Summary
La tecnologia MAPS è stata sviluppata per esaminare il targetome di uno specifico RNA normativo in vivo. L'sRNA di interesse è contrassegnato con un aptamer MS2 che consente la co-purificazione dei suoi partner di RNA e la loro identificazione tramite sequenziamento dell'RNA. Questo protocollo modificato è particolarmente adatto per i batteri Gram-positivi.
Abstract
Sebbene i piccoli RNA regolatori (sRNA) siano diffusi tra il dominio batterico della vita, le funzioni di molti di loro rimangono scarsamente caratterizzate in particolare a causa della difficoltà di identificare i loro obiettivi di mRNA. Qui, abbiamo descritto un protocollo modificato della purificazione ms2-affinity accoppiato con la tecnologia RNA Sequencing (MAPS), con l'obiettivo di rivelare tutti i partner RNA di uno specifico sRNA in vivo. In generale, l'aptamero MS2 è fuso all'estremità 5 ' dell'sRNA di interesse. Questo costrutto viene quindi espresso in vivo, permettendo all'MS2-sRNA di interagire con i suoi partner cellulari. Dopo la raccolta batterica, le cellule vengono leccate meccanicamente. L'estratto grezzo viene caricato in una colonna cromatografica a base di amilosio precedentemente rivestita con la proteina MS2 fusa alla proteina legante del maltosio. Ciò consente l'acquisizione specifica di MS2-sRNA e RNA interagenti. Dopo l'eluizione, gli RNA co-purificati sono identificati dal sequenziamento dell'RNA ad alta produttività e dalla successiva analisi bioinformatica. Il seguente protocollo è stato implementato nell'agente patogeno umano Gram-positivo Staphylococcus aureus ed è, in linea di principio, trasponibile a qualsiasi batterio Gram-positivo. In sintesi, la tecnologia MAPS costituisce un metodo efficiente per esplorare a fondo la rete normativa di un particolare sRNA, offrendo un'istantanea dell'intero targetome. Tuttavia, è importante tenere presente che gli obiettivi putativi identificati da MAPS devono ancora essere convalidati da approcci sperimentali complementari.
Introduction
Centinaia, forse anche migliaia di piccoli RNA (SRNA) normativi sono stati identificati nella maggior parte dei genomi batterici, ma le funzioni della stragrande maggioranza di essi rimangono insolito. Nel complesso, gli sRNA sono molecole brevi e non codificanti, che svolgono ruoli importanti nella fisiologia batterica e nell'adattamento agli ambientifluttuanti1,2,3. Infatti, queste macromolecole sono al centro di numerose reti normative complesse, che hanno un impatto sulle vie metaboliche, sulle risposte allo stress ma anche sulla virulenza e sulla resistenza agli antibiotici. Logicamente, la loro sintesi è innescata da specifici stimoli ambientali (ad esempio, fame di nutrienti, stress ossidativi o di membrana). La maggior parte degli sRNA regola più mRNA di destinazione a livello post-trascrizionale attraverso l'accoppiamento di base breve e non contiguo. Di solito impediscono l'avvio della traduzione competendo con i ribosomi per le regioni di iniziazione allatraduzione 4. La formazione di duplex sRNA:mRNA spesso si traduce anche nella degradazione attiva dell'mRNA bersaglio mediante reclutamento di specifiche RNasi.
La caratterizzazione di un targetome di sRNA (cioè l'intero insieme dei suoi RNA bersaglio) consente l'identificazione delle vie metaboliche in cui interviene e del potenziale segnale a cui risponde. Di conseguenza, le funzioni di uno specifico sRNA possono generalmente essere dedotte dal suo targetome. A tal fine, sono stati sviluppati diversi strumenti di previsione del silico come IntaRNA e CopraRNA5,6,7. In particolare si basano sulla complementarità delle sequenze, sull'accoppiamento dell'energia e sull'accessibilità del potenziale sito di interazione per determinare i partner di sRNA putativi. Tuttavia, gli algoritmi di previsione non integrano tutti i fattori che influenzano l'accoppiamento di base in vivo come il coinvolgimento degli RNA chaperones8 favorendo interazioni non ottimali o la co-espressione di entrambi i partner. A causa dei loro limiti intrinseci, il tasso falso positivo di strumenti di previsione rimane elevato. La maggior parte degli approcci sperimentali su larga scala si basano sulla co-purificazione delle coppie sRNA:mRNA che interagiscono con una proteina taggata di legame RNA (RBP)6,9. Ad esempio, il metodo RNA Interaction by Ligation and sequencing (RIL-seq) ha identificato duplex di RNA co-purificati con chaperones di RNA come Hfq e ProQ in Escherichia coli10,11. Una tecnologia simile chiamata UV-Crosslinking, Ligation And Sequencing of Hybrids (CLASH) è stata applicata agli SRNA associati a RNasi E- e Hfq in E. coli12,13. Nonostante i ruoli ben descritti di Hfq e ProQ nella regolazione mediata da sRNA in più batteri8,14,15, la regolazione a base di sRNA sembra essere indipendente dall'RNA in diversi organismi come S. aureus16,17,18. Anche se la purificazione dei duplex RNA in associazione con le RNasi è fattibile come dimostrato da Waters e colleghi13, questo rimane difficile poiché le RNasi innescano il loro rapido degrado. Pertanto, l'approccio MS2-Affinity Purification accoppiato con RNA Sequencing (MAPS)19,20 costituisce una solida alternativa in tali organismi.
A differenza dei metodi sopra menzionati, MAPS utilizza uno sRNA specifico come esca per catturare tutti gli RNA interagenti e quindi non si basa sul coinvolgimento di un RBP. L'intero processo è illustrato nella figura 1. In breve, l'sRNA viene taggato a 5' con l'aptamero di RNA MS2 che è specificamente riconosciuto dalla proteina del mantello MS2. Questa proteina è fusa con la proteina legante del maltosio (MBP) da immobilizzare su una resina amilosio. Pertanto, MS2-sRNA e i suoi partner RNA vengono mantenuti sulla colonna cromatografica di affinità. Dopo l'eluizione con maltosio, gli RNA co-purificati vengono identificati utilizzando il sequenziamento dell'RNA ad alta produttività seguito da analisi bioinformatiche (Figura 2). La tecnologia MAPS alla fine disegna una mappa interattiva di tutte le potenziali interazioni che si verificano in vivo.
La tecnologia MAPS è stata originariamente implementata nel batterio Gram-negativo non patogeno E. coli21. Sorprendentemente, MAPS ha aiutato a identificare un frammento derivato dal tRNA che interagisce specificamente con gli sRNA RyhB e RybB e prevenire qualsiasi rumore trascrizionale di sRNA per regolare gli obiettivi di mRNA in condizioni non induttivo. Successivamente, MAPS è stato applicato con successo ad altri E. coli sRNA come DsrA22, RprA23, CyaR23 e GcvB24 (tabella 1). Oltre a confermare obiettivi precedentemente noti, MAPS ha esteso il targetome di questi noti SRNA. Recentemente, MAPS è stato eseguito in Salmonella Typhimurium e ha rivelato che SraL sRNA si lega a rho mRNA, codificando per un fattore di terminazione di trascrizione25. Attraverso questo accoppiamento, SraL protegge rho mRNA dalla terminazione prematura della trascrizione innescata da Rho stessa. È interessante notare che questa tecnologia non è limitata agli sRNA e può essere applicata a qualsiasi tipo di RNA cellulare, come esemplificato dall'uso di un frammento derivato da tRNA26 e di una regione non tradotta di 5'di mRNA22 (Tabella 1).
Il metodo MAPS è stato adattato anche al batterio gram-positivo patogeno S. aureus19. In particolare, il protocollo di lysis è stato ampiamente modificato per rompere efficacemente le cellule a causa di una parete cellulare più spessa rispetto ai batteri Gram-negativi e per mantenere l'integrità dell'RNA. Questo protocollo adattato ha già svelato l'interactome di RsaA27,RsaI28 e RsaC29. Questo approccio ha fornito approfondimenti sul ruolo cruciale di questi sRNA nei meccanismi regolatori delle proprietà della superficie cellulare, dell'assorbimento del glucosio e delle risposte allo stress ossidativo.
Il protocollo sviluppato e implementato in E. coli nel 2015 è stato recentemente descritto in dettaglio30. Qui, forniamo il protocollo MAPS modificato, che è particolarmente adatto per lo studio delle reti normative sRNA nei batteri Gram-positivi (parete cellulare più spessa) sia non patogeni che patogeni (precauzioni di sicurezza).
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Protocol
1. Buffer e supporti
- Per gli esperimenti MAPS, preparare i seguenti buffer e supporti:
- Tampone A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl2 e 1 mM DTT)
- Tampone E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM maltosio, 0,1% Tritone, 1 mM MgCl2 e 1 mM DTT)
- Tampone di carico dell'RNA (0,025% cianolo di xilene e 0,025% blu bromofenolo in urea 8 M)
- Mezzo per infusione di cuore cerebrale (BHI) (12,5 g di cervello di vitello, 10 g di peptone, 5 g di cuore di manzo, 5 g di NaCl, 2,5 g di Na2HPO4 e 2 g di glucosio per 1 L)
- Lysogeny Broth (LB) medium (10 g di peptone, 5 g di estratto di lievito e 10 g di NaCl per 1 L) - Per i test northern blot, preparare i seguenti buffer:
- Soluzione di blocco (1x acido maleico e 1% reagente bloccante)
- Soluzione di ibridazione (50% formamide, 5x SSC, 7% SDS, 1% soluzione di blocco e 0,2% N-lauril sarcosina, 50 mM fosfato di sodio). Riscaldare con agitazione per dissolversi.
ATTENZIONE: Seguire attentamente le precauzioni di sicurezza relative a ciascun prodotto.
- 1 M fosfato di sodio (58 mM dibasico fosfato di sodio e 42 mM di fosfato di sodio monobasico)
- Tampone di citrato salino, citrato di sodio (SSC), concentrato 20x (3 M NaCl e citrato trisodico da 300 mM)
2. Problemi di sicurezza
- Eseguire tutte le fasi che coinvolgono batteri patogeni vitali in un laboratorio di contenimento di livello 2.
NOTA: Solo gli estratti di cellule possono essere prelevati all'esterno dopo la llisi (fase 5). - Indossa un camice da laboratorio e guanti.
- Assicurarsi che i polsi siano coperti.
- Pulire l'armadio di sicurezza biologico (Classe II) con una soluzione disinfettante.
- Smaltire i rifiuti solidi esposti ai batteri nell'apposito contenitore biomedico.
- Trattare i contenitori contenenti liquidi contaminati con una soluzione disinfettante. Quindi, scartalo in un lavandino.
- Lavare accuratamente mani e polsi con sapone e rimuovere il camice da laboratorio prima di lasciare il laboratorio di contenimento di livello 2.
3. Costruzione plasmide
NOTA: Ai fini della clonazione, è fondamentale identificare prima i confini dello sRNA endogeno. I plasmidi pCN51-P3 e pCN51-P3-MS2 sono descritti in Tomasini etal. Il promotore P3 permette un'alta espressione dello sRNA in modo dipendente dalla densità cellulare (cioè quando i batteri entrano nella fase stazionaria di crescita). Molti sRNA stafilococco si accumulano durante questa fase di crescita.
- Amplificare la sequenza di sRNA mediante PCR utilizzando una DNA polimerasi ad alta fedeltà e una macchina PCR. Seguire attentamente le istruzioni del produttore e leggere Garibyan e Avashia (2013)31 per maggiori dettagli.
- Utilizzare i modelli seguenti per progettare i primer specifici:
e 5'-CGCGGATCC(N)-3' rispettivamente per primer avanti e indietro.
NOTA: Questi oligonucleotidi consentono di fondere la sequenza MS2 (in grassetto) all'estremità 5' dell'sRNA di interesse. Pst I siti di restrizione I e BamHI (sottolineati) vengono aggiunti alle estremità 5' e 3' del costrutto MS2-sRNA per clonare l'amplicon nel plasmide pCN51-P327. (N) corrisponde alla sequenza specifica del gene (15-20 nucleotidi). - Digerire 1 μg di pCN51-P3 plasmide e 1 μg del prodotto PCR MS2-sRNA con 2 U di PstI e 1 U di BamHI nel tampone appropriato secondo le raccomandazioni del produttore.
- Incubare 1 h a 37 °C e purificare il DNA utilizzando un kit di purificazione PCR (vedi Tabella dei materiali).
- Mescolare il plasmide pCN51-P3 digerito (300 ng) e l'amplicon MS2-sRNA (rapporto molare per vettore:inserto = 1:3) in un tubo da 1,5 ml. (1988) 32 per massimizzarel'efficienza della legatura. Aggiungere 1 μL del Ligase Buffer e 10 U di T4 Ligase in ogni tubo. Regolare il volume a 10 μL con acqua ultrapura.
- Incubare a 22 °C per almeno 2 ore.
- Aggiungere 5 μL di miscela di lisciviazione a 50 μL di cellule E. coli congelate DH5α chimicamente competenti. (2001) 33 persaperne di più sulla trasformazione plasmide e sulle cellule chimicamente competenti.
- Incubare 30 minuti sul ghiaccio.
- Shock termico (45 s a 42 °C) il tubo di trasformazione utilizzando un blocco termico o un bagno d'acqua.
- Aggiungere 900 μL di mezzo LB e incubare a 37 °C per 30 min.
- Piastra 100 μL della sospensione batterica su una piastra di agar LB integrata con ampicillina (100 μg/μL).
NOTA: il vettore pCN51-P3 codifica un gene di resistenza all'ampicillina, che consente di selezionare solo cloni E. coli che trasportano il plasmide pCN51-P3-MS2-sRNA. - Estrarre il pCN51-P3-MS2-sRNA plasmide da una coltura batterica notturna (5 mL) coltivata in presenza di ampicillina (100 μg/μL) utilizzando un kit di miniprep del DNA plasmide (vedi Tabella dei materiali).
- Verificare il costrutto sequenziando Sanger34 utilizzando il seguente primer, 5'-TCTCGAAAATAATAGAGGG-3'.
- Trasformare il plasmide pCN51-P3-MS2-sRNA in cellule E. coli chimicamente competenti dc10B. Ripetere i passaggi da 3.7 a 3.11.
- Estrarre il pCN51-P3-MS2-sRNA plasmide (vedi fase 3.12) e trasformare 1-5 μg di DNA plasmide in cellule elettrocompetenti S. aureus HG001 ΔsRNA utilizzando un apparato elettroporazione. Seguire attentamente le istruzioni del produttore. Leggi Grosser e Richardson (2016)35 per saperne di più sui metodi per preparare l'elettrocompetente S. aureus.
ATTENZIONE: Questo passaggio comporta la manipolazione di batteri patogeni (vedere fase 2). - Aggiungere 900 μL di mezzo BHI e incubare a 37 °C per 3 ore.
- Centrifuga 1 min a 16.000 x g. Scartare il supernatante.
- Rimostrare il pellet in 100 μL di BHI e placcare la sospensione batterica su piastre di agar BHI integrate con eringomicina (10 μg/μL).
NOTA: Il vettore pCN51-P3 codifica anche un gene di resistenza all'eringomicina, che consente di selezionare solo cloni S. aureus che trasportano il plasmide pCN51-P3-MS2-sRNA.
4. Raccolta dei batteri
ATTENZIONE: Questo passaggio comporta la manipolazione di batteri patogeni (vedere fase 2).
- Coltivare una colonia di ceppi che trasportano pCN51-P3-MS2-sRNA o pCN51-P3-MS227 plasmidi in 3 mL di mezzo BHI integrati con eringomicina (10 μg/μL) in duplicati.
- Diluire ogni coltura notturna in 50 mL (≈1/100) di mezzo BHI fresco integrato con eringomicina (10 μg/μL) per raggiungere un OD600nm di 0,05. Utilizzare flaconi sterilizzati da 250 ml (rapporto tra pallone 5:1 e medio).
NOTA: Le condizioni medie e di crescita devono essere impostate in base al modello di espressione dello sRNA studiato. - Coltiva colture a 37 °C con scuotimenti a 180 giri/min per 6 h.
- Trasferire ogni coltura in un tubo di centrifuga da 50 ml.
- Centrifuga a 2.900 x g per 15 min a 4 °C. Scartare il supernatante.
- Tenere i pellet sul ghiaccio ed eseguire direttamente la lisi meccanica delle celle (fase 5) o congelare e conservare pellet a -80 °C.
5.Lisi a celle meccaniche
ATTENZIONE: I seguenti passaggi devono essere eseguiti su ghiaccio e i tamponi devono essere a 4 °C. Utilizzare guanti e prendere tutte le precauzioni per proteggere i campioni dalle RNasi.
- Resuspend pellets (fase 4.6) in 5 mL di Tampone A.
- Trasferire le celle rimorsi in tubi di centrifuga da 15 ml con 3,5 g di perline di silice (0,1 mm).
- Inserire tubi in uno strumento meccanico di lisi cellulare (vedi Tabella dei materiali). Eseguire un ciclo di 40 s a 4,0 m/s.
NOTA: Se un ciclo non è sufficiente per rompere le cellule, lasciare raffreddare il dispositivo per 5 minuti mantenendo i campioni sul ghiaccio. Quindi, ripetere un altro ciclo di 40 s a 4,0 m/s. L'efficienza della llisi cellulare può essere testata placcando il supernatante sulla piastra BHI-agar. - Centrifuga a 15.700 x g per 15 min. Recupera il supernatante e tienilo sul ghiaccio.
6. Preparazione della colonna
ATTENZIONE: Fare attenzione a non lasciare asciugare la resina amilosio. Se necessario, sigillare la colonna con un tappo finale. Preparare tutte le soluzioni prima di iniziare la purificazione dell'affinità.
- Inserire una colonna cromatografica in un rack di colonne (vedere Tabella dei materiali).
- Rimuovere la punta della colonna e lavare la colonna con acqua ultrapura.
- Aggiungere 300 μL di resina amilosio.
- Lavare la colonna con 10 mL di Buffer A.
- Diluire 1.200 pmol di proteine MBP-MS2 in 6 mL di Buffer A e caricarlo nella colonna.
- Lavare la colonna con 10 mL di Buffer A.
7. Purificazione dell'affinità MS2 (Figura 1)
- Caricare il lysate della cella nella colonna.
NOTA: Conservare 1 mL del llysato cellulare (estratto grezzo, CE) per estrarre l'RNA totale (fase 8) ed eseguire analisi northern blot (fase 9) e trascrittomica (fase 10). - Raccogliere la frazione flow-through (FT) in un tubo di raccolta pulito.
- Lavare la colonna 3 volte con 10 mL di Tampone A. Raccogliere la frazione di lavaggio (W).
- Elute la colonna con 1 mL di Buffer E e raccogliere la frazione di eluizione (E) in un microtubo da 2 mL.
- Conservare tutte le frazioni raccolte sul ghiaccio fino all'estrazione dell'RNA (fase 8) o congelarle a -20 °C per un uso successivo.
8. Estrazione dell'RNA delle frazioni raccolte (CE, FT, W ed E)
- Utilizzare 1 mL di ogni frazione (inclusi FT e W) per l'estrazione dell'RNA.
- Aggiungere 1 volume di fenolo. Mescolare vigorosamente.
ATTENZIONE: Il fenolo è volatile e corrosivo, presta attenzione e lavora in sicurezza sotto una cappa aspirante. - Centrifuga a 16.000 x g per 10 min a 20 °C.
- Trasferire la fase superiore in un microtubo pulito da 2 mL.
- Aggiungere 1 volume di alcol cloroformio/isoamil (24:1) e ripetere i passaggi da 8.3 a 8.4.
ATTENZIONE: Lavorare in sicurezza sotto una cappa aspirante. - Aggiungere 2,5 volumi di etanolo freddo 100% e 1/10 volume di 3 M di acetato di sodio (NaOAc) pH 5,2.
- Precipitare durante la notte a -20 °C.
NOTA: Le precipitazioni possono anche essere eseguite in un bagno di etanolo / ghiaccio secco durante 20 min o a -80 °C durante 2 ore. - Centrifuga a 16.000 x g per 15 min a 4 °C. Rimuovere lentamente l'etanolo con una pipetta facendo attenzione a non disturbare il pellet.
ATTENZIONE: Il pellet di RNA non è sempre visibile e a volte è sciolto in presenza di etanolo. - Aggiungere 500 μL di etanolo freddo all'80%.
- Centrifuga a 16.000 x g per 5 min a 4 °C.
- Scartare l'etanolo tubazione lentamente. Asciugare il pellet utilizzando un concentratore sottovuoto, 5 minuti in modalità di corsa.
- Rimescolare il pellet in un volume appropriato (15-50 μL) di acqua ultrapura. Congelare il pellet a -20 °C per un uso successivo.
- Valutare la quantità di RNA (260 nm) e la qualità (rapporti di lunghezza d'onda 260/280 e 260/230) utilizzando uno spettrofotometro/fluorometro (vedi Tabella dei materiali). Seguire attentamente le istruzioni del produttore.
NOTA: 3-4 μg sono generalmente ottenuti nella frazione di eluizione (E). Ciò dipende principalmente dalle condizioni testate.
9. Analisi della purificazione dell'affinità MS2 mediante macchia settentrionale36
- Diluire 5 μg di RNA di frazioni CE, FT, W e 500 ng di frazione E in 10 μL di acqua ultrapura e mescolare con 10 μL di tampone di carico dell'RNA.
- Incubare 3 min a 90 °C.
- Caricare campioni in pozzi di un gel di agarosio dell'1% integrato con 20 mM di tiocianato di guanidio ed eseguire il gel a 100-150 V in tampone TBE 1x a 4 °C. Leggi Koontz (2013)37 per maggiori dettagli.
- Trasferire gli RNA su una membrana di nitrocellulosa mediante trasferimento sottovuoto per 1h o trasferimento di capillarità durante la notte.
NOTA: Il metodo di capillarità è più efficiente per gli RNA di grandi dimensioni. - RNA a collegamento incrociato UV sulla membrana (120 mJ a 254 nm) utilizzando un retino ultravioletto.
- Inserire la membrana in una bottiglia di ibridazione con il lato RNA rivolto verso l'alto.
- Aggiungere 10-20 mL di soluzione di ibridazione preriscaldata. Incubare 30 min a 68 °C.
- Scartare la soluzione e aggiungere 10-20 mL di soluzione di ibridazione fresca integrata con 1 μL della sonda specifica dell'sRNA. Incubare durante la notte a 68 °C.
NOTA: La sonda RNA marcata DIG viene sintetizzata utilizzando un kit di etichettatura DIG RNA e seguendo le istruzioni del produttore. In alternativa, è possibile utilizzare una sonda con etichetta radio. - Lavare la membrana con 10-20 mL di soluzione di lavaggio 1 (2x SSC e 0,1% SDS) per 5 min a 20 °C. Ripeti una volta.
- Lavare la membrana con 10-20 mL di soluzione di lavaggio 2 (0,2x SSC e 0,1% SDS) per 15 min a 68 °C. Ripeti una volta.
- Incubare con 10-20 mL di soluzione di blocco per almeno 30 min a 20 °C.
- Scartare la soluzione e aggiungere 10-20 mL della soluzione di blocco integrata con l'anticorpo policlonale anti-digoxigenina (1/1000), coniugato alla fosfatasi alcalina. Incubare 30 min a 20 °C.
- Lavare la membrana con 10-20 mL della soluzione di lavaggio 3 (1x acido maleico e 0,3% Tween 20) per 15 min a 20 °C. Ripeti una volta.
- Incubare la membrana con 10-20 mL della soluzione di rilevamento (0,1 M Tris HCl e 0,1 M NaCl pH 9,5) 5 min a 20 °C.
- Mettere la membrana su un film di plastica e immergerla con il substrato (vedere Tabella dei materiali). Incubare 5 minuti al buio.
- Sigillare la membrana in un film di plastica. Metti la membrana in una cassetta per autorazione.
- Esporre la membrana a un film di autorazione nella stanza buia dedicata.
NOTA: Il tempo di esposizione dipende dalla potenza del segnale, da pochi secondi a minuti. - Rivelare la pellicola esposta in un dispositivo di sviluppo automatico.
10. Preparazione dei campioni per il sequenziamento dell'RNA
NOTA: Questo passaggio riguarda solo gli RNA estratti dalle frazioni E e CE.
- Aggiungere a ciascun campione 10 μL di tampone di 10x DNasi e DNasi I (1 U/μg di RNA trattati). Aggiungere acqua per un volume finale di 100 μL.
- Incubare 1 h a 37 °C.
- Estrarre e purificare gli RNA come descritto in precedenza (passaggi da 8.2 a 8.11).
- Rimescolare il pellet di RNA in 20 μL di acqua ultrapura.
NOTA: La presenza di DNA rimanente può essere controllata utilizzando PCR e primer specifici (ad esempio, gene 16S). - Valutare la quantità e la qualità dell'RNA utilizzando un sistema di analisi dell'elettroforesi basato su microfluidica (vedi Tabella dei materiali).
NOTA: 1 μg è generalmente ottenuto nella frazione di eluizione (E) dopo il trattamento con DNasi. - Rimuovere gli RNA ribosomiali con un kit di esaurimento dell'rRNA batterico.
NOTA: Gli RRNA grandi e abbondanti (cioè gli rRNA) tendono a interagire in modo non specifico con la colonna di affinità. Per eseguire questo passaggio sono necessari 500 ng di RNA estratto. - Valutare nuovamente la quantità e la qualità dell'RNA utilizzando un sistema di analisi dell'elettroforesi basato su microfluidici.
- Preparare librerie cDNA con 10-20 ng di RNA ribodepleted utilizzando un kit di preparazione della libreria cDNA e seguendo le istruzioni del produttore.
- Sequenziare le librerie ottenute utilizzando uno strumento di sequenziamento (ad esempio, single-end, 150 bp; vedi Tabella dei materiali).
NOTA: 5-10 milioni di letture per campione sono generalmente sufficienti.
11. Analisi dei dati RNAseq (figura2)
- Scarica i file di sequenziamento FastQ dalla piattaforma di sequenziamento.
- Accesso all'istanza Galaxy della stazione biologica Roscoff (https://galaxy.sb-roscoff.fr/) e accesso.
NOTA: ogni algoritmo menzionato può essere facilmente trovato utilizzando la barra di ricerca. Per ogni strumento viene fornita una guida per l'utente.
ATTENZIONE: la versione degli strumenti richiesti potrebbe differire dal server Galaxy pubblico38. - Fare clic sull'icona Ottieni dati e quindi caricare file dal computer. Caricare il file di sequenziamento FastQ di ogni controllo MS2 e gli esempi ms2-sRNA. Caricare anche il file del genoma di riferimento FASTA e il file di annotazione GFF.
- Eseguire i report FastQC Read Quality (Galaxy versione 0.69).
NOTA: questo strumento fornisce una valutazione della qualità delle sequenze grezze (ad esempio, punteggio di qualità, presenza di sequenze di adattatori). - Eseguire lo strumento di taglio flessibile di lettura Trimmomatic (Galaxy versione 0.36.6) per rimuovere in particolare le sequenze di adattatori e le letture di scarsa qualità. Indicare le sequenze di adattatori utilizzate per la preparazione della libreria (ad esempio, TruSeq 3, single-ended). Aggiungete le seguenti operazioni trimmomatiche: SLIDINGWINDOW (Number of bases=4; Media quality=20) e MINLEN (lunghezza minima delle letture=20).
- Eseguire di nuovo i report FastQC Read Quality (Galaxy versione 0.69).
- Run Bowtie2 - la mappa legge sul genoma di riferimento (Galaxy Version 2.3.2.2). Utilizzare il file FASTA Riferimento genoma della cronologia per mappare le letture con le impostazioni predefinite (locali molto sensibili).
NOTA: il file BAM generato dallo strumento Bowtie2 può essere visualizzato utilizzando l'Integrative Genomics Viewer (IGV). Sarà richiesto anche il file BAI associato. - Facoltativamente, eseguire Flagstat che compila le statistiche per il dataset BAM (Galaxy versione 2.0).
- Esegui conteggio htseq - Count (Galaxy versione 0.6.1) che allinea le letture delle feature sovrapposte nel file di annotazione GFF. Utilizzare la modalità Intersezione (non vuota).
- Archiviare tutti i file di conteggio non elaborati dall'analisi del conteggio htseq in un unico file Zip.
- Eseguire SARTools DESeq2 per confrontare i dati (Galaxy versione 1.6.3.0). Fornire il file Zip contenente i file di conteggio non elaborati e il file di progettazione, un file delimitato da tabulazioni che descrive l'esperimento. Seguire attentamente le istruzioni fornite per generare il file di progettazione.
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Representative Results
I risultati rappresentativi derivano dallo studio del targetome RsaC in S. aureus29. RsaC è uno sRNA non convenzionale lungo 1.116 nt. La sua estremità di 5' contiene diverse regioni ripetute mentre la sua estremità di 3 ' (544 nt) è strutturalmente indipendente e contiene tutti i siti di interazione previsti con i suoi obiettivi di mRNA. L'espressione di questo sRNA è indotta quando il manganese (Mn) è scarso, che si incontra spesso nel contesto della risposta immunitaria dell'ospite. Utilizzando la tecnologia MAPS, abbiamo identificato diversi mRNA che interagiscono direttamente con RsaC, rivelando il suo ruolo cruciale nelle risposte allo stress ossidativo (sodA, ldh1 e sarA) e ai metalli(znuBC-zur e sufCDSUB).
Convalida del costrutto MS2-sRNA e condizioni sperimentali
Prima di eseguire esperimenti MAPS, è importante determinare le condizioni ottimali di espressione dello sRNA studiato. Se viene utilizzato un promotore non nativo, aiuterà definitivamente a produrre il costrutto MS2-sRNA quando sono presenti i suoi obiettivi. Inoltre, il costrutto MS2-sRNA deve essere accuratamente convalidato per quanto riguarda dimensioni, stabilità, espressione e funzione. L'aptamer MS2 fu fuso all'estremità 5' della RsaC a figura intera (MS2-RsaC1116) o della forma più corta (MS2-RsaC544) corrispondente alla parte 3' di RsaC. Entrambi i costrutti sono stati espressi in vivo sotto il controllo del promotore P3 dipendente dal quorum in S. aureus HG001 ΔrsaC. La cancellazione del gene rsaC evita una competizione tra l'endogeno RsaC e MS2-RsaC. Il ceppo di tipo jolly contenente lo stesso vettore con il solo tag MS2 è stato utilizzato come controllo. Questo controllo consente di sottrarre interazioni non specifiche che si verificano con il tag MS2.
Per confermare i costrutti e visualizzare il loro modello di espressione, le cellule batteriche sono state raccolte dopo 2 h, 4 h e 6 h di crescita nel mezzo BHI a 37 °C. Dopo l'estrazione dell'RNA, l'analisi della macchia settentrionale è stata eseguita utilizzando la sonda DIG specifica di RsaC (Figura 3A). Il livello di RsaC endogeno (corsie 1-3) è aumentato significativamente dopo 6 ore di crescita, giustificando la selezione di questo punto di tempo per gli esperimenti MAPS. È importante sottolineare che i livelli di MS2-RsaC544 (corsie 7-9) e MS2-RsaC1.116 (corsie 10-12) erano paragonabili a RsaC endogeni a 6 h. Quindi, dovrebbero imitare il modello di espressione endogena di RsaC. Una forma più grande ma minore di RsaC era distinguibile e potrebbe essere dovuta a un'inefficiente fine della trascrizione. Questo fenomeno si osserva frequentemente quando un MS2-sRNA è espresso sotto il controllo di un forte promotore da un plasmide21. Non sono state osservate forme più brevi derivanti dalla terminazione o dalla degradazione della trascrizione aberrante.
L'aggiunta dell'aptamer MS2 ai 5' degli SRNA potrebbe anche interrompere il loro corretto ripiegamento e influenzare le loro funzioni. Questo passaggio è fondamentale per gli SRNA altamente strutturati come RsaC. Quindi l'attività ms2-sRNA dovrebbe essere testata e confrontata con lo sRNA endogeno quando possibile. Una destinazione precedentemente nota o un fenotipo osservabile può aiutare a monitorarla. Ad esempio, l'impatto di RsaC sull'accumulo di ROS intracellulare è stato utilizzato per convalidare i costrutti MS2-RsaC544 e MS2-RsaC1.116 29.
Analisi delle frazioni raccolte durante la purificazione dell'affinità
Gli RNA sono stati estratti da frazioni CE, FT ed E in deformazione WT che esprimevano solo l'etichetta MS2 e il ceppo ΔrsaC che esprimeva il costrutto MS2-RsaC544. Abbiamo dimostrato utilizzando l'analisi della macchia settentrionale che l'RsaC endogeno lungo 1.116 nt è stato arricchito nella frazione di eluizione ma si è rivelato interagire non specificamente con la colonna di affinità(Figura 3B, corsie 2-3). Abbiamo osservato lo stesso fenomeno con MS2-RsaC1.116 (dati non mostrati). Ciò è certamente dovuto alla sua lunghezza e alla complessa struttura secondaria. Pertanto, solo una forma meno strutturata e più breve (544 nt) di RsaC corrispondente alla sua parte 3 ' è stata utilizzata per eseguire esperimenti MAPS. Nella figura 3B, l'MS2-RsaC544 è stato altamente arricchito nella frazione di eluizione dimostrando che è stato mantenuto con successo dalla proteina di fusione MS2-MBP (corsia 6). Una forma più grande ma minore di MS2-RsaC544 è stata osservata come nella figura 3A. In questo caso, il rigore e il numero di lavaggi possono essere adattati a un legame non specifico ridotto o, al contrario, per limitare la perdita di veri partner interagenti.
Convalida degli obiettivi putativi dell'mRNA dopo l'analisi MAPS
A seguito dell'analisi bioinformatica, gli obiettivi putativi di mRNA sono elencati in base al cambio di piegatura tra il controllo MS2-sRNA e MS2, ottenuto utilizzando DeSeq2 (Figura 2). Ad esempio, i dati MS2-RsaC544 MAPS29 suggerivano che l'mRNA sodA, codificando per una dismutasi superossido in S. aureus, è un obiettivo principale (miglior hit, cambio piegatura più alto). Un'analisi della macchia settentrionale, eseguita con una sonda DIG specifica di sodAdopo la purificazione dell'affinità MS2, mostra che sodA è stato efficacemente co-arricchito con MS2-RsaC544 rispetto al controllo MS2 (Figura 3C).
Un'analisi trascritomica globale viene eseguita sistematicamente sulla frazione CE. Il confronto dei dati MAPS e questa analisi trascrittamica aiuta a regolare il rapporto di arricchimento e rivela una potenziale gerarchia di destinazione. Infatti, un mRNA scarsamente espresso, che è altamente arricchito dopo la purificazione dell'affinità MS2 ha certamente una maggiore affinità di legame rispetto a un mRNA altamente arricchito e altamente espresso.
È importante notare che tutti i candidati identificati da MAPS devono essere convalidati individualmente utilizzando esperimenti in vitro e/o in vivo come i test di spostamento della mobilità dell'elettroforesi (EMSA) o i test genetici dei reporter (vedi Jagodnik et al. (2017)39 per maggiori dettagli).
Figura 1. Illustrazione schematica del protocollo MAPS adattato a S. aureus. Dalla costruzione plasmide all'analisi dei dati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Flusso di lavoro di analisi MAPS e dati elaborati. Ogni passaggio, punto di controllo e formato di file sono rappresentati (vedere anche il passaggio 11). Il formato FastQ è un file di testo costituito dalle sequenze di DNA e dai corrispondenti punteggi di qualità. Il formato BAM è un file compresso contenente sequenze allineate. Il formato tabulare è un file di testo delimitato da tabulazioni con conteggi per ogni gene. Il grafico dei risultati illustra il tipo di dati ottenuti dopo l'analisi bioinformatica. I risultati presentati sono fittizi e non provengono da alcuno studio. Per ulteriori dettagli, le esercitazioni di base sono disponibili sul sito Web di Galaxy Project (https://galaxyproject.org/). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Costruisce controlli di convalida e MAPS. A. Analisi della macchia settentrionale dello sRNA rsac endogeno e dei relativi costrutti MS2. La deformazione WT trasporta il ceppo mutante pCN51-P3-MS2 (controllo) e ΔrsaC trasportare pCN51-P3-MS2, pCN51-P3-MS2-RsaC544 o pCN51-P3-MS2-RsaC1.116. I campioni sono stati prelevati dopo 2 h, 4 h e 6 ore di crescita nel BHI a 37 °C. I test northern blot sono stati eseguiti utilizzando una sonda DIG specifica di RsaC. B.Analisi della macchia settentrionale delle frazioni di purificazione dell'affinità MS2 utilizzando una sonda DIG specifica di RsaC. La co-purificazione è stata eseguita utilizzando ceppo WT + pCN51-P3-MS2 (controllo) e ceppo mutante ΔrsaC + pCN51-P3-MS2-RsaC544. Le cellule sono state raccolte dopo 6 ore di crescita in BHI a 37 °C. Estratto grezzo (CE), flusso (FT), eluizione (E). C. Analisi della macchia settentrionale delle frazioni di purificazione dell'affinità MS2 (CE ed E) utilizzando una sondaDIG specifica della soda. Cfr.paragrafo Bper i dettagli. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| RNA | digitare | riferimento |
| Escherichia coli | ||
| RyhB | SRNA | Lalaouna et al. |
| RybB | SRNA | Lalaouna et al. (2015) 21 di cui 21 |
| 3'ETSleuZ | frammento derivato dall'tRNA | Lalaouna e Massé (2015)26 |
| DsrA | SRNA | Lalaouna et al. (2015) 22 di cui: La commissione per i |
| Hns | mRNA (5'UTR) | Lalaouna et al. (2015) 22 di cui: La commissione per i |
| CiaR | SRNA | Lalaouna et al. (2018) 23 di cui 23 |
| RprA | SRNA | Lalaouna et al. (2018) 23 di cui 23 |
| McVB | SRNA | Lalaouna et al. (2019) 24 di cui 24 |
| Salmonella Tiphimurium | ||
| SraL | SRNA | Silva et al. (2019) 25 di cui: la commissione per i |
| Stafilococco aureo | ||
| RsaA | SRNA | Tomasini et al. (2017) 27 di cui 27 |
| RsaC | SRNA | Lalaouna et al. (2019) 29 di cui 29 |
| RsaI | SRNA | Bronesky et al. (2019) 28 di cui: La commissione per i |
La tabella 1. La tecnologia MAPS ha rivelato il targetome di diversi RNA in vari organismi.
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Discussion
Un protocollo modificato per i batteri Gram-positivi
Il protocollo iniziale di MAPS è stato sviluppato per studiare l'interactoma dello sRNA nell'organismo modello E. coli20,30. Qui descriviamo un protocollo modificato adatto alla caratterizzazione di reti regolatorie dipendenti dall'sRNA nell'opportunistico agente patogeno umano S. aureus ed è certamente trasponibile ad altri batteri Gram-positivi, patogeni o meno.
Particolare attenzione è stata dedicata alla fase di lisi cellulare. La stampa francese è stata sostituita da uno strumento meccanico a cell lysis. Questo metodo è efficace per rompere le cellule Gram-positive e limitare i rischi associati alla manipolazione di ceppi patogeni. Per migliorare la resa della purificazione dell'affinità MS2, la quantità di MS2-MBP immobilizzata sulla resina amilosio è stata drasticamente aumentata. Ciò ha richiesto di regolare il rigore e il numero di lavaggi.
A differenza del protocollo iniziale, MAPS viene qui eseguito in duplicato, da due repliche biologiche. È stato sviluppato un flusso di lavoro per implementare l'analisi statistica (Figura 2), che aumenta definitivamente la robustezza dei dati ottenuti.
Costrutto MS2 e la sua espressione
Questo protocollo MAPS è stato istituito per identificare il targetome degli sRNA stafilococco. Il costrutto MS2-sRNA è espresso da un plasmide a basso numero di copie (pCN51, da 20 a 25 copie/cella) e sotto il controllo del promotore P3 dipendente dal quorum, principalmente indotto durante la fase stazionaria. Questo modello di espressione corrisponde agli sRNA studiati in S. aureus (cioè RsaA, RsaI e RsaC) e assicura una sintesi MS2-sRNA piuttosto forte. Tuttavia, non possiamo escludere che in altri casi, il promotore P3 potrebbe non essere appropriato e non riflette lo stato fisiologico naturale dei batteri quando l'sRNA è indotto. Un altro modo per controllare la produzione di MS2-sRNA è quello di utilizzare promotori chimicamente inducibili (ad esempio, promotori induttibili alla tetraciclina). Questi strumenti consentono un'espressione di impulso del costrutto MS2-sRNA, ma questa impostazione non garantisce che i bersagli dell'RNA siano espressi concomitantemente. Un altro inconveniente è che l'espressione da un plasmide può portare alla sovrapproduzione dello sRNA studiato, ancora più enfatizzato con un vettore ad alto numero di copie. Ciò potrebbe potenzialmente comportare interazioni artefattuali o l'interruzione delle funzioni associate di chaperone di RNA. L'alternativa più appropriata è inserire un tag MS2 all'estremità 5 ' del gene endogeno dell'sRNA. Così, l'MS2-sRNA sarebbe stato codificato cromosomicamente e sotto il controllo del suo promotore nativo. Questo dovrebbe imitare meglio l'espressione endogena dello sRNA studiato ed evitare pregiudizi dovuti alla sovrapproduzione dello sRNA studiato. In ogni caso, il passo cruciale è verificare attentamente la lunghezza, la stabilità e la funzionalità del costrutto MS2-sRNA, in particolare utilizzando saggi northern blot con RNA totale estratto da colture coltivate in condizioni che innescano la produzione e la funzione di sRNA endogeno. Innegabilmente, l'uso di un costrutto MS2-sRNA non corretto/non funzionale può influenzare drasticamente i risultati generati, supportando il significato dei controlli sopra descritti. Infine, l'MS2-sRNA è sempre prodotto in unosfondo sRNA Δ per massimizzare l'arricchimento dei bersagli dell'mRNA. Inoltre, gli esperimenti possono essere eseguiti in ceppi ospiti con mutazioni specifiche nelle RNasi (ad esempio, mutanti di cancellazione o mutanti sensibili alla temperatura) per evitare la degradazione degli obiettivi di mRNA mediante reclutamento di RNasi dipendente dall'sRNA.
La validazione sperimentale dei candidati individuati da MAPS è ancora richiesta
Un punto che deve essere considerato è che MAPS fornisce un elenco di obiettivi putative di RNA. Tuttavia, alcuni RNA possono essere indirettamente arricchiti attraverso l'interazione con un bersaglio di mRNA condiviso o una proteina legante l'RNA. Di conseguenza, i candidati rivelati devono essere confermati da altri approcci sperimentali. Gli esperimenti di EMSA e footprinting sono comunemente usati per visualizzare il legame diretto di uno sRNA con bersagli putativi di RNA in vitro. Quindi, i test di stampa in vitro aiutano a monitorare l'impatto di uno sRNA sull'iniziazione della traduzione del suo obiettivo di mRNA. Infine, i saggi di northern blot e/o gene reporter(lacZ o gfp)completano questa convalida sperimentale in vivo. Tutti questi approcci sono descritti in Jagodnik et al.
A differenza delle tecnologie RIL-seq e CLASH, MAPS non fornisce direttamente informazioni sui siti di interazione. Tuttavia, un picco di letture mappate è frequentemente osservato in una regione ristretta del bersaglio dell'RNA (ad esempio, l'estremità 3 ' dell'operone glyW-cysT-leuZ 21), facilitando l'identificazione del sito di accoppiamento. In alternativa, è possibile utilizzare diversi strumenti di previsione per prevedere il sito di associazione putativa sulla destinazione identificata, ad esempio IntaRNA40.
MAPS esamina il targetome di un particolare sRNA
La tecnologia MAPS è adatta per lo studio del targetome di sRNA nei batteri Gram-negativi come E. coli e S. Typhimurium, ma anche ora con questo protocollo modificato in batteri Gram-positivi come S. aureus. Fondamentalmente, MAPS offre un'istantanea dei duplex RNA:sRNA formati in un dato momento e in specifiche condizioni di crescita. Sfortunatamente, l'elenco degli obiettivi di mRNA potrebbe essere incompleto. Ad esempio, un bersaglio di mRNA imparentato potrebbe essere perso a causa di condizioni sperimentali inappropriate, giustificando le precauzioni sopra menzionate.
Rispetto ad altri metodi comunemente usati come RIL-seq o CLASH, MAPS usa uno sRNA specifico per co-purificare tutti i bersagli di RNA interagenti. Qui, l'interazione sRNA:RNA non viene diluita tra gli altri duplex associati all'RBP, permettendo teoricamente di caratterizzare il suo targetome più profondamente. Tuttavia, sembra che i metodi RIL-seq/CLASH e MAPS rivelarono diversi insiemi di obiettivi putativi di sRNA12,41, suggerendo che questi approcci sperimentali sono complementari. Questa discrepanza potrebbe essere spiegata dalle variazioni delle condizioni di crescita e/o dei pregiudizi generati da ciascun metodo.
Di conseguenza, lo scopo dello studio dovrebbe influenzare la scelta del metodo. Per un'analisi globale dei targetomi di sRNA e quando un RBP è coinvolto nella regolazione mediata da sRNA, dovrebbero essere preferiti i metodi RIL-seq e CLASH. Entrambi gli approcci forniscono una panoramica delle reti normative basate su un particolare RBP e, di conseguenza, scoprono un'ampia varietà di SRNA e obiettivi associati. Al contrario, per lo studio di uno specifico sRNA o quando non è noto/coinvolto alcun RBP, MAPS rappresenta un'opzione appropriata.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla "Agence Nationale de la Recherche" (ANR, Grant ANR-16-CE11-0007-01, RIBOSTAPH e ANR-18-CE12- 0025-04, CoNoCo, a PR). È stato anche pubblicato nell'ambito del labEx NetRNA ANR-10-LABX-0036 e di ANR-17-EURE- 0023 (a PR), come finanziamento dallo Stato gestito da ANR nell'ambito degli investimenti per il futuro programma. DL è stato supportato dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione Europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione Marie Skłodowska-Curie n. 753137-SaRNAReg. Il lavoro in E. Massé Lab è stato supportato da sovvenzioni operative del Canadian Institutes of Health Research (CIHR), del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) e del National Institutes of Health NIH Team Grant R01 GM092830-06A1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Falcon | 352070 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | Starstedt | 72.691 | |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | RNA quantity and quality |
| 250 mL culture flask | Dominique Dutscher | 2515074 | Bacterial cultures |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon | 352051 | Culture centrifugation |
| Absolute ethanol | VWR Chemicals | 20821.321 | RNA extraction and purification |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | Bacterial pelleting | |
| Ampicilin (amp) | Sigma-Aldrich | A9518-5G | Growth medium |
| Amylose resin | New England BioLabs | E8021S | MS2-affinity purification |
| Anti-dioxigenin AP Fab fragment | Sigma Aldrich | 11093274910 | Northern blot assays |
| Autoradiography cassette | ThermoFisher Scientific | 50-212-726 | Northern blot assays |
| BamHI | ThermoFisher Scientific | ER0051 | Plasmid construction |
| BHI (Brain Heart Infusion) Broth | Sigma-Aldrich | 53286 | Growth medium |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | Northern blot assays |
| CDP-Star | Sigma Aldrich | 11759051001 | Northern blot assays (substrate) |
| Centrifuge 5415 R | Eppendorf | RNA extraction and purification | |
| Chloroform | Dominique Dutscher | 508320-CER | RNA extraction and purification |
| DIG-RNA labelling mix | Sigma-Aldrich | 11277073910 | Northern blot assays |
| DNase I | Roche | 4716728001 | DNase treatment |
| Erythromycin (ery) | Sigma-Aldrich | Fluka 45673 | Growth medium |
| FastPrep device | MP Biomedicals | 116004500 | Mechanical lysis |
| Guanidium Thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277-250G | Northern blot assays |
| Hybridization Hoven Hybrigene | Techne | FHB4DD | Northern blot assays |
| Hybridization tubes | Techne | FHB16 | Northern blot assays |
| Isoamyl alcohol | Fisher Scientific | A/6960/08 | RNA extraction and purification |
| LB (Lysogeny Broth) | Sigma-Aldrich | L3022 | Growth medium |
| Lysing Matrix B Bulk | MP Biomedicals | 6540-428 | Mechanical lysis |
| MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | Plasmid construction |
| Milli-Q water device | Millipore | Z00QSV0WW | Ultrapure water |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | RNA/DNA quantity and quality | |
| Nitrocellulose membrane | Dominique Dutsher | 10600002 | Northern blot assays |
| Phembact Neutre | PHEM Technologies | BAC03-5-11205 | Cleaning and decontamination |
| Phenol | Carl Roth | 38.2 | RNA extraction and purification |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530 | Plasmid construction |
| pMBP-MS2 | Addgene | 65104 | MS2-MBP production |
| Poly-Prep chromatography column | BioRad | 7311550 | MS2-affinity purification |
| PstI | ThermoFisher Scientific | ER0615 | Plasmid construction |
| Qubit 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | RNA quantity |
| RNAPro Solution | MP Biomedicals | 6055050 | Mechanical lysis |
| ScriptSeq Complete Kit | Illumina | BB1224 | Preparation of cDNA librairies |
| Spectrophotometer Genesys 20 | ThermoFisher Scientific | 11972278 | Bacterial cultures |
| SpeedVac Savant vacuum device | ThermoFisher Scientific | DNA120 | RNA extraction and purification |
| Stratalinker UV Crosslinker 1800 | Stratagene | 400672 | Northern blot assays |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher Scientific | EL0014 | Plasmid construction |
| TBE (Tris-Borate-EDTA) | Euromedex | ET020-C | Northern blot assays |
| ThermalCycler T100 | BioRad | 1861096 | Plasmid construction |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416-100ML | Northern blot assays |
| X-ray film processor | hu.q | HQ-350XT | Northern blot assays |
| X-ray films Super RX-N | FujiFilm | 4741019318 | Northern blot assays |
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