RNA targetome of Staphylococcus aureus non-coding RNA RsaA: impact on cell surface properties and defense mechanisms. Nucleic Acids Research. 45 (11), 6746-6760 (2017).
  28. Bronesky, D., et al. A multifaceted small RNA modulates gene expression upon glucose limitation in Staphylococcus aureus. The EMBO Journal. 38 (6), (2019).
  29. Lalaouna, D., et al. RsaC sRNA modulates the oxidative stress response of Staphylococcus aureus during manganese starvation. Nucleic Acids Research. 47 (1), 9871-9887 (2019).
  30. Carrier, M. C., Laliberte, G., Masse, E. Identification of New Bacterial Small RNA Targets Using MS2 Affinity Purification Coupled to RNA Sequencing. Methods in Molecular Biology. 1737, 77-88 (2018).
  31. Garibyan, L., Avashia, N. Polymerase chain reaction. Journal of Investigative Dermatology. 133 (3), 1-4 (2013).
  32. Revie, D., Smith, D. W., Yee, T. W. Kinetic analysis for optimization of DNA ligation reactions. Nucleic Acids Research. 16 (21), 10301-10321 (1988).
  33. Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. Introduction of plasmid DNA into cells. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 1 Unit 1.8 (2001).
  34. Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing. Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).
  35. Grosser, M. R., Richardson, A. R. Method for Preparation and Electroporation of S. aureus and S. epidermidis. Methods in Molecular Biology. 1373, 51-57 (2016).
  36. Krumlauf, R. Northern blot analysis. Methods in Molecular Biology. 58, 113-128 (1996).
  37. Koontz, L. Agarose gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 529, 35-45 (2013).
  38. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Reseaerch. 44, 3-10 (2016).
  39. Jagodnik, J., Brosse, A., Le Lam, T. N., Chiaruttini, C., Guillier, M. Mechanistic study of base-pairing small regulatory RNAs in bacteria. Methods. 117, 67-76 (2017).
  40. Mann, M., Wright, P. R., Backofen, R. IntaRNA 2.0: enhanced and customizable prediction of RNA-RNA interactions. Nucleic Acids Res. 45, 435-439 (2017).
  41. Georg, J., et al. The power of cooperation: Experimental and computational approaches in the functional characterization of bacterial sRNAs. Molecular Microbiology. 113 (3), 603-612 (2020).

Tags

التراجع، العدد 168، MAPS، الحمض النووي الريبي التنظيمي، تسلسل الحمض النووي الريبي، تارجتومي، الشبكة التنظيمية، التطهير المشترك، MS2 aptamer، البكتيريا إيجابية الغرام، المكورات العنقودية أوريوس
MS2-تقارب تنقية مقرونة تسلسل الحمض النووي الريبي في البكتيريا إيجابية الغرام
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mercier, N., Prévost, K.,… More

Mercier, N., Prévost, K., Massé, E., Romby, P., Caldelari, I., Lalaouna, D. MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria. J. Vis. Exp. (168), e61731, doi:10.3791/61731 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter