Bu makalede, enzimatik doku sindirim protokolü kullanılarak rhesus makak kaynaklı adipoz kaynaklı kök hücrelerin (ADSC’ler) izolasyonu anlatılmaktadır. Daha sonra, hücre dekolmanı, saymayı ve kaplamayı içeren ADSC proliferasyonunu tanımladık. Son olarak, ADSC farklılaşması spesifik adipojenik indükleyici ajanlar kullanılarak tanımlanmıştır. Ek olarak, farklılaşmayı doğrulamak için boyama tekniklerini açıklıyoruz.
Yağ dokusu, kendini yenileyebilen zengin ve erişilebilir bir multipotent kök hücre kaynağı sağlar. Bu adipoz türevi kök hücreler (ADSC’ler), fonksiyonel olarak in vivo adipositlerinkine benzeyen tutarlı bir ex vivo hücresel sistem sağlar. ADSC’lerin biyomedikal araştırmalarda kullanımı, yağ dokusunun metabolik regülasyonunun ve fonksiyonunun hücresel olarak araştırılmasına izin verir. ADSC farklılaşması yeterli adiposit genişlemesi için gereklidir ve suboptimal diferansiyasyon yağ disfonksiyonunun majör bir mekanizmasıdır. ADSC farklılaşmasındaki değişiklikleri anlamak, metabolik disfonksiyon ve hastalığın gelişimini anlamak için çok önemlidir. Bu makalede açıklanan protokoller, takip edildiğinde, glukoz alımı, lipoliz, lipogenez ve sekresyonu ölçen tahliller dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere, ADSC metabolik fonksiyonunu değerlendirmek için birkaç in vitro fonksiyonel test için kullanılabilecek olgun adipositler verecektir. Rhesus makakları (Macaca mulatta) fizyolojik, anatomik ve evrimsel olarak insanlara benzerdir ve bu nedenle dokuları ve hücreleri biyomedikal araştırmalarda ve tedavilerin geliştirilmesinde yaygın olarak kullanılmıştır. Burada, 4-9 yaş rhesus makaklarından elde edilen taze subkutan ve omental yağ dokusu kullanılarak ADSC izolasyonunu tanımladık. Yağ dokusu örnekleri kollajenazda enzimatik olarak sindirilir, ardından ADSC’leri stromal vasküler fraksiyondan izole etmek için filtrasyon ve santrifüjleme yapılır. İzole ADSC’ler stromal ortamda çoğaltılır ve ardından stromal ortamda 0.5 μg / mL deksametazon, 0.5 mM izobütil metilksantin ve 50 μM indometazin kokteyli kullanılarak yaklaşık 14-21 günlük farklılaşma sağlanır. Olgun adipositler yaklaşık 14 günlük farklılaşmada gözlenir. Bu yazıda, ADSC izolasyonu, proliferasyonu ve farklılaşması için protokolleri in vitro olarak açıklayacağız. Her ne kadar rhesus makak yağ dokusundan ADSC’lere odaklanmış olsak da, bu protokoller diğer hayvanlardan elde edilen yağ dokusu için minimum ayarlamalarla kullanılabilir.
Yağ dokusu, heterojen bir hücre karışımından, ağırlıklı olarak olgun adipositlerden ve fibroblastlar, bağışıklık hücreleri ve adipoz kaynaklı kök hücreleri (ADSC’ler) içeren stromal vasküler fraksiyondan oluşur1,2,3. Primer ADSC’ler doğrudan beyaz yağ dokusundan izole edilebilir ve adipositlere, kıkırdaklara veya kemik hücrelerine farklılaşmak için uyarılabilir4. ADSC’ler, in vitro multipotensinin korunması ve kendini yenileme gibi klasik kök hücre özellikleri sergiler; ve kültürde plastiğe yapışır 5,6. ADSC’ler, multipotensiyel olmaları ve non-invaziv teknikler kullanılarak büyük miktarlarda kolayca hasat edilebilmeleri nedeniyle rejeneratif tıpta kullanım için önemli bir ilgi çekicidir7. ADSC’lerin adipojenik farklılaşması, lipid birikimi, insülin ile uyarılmış glikoz alımı, lipoliz ve adipokin sekresyonu8 dahil olmak üzere olgun adipositleri fonksiyonel olarak taklit eden hücreler üretir. Olgun adipositlere benzerlikleri, adipositlerin hücresel özelliklerinin ve metabolik fonksiyonlarının fizyolojik olarak araştırılmasında ADSC’lerin yaygın olarak kullanılmasına yol açmıştır. Metabolik disfonksiyon ve bozuklukların gelişiminin hücresel veya doku seviyesinden kaynaklandığı fikrini destekleyen kanıtlar artmaktadır 9,10,11,12. Yeterli yağ dokusu genişlemesi, uygun adiposit fonksiyonu ve etkili metabolik regülasyon için optimal ADSC farklılaşması gereklidir13.
Bu makalede açıklanan protokoller, standart laboratuvar ekipmanlarını ve temel reaktifleri kullanan basit tekniklerdir. Makale ilk olarak primer ADSC’lerin mekanik ve enzimatik sindirim kullanılarak taze yağ dokusundan izole edilmesine yönelik protokolü açıklamaktadır. Daha sonra, ADSC’lerin stromal ortamda proliferasyon ve pasajı için protokol açıklanmaktadır. Son olarak, ADSC’lerin adipojenik farklılaşması için protokol tanımlanmıştır. Farklılaşmayı takiben, bu hücreler adiposit metabolizmasını ve işlev bozukluğu mekanizmalarını daha iyi anlamak için çalışmalar için kullanılabilir. Yağ Kırmızı O ve bor-dipirometen (BODIPY) boyaması kullanılarak adipojenik farklılaşmanın doğrulanması ve lipit damlacığı tespiti için protokoller de tanımlanmıştır. Bu protokollerin ayrıntıları, rhesus makaklarının taze omental yağ dokusundan izole edilen primer ADSC’lere odaklanmıştır. Biz ve diğerleri bu protokolü ADSC’leri rhesus makak subkutan ve omental yağ dokuları depolarından14,15’ten başarılı bir şekilde izole etmek için kullandık. Kullanılan aynı miktarda doku için, deri altı yağ dokusunun omental yağ dokusuna kıyasla daha yoğun, daha sert ve sindirimden daha az hücre verdiğini gözlemledik. Bu protokol aynı zamanda ADSC’leri insan yağ örneklerinden izole etmek için de kullanılmıştır16.
ADSC izolasyonu, proliferasyon ve farklılaşma protokolleri basit ve tekrarlanabilirdir, ancak yeterli izolasyon, sağlıklı genişleme ve verimli farklılaşmayı sağlamak için dikkatli bir teknik gerektirirler. Steril bir çalışma ortamı, tüm hücre kültürü deneyleri için kritik öneme sahiptir. Bakteriler veya mantarlar, kontamine aletler, ortamlar veya çalışma ortamı yoluyla hücre kültürlerine sokulabilir. Mantar kontaminasyonu, kültürdeki spor büyümesi ile belirtilirken, bakteriyel kontaminasy…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Curtis Vande Stouwe’ye teknik yardımları için teşekkür eder. Protokollerin geliştirilmesinin altında yatan araştırma, Ulusal Alkol İstismarı ve Alkolizm Enstitüsü’nden (5P60AA009803-25, 5T32AA007577-20 ve 1F31AA028459-01) gelen hibelerle desteklenmiştir.
0.4 % trypan blue | Thermo-Fisher | 15250061 | |
1.5-ml microcentrifuge tube | Dot Scientific | 707-FTG | |
100 % isopropanol | Sigma-Aldrich | PX1838-P | |
100-mm cell culture dish | Corning | 430167 | |
3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | |
50-mL plastic conical tube | Fisher Scientific | 50-465-232 | |
70-µm cell strainer | Corning | CLS431751 | |
a-MEM | Thermo-Fisher | 12561056 | |
Aluminum foil | Reynolds Wrap | ||
BODIPY | Thermo-Fisher | D3922 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 05470 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Collagenase, Type I | Thermo-Fisher | 17100017 | |
Dexamethasone-Water Soluble | Sigma-Aldrich | D2915 | |
Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Distilled water | Thermo-Fisher | 15230162 | |
Fetal Bovine Serum, USDA-approved | Sigma-Aldrich | F0926 | |
Fungizone/Amphotericin B (250 ug/mL) | Thermo-Fisher | 15290018 | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14175095 | |
Hemacytometer with cover slip | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
Inverted light microscope | Nikon | DIAPHOT-TMD | |
L-glutamine (200 mM) | Thermo-Fisher | 25030081 | |
Laboratory rocker, 0.5 to 1.0 Hz | Reliable Scientific | Model 55 Rocking | |
Neutral buffered formalin (10 %) | Pharmco | 8BUFF-FORM | |
Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
Paraformeldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | |
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo-Fisher | 10010023 | |
Red blood cell (RBC) lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
Serological pipettes, 2 to 25 mL | Costar Stripettes | ||
Standard humidified cell culture incubator, 37 °C, 5 % CO2 | Sanyo | MCO-17AIC | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo-Fisher | 25200056 |