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Biochemistry

Purification par affinité MS2 couplée au séquençage de l’ARN dans les bactéries à Gram positif

Published: February 23, 2021 doi: 10.3791/61731
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 1, 1
1Université de Strasbourg, CNRS, 2Department of Biochemistry, Université de Sherbrooke

Summary

La technologie MAPS a été développée pour examiner le targetome d’un ARN régulateur spécifique in vivo. L’ARN d’intérêt est marqué à l’aide d’un aptamère MS2 permettant la co-purification de ses partenaires ARN et leur identification par séquençage de l’ARN. Ce protocole modifié est particulièrement adapté aux bactéries à Gram positif.

Abstract

Bien que les petits ARN régulateurs (ARNs) soient répandus dans le domaine bactérien de la vie, les fonctions de beaucoup d’entre eux restent mal caractérisées notamment en raison de la difficulté d’identifier leurs cibles d’ARNm. Ici, nous avons décrit un protocole modifié de la purification par affinité MS2 couplé à la technologie de séquençage de l’ARN (MAPS), visant à révéler tous les partenaires ARN d’un ARN spécifique in vivo. En gros, l’aptamère MS2 est fusionné à l’extrémité 5' de l’ARNr d’intérêt. Cette construction est ensuite exprimée in vivo, permettant à l’ARNsM2 d’interagir avec ses partenaires cellulaires. Après la récolte bactérienne, les cellules sont lysées mécaniquement. L’extrait brut est chargé dans une colonne de chromatographie à base d’amylose préalablement recouverte de la protéine MS2 fusionnée à la protéine de liaison au maltose. Cela permet la capture spécifique de l’ARNs MS2 et des ARN en interaction. Après l’élution, les ARN co-purifiés sont identifiés par séquençage de l’ARN à haut débit et analyse bioinformatique ultérieure. Le protocole suivant a été mis en œuvre dans l’agent pathogène humain à Gram positif Staphylococcus aureus et est, en principe, transposable à toute bactérie à Gram positif. En résumé, la technologie MAPS constitue une méthode efficace pour explorer en profondeur le réseau de régulation d’un ARNr particulier, offrant un instantané de l’ensemble de son targetome. Cependant, il est important de garder à l’esprit que les cibles putatives identifiées par MAPS doivent encore être validées par des approches expérimentales complémentaires.

Introduction

Des centaines, voire des milliers de petits ARN régulateurs (ARNs) ont été identifiés dans la plupart des génomes bactériens, mais les fonctions de la grande majorité d’entre eux restent inhabituelles. Dans l’ensemble, les ARNs sont de courtes molécules non codantes, jouant un rôle majeur dans la physiologie bactérienne et l’adaptation aux environnements fluctuants1,2,3. En effet, ces macromolécules sont au centre de nombreux réseaux de régulation complexes, impactant les voies métaboliques, les réponses au stress mais aussi la virulence et la résistance aux antibiotiques. Logiquement, leur synthèse est déclenchée par des stimuli environnementaux spécifiques (p. ex. privation de nutriments, stress oxydatif ou membranaire). La plupart des ARNm régulent plusieurs ARNm cibles au niveau post-transcriptionnel par le biais d’appariements de bases courts et non contigus. Ils empêchent généralement l’initiation de la traduction en concurrençant les ribosomes pour les régions d’initiation de la traduction4. La formation de duplex ARNm:ARNm entraîne aussi souvent la dégradation active de l’ARNm cible par le recrutement de RNases spécifiques.

La caractérisation d’un targetome d’ARNs (c’est-à-dire l’ensemble de ses ARN cibles) permet d’identifier les voies métaboliques dans lesquelles il intervient et le signal potentiel auquel il répond. Par conséquent, les fonctions d’un ARNr spécifique peuvent généralement être déduites de son targetome. A cet effet, plusieurs outils de prédiction in silico ont été développés tels que IntaRNA et CopraRNA5,6,7. Ils s’appuient notamment sur la complémentarité des séquences, l’énergie d’appariement et l’accessibilité du site d’interaction potentiel pour déterminer les partenaires d’ARNs putatifs. Cependant, les algorithmes de prédiction n’intègrent pas tous les facteurs influençant l’appariement de bases in vivo tels que l’implication d’ARN chaperons8 favorisant des interactions sous-optimales ou la co-expression des deux partenaires. En raison de leurs limites inhérentes, le taux de faux positifs des outils de prédiction reste élevé. La plupart des approches expérimentales à grande échelle sont basées sur la co-purification des couples ARNs:ARNm interagissant avec une protéine de liaison à l’ARN marqué (RBP)6,9. Par exemple, la méthode RNA Interaction by Ligation and sequencing (RIL-seq) a identifié des duplex d’ARN co-purifiés avec des chaperons d’ARN tels que Hfq et ProQ dans Escherichia coli10,11. Une technologie similaire appelée UV-Crosslinking, Ligation And Sequencing of Hybrids (CLASH) a été appliquée aux ARNs associés à la RNase E- et Hfq dans E. coli12,13. Malgré les rôles bien décrits de Hfq et ProQ dans la régulation par l’ARN dans plusieurs bactéries8,14,15,la régulation basée sur l’ARNs semble être indépendante de l’ARN chez plusieurs organismes comme S. aureus16,17,18. Même si la purification des duplex d’ARN en association avec les RNases est possible comme démontré par Waters et ses collègues13,cela reste délicat car les RNases déclenchent leur dégradation rapide. Par conséquent, l’approche MS2-Affinity Purification couplée au Séquençage de l’ARN (MAPS)19,20 constitue une alternative solide chez de tels organismes.

Contrairement aux méthodes mentionnées ci-dessus, MAPS utilise un ARN spécifique comme appât pour capturer tous les ARN en interaction et ne repose donc pas sur l’implication d’un RBP. L’ensemble du processus est illustré à la figure 1. En bref, l’ARNs est marqué au 5' avec l’aptamère à ARN MS2 qui est spécifiquement reconnu par la protéine ms2. Cette protéine est fusionnée avec la protéine de liaison au maltose (MBP) pour être immobilisée sur une résine amylose. Par conséquent, l’ARNsM2 et ses partenaires ARN sont retenus sur la colonne de chromatographie d’affinité. Après élution avec du maltose, les ARN co-purifiés sont identifiés à l’aide d’un séquençage d’ARN à haut débit suivi d’une analyse bioinformatique(Figure 2). La technologie MAPS dessine finalement une carte en interaction de toutes les interactions potentielles se produisant in vivo.

La technologie MAPS a été mise en œuvre à l’origine dans la bactérie Gram négatif non pathogène E. coli21. Remarquablement, MAPS a aidé à identifier un fragment dérivé de l’ARNt interagissant spécifiquement avec les ARNs RyhB et RybB et empêchant tout bruit transcriptionnel de l’ARNr pour réguler les cibles de l’ARNm dans des conditions non induisantes. Par la suite, maps a été appliqué avec succès à d’autres ARNs de E. coli comme DsrA22,RprA23,CyaR23 et GcvB24 (Tableau 1). En plus de confirmer des cibles précédemment connues, MAPS a étendu le targetome de ces ARNs bien connus. Récemment, MAPS a été réalisée dans Salmonella Typhimurium et a révélé que l’ARNs SraL se lie à l’ARNm rho, codant pour un facteur de terminaison de transcription25. Grâce à cet appariement, SraL protège l’ARNm rho de l’arrêt prématuré de la transcription déclenché par Rho lui-même. Fait intéressant, cette technologie n’est pas limitée aux ARNs et peut être appliquée à n’importe quel type d’ARN cellulaires comme l’illustre l’utilisation d’un fragment dérivé de l’ARNt26 et d’une région non traduite 5'-de l’ARNm22 (Tableau 1).

La méthode MAPS a également été adaptée à la bactérie pathogène à Gram positif S. aureus19. Plus précisément, le protocole de lyse a été largement modifié pour briser efficacement les cellules en raison d’une paroi cellulaire plus épaisse que les bactéries à Gram négatif et pour maintenir l’intégrité de l’ARN. Ce protocole adapté a déjà démêlé l’interactome de RsaA27,RsaI28 et RsaC29. Cette approche a donné des aperçus sur le rôle crucial de ces ARNs dans les mécanismes de régulation des propriétés de surface cellulaire, de l’absorption de glucose, et des réponses oxydantes de stress.

Le protocole élaboré et mis en œuvre dans E. coli en 2015 a récemment été décrit en détail30. Ici, nous fournissons le protocole MAPS modifié, qui est particulièrement adapté à l’étude des réseaux de régulation de l’ARNs chez les bactéries Gram-positives (paroi cellulaire plus épaisse), qu’elles soient non pathogènes ou pathogènes (précautions de sécurité).

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Protocol

1. Tampons et supports

  1. Pour les expériences MAPS, préparez les mémoires tampons et les supports suivants :
    - Tampon A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl2 et 1 mM TNT)
    - Tampon E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM maltose, 0,1 % Triton, 1 mM MgCl2 et 1 mM TNT)
    - Tampon de charge d’ARN (0,025 % de cyanol de xylène et 0,025 % de bleu de bromophénol dans l’urée 8 M)
    - Brain Heart Infusion (BHI) milieu (12,5 g de cerveau de veau, 10 g de peptone, 5 g de cœur de bœuf, 5 g de NaCl, 2,5 g deNa2HPO4 et 2 g de glucose pour 1 L)
    - Bouillon de lysogenèse (LB) milieu (10 g de peptone, 5 g d’extrait de levure et 10 g de NaCl pour 1 L)
  2. Pour les analyses par transfert northern, préparer les tampons suivants :
    - Solution bloquante (1x acide maléique et réactif bloquant 1 %)
    - Solution d’hybridation (50 % de formamide, 5x SSC, 7 % de SDS, 1 % de solution bloquante et 0,2 % de N-lauryl sarcosine, 50 mM de phosphate de sodium). Chauffer avec agitation pour dissoudre.
    ATTENTION: Suivez attentivement les précautions de sécurité liées à chaque produit.
    - 1 M phosphate de sodium (58 mM de phosphate de sodium dibasique et 42 mM de phosphate de sodium monobasique)
    - Solution saline, tampon citrate de sodium (SSC), concentré 20x (NaCl 3 M et citrate trisodique 300 mM)

2. Questions de sécurité

  1. Effectuer toutes les étapes impliquant des bactéries pathogènes viables dans un laboratoire de confinement de niveau 2.
    REMARQUE: Seuls les extraits cellulaires peuvent être pris à l’extérieur après la lyse (étape 5).
  2. Mettez un sarrau de laboratoire et des gants.
  3. Assurez-vous que les poignets sont couverts.
  4. Nettoyer l’enceinte de sécurité biologique (classe II) avec une solution désinfectante.
  5. Éliminer les déchets solides exposés aux bactéries dans le bac biomédical approprié.
  6. Traiter les flacons contenant des liquides contaminés avec une solution désinfectante. Ensuite, jetez-le dans un évier.
  7. Lavez-vous soigneusement les mains et les poignets avec du savon et retirez le sarrau de laboratoire avant de quitter le laboratoire de confinement de niveau 2.

3. Construction du plasmide

REMARQUE: À des fins de clonage, il est crucial d’identifier d’abord les limites de l’ARNs endogène. Les plasmides pCN51-P3 et pCN51-P3-MS2 sont décrits dans Tomasini et coll. (2017)27. Le promoteur P3 permet une expression élevée de l’ARNs d’une manière dépendante de la densité cellulaire (c.-à-d. lorsque les bactéries entrent dans la phase stationnaire de croissance). De nombreux ARNs staphylococcique s’accumulent au cours de cette phase de croissance.

  1. Amplifier la séquence d’ARNs par PCR à l’aide d’une ADN polymérase haute fidélité et d’un appareil de PCR. Suivez attentivement les instructions du fabricant et lisez Garibyan et Avashia (2013)31 pour plus de détails.
  2. Utilisez les modèles suivants pour concevoir les amorces spécifiques :
    Equation 1
    et 5'-CGCGGATCC(N)-3' pour les amorces avant et arrière, respectivement.
    NOTE : Ces oligonucléotides permettent de fusionner la séquence MS2 (en gras) à l’extrémité 5' de l’ARNs d’intérêt. Le Pst Les sites de restriction I et BamHI (soulignés) sont ajoutés aux extrémités 5' et 3' de la construction MS2-sRNA pour cloner l’amplicon dans le plasmide pCN51-P327. (N) correspond à la séquence spécifique au gène (15-20 nucléotides).
  3. Digérer 1 μg de plasmide pCN51-P3 et 1 μg du produit PCR à ARNsM2 avec 2 U de PstI et 1 U de BamHI dans le tampon approprié selon les recommandations du fabricant.
  4. Incuber 1 h à 37 °C et purifier l’ADN à l’aide d’un kit de purification par PCR (voir la table des matériaux).
  5. Mélanger le plasmide pCN51-P3 digéré (300 ng) et l’amplicon MS2-ARNs (rapport molaire pour vecteur:insert = 1:3) dans un tube de 1,5 mL. Voir Revie et coll. (1988)32 pour maximiser l’efficacité de la ligature. Ajouter 1 μL du tampon ligase et 10 U de Ligase T4 dans chaque tube. Réglez le volume à 10 μL avec de l’eau ultrapure.
  6. Incuber à 22 °C pendant au moins 2 h.
  7. Ajouter 5 μL de mélange de ligature à 50 μL de cellules DH5α DH5α congelées chimiquement compétentes. Lisez Seidman et coll. (2001)33 pour en savoir plus sur la transformation des plasmides et les cellules chimiquement compétentes.
  8. Incuber 30 min sur la glace.
  9. Choc thermique (45 s à 42 °C) le tube de transformation à l’aide d’un bloc thermique ou d’un bain-marie.
  10. Ajouter 900 μL de milieu LB et incuber à 37 °C pendant 30 min.
  11. Plaque 100 μL de la suspension bactérienne sur une plaque de gélose LB complétée par de l’ampicilline (100 μg/μL).
    REMARQUE: le vecteur pCN51-P3 code pour un gène de résistance à l’ampicilline, ce qui permet de sélectionner uniquement des clones de E. coli porteurs du plasmide pCN51-P3-MS2-sRNA.
  12. Extraire le plasmide pCN51-P3-MS2-sRNA d’une culture bactérienne nocturne (5 mL) cultivée en présence d’ampicilline (100 μg/μL) à l’aide d’un kit de minipréparation d’ADN plasmidique (voir la table des matériaux).
  13. Vérifiez la construction par séquençagesanger 34 en utilisant l’amorce suivante, 5'-TCTCGAAAATAATAGAGGG-3'.
  14. Transformer le plasmide pCN51-P3-MS2-ARNstronique en cellules DC10B chimiquement compétentes pour E. coli.  Répétez les étapes 3.7 à 3.11.
  15. Extraire le plasmide pCN51-P3-MS2-ARNs (voir étape 3.12) et transformer 1 à 5 μg d’ADN plasmidique en cellules S. aureus électrocompétentes HG001 ΔsRNA à l’aide d’un appareil d’électroporation. Suivez attentivement les instructions du fabricant. Lisez Grosser et Richardson (2016)35 pour en savoir plus sur les méthodes de préparation de S. aureusélectrocompétent.
    ATTENTION : Cette étape implique la manipulation des bactéries pathogènes (voir étape2).
  16. Ajouter 900 μL de milieu BHI et incuber à 37 °C pendant 3 h.
  17. Centrifugeuse 1 min à 16 000 x g. Jetez le surnageant.
  18. Résurendre la pastille dans 100 μL de BHI et plaquer la suspension bactérienne sur des plaques de gélose BHI complétées par de l’érythromycine (10 μg/μL).
    REMARQUE: Le vecteur pCN51-P3 code également un gène de résistance à l’érythromycine, qui permet de sélectionner uniquement des clones de S. aureus porteurs du plasmide pCN51-P3-MS2-sRNA.

4. Récolte des bactéries

ATTENTION : Cette étape implique la manipulation de bactéries pathogènes (voir étape 2).

  1. Cultiver une colonie de souches porteuses de pCN51-P3-MS2-ARNr ou de plasmides pCN51-P3-MS227 dans 3 mL de milieu BHI complété par de l’érythromycine (10 μg/μL) en double.
  2. Diluer chaque culture pendant la nuit dans 50 mL (≈1/100) de milieu frais BHI complété par de l’érythromycine (10 μg/μL) pour atteindre une DO600nm de 0,05. Utiliser des fioles stérilisées de 250 mL (rapport fiole/milieu de 5:1).
    REMARQUE: Les conditions moyennes et de croissance doivent être définies en fonction du modèle d’expression de l’ARNs étudié.
  3. Cultiver des cultures à 37 °C en secouant à 180 rpm pendant 6 h.
  4. Transférer chaque culture dans un tube à centrifuger de 50 mL.
  5. Centrifuger à 2 900 x g pendant 15 min à 4 °C. Jetez le surnageant.
  6. Conservez les granulés sur la glace et effectuez directement une lyse mécanique des cellules (étape 5) ou congelez et entreposez les granulés à -80 °C.

5. Lyse cellulaire mécanique

ATTENTION : Les étapes suivantes doivent être effectuées sur la glace et les tampons doivent être à 4 °C. Utilisez des gants et prenez toutes les précautions pour protéger les échantillons contre les RNases.

  1. Remise en suspension des granulés (étape 4.6) dans 5 mL du tampon A.
  2. Transférer les cellules remises en suspension dans des tubes à centrifuger de 15 mL avec 3,5 g de billes de silice (0,1 mm).
  3. Insérez des tubes dans un instrument de lyse de cellules mécaniques (voir tableau des matériaux). Exécuter un cycle de 40 s à 4,0 m/s.
    REMARQUE: Si un cycle ne suffit pas à briser les cellules, laissez l’appareil refroidir pendant 5 min tout en gardant les échantillons sur la glace. Ensuite, répétez un autre cycle de 40 s à 4,0 m/s. L’efficacité de la lyse cellulaire peut être testée en plaquant le surnageant sur une plaque de gélose BHI.
  4. Centrifuger à 15 700 x g pendant 15 min. Récupérez le surnageant et gardez-le sur la glace.

6. Préparation de la colonne

ATTENTION : Veillez à ne pas laisser sécher la résine amylose. Si nécessaire, scellez la colonne avec un embout. Préparez toutes les solutions avant de commencer la purification par affinité.

  1. Mettez une colonne de chromatographie dans un rack de colonne (voir table des matériaux).
  2. Retirez la pointe de la colonne et lavez la colonne avec de l’eau ultrapure.
  3. Ajouter 300 μL de résine amylose.
  4. Laver la colonne avec 10 mL de tampon A.
  5. Diluer 1 200 pmol de protéine MBP-MS2 dans 6 mL de tampon A et le charger dans la colonne.
  6. Laver la colonne avec 10 mL de tampon A.

7. Purification par affinité MS2 (Figure 1)

  1. Chargez le lysat de cellule dans la colonne.
    REMARQUE : Conservez 1 mL du lysat cellulaire (extrait brut, CE) pour extraire l’ARN total (étape 8) et effectuer une analyse par transfert Northern (étape 9) et transcriptomique (étape 10).
  2. Recueillir la fraction d’écoulement (FT) dans un tube de collecte propre.
  3. Laver la colonne 3 fois avec 10 mL de tampon A. Recueillir la fraction de lavage (W).
  4. Éluer la colonne avec 1 mL de tampon E et recueillir la fraction d’élution (E) dans un microtube de 2 mL.
  5. Conservez toutes les fractions collectées sur la glace jusqu’à l’extraction de l’ARN (étape 8) ou congelez-les à -20 °C pour une utilisation ultérieure.

8. Extraction de l’ARN des fractions collectées (CE, FT, W et E)

  1. Utiliser 1 mL de chaque fraction (y compris FT et W) pour l’extraction de l’ARN.
  2. Ajouter 1 volume de phénol. Mélanger vigoureusement.
    ATTENTION: Le phénol est volatil et corrosif, faites attention et travaillez en toute sécurité sous une hotte.
  3. Centrifuger à 16 000 x g pendant 10 min à 20 °C.
  4. Transférer la phase supérieure dans un microtube propre de 2 mL.
  5. Ajouter 1 volume d’alcool chloroforme/isoamylique (24:1) et répéter les étapes 8.3 à 8.4.
    ATTENTION: Travaillez en toute sécurité sous une hotte.
  6. Ajouter 2,5 volumes d’éthanol froid à 100 % et 1/10 volume d’acétate de sodium 3 M (NaOAc) pH 5,2.
  7. Précipiter pendant la nuit à -20 °C.
    NOTA : Les précipitations peuvent également être effectuées dans un bain d’éthanol/de glace carbonique pendant 20 min ou à -80 °C pendant 2 h.
  8. Centrifuger à 16 000 x g pendant 15 min à 4 °C. Retirez lentement l’éthanol avec une pipette tout en faisant attention à ne pas déranger la pastille.
    ATTENTION : La pastille d’ARN n’est pas toujours visible et est parfois lâche en présence d’éthanol.
  9. Ajouter 500 μL d’éthanol froid à 80 %.
  10. Centrifuger à 16 000 x g pendant 5 min à 4 °C.
  11. Jetez l’éthanol en le pipetant lentement. Séchez la pastille à l’aide d’un concentrateur à vide, 5 min en mode de fonctionnement.
  12. Ressusciter la pastille dans un volume approprié (15-50 μL) d’eau ultrapure. Congeler la pastille à -20 °C pour une utilisation ultérieure.
  13. Évaluer la quantité d’ARN (260 nm) et la qualité (rapports de longueur d’onde 260/280 et 260/230) à l’aide d’un spectrophotomètre/fluoromètre (voir la table des matériaux). Suivez attentivement les instructions du fabricant.
    NOTA : 3-4 μg sont généralement obtenus dans la fraction d’élution (E). Cela dépend principalement des conditions testées.

9. Analyse de la purification par affinité MS2 par transfert Northern36

  1. Diluer 5 μg d’ARN des fractions CE, FT, W et 500 ng de fraction E dans 10 μL d’eau ultrapure et mélanger avec 10 μL de tampon de charge d’ARN.
  2. Incuber 3 min à 90 °C.
  3. Chargez les échantillons dans des puits d’un gel d’agarose à 1% complété par 20 mM de thiocyanate de guanidium et faites fonctionner le gel à 100-150 V dans un tampon TBE 1x à 4 °C. Lisez Koontz (2013)37 pour plus de détails.
  4. Transférer les ARN sur une membrane de nitrocellulose par transfert sous vide pendant 1h ou transfert de capillarité pendant la nuit.
    Remarque : la méthode de capillarité est plus efficace pour les grands ARN.
  5. ARN de réticulation UV sur la membrane (120 mJ à 254 nm) à l’aide d’un réticulant ultraviolet.
  6. Insérez la membrane dans une bouteille d’hybridation avec le côté ARN tourné vers le haut.
  7. Ajouter 10-20 mL de solution d’hybridation préchauffée. Incuber 30 min à 68 °C.
  8. Jetez la solution et ajoutez 10 à 20 mL de solution d’hybridation fraîche complétée par 1 μL de sonde spécifique à l’ARNs. Incuber pendant la nuit à 68 °C.
    REMARQUE : La sonde d’ARN marquée DIG est synthétisée à l’aide d’une trousse d’étiquetage de l’ARN DIG et en suivant les instructions du fabricant. Alternativement, une sonde radiomarquée peut être utilisée.
  9. Laver la membrane avec 10-20 mL de solution de lavage 1 (2x SSC et 0,1% SDS) pendant 5 min à 20 °C. Répétez une fois.
  10. Laver la membrane avec 10-20 mL de solution de lavage 2 (0,2x SSC et 0,1% SDS) pendant 15 min à 68 °C. Répétez une fois.
  11. Incuber avec 10-20 mL de solution de blocage pendant au moins 30 min à 20 °C.
  12. Jeter la solution et ajouter 10-20 mL de la solution bloquante complétée par l’anticorps polyclonal anti-digoxigenin (1/1000), conjugué à la phosphatase alcaline. Incuber 30 min à 20 °C.
  13. Laver la membrane avec 10-20 mL de la solution de lavage 3 (1x acide maléique et 0,3% Tween 20) pendant 15 min à 20 °C. Répétez une fois.
  14. Incuber la membrane avec 10-20 mL de la solution de détection (0,1 M Tris HCl et 0,1 M NaCl pH 9,5) 5 min à 20 °C.
  15. Mettez la membrane sur un film plastique et faites-la tremper avec le substrat (voir tableau des matériaux). Incuber 5 min dans l’obscurité.
  16. Scellez la membrane dans un film plastique. Mettez la membrane dans une cassette d’autoradiographie.
  17. Exposez la membrane à un film d’autoradiographie dans la pièce sombre dédiée.
    REMARQUE: Le temps d’exposition dépend de la force du signal, de quelques secondes à quelques minutes.
  18. Révélez le film exposé dans un dispositif de développement automatique.

10. Préparation des échantillons pour le séquençage de l’ARN

REMARQUE : Cette étape ne concerne que les ARN extraits des fractions E et CE.

  1. Ajouter à chaque échantillon 10 μL de tampon DNase 10x et de DNase I (1 U/μg d’ARN traités). Ajouter de l’eau pour un volume final de 100 μL.
  2. Incuber 1 h à 37 °C.
  3. Extraire et purifier les ARN comme décrit précédemment (étapes 8.2 à 8.11).
  4. Ressusciter la pastille d’ARN dans 20 μL d’eau ultrapure.
    REMARQUE : La présence d’ADN restant peut être vérifiée à l’aide de la PCR et d’amorces spécifiques (p. ex. gène 16S).
  5. Évaluer la quantité et la qualité de l’ARN à l’aide d’un système d’analyse par électrophorèse basé sur la microfluidique (voir la table des matériaux).
    REMARQUE: 1 μg est généralement obtenu dans la fraction d’élution (E) après traitement par DNase.
  6. Retirez les ARN ribosomiques à l’l’munition d’un kit d’épuisement de l’ARNr bactérien.
    REMARQUE : les ARN volumineux et abondants (c’est-à-dire les ARNr) ont tendance à interagir non spécifiquement avec la colonne d’affinité. 500 ng d’ARN extrait sont nécessaires pour effectuer cette étape.
  7. Évaluez à nouveau la quantité et la qualité de l’ARN à l’aide d’un système d’analyse par électrophorèse basé sur la microfluidique.
  8. Préparer des bibliothèques d’ADNc avec 10 à 20 ng d’ARN ribodéré à l’aide d’un kit de préparation de la bibliothèque d’ADNc et en suivant les instructions du fabricant.
  9. Séquencer les bibliothèques obtenues à l’aide d’un instrument de séquençage (p. ex., extrémité unique, 150 pb; voir la table des matériaux).
    REMARQUE: 5-10 millions de lectures par échantillon sont généralement suffisantes.

11. Analyse des données RNAseq (Figure 2)

  1. Téléchargez les fichiers de séquençage FastQ à partir de la plateforme de séquençage.
  2. Accès à l’instance Galaxy de la station biologique Roscoff (https://galaxy.sb-roscoff.fr/) et connexion.
    REMARQUE: Chaque algorithme mentionné peut être facilement trouvé à l’aide de la barre de recherche. Un guide de l’utilisateur est fourni pour chaque outil.
    Attention : La version des outils requis peut différer du serveur Galaxy public38.
  3. Cliquez sur l’icône Obtenir des données, puis sur Télécharger un fichier à partir de votre ordinateur. Téléchargez le fichier de séquençage FastQ de chaque contrôle MS2 et échantillons d’ARNsM2. Téléchargez également le fichier de génome de référence FASTA et le fichier d’annotation GFF.
  4. Exécutez les rapports FastQC Read Quality (Galaxy Version 0.69).
    Remarque : cet outil fournit une évaluation de la qualité des séquences brutes (par exemple, score de qualité, présence de séquences d’adaptateur).
  5. Exécutez l’outil de rognage de lecture flexible Trimmomatic (Galaxy Version 0.36.6) pour supprimer notamment les séquences d’adaptateurs et les lectures de mauvaise qualité. Indiquez les séquences d’adaptateurs utilisées pour la préparation de la bibliothèque (p. ex., TruSeq 3, à extrémité unique). Ajoutez les opérations Trimmomatic suivantes : SLIDINGWINDOW (Nombre de bases=4 ; Qualité moyenne = 20) et MINLEN (Longueur min des lectures = 20).
  6. Réexécutez les rapports FastQC Read Quality (Galaxy Version 0.69).
  7. Run Bowtie2 - la carte se lit par rapport au génome de référence (Galaxy Version 2.3.2.2). Utilisez le fichier FASTA de référence du génome de l’historique pour mapper les lectures avec les paramètres par défaut (local très sensible).
    Remarque : fichier BAM généré par l’outil Bowtie2 peut être visualisé à l’aide de la visionneuse de génomique intégrative (IGV). Le fichier BAI associé sera également requis.
  8. Si vous le souhaitez, exécutez Flagstat qui compile les statistiques pour le jeu de données BAM (Galaxy Version 2.0).
  9. Exécutez htseq-count - Count (Galaxy Version 0.6.1) qui aligne les fonctions qui se chevauchent dans le fichier d’annotation GFF. Utilisez le mode Intersection (non vide).
  10. Archivez tous les fichiers de comptage bruts de l’analyse htseq-count dans un seul fichier Zip.
  11. Exécutez SARTools DESeq2 pour comparer les données (Galaxy Version 1.6.3.0). Fournissez le fichier Zip contenant les fichiers de comptage brut et le fichier de conception, un fichier délimité par des tabulations décrivant l’expérience. Suivez attentivement les instructions fournies pour générer le fichier de conception.

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Representative Results

Les résultats représentatifs proviennent de l’étude du targetome RsaC chez S. aureus29. RsaC est un ARNs 1,116 nt-long non conventionnel. Son extrémité 5' contient plusieurs régions répétées tandis que son extrémité 3' (544 nt) est structurellement indépendante et contient tous les sites d’interaction prédits avec ses cibles ARNm. L’expression de cet ARNs est induite lorsque le manganèse (Mn) est rare, ce qui est souvent produit dans le contexte de la réponse immunitaire de l’hôte. À l’aide de la technologie MAPS, nous avons identifié plusieurs ARNm interagissant directement avec RsaC, révélant son rôle crucial dans les réponses au stressoxydatif (sodA, ldh1 et sarA)et liées aux métaux(znuBC-zur et sufCDSUB).

Validation de la construction de l’ARNsM2 et des conditions expérimentales
Avant d’effectuer des expériences MAPS, il est important de déterminer les conditions optimales d’expression de l’ARNs étudié. Si un promoteur non natif est utilisé, il aidera définitivement à produire la construction MS2-sRNA lorsque ses cibles sont présentes. En outre, la construction de l’ARNsM2 doit être soigneusement validée en ce qui concerne la taille, la stabilité, l’expression et la fonction. L’aptamère MS2 a été fusionné à l’extrémité 5' du RsaC pleine longueur (MS2-RsaC1116)ou de la forme plus courte (MS2-RsaC544)correspondant à la partie 3' de RsaC. Les deux constructions ont été exprimées in vivo sous le contrôle du promoteur P3 dépendant de la détection de quorum chez S. aureus HG001 ΔrsaC. La suppression du gène rsaC évite une concurrence entre le RsaC endogène et le MS2-RsaC. La souche de type sauvage contenant le même vecteur avec la balise MS2 seule a été utilisée comme témoin. Ce contrôle permet de soustraire les interactions non spécifiques qui se produisent avec la balise MS2.

Pour confirmer les constructions et visualiser leur modèle d’expression, des cellules bactériennes ont été récoltées après 2 h, 4 h et 6 h de croissance en milieu BHI à 37 °C. Après l’extraction de l’ARN, l’analyse par transfert Northern a été effectuée à l’aide d’une sonde DIG spécifique à RsaC(figure 3A). Le niveau de RsaC endogène (voies 1-3) a augmenté de manière significative après 6 h de croissance, justifiant le choix de ce point de temps pour des expériences de CARTES. Il est important de savoir que les niveaux de MS2-RsaC544 (voies 7-9) et de MS2-RsaC1 116 (voies 10-12) étaient comparables à ceux de RsaC endogène à 6 h. Par conséquent, ils devraient imiter le modèle d’expression endogène de RsaC. Une forme plus grande mais mineure de RsaC était distinguable et pourrait être due à une fin inefficace de la transcription. Ce phénomène est fréquemment observé lorsqu’un ARNsm2 est exprimé sous le contrôle d’un promoteur fort à partir d’un plasmide21. Aucune forme plus courte résultant de l’arrêt ou de la dégradation anorma de transcription n’a été observée.

L’ajout de l’aptamère MS2 aux 5' des ARNs pourrait également perturber leur pliage approprié et affecter leurs fonctions. Cette étape est essentielle pour les ARNrs hautement structurés comme RsaC. Par conséquent, l’activité de l’ARNsM2 devrait être testée et comparée à l’ARNs endogène lorsque cela est possible. Une cible déjà connue ou un phénotype observable peut aider à la surveiller. Par exemple, l’impact de RsaC sur l’accumulation de ROS intracellulaires a été utilisé pour valider les constructions MS2-RsaC544 et MS2-RsaC1,116 29.

Analyse des fractions collectées lors de la purification par affinité
Les ARN ont été extraits des fractions CE, FT et E dans la souche WT exprimant la balise MS2 seule et la souche ΔrsaC exprimant la construction MS2-RsaC544. Nous avons montré à l’aide de l’analyse par transfert northern que le RsaC endogène de 1 116 nt de long était enrichi en fraction d’élution, mais qu’il s’est avéré interagir de manière non spécifique avec la colonne d’affinité(figure 3B,voies 2-3). Nous avons observé le même phénomène avec MS2-RsaC1,116 (données non montrées). Cela est certainement dû à sa longueur et à sa structure secondaire complexe. Par conséquent, seule une forme moins structurée et plus courte (544 nt) de RsaC correspondant à sa partie 3' a été utilisée pour effectuer des expériences MAPS. Sur la figure 3B,le MS2-RsaC544 a été fortement enrichi en fraction d’élution démontrant qu’il a été retenu avec succès par la protéine de fusion MS2-MBP (voie 6). Une forme plus grande mais mineure de MS2-RsaC544 a été observée comme sur la figure 3A. Ici, la rigueur et le nombre de lavages peuvent être ajustés pour réduire la liaison non spécifique ou, au contraire, pour limiter la perte de véritables partenaires en interaction.

Validation de cibles d’ARNm putatives après analyse MAPS
Suite à l’analyse bioinformatique, les cibles putatives d’ARNm sont répertoriées en fonction du changement de pliage entre l’ARNsM2 et le témoin MS2, obtenu à l’aide de DeSeq2(Figure 2). Par exemple, les données MS2-RsaC544 MAPS29 suggèrent que l’ARNm sodA, codant pour une superoxyde dismutase chez S. aureus, est une cible principale (meilleur coup, changement de pli plus élevé). Une analyse par transfert Northern, effectuée avec une sonde DIG spécifique à la sodAaprès purification par affinité MS2, montre que la sodA a été efficacement co-enrichie avec MS2-RsaC544 par rapport au témoin MS2(Figure 3C).

Une analyse transcriptomique globale est systématiquement réalisée sur la fraction CE. La comparaison des données MAPS et cette analyse transcriptomique permet d’ajuster le taux d’enrichissement et révèle une hiérarchie cible potentielle. En effet, un ARNm mal exprimé, qui est fortement enrichi après purification par affinité MS2 a certainement une plus grande affinité de liaison qu’un ARNm hautement enrichi et fortement exprimé.

Il est important de noter que tous les candidats identifiés par MAPS doivent être validés individuellement à l’aide d’expériences in vitro et/ou in vivo telles que les tests de déplacement de mobilité par électrophorèse (EMSA) ou les tests de gènes rapporteurs (voir Jagodnik et coll. (2017)39 pour plus de détails).

Figure 1
Figure 1. Illustration schématique du protocole MAPS adapté à S. aureus. De la construction plasmidique à l’analyse des données. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Flux de travail d’analyse MAPS et données traitées. Chaque étape, point de contrôle et format de fichier sont représentés (voir aussi l’étape 11). Le format FastQ est un fichier texte composé des séquences d’ADN et des scores de qualité correspondants. Le format BAM est un fichier compressé contenant des séquences alignées. Le format tabulaire est un fichier texte délimité par des tabulations avec des nombres pour chaque gène. Le graphique des résultats illustre le type de données obtenues après analyse bioinformatique. Les résultats présentés sont fictifs et ne proviennent d’aucune étude. Pour plus de détails, des tutoriels de base sont disponibles sur le site Web de Galaxy Project (https://galaxyproject.org/). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Construit des contrôles de validation et de cartes. A. Analyse par transfert de Northern de l’ARNdb RsaC endogène et des constructions MS2 connexes. La souche WT porte la souche mutante pCN51-P3-MS2 (témoin) et la souche mutante ΔrsaC portent soit la souche pCN51-P3-MS2, pCN51-P3-MS2-RsaC544, soit la souche pCN51-P3-MS2-RsaC1 116. Des échantillons ont été prélevés après 2 h, 4 h et 6 h de croissance de BHI à 37 °C. Des essais de transfert de Northern ont été exécutés utilisant une sonde dig RsaC-spécifique. B. Analyse par transfert Northern de fractions de purification par affinité MS2 à l’aide d’une sonde DIG spécifique à rsac. La co-purification a été réalisée à l’aide de la souche WT + pCN51-P3-MS2 (témoin) et de la souche mutante ΔrsaC + pCN51-P3-MS2-RsaC544. Les cellules ont été récoltées après 6 h de croissance de BHI à 37 °C. Extrait brut (CE), flux à écoulement (FT), élution (E). C. Analyse par transfert Northern des fractions de purification par affinité MS2 (CE et E) à l’aide d’une sonde DIG spécifique à la sodA. Voir (B) pour plus de détails. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

ARN type référence
Escherichia coli
RyhB ARNdb Lalaouna et coll. (2015)21
RybB ARNdb Lalaouna et al. (2015) 21 ans
3'ETSleuZ Fragment dérivé de l’ARNt Lalaouna et Massé (2015)26
DsrA ARNdb Lalaouna et al. (2015) 22 ans
Hns ARNm (5'UTR) Lalaouna et al. (2015) 22 ans
CyaR ARNdb Lalaouna et al. (2018) 23 ans
RprA ARNdb Lalaouna et al. (2018) 23 ans
GcvB ARNdb Lalaouna et al. (2019) 24 ans
Salmonelle Typhimurium
SraL ARNdb Silva et al. (2019) 25 ans
Staphylococcus aureus
RsaA ARNdb Tomasini et al. (2017) 27 ans
RsaC ARNdb Lalaouna et al. (2019) 29 ans
RsaI ARNdb Bronesky et al. (2019) 28 ans

Tableau 1. La technologie MAPS a révélé le targetome de plusieurs ARN dans divers organismes.

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Discussion

Un protocole modifié pour les bactéries à Gram positif
Le protocole initial de MAPS a été développé pour étudier l’interactome de l’ARNs dans l’organisme modèle E. coli20,30. Ici, nous décrivons un protocole modifié qui convient à la caractérisation des réseaux de régulation ARN-dépendants dans l’agent pathogène humain opportuniste S. aureus et est certainement transposable à d’autres bactéries Gram-positives, pathogènes ou non.

Une attention particulière a été accordée à l’étape de lyse cellulaire. La presse Français a été remplacée par un instrument de lyse cellulaire mécanique. Cette méthode est efficace pour briser les cellules à Gram positif et limiter les risques associés à la manipulation de souches pathogènes. Pour améliorer le rendement de la purification par affinité MS2, la quantité de MS2-MBP immobilisée sur la résine amylose a été considérablement augmentée. Cela a nécessité d’ajuster la rigueur et le nombre de lavages.

Contrairement au protocole initial, MAPS est ici réalisé en double exemplaire, à partir de deux répliques biologiques. Un flux de travail a été développé pour mettre en œuvrel’analysestatistique ( Figure 2 ), ce qui augmente définitivement la robustesse des données obtenues.

Construction MS2 et son expression
Ce protocole MAPS a été établi pour identifier le targetome des ARNs staphylococcique. La construction de l’ARNsM2 est exprimée à partir d’un plasmide à faible nombre de copies (pCN51, 20 à 25 copies/cellule) et sous le contrôle du promoteur P3 dépendant de la détection du quorum, principalement induit pendant la phase stationnaire. Ce modèle d’expression correspond aux ARNs étudiés chez S. aureus (c’est-à-dire RsaA, RsaI et RsaC) et assure une synthèse assez forte de l’ARNsM2. Cependant, nous ne pouvons pas exclure que dans d’autres cas, le promoteur P3 puisse ne pas être approprié et ne reflète pas l’état physiologique naturel des bactéries lorsque l’ARNs est induit. Une autre façon de contrôler la production d’ARNsm2 est d’utiliser des promoteurs chimiquement inductibles (p. ex. promoteurs inductibles à la tétracycline). Ces outils permettent une expression d’impulsion de la construction ms2-sRNA, mais ce réglage ne garantit pas que les cibles d’ARN seront exprimées simultanément. Un autre inconvénient est que l’expression d’un plasmide peut conduire à la surproduction de l’ARNs étudié, encore plus souligné avec un vecteur de nombre de copies élevé. Cela pourrait entraîner des interactions artefactuelles ou la perturbation des fonctions d’chaperon d’ARN associées. L’alternative la plus appropriée consiste à insérer une étiquette MS2 à l’extrémité 5' du gène de l’ARNr endogène. Ainsi, l’ARNsM2 serait codé chromosomiquement et sous le contrôle de son promoteur natif. Cela devrait mieux imiter l’expression endogène de l’ARNs étudié et éviter le biais dû à la surproduction de l’ARNs étudié. Dans tous les cas, l’étape cruciale consiste à vérifier soigneusement la longueur, la stabilité et la fonctionnalité de la construction de l’ARNsM2, notamment en utilisant des tests northern blot avec de l’ARN total extrait de cultures cultivées dans des conditions qui déclenchent la production et la fonction endogènes de l’ARNs. Indéniablement, l’utilisation d’une construction d’ARNsM2 incorrecte/non fonctionnelle peut affecter considérablement les résultats générés, soutenant l’importance des contrôles décrits ci-dessus. Enfin, l’ARNsM2 est toujours produit dans un fondd’ARNs Δ afin de maximiser l’enrichissement des cibles d’ARNm. De plus, des expériences peuvent être réalisées dans des souches hôtes présentant des mutations spécifiques chez les RNases (par exemple, des mutants de délétion ou des mutants sensibles à la température) pour éviter la dégradation des cibles d’ARNm par le recrutement dépendant de l’ARN des RNases.

La validation expérimentale des candidats identifiés par MAPS est toujours requise
Un point qui doit être pris en compte est que MAPS fournit une liste de cibles d’ARN putatives. Cependant, certains ARN peuvent être indirectement enrichis par interaction avec une cible d’ARNm partagée ou une protéine de liaison à l’ARN. Par conséquent, les candidats révélés doivent être confirmés par d’autres approches expérimentales. Les expériences d’EMSA et d’empreintes sont couramment utilisées pour visualiser la liaison directe d’un ARNs à des cibles d’ARN putatives in vitro. Ensuite, les tests d’impression in vitro aident à surveiller l’impact d’un ARNl sur l’initiation de la traduction de sa cible d’ARNm. Enfin, les tests de transfert northern et/ou de rapporteur de gènes(lacZ ou gfp)complètent cette validation expérimentale in vivo. Toutes ces approches sont décrites dans Jagodnik et coll. (2017)39.

Contrairement aux technologies RIL-seq et CLASH, MAPS ne fournit pas directement d’informations sur les sites d’interaction. Néanmoins, un pic de lectures cartographiées est fréquemment observé dans une région restreinte de la cible d’ARN (par exemple, l’extrémité 3' de l’opéron glyW-cysT-leuZ 21),facilitant l’identification du site d’appariement. Alternativement, plusieurs outils de prédiction peuvent être utilisés pour prédire le site de liaison putatif sur la cible identifiée tels que IntaRNA40.

MAPS scrute le targetome d’un ARNr particulier
La technologie MAPS convient à l’étude du targetome de l’ARNs dans les bactéries Gram négatif telles que E. coli et S. Typhimurium, mais aussi maintenant avec ce protocole modifié dans les bactéries à Gram positif comme S. aureus. Fondamentalement, MAPS offre un instantané des duplex ARN:ARNs formés à un moment donné et dans des conditions de croissance spécifiques. Malheureusement, la liste des cibles d’ARNm pourrait être incomplète. Par exemple, une cible d’ARNm apparentée pourrait être omise en raison de conditions expérimentales inappropriées, justifiant les précautions mentionnées ci-dessus.

Par rapport à d’autres méthodes couramment utilisées telles que RIL-seq ou CLASH, MAPS utilise un ARNR spécifique pour co-purifier toutes les cibles d’ARN en interaction. Ici, les interactions ARN/ARN ne sont pas diluées parmi d’autres duplex associés au RBP, ce qui permet théoriquement de caractériser plus en profondeur son targetome. Cependant, il semble que les méthodes RIL-seq/CLASH et MAPS ont révélé différents ensembles de cibles putatives d’ARNs12,41,ce qui suggère que ces approches expérimentales sont complémentaires. Cet écart pourrait s’expliquer par des variations dans les conditions de croissance et/ou un biais généré par chaque méthode.

Par conséquent, le but de l’étude devrait influencer le choix de la méthode. Pour une analyse globale des targetomes de l’ARNs et lorsqu’un RBP est impliqué dans la régulation médiée par l’ARNs, les méthodes RIL-seq et CLASH doivent être préférées. Les deux approches fournissent une vue d’ensemble des réseaux de réglementation qui s’appuient sur un RBP particulier et, par conséquent, découvrent une grande variété d’ARNs et de cibles associées. Au contraire, pour l’étude d’un ARNs spécifique ou lorsqu’aucun RBP n’est connu/impliqué, MAPS représente une option appropriée.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ces travaux ont été soutenus par l’Agence Nationale de la Recherche (ANR, Subvention ANR-16-CE11-0007-01, RIBOSTAPH, et ANR-18-CE12- 0025-04, CoNoCo, à PR). Il a également été publié dans le cadre du labEx NetRNA ANR-10-LABX-0036 et de l’ANR-17-EURE- 0023 (à PR), en tant que financement de l’État géré par ANR dans le cadre des investissements pour le futur programme. DL a été soutenu par le programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention Marie Skłodowska-Curie n° 753137-SaRNAReg. Les travaux du laboratoire E. Massé ont été appuyés par des subventions de fonctionnement des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC), du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) et de la subvention d’équipe R01 GM092830-06A1 des NIH des National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Sarstedt 72.690.001
15 mL centrifuge tubes Falcon 352070
2 mL microcentrifuge tube Starstedt 72.691
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent G2939BA RNA quantity and quality
250 mL culture flask Dominique Dutscher 2515074 Bacterial cultures
50 mL centrifuge tubes Falcon 352051 Culture centrifugation
Absolute ethanol VWR Chemicals 20821.321 RNA extraction and purification
Allegra X-12R Centrifuge Beckman Coulter Bacterial pelleting
Ampicilin (amp) Sigma-Aldrich A9518-5G Growth medium
Amylose resin New England BioLabs E8021S MS2-affinity purification
Anti-dioxigenin AP Fab fragment Sigma Aldrich 11093274910 Northern blot assays
Autoradiography cassette ThermoFisher Scientific 50-212-726 Northern blot assays
BamHI ThermoFisher Scientific ER0051 Plasmid construction
BHI (Brain Heart Infusion) Broth Sigma-Aldrich 53286 Growth medium
Blocking reagent Sigma Aldrich 11096176001 Northern blot assays
CDP-Star Sigma Aldrich 11759051001 Northern blot assays (substrate)
Centrifuge 5415 R Eppendorf RNA extraction and purification
Chloroform Dominique Dutscher 508320-CER RNA extraction and purification
DIG-RNA labelling mix Sigma-Aldrich 11277073910 Northern blot assays
DNase I Roche 4716728001 DNase treatment
Erythromycin (ery) Sigma-Aldrich Fluka 45673 Growth medium
FastPrep device MP Biomedicals 116004500 Mechanical lysis
Guanidium Thiocyanate Sigma-Aldrich G9277-250G Northern blot assays
Hybridization Hoven Hybrigene Techne FHB4DD Northern blot assays
Hybridization tubes Techne FHB16 Northern blot assays
Isoamyl alcohol Fisher Scientific A/6960/08 RNA extraction and purification
LB (Lysogeny Broth) Sigma-Aldrich L3022 Growth medium
Lysing Matrix B Bulk MP Biomedicals 6540-428 Mechanical lysis
MicroPulser Electroporator BioRad 1652100 Plasmid construction
Milli-Q water device Millipore Z00QSV0WW Ultrapure water
NanoDrop spectrophotometer ThermoFisher Scientific RNA/DNA quantity and quality
Nitrocellulose membrane Dominique Dutsher 10600002 Northern blot assays
Phembact Neutre PHEM Technologies BAC03-5-11205 Cleaning and decontamination
Phenol Carl Roth 38.2 RNA extraction and purification
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530 Plasmid construction
pMBP-MS2 Addgene 65104 MS2-MBP production
Poly-Prep chromatography column BioRad 7311550 MS2-affinity purification
PstI ThermoFisher Scientific ER0615 Plasmid construction
Qubit 3 Fluorometer Invitrogen 15387293 RNA quantity
RNAPro Solution MP Biomedicals 6055050 Mechanical lysis
ScriptSeq Complete Kit Illumina BB1224 Preparation of cDNA librairies
Spectrophotometer Genesys 20 ThermoFisher Scientific 11972278 Bacterial cultures
SpeedVac Savant vacuum device ThermoFisher Scientific DNA120 RNA extraction and purification
Stratalinker UV Crosslinker 1800 Stratagene 400672 Northern blot assays
T4 DNA ligase ThermoFisher Scientific EL0014 Plasmid construction
TBE (Tris-Borate-EDTA) Euromedex ET020-C Northern blot assays
ThermalCycler T100 BioRad 1861096 Plasmid construction
Tween 20 Sigma Aldrich P9416-100ML Northern blot assays
X-ray film processor hu.q HQ-350XT Northern blot assays
X-ray films Super RX-N FujiFilm 4741019318 Northern blot assays

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Retraction MAPS Regulatory RNA RNA sequencing Targetome Regulatory network Co-purification MS2 aptamer Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus
Purification par affinité MS2 couplée au séquençage de l’ARN dans les bactéries à Gram positif
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Mercier, N., Prévost, K.,… More

Mercier, N., Prévost, K., Massé, E., Romby, P., Caldelari, I., Lalaouna, D. MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria. J. Vis. Exp. (168), e61731, doi:10.3791/61731 (2021).

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