Summary
MAPS-teknologien er udviklet til at undersøge targetomet af et specifikt lovgivningsmæssigt RNA in vivo. Det sRNA af interesse er mærket med en MS2 aptamer gør det muligt co-rensning af sine RNA partnere og deres identifikation ved RNA sekventering. Denne modificerede protokol er særligt velegnet til Gram-positive bakterier.
Abstract
Selv om små regulerende RNA'er (sRNA'er) er udbredt blandt livets bakterielle domæne, forbliver mange af dem dårligt karakteriseret, især på grund af vanskeligheden ved at identificere deres mRNA-mål. Her beskrev vi en modificeret protokol for MS2-Affinity Purification kombineret med RNA-sekventeringsteknologi (MAPS), der sigter mod at afsløre alle RNA-partnere i et specifikt sRNA in vivo. Generelt er MS2-aptameren smeltet sammen til 5's ekstremitet af det sRNA, der er af interesse. Denne konstruktion udtrykkes derefter in vivo, så MS2-sRNA kan interagere med sine cellulære partnere. Efter bakteriel høst lyser cellerne mekanisk. Den rå ekstrakt er indlæst i en amylose-baseret kromatografi kolonne tidligere belagt med MS2 protein smeltet til maltose bindende protein. Dette muliggør specifik registrering af MS2-sRNA og interagerende RNA'er. Efter eluering identificeres co-rensede RNA'er ved højgennemstrømning RNA-sekventering og efterfølgende bioinformatatisk analyse. Følgende protokol er implementeret i gram-positive menneskelige patogen Staphylococcus aureus og er i princippet kan overføres til enhver Gram-positive bakterier. Kortteknologi er kortteknologien en effektiv metode til at udforske det regulerende netværk af et bestemt sRNA og give et øjebliksbillede af hele målgruppen. Det er dog vigtigt at huske på, at de formodede mål, der er identificeret af MAPS, stadig skal valideres ved hjælp af supplerende eksperimentelle tilgange.
Introduction
Hundreder, måske endda tusinder af små regulerende RNA'er (sRNA'er) er blevet identificeret i de fleste bakterielle genomer, men funktionerne hos langt de fleste af dem forbliver ukarakteriserede. Samlet set sRNA'er er korte ikke-kodning molekyler, spiller store roller i bakteriel fysiologi og tilpasning til svingende miljøer1,2,3. Faktisk er disse makromolekyler i centrum for mange indviklede regulerende netværk, der påvirker metaboliske veje, stressresponser, men også virulens og antibiotikaresistens. Logisk set udløses deres syntese af specifikke miljøstimuli (f.eks. næringsstofsultning, oxidativ eller membranbelastning). De fleste SRNA'er regulerer flere mål mRNA'er på post-transskriptionsniveau gennem kort og ikke-sammenhængende baseparring. De forhindrer normalt, at oversættelsen påbegyndes ved at konkurrere med ribosomer om oversættelsesinitieringsområder4. Dannelsen af sRNA:mRNA duplexes resulterer også ofte i aktiv nedbrydning af mål mRNA ved rekruttering af specifikke RNases.
Karakteriseringen af en sRNA-targetome (dvs. hele sættet af dets mål-RNA'er) gør det muligt at identificere de metaboliske veje, hvor det griber ind, og det potentielle signal, det besvarer. Derfor kan funktionerne i et specifikt sRNA generelt udledes af dets targetome. Til dette formål er der udviklet flere i silicoforudsigelsesværktøjer som IntaRNA og CopraRNA5,6,7. De er især afhængige af sekvens komplementaritet, parring energi og tilgængelighed af den potentielle interaktion site til at bestemme formodede sRNA partnere. Forudsigelsesalgoritmer integrerer dog ikke alle faktorer, der påvirker baseparring in vivo, såsom inddragelse af RNA-chaperoner8, der favoriserer suboptimale interaktioner eller begge partneres fælles udtryk. På grund af deres iboende begrænsninger forbliver de falske positive forudsigelsesværktøjer høje. De fleste eksperimentelle storstilede tilgange er baseret på co-rensning af sRNA:mRNA par interagerer med en mærket RNA bindende protein (RBP)6,9. For eksempel identificerede RNA Interaction by Ligation and sekventering (RIL-seq) metoden RNA duplexes co-renset med RNA chaperoner som Hfq og ProQ i Escherichia coli10,11. En lignende teknologi kaldet UV-Crosslinking, Ligation og sekventering af hybrider (CLASH) blev anvendt på RNase E- og Hfq-associerede SRNA'er i E. coli12,13. På trods af de velbeskrevne roller Hfq og ProQ i sRNA-medieret regulering i flere bakterier8,14,15, synes sRNA-baseret regulering at være RNA-chaperone-uafhængig i flere organismer som S. aureus16,17,18. Selv om rensning af RNA-duplexer i samarbejde med RNases er mulig, som det fremgår af Waters og kolleger13, forbliver dette vanskeligt, da RNases udløser deres hurtige nedbrydning. Derfor udgør MS2-Affinity Purification kombineret med RNA-sekventering (MAPS) tilgang19,20 et solidt alternativ i sådanne organismer.
I modsætning til ovennævnte metoder bruger MAPS et specifikt sRNA som lokkemad til at fange alle interagerende RNA'er og er derfor ikke afhængig af inddragelsen af en RBP. Hele processen er afbildet i figur 1. Kort sagt, er sRNA mærket på 5 'med MS2 RNA aptamer, der er specielt anerkendt af MS2 pels protein. Dette protein er smeltet sammen med maltose bindende protein (MBP), der skal immobiliseres på en amylose harpiks. Derfor bevares MS2-sRNA og dets RNA-partnere på affinitetskromatografikolonnen. Efter elitær med maltose identificeres co-rensede RNA'er ved hjælp af højgennemstrømnings-RNA-sekventering efterfulgt af bioinformatatisk analyse (figur 2). MAPS-teknologien tegner i sidste ende et interagerende kort over alle potentielle interaktioner, der forekommer in vivo.
MAPS-teknologien blev oprindeligt implementeret i den ikke-patogene Gram-negative bakterie E. coli21. Bemærkelsesværdigt, MAPS hjalp med at identificere en tRNA-afledt fragment specifikt interagerer med både RyhB og RybB sRNA og forhindre enhver sRNA transskriptionel støj til at regulere mRNA mål i ikke-inducerende forhold. Derefter er MAPS blevet anvendt med succes på andre E. coli sRNA'er som DSRA22, RprA23,CyaR23 og GcvB24 (tabel 1). Ud over at bekræfte tidligere kendte mål udvidede MAPS targetomet for disse velkendte sRNA'er. For nylig er MAPS blevet udført i Salmonella Typhimurium og afslørede, at SraL sRNA binder sig til rho mRNA, kodning for en transskribering opsigelse faktor25. Gennem denne parring beskytter SraL rho mRNA mod den tidlige transskriberingsafslutning udløst af Rho selv. Interessant nok er denne teknologi ikke begrænset til sRNA'er og kan anvendes på enhver form for cellulære RNA'er som eksemplificeret ved brug af et tRNA-afledt fragment26 og en 5'-uoversat region af mRNA22 (tabel 1).
MAPS-metoden er også blevet tilpasset den patogene Gram-positive bakterie S. aureus19. Specifikt lysis protokollen er blevet bredt ændret til effektivt at bryde celler på grund af en tykkere cellevæg end Gram-negative bakterier og for at opretholde RNA integritet. Denne tilpassede protokol har allerede optrevlet interactome af RsaA27, RsaI28 og RsaC29. Denne tilgang gav indsigt i den afgørende rolle, som disse sRNA'er spiller i reguleringsmekanismer for celleoverfladeegenskaber, glukoseoptagelse og oxidative stressresponser.
Den protokol, der blev udviklet og implementeret i E. coli i 2015, er for nylig blevet beskrevet meget detaljeret30. Her leverer vi den modificerede MAPS-protokol, som er særligt velegnet til at studere sRNA-regulerende netværk i Gram-positive (tykkere cellevæg) bakterier, hvad enten de er ikke-patogene eller patogene (sikkerhedsforanstaltninger).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Buffere og medier
- I forbindelse med MAPS-eksperimenter skal du forberede følgende buffere og medier:
- Buffer A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl2 og 1 mM DTT)
- Buffer E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM maltose, 0,1% Triton, 1 mM MgCl2 og 1 mM DTT)
- RNA-læssebuffer (0,025% xylen cyanol og 0,025% bromophenolblå i 8 M urinstof)
- Brain Heart Infusion (BHI) medium (12,5 g kalvhjerne, 10 g pepton, 5 g oksekødhjerte, 5 g NaCl, 2,5 g Na2HPO4 og 2 g glukose til 1 L)
- Lysogeny Bouillon (LB) medium (10 g pepton, 5 g gærekstrakt og 10 g NaCl for 1 L) - For nordlig skamplet assays, forberede følgende buffere:
- Blokeringsopløsning (1x malesyre og 1% blokerende reagens)
- Hybridiseringsopløsning (50% formamid, 5x SSC, 7% SDS, 1% blokeringsopløsning og 0,2% N-laurylsarkcosin, 50 mM natriumphosphat). Varm med omrøring for at opløse.
ADVARSEL: Følg omhyggeligt de sikkerhedsforanstaltninger, der er forbundet med hvert produkt.
- 1 M natriumphosphat (58 mM natriumphosphatdibasisk og 42 mM natriumphosphatmonosfat)
- Saltvands-, natriumcitratbuffer, 20x koncentrat (3 M NaCl og 300 mM trinatriumcitrat)
2. Sikkerhedsspørgsmål
- Udfør alle trin, der involverer levedygtige patogene bakterier i et niveau 2 indeslutningslaboratorium.
BEMÆRK: Kun celleekstrakter kan tages udenfor efter lysis (trin 5). - Tag en kittel og handsker på.
- Sørg for, at håndleddene er dækket.
- Det biologiske sikkerhedsskab (klasse II) rengøres med en desinfektionsmiddelopløsning.
- Fast affald, der udsættes for bakterier, bortskaffes i den relevante biomedicinske beholder.
- Kolber, der indeholder kontaminerede væsker, behandles med en desinfektionsmiddelopløsning. Kassér det derefter i en vask.
- Vask forsigtigt hænder og håndled med sæbe og fjern laboratoriekitlen, før du forlader niveau 2-indeslutningslaboratoriet.
3. Plasmid konstruktion
BEMÆRK: Til kloning er det afgørende først at identificere grænserne for det endogene sRNA. PCN51-P3 og pCN51-P3-MS2 plasmiderne er beskrevet i Tomasini et al. (2017)27. P3-promotoren tillader højt udtryk for sRNA på en celletæthedsafhængig måde (dvs. når bakterier kommer ind i den stationære vækstfase). Mange stafylokok sRNA'er ophobes i denne vækstfase.
- Forstærk SRNA-sekvensen af PCR ved hjælp af en high-fidelity DNA polymerase og en PCR-maskine. Følg omhyggeligt producentens anvisninger, og læs Garibyan og Avashia (2013)31 for at få flere oplysninger.
- Brug følgende skabeloner til at designe de specifikke primere:
og 5'-CGCGGATCC(N)-3' for henholdsvis fremad- og omvendte primere.
BEMÆRK: Disse oligonukleotider gør det muligt at sammensmelte MS2-sekvensen (med fed skrift) til 5' enden af det pågældende sRNA. Pst I og BamHI begrænsning steder (understreget) er tilføjet på 5 'og 3' ekstremiteter af MS2-sRNA konstruere at klone amplicon i pCN51-P3 plasmid27. (N) svarer til den genspecifikke sekvens (15-20 nukleotider). - 1 μg pCN51-P3 plasmid og 1 μg af MS2-sRNA PCR-produktet med 2 U pstI og 1 U bamHI i den relevante buffer i overensstemmelse med fabrikantens anbefalinger.
- Inkuber 1 time ved 37 °C, og rense DNA ved hjælp af et PCR-rensesæt (se Materialetabel).
- Den fordøjede pCN51-P3 plasmid (300 ng) og MS2-sRNA-amplicon (molarforhold for vektor:insert = 1:3) blandes i et 1,5 mL rør. Se Revie et al. (1988)32 for at maksimere ligation effektivitet. Der tilsættes 1 μL ligasebuffer og 10 U T4 Ligase i hvert rør. Opskrevne volumen til 10 μL med ultrapure vand.
- Inkuber ved 22 °C i mindst 2 timer.
- Der tilsættes 5 μL ligationsblanding til 50 μL frosne DH5α kemisk kompetente E. coli-celler. Læs Seidman et al. (2001)33 for at lære mere om plasmidtransformation og kemisk kompetente celler.
- Inkuber 30 min på is.
- Varmechok (45 s ved 42 °C) transformationsrøret ved hjælp af en varmeblok eller et vandbad.
- Der tilsættes 900 μL LB-medium og inkuberes ved 37 °C i 30 min.
- Plade 100 μL af bakterieaffjedringen på en LB agar plade suppleret med ampicillin (100 μg/μL).
BEMÆRK: PCN51-P3-vektoren koder et ampicillinresistensgen, som kun gør det muligt at vælge E. coli-kloner, der bærer pCN51-P3-MS2-sRNA plasmid. - PCN51-P3-MS2-sRNA plasmid udvindes fra en bakteriekultur fra overnatning (5 mL), der dyrkes under tilstedeværelse af ampicillin (100 μg/μL) ved hjælp af et plasmid-DNA-miniprepsæt (se Materialetabel).
- Kontroller konstruktionen af Sanger sequencing34 ved hjælp af følgende primer, 5'-TCTCGAAAATAATAGAGGG-3'.
- Omdan pCN51-P3-MS2-sRNA plasmid til DC10B kemisk kompetente E. coli celler. Gentag trin 3.7 til 3.11.
- PCN51-P3-MS2-sRNA plasmid (se trin 3.12) udtrækkes, og 1-5 μg plasmid-DNA omdannes til HG001 ΔsRNA-elektrokompetenceR S. aureusceller ved hjælp af et elektroporationsapparat. Følg nøje producentens anvisninger. Læs Grosser og Richardson (2016)35 for at lære mere om metoder til forberedelse af elektrokompetencer S. aureus.
ADVARSEL: Dette trin indebærer håndtering af patogene bakterier (se trin 2). - Der tilsættes 900 μL BHI-medium, og der inkuberes ved 37 °C i 3 timer.
- Centrifuge 1 min ved 16.000 x g. Kassér supernatanten.
- Pelletpen blev genbrugt i 100 μL BHI, og bakterieaffjedringen på BHI-agarpladerne blev genindført med erythromycin (10 μg/μL).
BEMÆRK: PCN51-P3-vektoren koder også et erythromycinresistensgen, som kun gør det muligt at vælge S. aureus-kloner, der bærer pCN51-P3-MS2-sRNA plasmid.
4. Bakteriehøst
ADVARSEL: Dette trin indebærer håndtering af patogene bakterier (se trin 2).
- Der dyrkes en koloni af stammer, der bærer enten pCN51-P3-MS2-sRNA eller pCN51-P3-MS227 plasmider i 3 ml BHI-medium suppleret med erythromycin (10 μg/μL) i dubletter.
- Hver natkultur fortyndes i 50 ml (≈1/100) frisk BHI-medium suppleret med erythromycin (10 μg/μL) for at nå en OD600nm på 0,05. Der anvendes 250 mL steriliserede kolber (5:1 kolbe-til-medium-forhold).
BEMÆRK: Mellem- og vækstbetingelserne skal fastsættes i overensstemmelse med det undersøgte sRNA's udtryksmønster. - Dyrke kulturer ved 37 °C med rysten ved 180 omdrejninger i minuttet i 6 timer.
- Overfør hver kultur til et 50 mL centrifugerør.
- Centrifuge ved 2.900 x g i løbet af 15 minutter ved 4 °C. Kassér supernatanten.
- Opbevar pellets på is og udfør direkte mekanisk celle lysis (trin 5) eller fryse og opbevare pellets ved -80 °C.
5. Mekanisk celle lysis
ADVARSEL: Følgende trin skal udføres på is, og bufferne skal være ved 4 °C. Brug handsker og tage alle forholdsregler for at beskytte prøver fra RNases.
- Genbrugte pellets (trin 4.6) i 5 mL buffer A.
- De resuspenderede celler overføres i 15 mL centrifugerør med 3,5 g silicaperler (0,1 mm).
- Indsætningsrør i et mekanisk cellelysisinstrument (se Materialeoversigt). Kør en cyklus på 40 s ved 4,0 m/s.
BEMÆRK: Hvis en cyklus ikke er nok til at bryde celler, skal du lade enheden køle af i 5 minutter, mens prøverne holdes på is. Gentag derefter en anden cyklus på 40 s ved 4,0 m/s. Effektiviteten af celle lysis kan testes ved plating supernatanten på BHI-agar plade. - Centrifuge ved 15.700 x g i 15 min. Få fat i supernatanten og hold den på is.
6. Forberedelse af søjle
ADVARSEL: Pas på ikke at lade amyloseharpiksen tørre. Hvis det er nødvendigt, forsegles kolonnen med en endehætte. Forbered alle løsningerne, før du starter affinitetsrensningen.
- Sæt en kromatografikolonne i et kolonnestativ (se Materialeoversigt).
- Fjern søjlespidsen og vask søjlen med ultrapure vand.
- Der tilsættes 300 μL amyloseharpiks.
- Kolonnen vaskes med 10 mL buffer A.
- Fortynd 1.200 pmol MBP-MS2 protein i 6 mL Buffer A og læg det ind i kolonnen.
- Kolonnen vaskes med 10 mL buffer A.
7. Rensning af MS2-affinitet (figur 1)
- Indlæs cellelysatet i kolonnen.
BEMÆRK: Hold 1 mL af celle lysate (Rå ekstrakt, CE) for at udtrække den samlede RNA (trin 8) og udføre nordlige blot (trin 9) og transskription (trin 10) analyse. - Saml gennemstrømningsfraktionen (FT) i et rent opsamlingsrør.
- Kolonnen vaskes 3 gange med 10 mL buffer A. Vask vaskefraktionen (W).
- Elute kolonnen med 1 mL Buffer E og indsamle eluering fraktion (E) i en 2 mL mikrorør.
- Alle indsamlede fraktioner opbevares på is, indtil RNA-ekstraktionen (trin 8) eller fryses ved -20 °C til senere brug.
8. RNA-ekstraktion af indsamlede fraktioner (CE, FT, W og E)
- Brug 1 mL af hver fraktion (inklusive FT og W) til RNA-ekstraktion.
- Tilsæt 1 volumen phenol. Bland kraftigt.
ADVARSEL: Phenol er flygtigt og ætsende, vær opmærksom og arbejd sikkert under en røghætte. - Centrifuge ved 16.000 x g i 10 min ved 20 °C.
- Overfør den øverste fase i et rent 2 mL mikrorør.
- Der tilsættes 1 volumen chloroform/isoamylalkohol (24:1) og trin 8.3 til 8.4 gentages.
ADVARSEL: Arbejd sikkert under en røghætte. - Der tilsættes 2,5 volumener kold ethanol på 100 % og 1/10 volumen af 3 M natriumacetat (NaOAc) pH 5,2.
- Udfældes natten over ved -20 °C.
BEMÆRK: Nedbør kan også udføres i et ethanol-/tørisbad i løbet af 20 minutter eller ved -80 °C i løbet af 2 timer. - Centrifuge ved 16.000 x g i 15 minutter ved 4 °C. Fjern langsomt ethanol med en pipette, mens du passer på ikke at forstyrre pellet.
ADVARSEL: RNA-pellet er ikke altid synlig og er undertiden løs i nærværelse af ethanol. - Der tilsættes 500 μL 80% kold ethanol.
- Centrifuge ved 16.000 x g i 5 min ved 4 °C.
- Kassér ethanol ved at pipettere det langsomt. Tør pellet ved hjælp af en vakuumkoncentrator, 5 min på køretilstand.
- Pelletpen blev genbrugt i et passende volumen (15-50 μL) ultrapurt vand. Pelletlen fryses ved -20 °C til senere brug.
- Vurdere RNA-kvantitet (260 nm) og kvalitet (260/280 og 260/230 bølgelængdeforhold) ved hjælp af et spektrofotometer/fluorometer (se materialetabel). Følg nøje producentens anvisninger.
BEMÆRK: 3-4 μg opnås normalt i elueringsfraktionen (E). Dette afhænger hovedsageligt af testede forhold.
9. Analyse af MS2-affinitetsrensning foretaget af Northern blot36
- 5 μg RNA fortyndes af CE, FT, W-fraktioner og 500 ng E-fraktion i 10 μL ultrapurt vand og blandes med 10 μL RNA-læssebuffer.
- 3 min. inkuberes ved 90 °C.
- Prøverne indlæses i brønde af en 1% agarosegel suppleret med 20 mM guanidiumthocyanat, og gelen køres ved 100-150 V i TBE 1x buffer ved 4 °C. Læs Koontz (2013)37 for flere detaljer.
- Overfør RNA'er på en nitrocellulosemembran ved vakuumoverførsel til 1 time eller kapillaritetsoverførsel natten over.
BEMÆRK: Kapillaritetsmetoden er mere effektiv til store RNA'er. - UV cross-link RNA'er på membranen (120 mJ ved 254 nm) ved hjælp af en ultraviolet crosslinker.
- Sæt membranen i en hybridiseringsflaske med RNA-siden vendt op.
- Tilsæt 10-20 ml forvarmet hybridiseringsløsning. 30 min. inkuberes ved 68 °C.
- Opløsningen kasseres, og der tilsættes 10-20 ml frisk hybridiseringsopløsning suppleret med 1 μL af den sRNA-specifikke sonde. Inkuber natten over ved 68 °C.
BEMÆRK: Den DIG-mærkede RNA-sonde syntetiseres ved hjælp af et DIG RNA-mærkningssæt og følger producentens anvisninger. Alternativt kan en radioaktivt mærket sonde bruges. - Membranen vaskes med 10-20 ml vaskeopløsning 1 (2x SSC og 0,1% SDS) i 5 min ved 20 °C. Gentag én gang.
- Membranen vaskes med 10-20 ml vaskeopløsning 2 (0,2x SSC og 0,1% SDS) i 15 min ved 68 °C. Gentag én gang.
- Der inkuberes med 10-20 ml blokeringsopløsning i mindst 30 min ved 20 °C.
- Opløsningen kasseres, og der tilsættes 10-20 ml af blokeringsopløsningen suppleret med det polyklonale anti-digoxigeninantistof (1/1000), konjugeret til alkalisk fosfatase. 30 min. inkuberes ved 20 °C.
- Membranen vaskes med 10-20 ml vaskeopløsning 3 (1x maleinsyre og 0,3% tween 20) i 15 min ved 20 °C. Gentag én gang.
- Membranen inkuberes med 10-20 ml detektionsopløsning (0,1 M Tris HCl og 0,1 M NaCl pH 9,5) 5 min ved 20 °C.
- Sæt membranen på en plastikfilm og blød den med substratet (se Materialetabel). Inkuber 5 minutter i mørket.
- Forsegl membranen i en plastikfilm. Sæt membranen i en autoradiografi kassette.
- Udsæt membranen for en autoradiografifilm i det dedikerede mørke rum.
BEMÆRK: Redegørelsen afhænger af signalstyrken fra få sekunder til minutter. - Afslør den eksponerede film i en enhed til automatisk udvikling.
10. Forberedelse af prøverne til RNA-sekventering
BEMÆRK: Dette trin vedrører kun RNA'er, der er udvundet af E- og CE-fraktioner.
- Der til hver prøve tilsættes 10 μL 10x DNase buffer og DNase I (1 U/μg behandlede RNA'er). Tilsæt vand til et sidste volumen på 100 μL.
- 1 time ved 37 °C inkuberes.
- Ekstrakter og rensning af RNA'er som tidligere beskrevet (trin 8.2 til 8.11).
- RNA-pelletpen blev genbrugt i 20 μL ultrapurevand.
BEMÆRK: Tilstedeværelsen af resterende DNA kan kontrolleres ved hjælp af PCR og specifikke primere (f.eks. 16S-gen). - Vurdere RNA-kvantitet og -kvalitet ved hjælp af et mikrofluidics-baseret elektroforeseanalysesystem (se Materialetabel).
BEMÆRK: 1 μg opnås normalt ved elueringsfraktionen (E) efter DNase-behandlingen. - Fjern ribosomale RNA'er med et bakterielt rRNA-udtømningssæt.
BEMÆRK: Store og rigelige RNA'er (dvs. rRNA'er) har en tendens til ikke-specifikt at interagere med affinitetskolonnen. Der kræves 500 ng ekstraheret RNA for at udføre dette trin. - Vurder igen RNA-kvantitet og kvalitet ved hjælp af et mikrofluidics-baseret elektroforeseanalysesystem.
- Forbered cDNA-biblioteker med 10-20 ng ribodepleted RNA ved hjælp af et cDNA-biblioteksforberedelsessæt og efter producentens anvisninger.
- Sekvensér de opnåede biblioteker ved hjælp af et sekventeringsinstrument (f.eks. ens formål, 150 bp; se materialeoversigten).
BEMÆRK: 5-10 millioner læsninger pr. prøve er generelt nok.
11. RNAseq dataanalyse (figur 2)
- Download FastQ-sekventeringsfilerne fra sekventeringsplatformen.
- Adgang til Galaxy forekomst af Roscoff biologiske station (https://galaxy.sb-roscoff.fr/) og logge ind.
BEMÆRK: Hver nævnt algoritme kan nemt findes ved hjælp af søgefeltet. Der findes en brugervejledning til hvert værktøj.
ADVARSEL: Versionen af de nødvendige værktøjer kan afvige fra den offentlige Galaxy Server38. - Klik på ikonet Hent data , og overførderefter fil fra computeren . Overfør FastQ-sekventeringsfilen for hvert MS2-kontrolelement og MS2-sRNA-eksempel. Overfør også FASTA-referencegenomfil og GFF-anmærkningsfil.
- Kør FastQC-rapporter om læsekvalitet (Galaxy Version 0.69).
BEMÆRK: Dette værktøj giver en kvalitetsvurdering af rå sekvenser (f.eks. kvalitetsscore, tilstedeværelse af adaptersekvenser). - Kør Trimmomatic fleksibel læse trimning værktøj (Galaxy Version 0.36.6) til især at fjerne adapter sekvenser og dårlig kvalitet læser. Angiv de adaptersekvenser, der bruges til biblioteksforberedelse (f.eks. TruSeq 3, single-ended). Tilføj følgende trimmomatiske handlinger: SLIDINGWINDOW (Antal baser=4; Gennemsnitlig kvalitet=20) og MINLEN (Min længde af læser = 20).
- Kør fastqc-rapporter om læs kvalitet igen (Galaxy Version 0.69).
- Kør Bowtie2 - kort læser mod reference genom (Galaxy Version 2.3.2.2). Brug FASTA-filen Genomreference fra oversigten til at tilknytte læsninger med standardindstillinger (meget følsom lokal).
BEMÆRK: BAM-fil genereret af Bowtie2-værktøjet kan visualiseres ved hjælp af Integrative Genomics Viewer (IGV). Tilknyttet BAI-fil vil også være påkrævet. - Du kan også køre flagstat, der samler statistik for BAM-datasæt (Galaxy Version 2.0).
- Kør htseq-count - Count (Galaxy Version 0.6.1), som justerer læse overlappende funktioner i GFF-anmærkningsfilen. Brug tilstanden Skæringspunkt (ikke tom).
- Arkiver alle raw counts-filer fra htseq-count-analyse i en enkelt Zip-fil.
- Kør SARTools DESeq2 for at sammenligne data (Galaxy Version 1.6.3.0). Angiv den Zip-fil, der indeholder rå antal filer og designfilen, en fanesepareret fil, der beskriver eksperimentet. Følg omhyggeligt den medfølgende vejledning for at generere designfilen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De repræsentative resultater stammer fra undersøgelsen af RsaC targetome i S. aureus29. RsaC er en ukonventionel 1.116 nt-lang sRNA. Dens 5'-ende indeholder flere gentagne regioner, mens dens 3' end (544 nt) er strukturelt uafhængig og indeholder alle forudsagte interaktionssteder med sine mRNA-mål. Udtrykket af dette sRNA induceres, når mangan (Mn) er knap, hvilket ofte opstår i forbindelse med værts immunrespons. Ved hjælp af MAPS-teknologi identificerede vi flere mRNA'er, der interagerede direkte med RsaC, og afslørede dets afgørende rolle i oxidativ stress (sodA, ldh1 og sarA) og metalrelaterede (znuBC-zur og sufCDSUB) svar.
Validering af MS2-sRNA-konstruktionen og forsøgsbetingelserne
Før du udfører MAPS-eksperimenter, er det vigtigt at bestemme de optimale udtryksbetingelser for det studerede sRNA. Hvis der anvendes en ikke-indfødt promotor, vil det definitivt hjælpe med at producere MS2-sRNA-konstruktionen, når dens mål er til stede. Desuden bør MS2-sRNA-konstruktionen valideres omhyggeligt med hensyn til størrelse, stabilitet, udtryk og funktion. MS2-aptameren blev smeltet sammen til 5's ende af enten RsaC i fuld længde (MS2-RsaC1116)eller den kortere form (MS2-RsaC544),der svarer til 3'-delen af RsaC. Begge konstruktioner blev udtrykt in vivo under kontrol af quorum sensing afhængige P3 promotor i S. aureus HG001 ΔrsaC. Sletningen af rsaC-genet undgår en konkurrence mellem det endogene RsaC og MS2-RsaC. Den stamme af vild type, der indeholder den samme vektor med MS2-mærket alene, blev brugt som kontrol. Dette kontrolelement gør det muligt at trække uspecifikke interaktioner fra, der forekommer med MS2-koden.
For at bekræfte konstruktionerne og visualisere deres udtryksmønster blev bakterieceller høstet efter 2 timer, 4 timer og 6 timers vækst i BHI-medium ved 37 °C. Efter RNA-ekstraktionen blev northern blot-analysen udført ved hjælp af RsaC-specifik DIG-sonde (Figur 3A). Niveauet af endogen RsaC (bane 1-3) steg betydeligt efter 6 timers vækst, hvilket begrunder valget af dette tidspunkt for MAPS-eksperimenter. Det er vigtigt, at niveauerne af MS2-RsaC544 (vognbane 7-9) og MS2-RsaC1.116 (vognbane 10-12) kunne sammenlignes med endogen RsaC ved 6 timer. Derfor bør de efterligne det endogene udtryksmønster af RsaC. En større, men mindre form for RsaC kunne skelnes og kan skyldes en ineffektiv afslutning af transskription. Dette fænomen observeres ofte , når et MS2-sRNA udtrykkes under kontrol af en stærk promotor fra en plasmid21. Der blev ikke observeret kortere formularer som følge af afvigende transskriberingsafslutning eller nedbrydning.
Tilføjelsen af MS2-aptameren ved 5' sRNA'erne kan også forstyrre deres korrekte foldning og påvirke deres funktioner. Dette trin er afgørende for meget strukturerede sRNA'er som RsaC. Derfor bør MS2-sRNA-aktivitet testes og sammenlignes med endogent sRNA, når det er muligt. Et tidligere kendt mål eller en observerbar fænotype kan hjælpe med at overvåge det. F.eks. blev RsaC's indvirkning på intracellulær ROS-akkumulering brugt til at validere MS2-RsaC544 og MS2-RsaC1.116 konstruktioner29.
Analyse af indsamlede fraktioner under affinitetsrensning
RNA'er blev udvundet af CØE-, FT- og E-fraktioner i WT-stamme, der udtrykker MS2-mærke alene, og ΔrsaC-stamme, der udtrykker MS2-RsaC544-konstruktion. Vi viste ved hjælp af Northern blot analyse, at de 1.116 nt-lange endogene RsaC blev beriget i elution fraktion, men viste sig at interagere ikke-specifikt med affinitet kolonne(Figur 3B, baner 2-3). Vi observerede det samme fænomen med MS2-RsaC1.116 (data ikke vist). Dette skyldes helt sikkert dens længde og komplekse sekundære struktur. Derfor blev kun en mindre struktureret og kortere form (544 nt) af RsaC svarende til dets 3' del brugt til at udføre MAPS-eksperimenter. I figur 3Bblev MS2-RsaC544 højt beriget med elueringsfraktionen, hvilket viste, at det med succes blev bibeholdt af MS2-MBP-fusionsproteinet (bane 6). Der blev observeret en større, men mindre form for MS2-RsaC544 som i figur 3A. Her kan strengheden og antallet af vaske justeres til enten reduceret ikke-specifik binding eller tværtimod for at begrænse tab af ægte interagerende partnere.
Validering af formodede mRNA-mål efter MAPS-analyse
Efter bioinformatisk analyse er formodede mRNA-mål opført i henhold til Fold-ændringen mellem MS2-sRNA- og MS2-kontrol, opnået ved hjælp af DeSeq2 (Figur 2). For eksempel foreslog MS2-RsaC544 MAPS-data29, at sodA mRNA, kodning for en superoxid dismutase i S. aureus, er et hovedmål (bedste hit, højere Fold-change). En nordlig blot-analyse, udført med en sodA-specifikDIG-sonde efter MS2-affinitetsrensning, viser, at sodA effektivt blev co-beriget med MS2-RsaC544 sammenlignet med MS2-styringen (Figur 3C).
En global transskriptionsanalyse udføres systematisk på CE-fraktionen. Sammenligningen af MAPS-data og denne transskriptionsanalyse hjælper med at justere berigelsesforholdet og afslører et potentielt målhierarki. Faktisk har et dårligt udtrykt mRNA, som er højt beriget efter MS2-affinitetsrensning, bestemt en større bindende affinitet end et højt beriget og højt udtrykt mRNA.
Det er vigtigt at bemærke, at alle kandidater, der er identificeret ved MAPS, skal valideres individuelt ved hjælp af in vitro- og/eller in vivo-eksperimenter som Elektrophoresis Mobility Shift Assays (EMSA) eller reportergenanalyser (se Jagodnik et al. (2017)39 for yderligere oplysninger).
Figur 1. Skematisk illustration af MAPS-protokollen tilpasset S. aureus. Fra plasmidkonstruktion til dataanalyse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. MAPS-analysearbejdsgang og behandlede data. Hvert trin, kontrolpunkt og filformat er repræsenteret (se også trin 11). FastQ-format er en tekstfil, der består af DNA-sekvenserne og tilsvarende kvalitetsscores. BAM-format er en komprimeret fil, der indeholder justerede sekvenser. Tabelformat er en tabulatorsepareret tekstfil med antal for hvert gen. Resultatdiagrammet illustrerer den type data, der er opnået efter bioinformatikanalyse. Præsenterede resultater er fiktive og stammer ikke fra nogen undersøgelse. For yderligere detaljer er grundlæggende tutorials tilgængelige på Galaxy Project hjemmeside (https://galaxyproject.org/). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Konstruerer validerings- og MAPS-kontrolelementer. A.Nordlige blot analyse af endogene RsaC sRNA og relaterede MS2 konstruktioner. WT-stammen bærer pCN51-P3-MS2 (kontrol) og ΔrsaC mutant stamme bære enten pCN51-P3-MS2, pCN51-P3-MS2-RsaC544 eller pCN51-P3-MS2-RsaC1.116. Der blev udtaget prøver efter 2 timer, 4 timer og 6 timer med vækst i BHI ved 37 °C. Nordlige blot assays blev udført ved hjælp af en RsaC-specifik GRAVE sonde. B.Nordlig blot analyse af MS2-affinitetsrensningsfraktioner ved hjælp af en RsaC-specifik DIG-sonde. Den fælles rensning blev udført ved hjælp af WT stamme + pCN51-P3-MS2 (kontrol) og ΔrsaC mutant stamme + pCN51-P3-MS2-RsaC544. Cellerne blev høstet efter 6 timers vækst i BHI ved 37 °C. Råekstrakt (CE), gennemstrømning (FT), eluering (E). C. Nordlig blot analyse af MS2-affinitet rensning fraktioner (CE og E) ved hjælp af en sodA-specifikGRAVE sonde. Yderligere oplysninger finder du i(B). Klik her for at se en større version af dette tal.
| RNA | slags | henvisning |
| Escherichia coli | ||
| RyhB | sRNA | Lalaouna m.fl. (2015)21 |
| RybB | sRNA | Lalaouna et al. (2015) 21 år |
| 3'ETSleuZ | tRNA-afledt fragment | Lalaouna og Massé (2015)26 |
| DSRA | sRNA | Lalaouna et al. (2015) 22 år |
| Hns | mRNA (5'UTR) | Lalaouna et al. (2015) 22 år |
| CyaR | sRNA | Lalaouna et al. (2018) 23 år |
| RprA | sRNA | Lalaouna et al. (2018) 23 år |
| GcvB | sRNA | Lalaouna et al. (2019) 24 år |
| Salmonella Typhimurium | ||
| SraL | sRNA | Silva et al. (2019) 25 år |
| Staphylococcus aureus | ||
| RsaA | sRNA | Tomasini et al. (2017) 27 år |
| RsaC | sRNA | Lalaouna et al. (2019) 29 år |
| RsaI | sRNA | Bronesky et al. (2019) 28 år |
Tabel 1. MAPS-teknologi afslørede targetome af flere RNA'er i forskellige organismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En modificeret protokol for Gram-positive bakterier
Den oprindelige protokol for MAPS blev udviklet til at studere sRNA interactome i modelorganismen E. coli20,30. Her beskriver vi en modificeret protokol, som er egnet til karakterisering af sRNA-afhængige reguleringsnetværk i det opportunistiske menneskelige patogen S. aureus og helt sikkert kan overføres til andre Gram-positive bakterier, patogene eller ej.
Der blev lagt særlig vægt på celle lysis trin. Den franske presse er blevet erstattet af et mekanisk celle lysis instrument. Denne metode er effektiv til at bryde Gram-positive celler og begrænse risici forbundet med håndtering af patogene stammer. For at forbedre udbyttet af MS2-affinitetsrensningen er mængden af MS2-MBP, der er immobiliseret på amyloseharpiksen, blevet drastisk forøget. Dette har krævet at justere strengheden og antallet af vaske.
I modsætning til den oprindelige protokol udføres MAPS her i to eksemplarer fra to biologiske replikater. Der er udviklet en arbejdsgang til gennemførelse af statistiske analyser (figur 2), som definitivt øger robustheden af de opnåede data.
MS2-konstruktion og dens udtryk
Denne MAPS-protokol blev oprettet for at identificere targetome af stafylokok sRNA'er. MS2-sRNA-konstruktionen udtrykkes fra et lavkopieret nummerplasmid (pCN51, 20 til 25 kopier/celle) og under kontrol af quorum-sensing dependent P3-promotoren, hovedsagelig induceret i stationær fase. Dette udtryksmønster svarer til studerede sRNA'er i S. aureus (dvs. RsaA, RsaI og RsaC) og sikrer en ret stærk MS2-sRNA-syntese. Vi kan dog ikke udelukke, at P3-promotoren i andre tilfælde muligvis ikke er passende og ikke afspejler bakteriernes naturlige fysiologiske tilstand, når sRNA induceres. En anden måde at kontrollere MS2-sRNA-produktionen på er at anvende kemisk umulige initiativtagere (f.eks. tetracyklin-ufremkommlige initiativtagere). Disse værktøjer tillader et pulsudtryk af MS2-sRNA-konstruktionen, men denne indstilling garanterer ikke, at RNA-mål samtidig udtrykkes. En anden ulempe er, at udtryk fra en plasmid kan føre til overproduktion af det undersøgte sRNA, endnu mere understreget med høj kopinummervektor. Dette kan potentielt resultere i artefakter eller afbrydelse af tilknyttede RNA-chaperonefunktioner. Det mest hensigtsmæssige alternativ er at indsætte et MS2-mærke i 5's ende af det endogene sRNA-gen. Således ville MS2-sRNA være kromosomalt kodet og under kontrol af sin indfødte promotor. Dette bør bedre efterligne det endogene udtryk for studeret sRNA og undgå bias på grund af overproduktionen af det undersøgte sRNA. Under alle omstændigheder er det afgørende skridt omhyggeligt at kontrollere længden, stabiliteten og funktionaliteten af MS2-sRNA-konstruktionen, navnlig ved hjælp af nordlige blot-assays med det samlede RNA udvundet fra kulturer dyrket under forhold, der udløser den endogene sRNA-produktion og -funktion. Det er ubestrideligt, at brugen af en forkert/ufunktionel MS2-sRNA-konstruktion drastisk kan påvirke genererede resultater og understøtte betydningen af de ovenfor beskrevne kontroller. Endelig produceres MS2-sRNA altid i en ΔsRNA-baggrund for at maksimere berigelsen af mRNA-mål. Desuden kan der udføres forsøg i værtsstammer med specifikke mutationer i RNases (f.eks. sletningsmutanter eller temperaturfølsomme mutanter) for at undgå mRNA-målforringelse ved sRNA-afhængig rekruttering af RNases.
Den eksperimentelle validering af kandidater, der er identificeret af MAPS, er stadig påkrævet
Et punkt, der skal overvejes, er, at MAPS giver en liste over formodede RNA-mål. Nogle RNA'er kan dog indirekte beriges via interaktion med et fælles mRNA-mål eller et RNA-bindende protein. Derfor skal afslørede kandidater bekræftes af andre eksperimentelle tilgange. EMSA og fodaftryk eksperimenter er almindeligt anvendt til at visualisere den direkte binding af en sRNA til formodede RNA mål in vitro. Derefter hjælper in vitro-toeprinting-assays med at overvåge virkningen af et sRNA på oversættelsesstart af dets mRNA-mål. Endelig supplerer nordlige blot og/eller gen reporter assays (lacZ eller gfp) denne eksperimentelle validering in vivo. Alle disse tilgange er beskrevet i Jagodnik et al. (2017)39.
I modsætning til RIL-seq- og CLASH-teknologier giver MAPS ikke direkte oplysninger om interaktionsstederne. Ikke desto mindre observeres der ofte et højdepunkt af kortlagte aflæsninger i et begrænset område af RNA-målet (f.eks. 3' enden af glyW-cysT-leuZ operon21), hvilket letter identifikationen af parringsstedet. Alternativt kan flere forudsigelsesværktøjer bruges til at forudsige det formodede bindingsstedpå det identificerede mål, f.eks.
MAPS gransker targetome af en bestemt sRNA
MAPS-teknologi er velegnet til undersøgelse af sRNA-targetome i Gram-negative bakterier som E. coli og S. Typhimurium, men også nu med denne modificerede protokol i Gram-positive bakterier som S. aureus. Maps tilbyder grundlæggende et øjebliksbillede af RNA:sRNA-duplexer, der dannes på et givet tidspunkt og under specifikke vækstbetingelser. Desværre kan listen over mRNA-mål være ufuldstændig. For eksempel kan et cognate mRNA-mål gå glip af på grund af uhensigtsmæssige forsøgsbetingelser, der begrunder ovennævnte forholdsregler.
Sammenlignet med andre almindeligt anvendte metoder såsom RIL-seq eller CLASH bruger MAPS et specifikt sRNA til at rense alle interagerende RNA-mål. Her fortyndes sRNA:RNA-interaktion ikke blandt andre RBP-associerede duplexer, hvilket teoretisk gør det muligt at karakterisere sin targetome dybere. Det ser dog ud til, at RIL-seq/CLASH- og MAPS-metoder afslørede forskellige sæt formodede sRNA-mål12,41, hvilket tyder på, at disse eksperimentelle tilgange supplerer hinanden. Denne forskel kan forklares ved variationer i vækstbetingelserne og/eller skævhed, der opstår ved hver metode.
Formålet med undersøgelsen bør derfor påvirke valget af metode. For en global analyse af sRNA targetomes og når en RBP er involveret i sRNA-medieret regulering, RIL-seq og CLASH metoder bør foretrækkes. Begge tilgange giver et overblik over de lovgivningsmæssige netværk, der er baseret på et bestemt ringområde, og afdækker derfor en lang række sRNA'er og tilknyttede mål. Tværtimod udgør MAPS en passende mulighed i forbindelse med undersøgelsen af et bestemt sRNA, eller hvis der ikke er nogen RBP kendt/involveret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af "Agence Nationale de la Recherche" (ANR, Grant ANR-16-CE11-0007-01, RIBOSTAPH og ANR-18-CE12- 0025-04, CoNoCo, til PR). Det er også blevet offentliggjort inden for rammerne af labEx NetRNA ANR-10-LABX-0036 og ANR-17-EURE- 0023 (til PR), som finansiering fra staten forvaltes af ANR som en del af investeringerne til det fremtidige program. DL blev støttet af EU's Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogram under Marie Skłodowska-Curie-tilskudsaftalen nr. 753137-SaRNAReg. Arbejdet i E. Massé Lab er blevet støttet af driftstilskud fra Canadian Institutes of Health Research (CIHR), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) og National Institutes of Health NIH Team Grant R01 GM092830-06A1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Falcon | 352070 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | Starstedt | 72.691 | |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | RNA quantity and quality |
| 250 mL culture flask | Dominique Dutscher | 2515074 | Bacterial cultures |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon | 352051 | Culture centrifugation |
| Absolute ethanol | VWR Chemicals | 20821.321 | RNA extraction and purification |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | Bacterial pelleting | |
| Ampicilin (amp) | Sigma-Aldrich | A9518-5G | Growth medium |
| Amylose resin | New England BioLabs | E8021S | MS2-affinity purification |
| Anti-dioxigenin AP Fab fragment | Sigma Aldrich | 11093274910 | Northern blot assays |
| Autoradiography cassette | ThermoFisher Scientific | 50-212-726 | Northern blot assays |
| BamHI | ThermoFisher Scientific | ER0051 | Plasmid construction |
| BHI (Brain Heart Infusion) Broth | Sigma-Aldrich | 53286 | Growth medium |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | Northern blot assays |
| CDP-Star | Sigma Aldrich | 11759051001 | Northern blot assays (substrate) |
| Centrifuge 5415 R | Eppendorf | RNA extraction and purification | |
| Chloroform | Dominique Dutscher | 508320-CER | RNA extraction and purification |
| DIG-RNA labelling mix | Sigma-Aldrich | 11277073910 | Northern blot assays |
| DNase I | Roche | 4716728001 | DNase treatment |
| Erythromycin (ery) | Sigma-Aldrich | Fluka 45673 | Growth medium |
| FastPrep device | MP Biomedicals | 116004500 | Mechanical lysis |
| Guanidium Thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277-250G | Northern blot assays |
| Hybridization Hoven Hybrigene | Techne | FHB4DD | Northern blot assays |
| Hybridization tubes | Techne | FHB16 | Northern blot assays |
| Isoamyl alcohol | Fisher Scientific | A/6960/08 | RNA extraction and purification |
| LB (Lysogeny Broth) | Sigma-Aldrich | L3022 | Growth medium |
| Lysing Matrix B Bulk | MP Biomedicals | 6540-428 | Mechanical lysis |
| MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | Plasmid construction |
| Milli-Q water device | Millipore | Z00QSV0WW | Ultrapure water |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | RNA/DNA quantity and quality | |
| Nitrocellulose membrane | Dominique Dutsher | 10600002 | Northern blot assays |
| Phembact Neutre | PHEM Technologies | BAC03-5-11205 | Cleaning and decontamination |
| Phenol | Carl Roth | 38.2 | RNA extraction and purification |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530 | Plasmid construction |
| pMBP-MS2 | Addgene | 65104 | MS2-MBP production |
| Poly-Prep chromatography column | BioRad | 7311550 | MS2-affinity purification |
| PstI | ThermoFisher Scientific | ER0615 | Plasmid construction |
| Qubit 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | RNA quantity |
| RNAPro Solution | MP Biomedicals | 6055050 | Mechanical lysis |
| ScriptSeq Complete Kit | Illumina | BB1224 | Preparation of cDNA librairies |
| Spectrophotometer Genesys 20 | ThermoFisher Scientific | 11972278 | Bacterial cultures |
| SpeedVac Savant vacuum device | ThermoFisher Scientific | DNA120 | RNA extraction and purification |
| Stratalinker UV Crosslinker 1800 | Stratagene | 400672 | Northern blot assays |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher Scientific | EL0014 | Plasmid construction |
| TBE (Tris-Borate-EDTA) | Euromedex | ET020-C | Northern blot assays |
| ThermalCycler T100 | BioRad | 1861096 | Plasmid construction |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416-100ML | Northern blot assays |
| X-ray film processor | hu.q | HQ-350XT | Northern blot assays |
| X-ray films Super RX-N | FujiFilm | 4741019318 | Northern blot assays |
References
- Carrier, M. C., Lalaouna, D., Masse, E. Broadening the Definition of Bacterial Small RNAs: Characteristics and Mechanisms of Action. Annual Review of Microbiology. 72, 141-161 (2018).
- Hör, J., Matera, G., Vogel, J., Gottesman, S., Storz, G. Trans-Acting Small RNAs and Their Effects on Gene Expression in Escherichia coli and Salmonella enterica. EcoSal Plus. 9 (1), (2020).
- Desgranges, E., Marzi, S., Moreau, K., Romby, P., Caldelari, I. Noncoding RNA. Microbiology Spectrum. 7 (2), (2019).
- Adams, P. P., Storz, G. Prevalence of small base-pairing RNAs derived from diverse genomic loci. Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (7), 194524 (2020).
- Pain, A., et al. An assessment of bacterial small RNA target prediction programs. RNA Biology. 12 (5), 509-513 (2015).
- Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S., Lalaouna, D. Navigation through the twists and turns of RNA sequencing technologies: Application to bacterial regulatory RNAs. Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. , 194506 (2020).
- Wright, P. R., et al. CopraRNA and IntaRNA: predicting small RNA targets, networks and interaction domains. Nucleic Acids Research. 42, Web Server issue 119-123 (2014).
- Smirnov, A., Schneider, C., Hor, J., Vogel, J. Discovery of new RNA classes and global RNA-binding proteins. Current Opinion in Microbiology. 39, 152-160 (2017).
- Saliba, A. E., Santos, S., Vogel, J. New RNA-seq approaches for the study of bacterial pathogens. Current Opinion in Microbiology. 35, 78-87 (2017).
- Melamed, S., Adams, P. P., Zhang, A., Zhang, H., Storz, G. RNA-RNA Interactomes of ProQ and Hfq Reveal Overlapping and Competing Roles. Molecular Cell. 77 (2), 411-425 (2020).
- Melamed, S., et al. Global Mapping of Small RNA-Target Interactions in Bacteria. Molecular Cell. 63 (5), 884-897 (2016).
- Iosub, I. A., et al. Hfq CLASH uncovers sRNA-target interaction networks linked to nutrient availability adaptation. Elife. 9, (2020).
- Waters, S. A., et al. Small RNA interactome of pathogenic E. revealed through crosslinking of RNase E. The EMBO Journal. 36 (3), 374-387 (2017).
- Dos Santos, R. F., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. New molecular interactions broaden the functions of the RNA chaperone Hfq. Current Genetics. , (2019).
- Kavita, K., de Mets, F., Gottesman, S. New aspects of RNA-based regulation by Hfq and its partner sRNAs. Current Opinion in Microbiology. 42, 53-61 (2018).
- Bohn, C., Rigoulay, C., Bouloc, P. No detectable effect of RNA-binding protein Hfq absence in Staphylococcus aureus. BMC Microbiology. 7, 10 (2007).
- Jousselin, A., Metzinger, L., Felden, B. On the facultative requirement of the bacterial RNA chaperone, Hfq. Trends in Microbiology. 17 (9), 399-405 (2009).
- Olejniczak, M., Storz, G. ProQ/FinO-domain proteins: another ubiquitous family of RNA matchmakers. Molecular Microbiology. 104 (6), 905-915 (2017).
- Lalaouna, D., Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S. Chapter Sixteen - MS2-Affinity Purification Coupled With RNA Sequencing Approach in the Human Pathogen Staphylococcus aureus. Methods in Enzymology. 612, 393-411 (2018).
- Lalaouna, D., Prevost, K., Eyraud, A., Masse, E. Identification of unknown RNA partners using MAPS. Methods. 117, 28-34 (2017).
- Lalaouna, D., et al. A 3' external transcribed spacer in a tRNA transcript acts as a sponge for small RNAs to prevent transcriptional noise. Molecular Cell. 58 (3), 393-405 (2015).
- Lalaouna, D., Morissette, A., Carrier, M. C., Masse, E. DsrA regulatory RNA represses both hns and rbsD mRNAs through distinct mechanisms in Escherichia coli. Molecular Microbiology. 98 (2), 357-369 (2015).
- Lalaouna, D., Prevost, K., Laliberte, G., Houe, V., Masse, E. Contrasting silencing mechanisms of the same target mRNA by two regulatory RNAs in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 46 (5), 2600-2612 (2018).
- Lalaouna, D., Eyraud, A., Devinck, A., Prevost, K., Masse, E. GcvB small RNA uses two distinct seed regions to regulate an extensive targetome. Molecular Microbiology. 111 (2), 473-486 (2019).
- Silva, I. J., et al. SraL sRNA interaction regulates the terminator by preventing premature transcription termination of rho mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3042-3051 (2019).
- Lalaouna, D., Masse, E. Identification of sRNA interacting with a transcript of interest using MS2-affinity purification coupled with RNA sequencing (MAPS) technology. Genomics Data. 5, 136-138 (2015).
- Tomasini, A., et al. The RNA targetome of Staphylococcus aureus non-coding RNA RsaA: impact on cell surface properties and defense mechanisms. Nucleic Acids Research. 45 (11), 6746-6760 (2017).
- Bronesky, D., et al. A multifaceted small RNA modulates gene expression upon glucose limitation in Staphylococcus aureus. The EMBO Journal. 38 (6), (2019).
- Lalaouna, D., et al. RsaC sRNA modulates the oxidative stress response of Staphylococcus aureus during manganese starvation. Nucleic Acids Research. 47 (1), 9871-9887 (2019).
- Carrier, M. C., Laliberte, G., Masse, E. Identification of New Bacterial Small RNA Targets Using MS2 Affinity Purification Coupled to RNA Sequencing. Methods in Molecular Biology. 1737, 77-88 (2018).
- Garibyan, L., Avashia, N. Polymerase chain reaction. Journal of Investigative Dermatology. 133 (3), 1-4 (2013).
- Revie, D., Smith, D. W., Yee, T. W. Kinetic analysis for optimization of DNA ligation reactions. Nucleic Acids Research. 16 (21), 10301-10321 (1988).
- Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. Introduction of plasmid DNA into cells. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 1 Unit 1.8 (2001).
- Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing. Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).
- Grosser, M. R., Richardson, A. R. Method for Preparation and Electroporation of S. aureus and S. epidermidis. Methods in Molecular Biology. 1373, 51-57 (2016).
- Krumlauf, R. Northern blot analysis. Methods in Molecular Biology. 58, 113-128 (1996).
- Koontz, L. Agarose gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 529, 35-45 (2013).
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Reseaerch. 44, 3-10 (2016).
- Jagodnik, J., Brosse, A., Le Lam, T. N., Chiaruttini, C., Guillier, M. Mechanistic study of base-pairing small regulatory RNAs in bacteria. Methods. 117, 67-76 (2017).
- Mann, M., Wright, P. R., Backofen, R. IntaRNA 2.0: enhanced and customizable prediction of RNA-RNA interactions. Nucleic Acids Res. 45, 435-439 (2017).
- Georg, J., et al. The power of cooperation: Experimental and computational approaches in the functional characterization of bacterial sRNAs. Molecular Microbiology. 113 (3), 603-612 (2020).
