Summary

Rhesus Macaque Adipoz Türevi Kök Hücrelerin İzolasyonu, Proliferasyonu ve Farklılaşması

Published: May 26, 2021
doi:

Summary

Bu makalede, enzimatik doku sindirim protokolü kullanılarak rhesus makak kaynaklı adipoz kaynaklı kök hücrelerin (ADSC’ler) izolasyonu anlatılmaktadır. Daha sonra, hücre dekolmanı, saymayı ve kaplamayı içeren ADSC proliferasyonunu tanımladık. Son olarak, ADSC farklılaşması spesifik adipojenik indükleyici ajanlar kullanılarak tanımlanmıştır. Ek olarak, farklılaşmayı doğrulamak için boyama tekniklerini açıklıyoruz.

Abstract

Yağ dokusu, kendini yenileyebilen zengin ve erişilebilir bir multipotent kök hücre kaynağı sağlar. Bu adipoz türevi kök hücreler (ADSC’ler), fonksiyonel olarak in vivo adipositlerinkine benzeyen tutarlı bir ex vivo hücresel sistem sağlar. ADSC’lerin biyomedikal araştırmalarda kullanımı, yağ dokusunun metabolik regülasyonunun ve fonksiyonunun hücresel olarak araştırılmasına izin verir. ADSC farklılaşması yeterli adiposit genişlemesi için gereklidir ve suboptimal diferansiyasyon yağ disfonksiyonunun majör bir mekanizmasıdır. ADSC farklılaşmasındaki değişiklikleri anlamak, metabolik disfonksiyon ve hastalığın gelişimini anlamak için çok önemlidir. Bu makalede açıklanan protokoller, takip edildiğinde, glukoz alımı, lipoliz, lipogenez ve sekresyonu ölçen tahliller dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere, ADSC metabolik fonksiyonunu değerlendirmek için birkaç in vitro fonksiyonel test için kullanılabilecek olgun adipositler verecektir. Rhesus makakları (Macaca mulatta) fizyolojik, anatomik ve evrimsel olarak insanlara benzerdir ve bu nedenle dokuları ve hücreleri biyomedikal araştırmalarda ve tedavilerin geliştirilmesinde yaygın olarak kullanılmıştır. Burada, 4-9 yaş rhesus makaklarından elde edilen taze subkutan ve omental yağ dokusu kullanılarak ADSC izolasyonunu tanımladık. Yağ dokusu örnekleri kollajenazda enzimatik olarak sindirilir, ardından ADSC’leri stromal vasküler fraksiyondan izole etmek için filtrasyon ve santrifüjleme yapılır. İzole ADSC’ler stromal ortamda çoğaltılır ve ardından stromal ortamda 0.5 μg / mL deksametazon, 0.5 mM izobütil metilksantin ve 50 μM indometazin kokteyli kullanılarak yaklaşık 14-21 günlük farklılaşma sağlanır. Olgun adipositler yaklaşık 14 günlük farklılaşmada gözlenir. Bu yazıda, ADSC izolasyonu, proliferasyonu ve farklılaşması için protokolleri in vitro olarak açıklayacağız. Her ne kadar rhesus makak yağ dokusundan ADSC’lere odaklanmış olsak da, bu protokoller diğer hayvanlardan elde edilen yağ dokusu için minimum ayarlamalarla kullanılabilir.

Introduction

Yağ dokusu, heterojen bir hücre karışımından, ağırlıklı olarak olgun adipositlerden ve fibroblastlar, bağışıklık hücreleri ve adipoz kaynaklı kök hücreleri (ADSC’ler) içeren stromal vasküler fraksiyondan oluşur1,2,3. Primer ADSC’ler doğrudan beyaz yağ dokusundan izole edilebilir ve adipositlere, kıkırdaklara veya kemik hücrelerine farklılaşmak için uyarılabilir4. ADSC’ler, in vitro multipotensinin korunması ve kendini yenileme gibi klasik kök hücre özellikleri sergiler; ve kültürde plastiğe yapışır 5,6. ADSC’ler, multipotensiyel olmaları ve non-invaziv teknikler kullanılarak büyük miktarlarda kolayca hasat edilebilmeleri nedeniyle rejeneratif tıpta kullanım için önemli bir ilgi çekicidir7. ADSC’lerin adipojenik farklılaşması, lipid birikimi, insülin ile uyarılmış glikoz alımı, lipoliz ve adipokin sekresyonu8 dahil olmak üzere olgun adipositleri fonksiyonel olarak taklit eden hücreler üretir. Olgun adipositlere benzerlikleri, adipositlerin hücresel özelliklerinin ve metabolik fonksiyonlarının fizyolojik olarak araştırılmasında ADSC’lerin yaygın olarak kullanılmasına yol açmıştır. Metabolik disfonksiyon ve bozuklukların gelişiminin hücresel veya doku seviyesinden kaynaklandığı fikrini destekleyen kanıtlar artmaktadır 9,10,11,12. Yeterli yağ dokusu genişlemesi, uygun adiposit fonksiyonu ve etkili metabolik regülasyon için optimal ADSC farklılaşması gereklidir13.

Bu makalede açıklanan protokoller, standart laboratuvar ekipmanlarını ve temel reaktifleri kullanan basit tekniklerdir. Makale ilk olarak primer ADSC’lerin mekanik ve enzimatik sindirim kullanılarak taze yağ dokusundan izole edilmesine yönelik protokolü açıklamaktadır. Daha sonra, ADSC’lerin stromal ortamda proliferasyon ve pasajı için protokol açıklanmaktadır. Son olarak, ADSC’lerin adipojenik farklılaşması için protokol tanımlanmıştır. Farklılaşmayı takiben, bu hücreler adiposit metabolizmasını ve işlev bozukluğu mekanizmalarını daha iyi anlamak için çalışmalar için kullanılabilir. Yağ Kırmızı O ve bor-dipirometen (BODIPY) boyaması kullanılarak adipojenik farklılaşmanın doğrulanması ve lipit damlacığı tespiti için protokoller de tanımlanmıştır. Bu protokollerin ayrıntıları, rhesus makaklarının taze omental yağ dokusundan izole edilen primer ADSC’lere odaklanmıştır. Biz ve diğerleri bu protokolü ADSC’leri rhesus makak subkutan ve omental yağ dokuları depolarından14,15’ten başarılı bir şekilde izole etmek için kullandık. Kullanılan aynı miktarda doku için, deri altı yağ dokusunun omental yağ dokusuna kıyasla daha yoğun, daha sert ve sindirimden daha az hücre verdiğini gözlemledik. Bu protokol aynı zamanda ADSC’leri insan yağ örneklerinden izole etmek için de kullanılmıştır16.

Protocol

Elde edilen tüm dokular ve prosedürler, Louisiana Eyalet Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi’ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmış ve Ulusal Sağlık Enstitüsü’nün kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir (NIH yayını No. 85-12, gözden geçirilmiş 1996). 1. Tamponların ve çözeltilerin hazırlanması 1x PBS’ye %5 penisilin/streptomisin (kalem/strep) ve 0,25 μg/mL mantar inhibitörü ekleyerek steril 5-fosfat tampon…

Representative Results

Rhesus makak yağ dokusu örneklerinden izole edilen ADSC’ler kültür plakalarına tohumlandı ve Şekil 1’de gösterilmiştir. Kaplama gününde, hücreler yapışmaz ve Şekil 1A’da gösterildiği gibi kültür kabında yüzer. 72 saat içinde, ADSC’ler% 80 oranında akıcı hale gelecek ve adiposit farklılaşmasına hazır olacaktır (Şekil 1B). ADSC’ler kimyasal indüksiyondan sonra güçlü adipojenik özellikler sergiler. 1…

Discussion

ADSC izolasyonu, proliferasyon ve farklılaşma protokolleri basit ve tekrarlanabilirdir, ancak yeterli izolasyon, sağlıklı genişleme ve verimli farklılaşmayı sağlamak için dikkatli bir teknik gerektirirler. Steril bir çalışma ortamı, tüm hücre kültürü deneyleri için kritik öneme sahiptir. Bakteriler veya mantarlar, kontamine aletler, ortamlar veya çalışma ortamı yoluyla hücre kültürlerine sokulabilir. Mantar kontaminasyonu, kültürdeki spor büyümesi ile belirtilirken, bakteriyel kontaminasy…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar Curtis Vande Stouwe’ye teknik yardımları için teşekkür eder. Protokollerin geliştirilmesinin altında yatan araştırma, Ulusal Alkol İstismarı ve Alkolizm Enstitüsü’nden (5P60AA009803-25, 5T32AA007577-20 ve 1F31AA028459-01) gelen hibelerle desteklenmiştir.

Materials

0.4 % trypan blue Thermo-Fisher 15250061
1.5-ml microcentrifuge tube Dot Scientific 707-FTG
100 % isopropanol Sigma-Aldrich PX1838-P
100-mm cell culture dish Corning 430167
3-Isobutyl-1-methylxanthine Sigma-Aldrich I7018
50-mL plastic conical tube Fisher Scientific 50-465-232
70-µm cell strainer Corning CLS431751
a-MEM Thermo-Fisher 12561056
Aluminum foil Reynolds Wrap
BODIPY Thermo-Fisher D3922
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich 05470
Centrifuge Eppendorf 5810 R
Collagenase, Type I Thermo-Fisher 17100017
Dexamethasone-Water Soluble Sigma-Aldrich D2915
Dimethyl sulfoxide, DMSO Sigma-Aldrich D2650
Distilled water Thermo-Fisher 15230162
Fetal Bovine Serum, USDA-approved Sigma-Aldrich F0926
Fungizone/Amphotericin B (250 ug/mL) Thermo-Fisher 15290018
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) Thermo-Fisher 14175095
Hemacytometer with cover slip Sigma-Aldrich Z359629
Indomethacin Sigma-Aldrich I7378
Inverted light microscope Nikon DIAPHOT-TMD
L-glutamine (200 mM) Thermo-Fisher 25030081
Laboratory rocker, 0.5 to 1.0 Hz Reliable Scientific Model 55 Rocking
Neutral buffered formalin (10 %) Pharmco 8BUFF-FORM
Oil Red O Sigma-Aldrich O0625
Paraformeldehyde Sigma-Aldrich P6148
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo-Fisher 15140122
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Thermo-Fisher 10010023
Red blood cell (RBC) lysis buffer Qiagen 158904
Serological pipettes, 2 to 25 mL Costar Stripettes
Standard humidified cell culture incubator, 37 °C, 5 % CO2 Sanyo MCO-17AIC
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo-Fisher 25200056

References

  1. Fain, J. N. Release of interleukins and other inflammatory cytokines by human adipose tissue is enhanced in obesity and primarily due to the nonfat cells. Vitamins and Hormones. 74, 443-477 (2006).
  2. Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obesity Reviews. 11 (1), 11-18 (2010).
  3. Wang, P., Mariman, E., Renes, J., Keijer, J. The secretory function of adipocytes in the physiology of white adipose tissue. Journal of Cellular Physiology. 216 (1), 3-13 (2008).
  4. Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
  5. Via, A. G., Frizziero, A., Oliva, F. Biological properties of mesenchymal Stem Cells from different sources. Muscles, Ligaments and Tendons Journal. 2 (3), 154-162 (2012).
  6. Horwitz, E. M., et al. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 7 (5), 393-395 (2005).
  7. Zuk, P. Adipose-derived stem cells in tissue regeneration: A Review. International Scholarly Research Notices Stem Cells. 2013, 713959 (2013).
  8. Smith, U., Kahn, B. B. Adipose tissue regulates insulin sensitivity: role of adipogenesis, de novo lipogenesis and novel lipids. Journal of Internal Medicine. 280 (5), 465-475 (2016).
  9. Laclaustra, M., Corella, D., Ordovas, J. M. Metabolic syndrome pathophysiology: the role of adipose tissue. Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Disease. 17 (2), 125-139 (2007).
  10. Grundy, S. M. Adipose tissue and metabolic syndrome: too much, too little or neither. European Journal of Clinical Investigation. 45 (11), 1209-1217 (2015).
  11. Neeland, I. J., et al. Dysfunctional adiposity and the risk of prediabetes and type 2 diabetes in obese adults. Journal of the American Medical Association. 308 (11), 1150-1159 (2012).
  12. Kahn, C. R., Wang, G., Lee, K. Y. Altered adipose tissue and adipocyte function in the pathogenesis of metabolic syndrome. Journal of Clinical Investigation. 129 (10), 3990-4000 (2019).
  13. Sarjeant, K., Stephens, J. M. Adipogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (9), 008417 (2012).
  14. Ford, S. M., et al. Differential contribution of chronic binge alcohol and antiretroviral therapy to metabolic dysregulation in SIV-infected male macaques. American Journal of Physiology – Endocrinology and Metabolism. 315 (5), 892-903 (2018).
  15. Gagliardi, C., Bunnell, B. A. Isolation and culture of rhesus adipose-derived stem cells. Methods in Molecular Biology. 702, 3-16 (2011).
  16. Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
  17. Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  18. Wang, Q. A., Scherer, P. E., Gupta, R. K. Improved methodologies for the study of adipose biology: insights gained and opportunities ahead. Journal of Lipid Research. 55 (4), 605-624 (2014).

Play Video

Cite This Article
Poret, J. M., Molina, P. E., Simon, L. Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells. J. Vis. Exp. (171), e61732, doi:10.3791/61732 (2021).

View Video