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Biochemistry

एमएस 2-आत्मीयता शुद्धि ग्राम-सकारात्मक बैक्टीरिया में आरएनए अनुक्रमण के साथ मिलकर

Published: February 23, 2021 doi: 10.3791/61731
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 1, 1
1Université de Strasbourg, CNRS, 2Department of Biochemistry, Université de Sherbrooke

Summary

वीवो में एक विशिष्ट नियामक आरएनए के लक्ष्य की छानबीन के लिए मैप्स तकनीक विकसित की गई है। ब्याज की SRNA एक MS2 aptamer के साथ टैग किया गया है जो अपने आरएनए भागीदारों के सह-शुद्धिकरण और आरएनए अनुक्रमण द्वारा उनकी पहचान को सक्षम करता है। यह संशोधित प्रोटोकॉल विशेष रूप से ग्राम-सकारात्मक बैक्टीरिया के लिए अनुकूल है।

Abstract

यद्यपि छोटे नियामक आरएनए (एसआरएएनए) जीवन के बैक्टीरियल डोमेन के बीच व्यापक हैं, उनमें से कई के कार्य विशेष रूप से अपने एमआरएनए लक्ष्यों की पहचान करने में कठिनाई के कारण खराब विशेषता रखते हैं। यहां, हमने वीवो में एक विशिष्ट SRNA के सभी आरएनए भागीदारों को प्रकट करने के उद्देश्य से आरएनए अनुक्रमण (मानचित्र) प्रौद्योगिकी के साथ मिलकर MS2-आत्मीयता शुद्धि के एक संशोधित प्रोटोकॉल का वर्णन किया। मोटे तौर पर, MS2 इप्टमर ब्याज की SRNA के 5 ' चरम पर जुड़ा हुआ है । यह निर्माण तब वीवो में व्यक्त किया जाता है, जिससे एमएस 2-एसआरएनए को अपने सेलुलर भागीदारों के साथ बातचीत करने की अनुमति होती है। बैक्टीरियल हार्वेस्टिंग के बाद, कोशिकाओं को यांत्रिक रूप से lysed किया जाता है। कच्चे तेल निकालने के लिए एक एमिलोज आधारित क्रोमेटोग्राफी कॉलम में लोड किया जाता है जो पहले MS2 प्रोटीन के साथ लेपित होता है जो माल्टोज बाध्यकारी प्रोटीन के लिए जुड़ा हुआ है । यह MS2-sRNA के विशिष्ट कब्जे और बातचीत RNAs सक्षम बनाता है । उन्मूलन के बाद, सह-शुद्ध आरएनए की पहचान उच्च-थ्रूपुट आरएनए अनुक्रमण और बाद में बायोइन्फॉर्मेटिक विश्लेषण द्वारा की जाती है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल को ग्राम-सकारात्मक मानव रोगजनक स्टेफिलोकोकस ऑरियस में लागू किया गया है और सैद्धांतिक रूप से, किसी भी ग्राम-सकारात्मक बैक्टीरिया के लिए स्थानांतरित किया जा सकता है। संक्षेप में, मैप्स तकनीक एक विशेष एसआरएनए के नियामक नेटवर्क का गहराई से पता लगाने के लिए एक कुशल विधि का गठन करती है, जो इसके पूरे टारगेटोम का स्नैपशॉट पेश करती है। हालांकि, यह ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है कि मानचित्र द्वारा पहचाने गए ख्यात लक्ष्यों को अभी भी पूरक प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों द्वारा मान्य किए जाने की आवश्यकता है ।

Introduction

सैकड़ों, शायद यहां तक कि छोटे नियामक RNAs (sRNAs) के हजारों सबसे जीवाणु जीनोम में पहचान की गई है, लेकिन उनमें से अधिकांश के कार्य अस्वाभावित रहते हैं । कुल मिलाकर, एसआरएएनए छोटे गैर-कोडिंग अणु हैं, जो बैक्टीरियल फिजियोलॉजी में प्रमुख भूमिकाएं निभाते हैं और वातावरण में उतार-चढ़ाव के लिए अनुकूलन करते हैं1,2,3। दरअसल, ये मैक्रोमॉलिक कई जटिल नियामक नेटवर्क के केंद्र में हैं, जो मेटाबोलिक रास्तों, तनाव प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करते हैं, लेकिन उग्रता और एंटीबायोटिक प्रतिरोध भी करते हैं। तार्किक रूप से, उनका संश्लेषण विशिष्ट पर्यावरण उत्तेजनाओं (जैसे, पोषक तत्वों की भुखमरी, ऑक्सीडेटिव या झिल्ली तनाव) से शुरू होता है। अधिकांश एसआरएनए लघु और गैर-समीपस्थ आधार पेयरिंग के माध्यम से पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शनल स्तर पर कई लक्ष्य mRNAs को विनियमित करते हैं। वे आमतौर पर अनुवाद दीक्षा क्षेत्रों के लिए राइबोसोम्स के साथ प्रतिस्पर्धा करके अनुवाद दीक्षा को रोकते हैं। एसआरएनए का गठन: एमआरएनए डुप्लेक्स भी अक्सर विशिष्ट RNases की भर्ती द्वारा लक्ष्य एमआरएनए के सक्रिय क्षरण में परिणाम देता है।

एक SRNA targetome के लक्षण वर्णन (यानी, अपने लक्ष्य RNAs के पूरे सेट) मेटाबोलिक रास्ते जिसमें यह हस्तक्षेप और संभावित संकेत यह जवाब की पहचान की अनुमति देता है । नतीजतन, एक विशिष्ट एसआरएनए के कार्यों को आम तौर पर इसके टारगेटोम से अनुमानित किया जा सकता है। इस उद्देश्य के लिए, सिलिको भविष्यवाणी उपकरणों में कई ऐसे IntaRNAऔर CopraRNA5,6,7के रूप में विकसित किया गया है । वे विशेष रूप से अनुक्रम पूरकता पर भरोसा करते हैं, ख्यात SRNA भागीदारों का निर्धारण करने के लिए ऊर्जा और संभावित बातचीत साइट की पहुंच बांधना। हालांकि, भविष्यवाणी एल्गोरिदम वीवो में आधार-पेयरिंग को प्रभावित करने वाले सभी कारकों को एकीकृत नहीं करते हैं जैसे कि आरएनए चैपरोन्स8 की भागीदारी उप-इष्टतम बातचीत या दोनों भागीदारों की सह-अभिव्यक्ति का पक्ष लेते हैं। उनकी अंतर्निहित सीमाओं के कारण, भविष्यवाणी उपकरणों की झूठी सकारात्मक दर अधिक रहती है। अधिकांश प्रायोगिक बड़े पैमाने पर दृष्टिकोण एसआरएनए के सह-शुद्धिकरण पर आधारित होते हैं: एमआरएनए जोड़े एक टैग किए गए आरएनए बाइंडिंग प्रोटीन (आरबीपी)6,9के साथ बातचीत करते हैं। उदाहरण के लिए, लिगेशन और सीक्वेंसिंग (आरआईएल-सेक्यू) विधि द्वारा आरएनए इंटरैक्शन ने एशेरिचिया कोलाई10, 11में एचएफक्यू और प्रोक्यू जैसे आरएनए चैपरोन्स के साथ सह-शुद्ध आरएनए डुप्लेक्स की पहचानकी। यूवी-क्रॉसलिंकिंग, लिगेशन और सीक्वेंसिंग ऑफ हाइब्रिड (क्लैश) नामक इसी तरह की तकनीक ई कोलाई12, 13में आरएनएसई ई-और एचएफक्यू से जुड़े एसआरएएनए पर लागू की गई थी । कई बैक्टीरिया8,14, 15में एसआरएनए-मध्यस्थता विनियमन में एचएफक्यू और प्रोक्यू की अच्छी तरह से वर्णित भूमिकाओं के बावजूद, एसआरएनए आधारित विनियमन एस ऑरियस16, 17, 18जैसे कई जीवों में आरएनए चैपरोन-स्वतंत्र प्रतीत होता है। यहां तक कि अगर RNases के सहयोग से आरएनए डुप्लेक्स का शुद्धिकरण संभव है जैसा कि जल और सहकर्मियोंद्वारा 13का प्रदर्शन किया गया है, तो यह मुश्किल बना हुआ है क्योंकि RNases उनके तेजी से क्षरण को ट्रिगर करता है। इसलिए, एमएस2-एफ़िनिटी शुद्धि आरएनए अनुक्रमण (मानचित्र) दृष्टिकोण19,20 के साथ मिलकर ऐसे जीवों में एक ठोस विकल्प बनता है।

उपर्युक्त विधियों के विपरीत, मानचित्र सभी बातचीत करने वाले आरएनए को पकड़ने के लिए चारा के रूप में एक विशिष्ट एसआरएनए का उपयोग करता है और इसलिए आरबीपी की भागीदारी पर भरोसा नहीं करता है। इस पूरी प्रक्रिया को चित्र 1में दर्शाया गया है . संक्षेप में, SRNA MS2 आरएनए इप्टामर के साथ 5 ' पर टैग किया गया है जो विशेष रूप से MS2 कोट प्रोटीन द्वारा मान्यता प्राप्त है। इस प्रोटीन को मैस्टोज बाइंडिंग प्रोटीन (एमबीपी) के साथ एक एमिलोज राल पर स्थिर किया जाता है। इसलिए, एमएस 2-एसआरएनए और इसके आरएनए भागीदारों को आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी कॉलम पर बनाए रखा जाता है। माल्टोज के साथ उन्मूलन के बाद, सह-शुद्ध आरएनए की पहचान उच्च-थ्रूपुट आरएनए अनुक्रमण का उपयोग करके की जाती है जिसके बाद बायोइंफॉर्मेटिक विश्लेषण(चित्रा 2)होता है। मैप्स तकनीक अंततः वीवो में होने वाली सभी संभावित बातचीत का एक बातचीत नक्शा खींचती है।

मानचित्र प्रौद्योगिकी मूल रूप से गैर रोगजनक ग्राम नकारात्मक जीवाणु ई. कोलाई21में लागू किया गया था । उल्लेखनीय रूप से, मैप्स ने एक tRNA-व्युत्पन्न टुकड़े की पहचान करने में मदद की विशेष रूप से RyhB और RybB sRNAs दोनों के साथ बातचीत और गैर-उत्प्रेरण स्थितियों में एमएनए लक्ष्यों को विनियमित करने के लिए किसी भी SRNA ट्रांसक्रिप्शनल शोर को रोकने के लिए । इसके बाद, मैप्स को अन्य ई. कोलाई एसआरएन जैसे डीएसआरए22,आरपीआरए 23, सीआर23और जीसीवीबी24 (तालिका 1)पर सफलतापूर्वक लागू किया गया है। पहले से ज्ञात लक्ष्यों की पुष्टि करने के अलावा, मानचित्र ने इन प्रसिद्ध एसआरएएनए के टारगेटोम को बढ़ाया। हाल ही में, मैप्स साल्मोनेला टाइफिमुरियम में किया गया है और पता चला है कि SraL sRNA rho mRNA के लिए बांधता है, एक प्रतिलेखन समाप्ति कारक25के लिए कोडिंग । इस बांधना के माध्यम से, SraL Rho द्वारा ही शुरू समय से पहले प्रतिलेखन समाप्ति से rho mRNA की रक्षा करता है । दिलचस्प बात यह है कि यह तकनीक एसआरएएनए तक ही सीमित नहीं है और इसे किसी भी प्रकार के सेलुलर आरएनए पर लागू किया जा सकता है जैसा कि एक ट्रान-व्युत्पन्न खंड26 और एमआरएनए22 (तालिका 1)के 5'-अनट्रांसलापारित क्षेत्र के उपयोग से उदाहरण है।

मैप्स विधि को रोगजनक ग्राम-सकारात्मक जीवाणु एस ऑरियस19के लिए भी अनुकूलित किया गयाहै । विशेष रूप से, लाइसिस प्रोटोकॉल को ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया की तुलना में मोटा सेल दीवार के कारण कोशिकाओं को कुशलतापूर्वक तोड़ने और आरएनए अखंडता को बनाए रखने के लिए व्यापक रूप से संशोधित किया गया है। इस अनुकूलित प्रोटोकॉल ने आरएसएए 27 , आरएसएआई28और आरएसएसी29 के इंटरैक्टोम को पहले ही खोल दिया था । इस दृष्टिकोण ने सेल सतह गुणों, ग्लूकोज तेज और ऑक्सीडेटिव तनाव प्रतिक्रियाओं के नियामक तंत्र में इन एसआरएन की महत्वपूर्ण भूमिका में अंतर्दृष्टि दी।

2015 में ई कोलाई में विकसित और लागू किए गए प्रोटोकॉल को हाल ही में30विस्तार से वर्णित किया गया है। यहां, हम संशोधित मानचित्र प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जो ग्राम-सकारात्मक (मोटा सेल वॉल) बैक्टीरिया में एसआरएनए नियामक नेटवर्क का अध्ययन करने के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है चाहे गैर-रोगजनक या रोगजनक (सुरक्षा सावधानियां)।

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Protocol

1. बफ़र्स और मीडिया

  1. मानचित्र प्रयोगों के लिए, निम्नलिखित बफ़र्स और मीडिया तैयार करें:
    - बफर ए (150 एमएमएम केसीएल, 20 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8, 1 एमएमएम एमजीसीएल2 और 1 एमएम डीटीटी)
    - बफर ई (250 एमएमएम केसीएल, 20 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8, 12 एमएम माल्टोज, 0.1% ट्राइटन, 1 एमएमएम एमजीसीएल2 और 1 एमएमएम डीटीटी)
    - आरएनए लोडिंग बफर (0.025% जाइलीन साइनोल और 8 एम यूरिया में 0.025% ब्रोमोफेनॉल ब्लू)
    - ब्रेन हार्ट इन्फ्यूजन (बीएचआई) माध्यम (बछड़े के मस्तिष्क का 12.5 ग्राम, पेप्टोन का 10 ग्राम, बीफ हार्ट का 5 ग्राम, एनएसीएल का 5 ग्राम, 2.5 ग्रामएनए 2एचपीओ4 और 1 एल के लिए ग्लूकोज का 2 ग्राम)
    - Lysogeny शोरबा (पौंड) माध्यम (पेप्टोन के 10 ग्राम, खमीर निकालने के 5 ग्राम और 1 एल के लिए NaCl के 10 ग्राम)
  2. उत्तरी दाग परख के लिए, निम्नलिखित बफ़र्स तैयार करें:
    - समाधान अवरुद्ध (1x मलिक एसिड और 1% अवरुद्ध अभिकर्मक)
    - संकरण समाधान (50% फॉर्ममाइड, 5x एसएससी, 7% एसडीएस, 1% अवरुद्ध समाधान और 0.2% एन-लॉरिल सारकोसैन, 50 m सोडियम फॉस्फेट)। आंदोलन के साथ गर्मी भंग करने के लिए।
    सावधानी: प्रत्येक उत्पाद से संबंधित सुरक्षा सावधानियों का सावधानीपूर्वक पालन करें।
    - 1 एम सोडियम फॉस्फेट (58 एमएम सोडियम फॉस्फेट डिबेसिक और 42 एमएम सोडियम फॉस्फेट मोनोबेसिक)
    - खारा, सोडियम साइट्रेट (एसएससी) बफर, 20x ध्यान केंद्रित (3 एम एनएसीएल और 300 m trisodium साइट्रेट)

2. सुरक्षा के मुद्दे

  1. स्तर 2 रोकथाम प्रयोगशाला में व्यवहार्य रोगजनक बैक्टीरिया से जुड़े सभी कदमों को पूरा करें।
    नोट: लाइसिस (चरण 5) के बाद केवल सेल अर्क को बाहर ले जाया जा सकता है।
  2. एक प्रयोगशाला कोट और दस्ताने पर रखो।
  3. सुनिश्चित करें कि कलाई कवर कर रहे हैं।
  4. कीटाणुनाशक समाधान के साथ जैविक सुरक्षा कैबिनेट (कक्षा II) को साफ करें।
  5. उपयुक्त बायोमेडिकल बिन में बैक्टीरिया के संपर्क में आने वाले ठोस कचरे को निपटाएं।
  6. कीटाणुनाशक समाधान के साथ दूषित तरल पदार्थ युक्त फ्लैक्स का इलाज करें। इसके बाद इसे सिंक में फेंक दें।
  7. ध्यान से साबुन के साथ हाथ और कलाई धोने और स्तर 2 रोकथाम प्रयोगशाला छोड़ने से पहले प्रयोगशाला कोट हटा दें।

3. प्लाज्मिड निर्माण

नोट: क्लोनिंग उद्देश्यों के लिए, पहले अंतर्जात sRNA की सीमाओं की पहचान करना महत्वपूर्ण है। PCN51-P3 और pCN51-P3-MS2 प्लाज्मिड्स टॉमासिनी एट अल (२०१७)27में वर्णित हैं । पी 3 प्रमोटर सेल-घनत्व-निर्भर तरीके से एसआरएनए की उच्च अभिव्यक्ति की अनुमति देता है (यानी, जब बैक्टीरिया विकास के स्थिर चरण में प्रवेश करते हैं)। इस विकास चरण के दौरान कई स्टेफिलोकोकल एसआरएन जमा होते हैं।

  1. एक उच्च निष्ठा डीएनए बहुलक और एक पीसीआर मशीन का उपयोग कर पीसीआर द्वारा SRNA अनुक्रम बढ़ाना । ध्यान से निर्माता के निर्देशों का पालन करें और अधिक जानकारी के लिए गरीबयान और अवाशिया(2013) 31 पढ़ें।
  2. विशिष्ट प्राइमर डिजाइन करने के लिए निम्नलिखित टेम्पलेट्स का उपयोग करें:
    Equation 1
    और 5'-सीजीसीजीजीजीटीसीसी(एन) -3 क्रमशः फॉरवर्ड और रिवर्स प्राइमर के लिए।
    नोट: ये ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स एमएस 2 अनुक्रम (बोल्ड में) को ब्याज के sRNA के 5 ' अंत तक फ्यूज करने में सक्षम बनाते हैं । पीएसटी मैं और बामहाय प्रतिबंध साइटों (रेखांकित) MS2-sRNA के 5 ' और 3 ' चरम पर जोड़ा जाता है pCN51-P3 प्लाज्मिड27में एम्प्लिकॉन क्लोन का निर्माण । (N) जीन-विशिष्ट अनुक्रम (15-20 न्यूक्लियोटाइड) से मेल खाती है।
  3. निर्माता की सिफारिशों के अनुसार उपयुक्त बफर में पीएन51-पी 3 प्लाज्मिड के 1 माइक्रोन और एमएस 2-एसआरएनए पीसीआर उत्पाद के 2 यू ऑफ पीएसटीI और 1यू ऑफ बाम एचआई के साथ डाइजेस्ट करें।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे इनक्यूबेट और एक पीसीआर शुद्धिकरण किट का उपयोग कर डीएनए शुद्ध (सामग्री की मेजदेखें) ।
  5. पचा pCN51-P3 प्लाज्मिड (300 एनजी) और MS2-sRNA एम्प्लिकॉन (वेक्टर के लिए मोलर अनुपात: डालें = 1:3) एक 1.5 एमएल ट्यूब में मिलाएं। लिगाशन दक्षता को अधिकतम करने के लिए रेवी एट अल(1988) 32 देखें। प्रत्येक ट्यूब में लिगासे बफर के 1 माइक्रोन और टी 4 लीगासे के 10 यू जोड़ें। मात्रा को अल्ट्रापुरे पानी के साथ 10 माइक्रोल में समायोजित करें।
  6. कम से कम 2 घंटे के लिए 22 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  7. जमे हुए DH5α रासायनिक सक्षम ई. कोलाई कोशिकाओं के 50 μL के लिए लिगेशन मिश्रण के 5 μL जोड़ें। पढ़ें Seidman एट अल ( २००१)३३ प्लाज्मिड परिवर्तन और रासायनिक रूप से सक्षम कोशिकाओं के बारे में अधिक जानने के लिए ।
  8. बर्फ पर 30 मिनट इनक्यूबेट।
  9. हीट शॉक (45 एस 42 डिग्री सेल्सियस पर) हीट ब्लॉक या वॉटर बाथ का उपयोग करके ट्रांसफॉर्मेशन ट्यूब।
  10. एलबी मीडियम के 900 माइक्रोन डालें और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  11. एम्पीसिलिन (100 माइक्रोग्राम/माइक्रोन) के साथ पूरक एक पौंड आगार प्लेट पर बैक्टीरियल निलंबन की प्लेट 100 माइक्रोन।
    नोट: PCN51-P3 वेक्टर एक एम्पीसिलिन प्रतिरोध जीन है, जो केवल ई. कोलाई क्लोन का चयन करने के लिए सक्षम बनाता है pCN51-P3-MS2-sRNA प्लाज्मिड ले जाने ।
  12. एक प्लाज्मिड डीएनए मिनीप्रेप किट (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके एम्पिसिलिन (100 माइक्रोग्राम/माइक्रोन) की उपस्थिति में उगाए गए एक रात के जीवाणु संस्कृति (5 एमएल) से पीसीएन51-पी 3-एमएस2-एसआरएनए प्लाज्मिड निकालें।
  13. निम्नलिखित प्राइमर, 5'-टीसीजीएएएटैगगिग-3'का उपयोग करके सेंगर अनुक्रमण34 द्वारा निर्माण को सत्यापित करें।
  14. DC10B रासायनिक रूप से सक्षम ई. कोलाई कोशिकाओं में pCN51-P3-MS2-sRNA प्लाज्मिड को बदलें। 3.7 से 3.11 तक के चरणों को दोहराएं।
  15. PCN51-P3-MS2-sRNA प्लाज्मिड निकालें (चरण 3.12 देखें) और एक इलेक्ट्रोपॉशन उपकरण का उपयोग कर HG001 1srna इलेक्ट्रोकंपेंट एस ऑरियस कोशिकाओं में प्लाज्मिड डीएनए के 1-5μg को बदल दें। ध्यान से निर्माता के निर्देशों का पालन करें। पढ़ें ग्रॉसर और रिचर्डसन (२०१६)३५ इलेक्ट्रोकंप्यूटेंट एस ऑरियसतैयार करने के तरीकों के बारे में अधिक जानने के लिए।
    सावधानी: इस कदम रोगजनक बैक्टीरिया की हैंडलिंग शामिल है (चरण 2 देखें)।
  16. बीएचआई माध्यम के 900 माइक्रोन जोड़ें और 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  17. 16,000 x ग्रामपर 1 मिनट सेंट्रलाइज। सुपरनेट को त्याग दें।
  18. बीएचआई के 100 माइक्रोन में गोली को फिर से रीसुस्ल करें और बीएचआई एगर प्लेट्स पर बैक्टीरियल सस्पेंशन को एरिथ्रोमाइसिन (10 माइक्रोग्राम/माइक्रोन) के साथ पूरक किया गया।
    नोट: PCN51-P3 वेक्टर भी एक erythromycin प्रतिरोध जीन है, जो केवल एस ऑरियस क्लोन pCN51-P3-MS2-sRNA प्लाज्मिड ले जाने का चयन करने में सक्षम बनाता है एन्कोड ।

4. बैक्टीरिया की कटाई

सावधानी: इस चरण में रोगजनक बैक्टीरिया की हैंडलिंग शामिल है (चरण 2 देखें)।

  1. डुप्लिकेट में एरिथ्रोमाइसिन (10 माइक्रोग्राम/माइक्रोल) के साथ पूरक बीएचआई माध्यम के 3 एमएल में या तो pCN51-P3-sRNA या pCN51-P3-MS227 प्लाज्मिड्स ले जाने वाले उपभेदों की एक कॉलोनी बढ़ाएं ।
  2. ताजा बीएचआई माध्यम के 50 मिलीएल (≈1/100) में प्रत्येक रात की संस्कृति को पतला करें एरिथ्रोमाइसिन (10 माइक्रोग्राम/माइक्रोन) के साथ पूरक 0.05 के एक ओडी600nm तक पहुंचने के लिए। 250 एमएल निष्फल फ्लास्क (5:1 फ्लास्क-टू-मीडियम रेशियो) का उपयोग करें।
    नोट: मध्यम और विकास की स्थिति का अध्ययन sRNA के अभिव्यक्ति पैटर्न के अनुसार निर्धारित किया जाना चाहिए ।
  3. 6 घंटे के लिए 180 आरपीएम पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृतियों को बढ़ाएं।
  4. प्रत्येक संस्कृति को 50 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के दौरान 2,900 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। सुपरनेट को त्याग दें।
  6. बर्फ पर छर्रों रखें और सीधे यांत्रिक सेल लाइसिस (चरण 5) या फ्रीज और -80 डिग्री सेल्सियस पर छर्रों की दुकान करते हैं।

5. मैकेनिकल सेल लाइसिस

सावधानी: निम्नलिखित कदम बर्फ पर किए जाने चाहिए और बफ़र्स 4 डिग्री सेल्सियस पर होना चाहिए। दस्ताने का उपयोग करें और RNases से नमूनों की रक्षा के लिए सभी सावधानियों ले।

  1. बफर ए के 5 एमएल में रेशपेंड छर्रों (चरण 4.6) ।
  2. 3.5 ग्राम सिलिका मोती (0.1 मिमी) के साथ 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूबों में पुनर्नक्षित कोशिकाओं को स्थानांतरित करें।
  3. एक यांत्रिक सेल लाइसिस उपकरण में ट्यूब डालें (सामग्री की तालिकादेखें)। 4.0 मीटर पर 40 एस का एक चक्र चलाएं।
    नोट: यदि एक चक्र कोशिकाओं को तोड़ने के लिए पर्याप्त नहीं है, तो बर्फ पर नमूने रखते हुए डिवाइस को 5 मिनट के लिए ठंडा होने दें। फिर, 40 मीटर प्रति मीटर पर 40 एस का एक और चक्र दोहराएं। बीएचआई-आगर प्लेट पर सुपरनेट चढ़ाना द्वारा सेल लाइसिस की दक्षता का परीक्षण किया जा सकता है।
  4. 15 मिनट के लिए 15,700 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। सुपरनेट को ठीक करें और इसे बर्फ पर रखें।

6. कॉलम तैयारी

सावधानी: एमीलोज राल को सूखने न दें। यदि आवश्यक हो, तो कॉलम को एंड-कैप के साथ सील करें। आत्मीयता शुद्धि शुरू करने से पहले सभी समाधान तैयार करें।

  1. एक कॉलम रैक में एक क्रोमेटोग्राफी कॉलम रखो (सामग्री की तालिकादेखें)।
  2. कॉलम टिप निकालें और कॉलम को अल्ट्रापुरे पानी से धोएं।
  3. एमीलोज राल के 300 माइक्रोन जोड़ें।
  4. बफर ए के 10 एमएल के साथ कॉलम धोएं।
  5. बफर ए के 6 एमएल में एमबीपी-एमएस2 प्रोटीन के 1,200 पीएमओएल को पतला करें और इसे कॉलम में लोड करें।
  6. बफर ए के 10 एमएल के साथ कॉलम धोएं।

7. MS2-आत्मीयता शुद्धि(चित्रा 1)

  1. सेल को कॉलम में लोड करें।
    नोट: कुल आरएनए (चरण 8) निकालने और उत्तरी दाग (चरण 9) और ट्रांसक्रिप्टोमिक (चरण 10) विश्लेषण करने के लिए सेल lysate (क्रूड निकालने, सीई) के 1 मिलियन मिलियन रखें।
  2. एक साफ संग्रह ट्यूब में प्रवाह के माध्यम से अंश (एफटी) ले लीजिए।
  3. बफर ए के 10 एमएल के साथ कॉलम को 3 बार धोएं। वॉश अंश (डब्ल्यू) को इकट्ठा करें।
  4. बफर ई के 1 एमएल के साथ कॉलम को एल्यूट करें और 2 एमएल माइक्रोट्यूब में एल्यूशन अंश (ई) एकत्र करें।
  5. आरएनए निष्कर्षण (चरण 8) तक बर्फ पर सभी एकत्र अंश रखें या बाद में उपयोग के लिए उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।

8. एकत्र अंशों की आरएनए निकासी (सीई, एफटी, डब्ल्यू और ई)

  1. आरएनए निष्कर्षण के लिए प्रत्येक अंश (एफटी और डब्ल्यू सहित) के 1 एमएल का उपयोग करें।
  2. फिनॉल की 1 वॉल्यूम डालें। जोर से मिलाएं।
    सावधानी: फिनोल अस्थिर और संक्षारक है, ध्यान देना और एक धुएं हुड के नीचे सुरक्षित रूप से काम करते हैं।
  3. 20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 16,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
  4. ऊपरी चरण को साफ 2 एमएल माइक्रोट्यूब में स्थानांतरित करें।
  5. क्लोरोफॉर्म/आइसोअमिल अल्कोहल (24:1) की 1 मात्रा जोड़ें और 8.3 से 8.4 चरणों को दोहराएं।
    सावधानी: एक धूम हुड के नीचे सुरक्षित रूप से काम करें।
  6. कोल्ड इथेनॉल 100% की 2.5 मात्रा और 3 एम सोडियम एसीटेट (नाओएसी) पीएच 5,2 की 1/10 मात्रा जोड़ें।
  7. -20 डिग्री सेल्सियस पर रात भर उपजी।
    नोट: वर्षा भी 20 मिनट के दौरान एक इथेनॉल/सूखी बर्फ स्नान में किया जा सकता है या 2 घंटे के दौरान-८० डिग्री सेल्सियस पर ।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 16,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। गोली को परेशान न करने के लिए सावधान रहने के दौरान धीरे-धीरे एक पिपेट के साथ इथेनॉल को हटा दें।
    सावधानी: आरएनए गोली हमेशा दिखाई नहीं देती है और कभी-कभी इथेनॉल की उपस्थिति में ढीली होती है।
  9. 80% ठंड इथेनॉल के 500 माइक्रोन जोड़ें।
  10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 16,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
  11. इथेनॉल को धीरे-धीरे पाइपिंग करके त्यागें। एक वैक्यूम सांतादार, रन मोड पर 5 मिनट का उपयोग कर गोली सूखी।
  12. पैलेटरी के पानी की उचित मात्रा (15-50 माइक्रोन) में गोली को फिर से र्ल्स करें। बाद में उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर गोली फ्रीज करें।
  13. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर/फ्लोरोमीटर (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके आरएनए मात्रा (२६० एनएम) और गुणवत्ता (260/280 और 260/230 तरंगदैर्ध्य अनुपात) का आकलन करें । ध्यान से निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
    नोट: 3-4 μg आम तौर पर elution अंश (ई) में प्राप्त कर रहे हैं । यह मुख्य रूप से परीक्षण की स्थिति पर निर्भर करता है।

9. उत्तरी दाग 36 द्वारा MS2-आत्मीयता शुद्धि का विश्लेषण

  1. सीई, एफटी, डब्ल्यू अंशों और अल्ट्रापुरे पानी के 10 माइक्रोन में ई अंश के 500 एनजी पतला और आरएनए लोडिंग बफर के 10 माइक्रोन के साथ मिश्रण।
  2. 90 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट इनक्यूबेट।
  3. 1% एगर उठे जेल के कुओं में लोड नमूने 20 mm ग्वानिडियम थिओसाइनेट के साथ पूरक और 4 डिग्री सेल्सियस पर TBE 1x बफर में 100-150 वी पर जेल चलाते हैं। अधिक जानकारी के लिए Koontz (२०१३)३७ पढ़ें ।
  4. रातोंरात 1h या केशिका हस्तांतरण के लिए वैक्यूम हस्तांतरण द्वारा नाइट्रोसेल्यूलोस झिल्ली पर आरएनए स्थानांतरित करें।
    नोट: केशिका विधि बड़े आरएनए के लिए अधिक कुशल है।
  5. एक पराबैंगनी क्रॉसलिंकर का उपयोग करके झिल्ली (254 एनएम पर 120 एमजे) पर यूवी क्रॉस-लिंक आरएनए।
  6. आरएनए पक्ष का सामना करना पड़ के साथ एक संकरण बोतल में झिल्ली डालें।
  7. पहले से गरम संकरण समाधान के 10-20 एमएल जोड़ें। 68 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट इनक्यूबेट।
  8. समाधान को त्यागें और एसआरएनए-विशिष्ट जांच के 1 माइक्रोन के साथ पूरक ताजा संकरण समाधान के 10-20 एमएल जोड़ें। रात भर 68 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया।
    नोट: डीआईजी लेबल आरएनए जांच एक DIG आरएनए लेबलिंग किट का उपयोग कर और निर्माता के निर्देशों का पालन सिंथेटाइज्ड है । वैकल्पिक रूप से, एक रेडियोलेबेल्ड जांच का उपयोग किया जा सकता है।
  9. 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए वॉश सॉल्यूशन 1 (2x एसएससी और 0.1% एसडीएस) के 10-20 एमएल के साथ झिल्ली धोएं। एक बार दोहराएं।
  10. 68 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए वॉश सॉल्यूशन 2 (0.2x एसएससी और 0.1% एसडीएस) के 10-20 एमएल के साथ झिल्ली धोएं। एक बार दोहराएं।
  11. 20 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 30 मिनट के लिए अवरुद्ध समाधान के 10-20 एमएल के साथ इनक्यूबेट।
  12. समाधान को त्यागें और पॉलीक्लोनल एंटी-डिगोक्सिजेनिन एंटीबॉडी (1/1000) के साथ पूरक अवरुद्ध समाधान के 10-20 एमएल जोड़ें, जो क्षारीय फॉस्फेट के लिए संयुग्मित है। 20 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट इनक्यूबेट।
  13. 20 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए वॉश सॉल्यूशन 3 (1x मलिक एसिड और 0.3% ट्वीन 20) के 10-20 एमएल के साथ झिल्ली धोएं। एक बार दोहराएं।
  14. 20 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट का पता लगाने वाले समाधान (0.1 एम ट्राइस एचसीएल और 0.1 एम एनएसीएल पीएच 9.5) 5 मिनट के साथ झिल्ली को इनक्यूबेट करें।
  15. एक प्लास्टिक फिल्म पर झिल्ली रखो और यह सब्सट्रेट के साथ भिगोना (सामग्री की मेजदेखें) । अंधेरे में 5 मिनट इनक्यूबेट करें।
  16. एक प्लास्टिक फिल्म में झिल्ली सील। झिल्ली को ऑटोरेडियोग्राफी कैसेट में रखें।
  17. समर्पित अंधेरे कमरे में एक ऑटोरेडियोग्राफी फिल्म के लिए झिल्ली का पर्दाफाश करें।
    नोट: प्रदर्शनी समय संकेत शक्ति पर निर्भर करता है, कुछ सेकंड से मिनट के लिए ।
  18. एक स्वचालित विकासशील डिवाइस में उजागर फिल्म का पता चलता है।

10. आरएनए अनुक्रमण के लिए नमूनों की तैयारी

नोट: यह कदम केवल ई और सीई अंशों से निकाले गए आरएनए से संबंधित है।

  1. प्रत्येक नमूने में जोड़ें 10x DNase बफर और DNase मैं (1 U/μg के इलाज RNAs) के 10 μL । 100 माइक्रोल की अंतिम मात्रा के लिए पानी जोड़ें।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे इनक्यूबेट।
  3. पहले वर्णित आरएनए को निकालें और शुद्ध करें (चरण 8.2 से 8.11)।
  4. 20 माइक्रोन में आरएनए गोली को अल्ट्रापुरे पानी के 20 माइक्रोन में फिर से खर्च करें।
    नोट: शेष डीएनए की उपस्थिति पीसीआर और विशिष्ट प्राइमर (जैसे, 16S जीन) का उपयोग करके जांच की जा सकती है ।
  5. माइक्रोफ्लुइडिक्स-आधारित इलेक्ट्रोफोरेसिस विश्लेषण प्रणाली (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके आरएनए मात्रा और गुणवत्ता का आकलन करें।
    नोट: 1 माइक्रोन आम तौर पर DNase उपचार के बाद elution अंश (ई) में प्राप्त किया जाता है ।
  6. एक बैक्टीरियल आरआरएनए कमी किट के साथ राइबोसोमल आरएनए निकालें।
    नोट: बड़े और प्रचुर मात्रा में आरएनए (यानी, rRNAs) गैर विशेष रूप से आत्मीयता कॉलम के साथ बातचीत करते हैं । इस कदम को अंजाम देने के लिए निकाले गए आरएनए की 500 एनजी की जरूरत होती है।
  7. माइक्रोफ्लुइडिक्स आधारित इलेक्ट्रोफोरेसिस विश्लेषण प्रणाली का उपयोग करके आरएनए मात्रा और गुणवत्ता का फिर से आकलन करें।
  8. सीडीएनए पुस्तकालय तैयार करने वाली किट का उपयोग करके और निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए 10-20 एनजी रिबोनोप्लेटेड आरएनए के साथ सीडीएनए पुस्तकालय तैयार करें।
  9. एक अनुक्रमण साधन (जैसे, एकल अंत, 150 बीपी; सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके प्राप्त पुस्तकालयों को अनुक्रम करें।
    नोट: प्रति नमूना 5-10 मिलियन पढ़ता है आम तौर पर पर्याप्त हैं।

11. RNAseq डेटा विश्लेषण(चित्रा 2)

  1. अनुक्रमण मंच से फास्टक्यू अनुक्रमण फ़ाइलों को डाउनलोड करें।
  2. Roscoff जैविक स्टेशन(https://galaxy.sb-roscoff.fr/)के आकाशगंगा उदाहरण के लिए उपयोग और लॉग इन करें ।
    नोट: हर उल्लिखित एल्गोरिदम आसानी से खोज बार का उपयोग करके पाया जा सकता है। प्रत्येक उपकरण के लिए एक उपयोगकर्ता गाइड प्रदान की जाती है।
    सावधानी: आवश्यक उपकरणों का संस्करण सार्वजनिक गैलेक्सी सर्वर38से अलग हो सकता है।
  3. डेटा आइकन प्राप्त करने पर क्लिक करें और फिर अपने कंप्यूटर से फ़ाइल अपलोड करें। प्रत्येक MS2 नियंत्रण और MS2-sRNA नमूनों की FastQ अनुक्रमण फ़ाइल अपलोड करें। फास्टा रेफरेंस जीनोम फाइल और जीएफएफ एनोटेशन फाइल भी अपलोड करें।
  4. रन FastQC पढ़ें गुणवत्ता रिपोर्ट (गैलेक्सी संस्करण 0.69)।
    नोट: यह उपकरण कच्चे दृश्यों (जैसे, गुणवत्ता स्कोर, एडाप्टर दृश्यों की उपस्थिति) का गुणवत्ता मूल्यांकन प्रदान करता है।
  5. विशेष रूप से एडाप्टर दृश्यों और खराब गुणवत्ता पढ़ता है को दूर करने के लिए ट्रिमिंग टूल (गैलेक्सी संस्करण 0.36.6) को चलाने के लिए ट्रिमिंग लचीली पढ़ें। पुस्तकालय तैयार करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एडाप्टर दृश्यों को इंगित करें (उदाहरण के लिए, TruSeq 3, एकल-समाप्त)। निम्नलिखित ट्रिमोमैटिक ऑपरेशंस जोड़ें: स्लाइडिंगविंडो (ठिकानों की संख्या = 4; औसत गुणवत्ता = 20) और मिनलेन (पढ़ता है = 20 की न्यूनतम लंबाई) ।
  6. फिर से चलाएं FastQC पढ़ें गुणवत्ता रिपोर्ट (गैलेक्सी संस्करण 0.69)।
  7. भागो Bowtie2 - नक्शा संदर्भ जीनोम (गैलेक्सी संस्करण 2.3.2.2) के खिलाफ पढ़ता है। डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स (बहुत संवेदनशील स्थानीय) के साथ पढ़ता है नक्शा करने के लिए इतिहास से जीनोम संदर्भ FASTA फ़ाइल का प्रयोग करें।
    नोट: Bowtie2 टूल द्वारा उत्पन्न बीएएम फ़ाइल को इंटीग्रेटिव जीनोमिक्स व्यूअर (आईजीवी) का उपयोग करके कल्पना की जा सकती है। एसोसिएटेड बाई फाइल की भी जरूरत होगी।
  8. वैकल्पिक रूप से, भागो फ्लैगस्टेट जो बाम डेटासेट (गैलेक्सी संस्करण 2.0) के लिए आँकड़े संकलित करता है।
  9. रन htseq-गिनती - गिनती (गैलेक्सी संस्करण 0.6.1) जो संरेखित करता है GFF एनोटेशन फ़ाइल में ओवरलैपिंग सुविधाओं को पढ़ता है। चौराहे (खाली न करें) मोड का उपयोग करें।
  10. संग्रह सभी कच्चे एक ही ज़िप फ़ाइल में htseq गिनती विश्लेषण से फ़ाइलों मायने रखता है ।
  11. डेटा (गैलेक्सी वर्जन 1.6.3.0) की तुलना करने के लिए SARTools DESeq2 चलाएं। ज़िप फ़ाइल उपलब्ध कराएं जिसमें कच्ची गिनती फ़ाइलें और डिज़ाइन फ़ाइल, प्रयोग का वर्णन करने वाली एक टैब डीलिमित फ़ाइल है। ध्यान से डिजाइन फ़ाइल उत्पन्न करने के लिए प्रदान की निर्देशों का पालन करें।

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Representative Results

प्रतिनिधि परिणाम एस ऑरियस29में आरएसएसी टार्गेटोम के अध्ययन से उत्पन्न होते हैं। आरएसएएसी एक अपरंपरागत 1,116 एनटी-लंबे एसआरएनए है। इसके 5 ' अंत में कई दोहराए गए क्षेत्र शामिल हैं जबकि इसका 3 ' अंत (५४४ एनटी) संरचनात्मक रूप से स्वतंत्र है और इसमें अपने एमआरएनए लक्ष्यों के साथ सभी भविष्यवाणी की गई बातचीत साइटें शामिल हैं । इस SRNA की अभिव्यक्ति प्रेरित है जब मैंगनीज (एमएन) दुर्लभ है, जो अक्सर मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के संदर्भ में सामना करना पड़ता है । मानचित्र प्रौद्योगिकी का उपयोग करके, हमने आरएसएसी के साथ सीधे बातचीत करते हुए कई mRNAs की पहचान की, ऑक्सीडेटिव तनाव(सोडा, एलडीएच1 और सारा)और धातु से संबंधित(znuBC-zur और sufCDSUB)प्रतिक्रियाओं में अपनी महत्वपूर्ण भूमिका का खुलासा किया।

MS2-sRNA निर्माण और प्रयोगात्मक शर्तों का सत्यापन
मानचित्र प्रयोगों को करने से पहले, अध्ययन किए गए एसआरएनए की अभिव्यक्ति की इष्टतम स्थितियों को निर्धारित करना महत्वपूर्ण है। यदि एक गैर देशी प्रमोटर का उपयोग किया जाता है, तो यह निश्चित रूप से MS2-sRNA निर्माण का उत्पादन करने में मदद करेगा जब इसके लक्ष्य मौजूद हैं। इसके अलावा, MS2-sRNA निर्माण ध्यान से आकार, स्थिरता, अभिव्यक्ति और समारोह के संबंध में मान्य किया जाना चाहिए । एमएस 2 इप्टामर को या तो पूर्ण लंबाई वाले आरएसएसी (एमएस2-आरएसएसी1116)या छोटे फॉर्म (एमएस2-आरएसएसी544)के 5 के अंत तक जोड़ा गया था जो आरएसएसी के 3 भाग के अनुरूप था। दोनों निर्माण वीवो में एस ऑरियस एचजी001आरएसएसी में कोरम संवेदन आश्रित पी 3 प्रमोटर के नियंत्रण में व्यक्त किए गए थे। आरएसएसी जीन को हटाने से अंतर्जात आरएसएसी और एमएस2-आरएसएसी के बीच प्रतिस्पर्धा से बचा जाता है । अकेले MS2 टैग के साथ एक ही वेक्टर युक्त जंगली प्रकार तनाव नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । यह नियंत्रण MS2 टैग के साथ होने वाली अविशिष्ट बातचीत को घटाने की अनुमति देता है।

निर्माण की पुष्टि करने और अभिव्यक्ति के अपने पैटर्न की कल्पना करने के लिए, जीवाणु कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर बीएचआई माध्यम में 2 घंटे, 4 घंटे और 6 घंटे की वृद्धि के बाद काटा गया था। आरएनए निष्कर्षण के बाद, उत्तरी दाग विश्लेषण RsaC-विशिष्ट डीआईजी जांच(चित्रा 3A)का उपयोग करके किया गया था । अंतर्जात आरएसएसी (लेन 1-3) का स्तर 6 एच के विकास के बाद काफी बढ़ गया, जो मानचित्र प्रयोगों के लिए इस समय बिंदु के चयन को न्यायोचित ठहराता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि एमएस 2-आरएसएसी544 (लेन 7-9) और एमएस2-आरएसएसी1,116 (लेन 10-12) का स्तर 6 घंटे में अंतर्जात आरएसएसी के बराबर था। इसलिए, उन्हें आरएसएसी के अंतर्जात अभिव्यक्ति पैटर्न की नकल करनी चाहिए। आरएसएसी का एक बड़ा लेकिन मामूली रूप अलग-अलग था और प्रतिलेखन के अक्षम अंत के कारण हो सकता है। यह घटना अक्सर देखी जाती है जब एक एमएस2-एसआरएनए एक प्लाज्मिड21से एक मजबूत प्रमोटर के नियंत्रण में व्यक्त किया जाता है। गुमराह प्रतिलेखन समाप्ति या गिरावट के परिणामस्वरूप कोई छोटा रूप नहीं देखा गया।

एसआरएनएएस के 5' में एमएस2 इप्टमर के अलावा उनके उचित तह को भी बाधित कर सकता है और उनके कार्यों को प्रभावित कर सकता है। यह कदम आरएसएसी के रूप में अत्यधिक संरचित एसआरएन के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए एमएस 2-एसआरएनए गतिविधि का परीक्षण किया जाना चाहिए और जब संभव हो तो एंडोजेनस एसआरएनए की तुलना में। पहले से ज्ञात लक्ष्य या एक नमूदार फेनोटाइप इसकी निगरानी करने में मदद कर सकता है। उदाहरण के लिए, इंट्रासेलुलर आरओएस संचय पर आरएसएसी के प्रभाव का उपयोग एमएस 2-आरएसएसी544 और एमएस 2-आरएसएसी1,116 निर्माण29को मान्य करने के लिए किया गया था।

आत्मीयता शुद्धि के दौरान एकत्र अंशों का विश्लेषण
आरएनए को डब्ल्यूटीई स्ट्रेन में सीई, एफटी और ई अंशों से निकाला गया था जिसमें अकेले एमएस2 टैग औरआरएसएसी स्ट्रेन को व्यक्त करते हुए MS2-RsaC544 का निर्माण किया गया था। हमने उत्तरी दाग विश्लेषण का उपयोग करके दिखाया कि 1,116 एनटी-लंबे अंतर्जात आरएसएसी को एल्यूशन अंश में समृद्ध किया गया था, लेकिन आत्मीयता कॉलम(चित्रा 3B, लेन 2-3)के साथ गैर-विशेष रूप से बातचीत करने के लिए निकला। हमने MS2-RsaC1,116 (डेटा नहीं दिखाया गया) के साथ एक ही घटना देखी। यह निश्चित रूप से इसकी लंबाई और जटिल माध्यमिक संरचना के कारण है । इसलिए, मानचित्र प्रयोगों को करने के लिए आरएसएसी के केवल कम संरचित और छोटे रूप (544 एनटी) का उपयोग किया गया था। चित्रा 3 बीमें, MS2-RsaC544 को यह प्रदर्शित करने वाले एल्यूशन अंश में अत्यधिक समृद्ध किया गया था कि इसे एमएस 2-एमबीपी फ्यूजन प्रोटीन (लेन 6) द्वारा सफलतापूर्वक बनाए रखा गया था। एमएस 2-आरएसएसी544 का एक बड़ा लेकिन मामूली रूप चित्र 3 एके रूप में देखा गया। यहां, सही बातचीत करने वाले भागीदारों के नुकसान को सीमित करने के लिए, धोने की स्ट्रिंग और संख्या को या तो कम गैर-विशिष्ट बाध्यकारी या इसके विपरीत समायोजित किया जा सकता है।

मानचित्र विश्लेषण के बाद ख्यात mRNA लक्ष्यों का सत्यापन
बायोइन्फॉर्मेटिक विश्लेषण के बाद, ख्यात एमआरएनए लक्ष्यों को MS2-sRNA और MS2 नियंत्रण के बीच गुना-परिवर्तन के अनुसार सूचीबद्ध किया गया है, जो DeSeq2(चित्रा 2)का उपयोग करके प्राप्त किया गया है। उदाहरण के लिए, MS2-RsaC544 मानचित्र डेटा29 ने सुझाव दिया कि एस ऑरियसमें सुपरऑक्साइड डिस्म्यूट्स के लिए कोडिंग, सोडा एमआरएनए एक मुख्य लक्ष्य (सर्वश्रेष्ठ हिट, उच्च गुना-परिवर्तन) है। MS2-आत्मीयता शुद्धि के बाद एक सोडा-विशिष्टडीआईजी जांच के साथ किए गए उत्तरी दाग विश्लेषण से पता चलता है कि एमएस 2 नियंत्रण(चित्रा 3 सी)की तुलना में एमएस 2-आरएसएसी544 के साथ सोडा को कुशलतापूर्वक सह-समृद्ध किया गया था।

सीई अंश पर व्यवस्थित रूप से एक वैश्विक प्रतिलिपि विश्लेषण किया जाता है। मानचित्र डेटा की तुलना और यह ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण संवर्धन अनुपात को समायोजित करने में मदद करता है और एक संभावित लक्ष्य पदानुक्रम का पता चलता है। दरअसल, एक खराब व्यक्त mRNA, जो अत्यधिक MS2-आत्मीयता शुद्धि के बाद समृद्ध है निश्चित रूप से एक अत्यधिक समृद्ध और अत्यधिक व्यक्त mRNA से अधिक बाध्यकारी लगाव है ।

यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि मानचित्र द्वारा पहचाने गए सभी उम्मीदवारों को व्यक्तिगत रूप से इन विट्रो और/या वीवो प्रयोगों जैसे इलेक्ट्रोफोरेसिस मोबिलिटी शिफ्ट परख (EMSA) या रिपोर्टर जीन परख (अधिक जानकारी के लिए जगोडनिक एट अल (२०१७)३९ देखें) का उपयोग करके मान्य किया जाना चाहिए ।

Figure 1
चित्रा 1. एस ऑरियसके लिए अनुकूलित मानचित्र प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध चित्रण। प्लाज्मिड निर्माण से लेकर डेटा विश्लेषण तक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2। मानचित्र विश्लेषण कार्यप्रवाह और प्रसंस्कृत डेटा। प्रत्येक चरण, चेक पॉइंट और फ़ाइल प्रारूप का प्रतिनिधित्व किया जाता है (चरण 11 भी देखें)। FastQ प्रारूप डीएनए दृश्यों और इसी गुणवत्ता स्कोर से मिलकर एक पाठ फ़ाइल है। बाम प्रारूप एक संकुचित फ़ाइल है जिसमें गठबंधन दृश्य होते हैं। टैबुलर प्रारूप प्रत्येक जीन के लिए गिनती के साथ एक टैब-डीलिमित टेक्स्ट फ़ाइल है। परिणाम चार्ट जैव सूचना विश्लेषण के बाद प्राप्त डेटा की तरह दिखाता है । प्रस्तुत परिणाम फर्जी हैं और किसी भी अध्ययन से उत्पन्न नहीं होते हैं। अधिक जानकारी के लिए, बुनियादी ट्यूटोरियल गैलेक्सी प्रोजेक्ट वेबसाइट (https://galaxyproject.org/) पर उपलब्ध हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: सत्यापन और मानचित्र नियंत्रण का निर्माण करता है। A.अंतर्जात आरएसएसी एसआरएनए और संबंधित एमएस 2 निर्माणों का उत्तरी दाग विश्लेषण। डब्ल्यूटी स्ट्रेन में पीएन51-पी3-एमएस2 (कंट्रोल) औरआरएसएसी उत्परिवर्ती स्ट्रेन या तो पीसीएन51-पी3-एमएस2, पीसीएन51-पी3-एमएस2-आरएसएसी५४४ या पीसीएन51-पी3-एमएस2-आरएसएसी१,११६ले जाते हैं । बीएचआई में 2 घंटे, 4 घंटे और 6 घंटे की वृद्धि के बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूने लिए गए। उत्तरी दाग परख एक RsaC विशिष्ट डीआईजी जांच का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया । B.RSAC-विशिष्ट डीआईजी जांच का उपयोग करके MS2-आत्मीयता शुद्धि अंशों का उत्तरी दाग विश्लेषण। सह-शुद्धिकरण डब्ल्यूटीई स्ट्रेन + पीसीएन51-पी3-एमएस2 (नियंत्रण) औरआरएसएसी उत्परिवर्ती तनाव + पीसीएन51-पी 3-एमएस2-आरएसएसी544का उपयोग करके किया गया था। बीएचआई में 6 घंटे की वृद्धि के बाद कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर काटा गया। क्रूड निकालने (सीई), फ्लो थ् माध्यम से (एफटी), एल्यूशन (ई)। C. एक सोडा-विशिष्टडीआईजी जांच का उपयोग करके MS2-आत्मीयता शुद्धिकरण अंशों (सीई और ई) का उत्तरी दाग विश्लेषण। विवरण के लिए(ख)देखें । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

RNA प्रकार संदर्भ
एस्चेरिचिया कोलाई
RyhB एसआरएनए लालौना एट अल . (२०१५)21
रिब्ब एसआरएनए लालौना एट अल। (2015) 21
3'ईटीएसल्यूज़ ट्रान-व्युत्पन्न टुकड़ा लालौना और मैसी (2015)26
डीएसआरए एसआरएनए लालौना एट अल। (2015) 22
एचएनएस एमआरएनए (5'यूटीआर) लालौना एट अल। (2015) 22
सियार एसआरएनए लालौना एट अल। (2018) 23
आरपीआरए एसआरएनए लालौना एट अल। (2018) 23
जीसीवीबी एसआरएनए लालौना एट अल। (2019) 24
साल्मोनेला टाइफिमुरियम
एसआरएएल एसआरएनए सिल्वा एट अल। (2019) 25
स्टेफिलोकोकस ऑरियस
आरएसएए एसआरएनए टॉमासिनी एट अल। (2017) 27
आरएसएसी एसआरएनए लालौना एट अल। (2019) 29
आरएसईआई एसआरएनए ब्रोनेस्की एट अल। (2019) 28

तालिका 1. मैप्स टेक्नोलॉजी ने विभिन्न जीवों में कई आरएनए के टारगेटोम का खुलासा किया ।

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Discussion

ग्राम-सकारात्मक बैक्टीरिया के लिए एक संशोधित प्रोटोकॉल
मानचित्र का प्रारंभिक प्रोटोकॉल मॉडल जीव ई. कोलाई20,30में एसआरएनए इंटरक्टोम का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था । यहां, हम एक संशोधित प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो अवसरवादी मानव रोगजनक एस ऑरियस में एसआरएनए-निर्भर नियामक नेटवर्क के लक्षण वर्णन के लिए उपयुक्त है और निश्चित रूप से अन्य ग्राम-सकारात्मक बैक्टीरिया, रोगजनक या नहीं के लिए स्थानांतरित है।

सेल लाइसिस स्टेप पर विशेष ध्यान दिया गया। फ्रेंच प्रेस को मैकेनिकल सेल लाइसिस इंस्ट्रूमेंट की जगह लिया गया है । यह विधि ग्राम-सकारात्मक कोशिकाओं को तोड़ने और रोगजनक उपभेदों की हैंडलिंग से जुड़े जोखिमों को सीमित करने के लिए प्रभावी है। MS2-आत्मीयता शुद्धि की उपज में सुधार करने के लिए, एमिलोज राल पर स्थिर MS2-MBP की मात्रा में भारी वृद्धि हुई है । यह स्ट्रिंग और वॉश की संख्या को समायोजित करने के लिए आवश्यक है।

प्रारंभिक प्रोटोकॉल के विपरीत, मानचित्र यहां दो जैविक प्रतिकृति से डुप्लिकेट में किया जाता है। सांख्यिकीय विश्लेषण(चित्रा 2)को लागू करने के लिए एक कार्यप्रवाह विकसित किया गया है, जो निश्चित रूप से प्राप्त डेटा की मजबूती को बढ़ाता है।

MS2 निर्माण और इसकी अभिव्यक्ति
इस मैप्स प्रोटोकॉल की स्थापना स्टेफिलोकोकल एसआरएन के टारगेटोम की पहचान करने के लिए की गई थी। एमएस2-एसआरएनए निर्माण एक कम कॉपी संख्या प्लाज्मिड (पीसीएन51, 20 से 25 प्रतियां/सेल) और कोरम-संवेदन निर्भर पी 3 प्रमोटर के नियंत्रण में व्यक्त किया जाता है, जो मुख्य रूप से स्थिर चरण के दौरान प्रेरित होता है। यह अभिव्यक्ति पैटर्न एस ऑरियस (यानी आरएसएए, आरएसएआई और आरएसएसी) में अध्ययन किए गए एसआरएन से मेल खाता है और एक मजबूत एमएस 2-एसआरएनए संश्लेषण सुनिश्चित करता है। हालांकि, हम बाहर नहीं कर सकते कि अन्य मामलों में, P3 प्रमोटर उचित नहीं हो सकता है और जब SRNA प्रेरित किया जाता है बैक्टीरिया की प्राकृतिक शारीरिक स्थिति को प्रतिबिंबित नहीं करता है । MS2-sRNA उत्पादन को नियंत्रित करने का एक और तरीका रासायनिक रूप से अकांक्षित प्रमोटरों (उदाहरण के लिए, टेट्रासाइक्लिन-अकक्षीय प्रमोटर) का उपयोग करना है। ये उपकरण MS2-sRNA निर्माण की एक पल्स अभिव्यक्ति की अनुमति देते हैं, लेकिन इस सेटिंग की गारंटी नहीं है कि आरएनए लक्ष्य सहवर्ती व्यक्त किया जाएगा । एक और दोष यह है कि प्लाज्मिड से अभिव्यक्ति अध्ययन किए गए एसआरएनए के अधिक उत्पादन का कारण बन सकती है, और भी अधिक उच्च कॉपी नंबर वेक्टर के साथ जोर दिया जाता है। इसके परिणामस्वरूप संभवतः आर्टिफैक्टिक इंटरैक्शन या संबद्ध आरएनए चैपरवन कार्यों में व्यवधान हो सकता है। सबसे उपयुक्त विकल्प अंतर्जात sRNA जीन के 5 ' अंत में एक MS2 टैग डालने के लिए है । इस प्रकार, MS2-sRNA गुणसूत्री इनकोड और अपने मूल प्रमोटर के नियंत्रण में होगा । यह बेहतर अध्ययन sRNA के अंतर्जात अभिव्यक्ति की नकल और अध्ययन sRNA के अधिक उत्पादन के कारण पूर्वाग्रह से बचने चाहिए । किसी भी मामले में, महत्वपूर्ण कदम MS2-sRNA निर्माण की लंबाई, स्थिरता और कार्यक्षमता को सावधानीपूर्वक सत्यापित करना है, विशेष रूप से उत्तरी दाग का उपयोग करके उन परिस्थितियों में उगाई गई संस्कृतियों से निकाले गए कुल आरएनए के साथ जो अंतर्जात sRNA उत्पादन और कार्य को ट्रिगर करते हैं। निर्विवाद रूप से, एक अनुचित/अप्रतिम MS2-sRNA निर्माण का उपयोग काफी उत्पन्न परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं, ऊपर वर्णित नियंत्रण के महत्व का समर्थन । अंत में, एमएस 2-एसआरएनए हमेशाएमआरएनए लक्ष्यों के संवर्धन को अधिकतम करने के लिए एक एसआरएनए पृष्ठभूमि में उत्पादित किया जाता है। इसके अलावा, RNases (उदाहरण के लिए, हटाने म्यूटेंट या तापमान के प्रति संवेदनशील म्यूटेंट) में विशिष्ट उत्परिवर्तनों के साथ मेजबान उपभेदों में प्रयोग किए जा सकते हैं ताकि आरएनए-निर्भर भर्ती द्वारा एमआरएनए लक्ष्य क्षरण से बचा जा सके।

मानचित्र द्वारा पहचाने गए उम्मीदवारों का प्रायोगिक सत्यापन अभी भी आवश्यक है
एक बात जिस पर विचार करने की आवश्यकता है वह यह है कि मानचित्र ख्यात आरएनए लक्ष्यों की सूची प्रदान करता है । हालांकि, कुछ RNAs अप्रत्यक्ष रूप से एक साझा mRNA लक्ष्य या एक आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन के साथ बातचीत के माध्यम से समृद्ध किया जा सकता है । नतीजतन, पता चला उंमीदवारों अंय प्रयोगात्मक दृष्टिकोण से पुष्टि की जानी चाहिए । EMSA और पदचिह्न प्रयोगों आमतौर पर विट्रो में ख्यात आरएनए लक्ष्यों के लिए एक sRNA के प्रत्यक्ष बाध्यकारी कल्पना करने के लिए उपयोग किया जाता है । फिर, इन विट्रो इट्प्रिंटिंग परख अपने एमआरएनए लक्ष्य के अनुवाद दीक्षा पर एक एसआरएनए के प्रभाव की निगरानी करने में मदद करता है। अंत में, उत्तरी दाग और/या जीन रिपोर्टर परख(lacZ या gfp)वीवो में इस प्रयोगात्मक सत्यापन के पूरक हैं । इन सभी दृष्टिकोणों को जगोनिक एट अल (2017)39में वर्णित किया गया है।

आरआईएल-एसईक्यू और क्लैश प्रौद्योगिकियों के विपरीत, मैप्स सीधे बातचीत साइटों पर जानकारी प्रदान नहीं करता है। फिर भी, मैप किए गए रीड्स की एक चोटी अक्सर आरएनए लक्ष्य के प्रतिबंधित क्षेत्र में देखी जाती है (उदाहरण के लिए, ग्लाइडब्ल्यू-साइस्ट-ल्यूज़ ऑपरन21का 3'एंड), पेयरिंग साइट की पहचान को सुविधाजनक बनाता है। वैकल्पिक रूप से, कई भविष्यवाणी उपकरणों का उपयोग इंडेटिव बाध्यकारी साइट को पहचाने गए लक्ष्य जैसे त्वपूर्ण बाध्यकारी साइट जैसे स्टारना40पर भविष्यवाणी करने के लिए किया जा सकता है।

मानचित्र एक विशेष sRNA के लक्ष्य की छानबीन करता है
मैप्स तकनीक ई कोलाई और एस टाइफिमुरियम जैसे ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया में एसआरएनए टार्गेटोम के अध्ययन के लिए उपयुक्त है, लेकिन अब एस ऑरियसजैसे ग्राम-सकारात्मक बैक्टीरिया में इस संशोधित प्रोटोकॉल के साथ भी। मूल रूप से, मैप्स आरएनए का एक स्नैपशॉट प्रदान करता है: एक दिए गए समय पर और विशिष्ट विकास स्थितियों में बने एसआरएनए डुप्लेक्स। दुर्भाग्यवश, एमआरएनए लक्ष्यों की सूची अधूरी हो सकती है । उदाहरण के लिए, एक कॉग्नेट mRNA लक्ष्य अनुचित प्रयोगात्मक शर्तों के कारण याद किया जा सकता है, उपर्युक्त सावधानियों को जायज ठहराते हुए ।

आरआईएल-सेक़ या क्लैश जैसे अन्य आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले तरीकों की तुलना में, मैप्स सभी बातचीत आरएनए लक्ष्यों को सह-शुद्ध करने के लिए एक विशिष्ट एसआरएनए का उपयोग करता है। यहां, एसआरएनए: आरएनए इंटरैक्शन अन्य आरबीपी-संबद्ध डुप्लेक्स के बीच पतला नहीं है, सैद्धांतिक रूप से अपने टारगेटोम को अधिक गहराई से चित्रित करने की अनुमति देता है। हालांकि, ऐसा लगता है कि आरआईएल-एसईक्यू/क्लैश और मैप्स विधियों ने ख्यात SRNA लक्ष्य12,41के विभिन्न सेटों का खुलासा किया, जिसमें यह सुझाव दिया गया है कि ये प्रायोगिक दृष्टिकोण पूरक हैं। इस विसंगति को विकास की स्थिति में भिन्नता और/या प्रत्येक विधि द्वारा उत्पन्न पूर्वाग्रह द्वारा समझाया जा सकता है ।

तदनुसार, अध्ययन का उद्देश्य विधि के विकल्प को प्रभावित करना चाहिए। SRNA targetomes के एक वैश्विक विश्लेषण के लिए और जब एक RBP SRNA मध्यस्थता विनियमन में शामिल है, RIL-seq और संघर्ष के तरीकों को प्राथमिकता दी जानी चाहिए । दोनों दृष्टिकोण एक विशेष आरबीपी पर निर्भर नियामक नेटवर्क का अवलोकन प्रदान करते हैं और इसके परिणामस्वरूप, विभिन्न प्रकार के एसआरएएनए और संबद्ध लक्ष्यों को उजागर करते हैं। इसके विपरीत, एक विशिष्ट SRNA के अध्ययन के लिए या जब कोई RBP जाना जाता है/शामिल है, नक्शे एक उपयुक्त विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को "एग्नेस नेशनल डे ला रेचेचे" (एएनआर, ग्रांट एएनआर-16-सीई11-0007-01, रिबोस्टाफ, और एएनआर-18-CE12-0025-04, कोनोको, पीआर के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था। यह भी labEx NetRNA ANR-10-LABX-0036 और ANR-17-EURE-0023 (पीआर के लिए) के ढांचे के तहत प्रकाशित किया गया है, के रूप में राज्य से धन के रूप में भविष्य के कार्यक्रम के लिए निवेश के भाग के रूप में ANR द्वारा प्रबंधित । डीएल मैरी Skłodowska-क्यूरी अनुदान समझौते नंबर 753137-SaRNAReg के तहत यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था । ई. मैसे लैब में काम कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थानों (CIHR), प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (NSERC) से अनुदान के संचालन के द्वारा समर्थित किया गया है, और स्वास्थ्य NIH टीम अनुदान R01 GM092830-06A1 के राष्ट्रीय संस्थानों ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Sarstedt 72.690.001
15 mL centrifuge tubes Falcon 352070
2 mL microcentrifuge tube Starstedt 72.691
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent G2939BA RNA quantity and quality
250 mL culture flask Dominique Dutscher 2515074 Bacterial cultures
50 mL centrifuge tubes Falcon 352051 Culture centrifugation
Absolute ethanol VWR Chemicals 20821.321 RNA extraction and purification
Allegra X-12R Centrifuge Beckman Coulter Bacterial pelleting
Ampicilin (amp) Sigma-Aldrich A9518-5G Growth medium
Amylose resin New England BioLabs E8021S MS2-affinity purification
Anti-dioxigenin AP Fab fragment Sigma Aldrich 11093274910 Northern blot assays
Autoradiography cassette ThermoFisher Scientific 50-212-726 Northern blot assays
BamHI ThermoFisher Scientific ER0051 Plasmid construction
BHI (Brain Heart Infusion) Broth Sigma-Aldrich 53286 Growth medium
Blocking reagent Sigma Aldrich 11096176001 Northern blot assays
CDP-Star Sigma Aldrich 11759051001 Northern blot assays (substrate)
Centrifuge 5415 R Eppendorf RNA extraction and purification
Chloroform Dominique Dutscher 508320-CER RNA extraction and purification
DIG-RNA labelling mix Sigma-Aldrich 11277073910 Northern blot assays
DNase I Roche 4716728001 DNase treatment
Erythromycin (ery) Sigma-Aldrich Fluka 45673 Growth medium
FastPrep device MP Biomedicals 116004500 Mechanical lysis
Guanidium Thiocyanate Sigma-Aldrich G9277-250G Northern blot assays
Hybridization Hoven Hybrigene Techne FHB4DD Northern blot assays
Hybridization tubes Techne FHB16 Northern blot assays
Isoamyl alcohol Fisher Scientific A/6960/08 RNA extraction and purification
LB (Lysogeny Broth) Sigma-Aldrich L3022 Growth medium
Lysing Matrix B Bulk MP Biomedicals 6540-428 Mechanical lysis
MicroPulser Electroporator BioRad 1652100 Plasmid construction
Milli-Q water device Millipore Z00QSV0WW Ultrapure water
NanoDrop spectrophotometer ThermoFisher Scientific RNA/DNA quantity and quality
Nitrocellulose membrane Dominique Dutsher 10600002 Northern blot assays
Phembact Neutre PHEM Technologies BAC03-5-11205 Cleaning and decontamination
Phenol Carl Roth 38.2 RNA extraction and purification
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530 Plasmid construction
pMBP-MS2 Addgene 65104 MS2-MBP production
Poly-Prep chromatography column BioRad 7311550 MS2-affinity purification
PstI ThermoFisher Scientific ER0615 Plasmid construction
Qubit 3 Fluorometer Invitrogen 15387293 RNA quantity
RNAPro Solution MP Biomedicals 6055050 Mechanical lysis
ScriptSeq Complete Kit Illumina BB1224 Preparation of cDNA librairies
Spectrophotometer Genesys 20 ThermoFisher Scientific 11972278 Bacterial cultures
SpeedVac Savant vacuum device ThermoFisher Scientific DNA120 RNA extraction and purification
Stratalinker UV Crosslinker 1800 Stratagene 400672 Northern blot assays
T4 DNA ligase ThermoFisher Scientific EL0014 Plasmid construction
TBE (Tris-Borate-EDTA) Euromedex ET020-C Northern blot assays
ThermalCycler T100 BioRad 1861096 Plasmid construction
Tween 20 Sigma Aldrich P9416-100ML Northern blot assays
X-ray film processor hu.q HQ-350XT Northern blot assays
X-ray films Super RX-N FujiFilm 4741019318 Northern blot assays

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रिऐक्शन इश्यू 168 मैप्स रेगुलेटरी आरएनए आरएनए सीक्वेंसिंग टार्गेटोम रेगुलेटरी नेटवर्क को-शुद्धि एमएस2 इप्टमर ग्राम-पॉजिटिव बैक्टीरिया स्टेफिलोकोकस ऑरियस
एमएस 2-आत्मीयता शुद्धि ग्राम-सकारात्मक बैक्टीरिया में आरएनए अनुक्रमण के साथ मिलकर
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Mercier, N., Prévost, K., Massé, E., Romby, P., Caldelari, I., Lalaouna, D. MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria. J. Vis. Exp. (168), e61731, doi:10.3791/61731 (2021).

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