Præsenteret her er en protokol for kryogen overførsel af frosne prøver i den dynamiske nukleare polarisering (DNP) magiske vinkel spinning (MAS) nukleare magnetiske resonans (NMR) sonde. Protokollen indeholder anvisninger til rotorlagring forud for eksperimentet og anvisninger for levedygtighedsmålinger før og efter forsøget.
Dynamisk nuklear polarisering (DNP) kan dramatisk øge følsomheden af magiske vinkel spinning (MAS) nukleare magnetiske resonans (NMR) spektroskopi. Disse følsomhedsgevinster stiger, efterhånden som temperaturerne falder, og er store nok til at gøre det muligt at studere molekyler ved meget lave koncentrationer ved driftstemperaturerne (~100 K) for de fleste kommercielle DNP-udstyrede NMR-spektrometre. Dette fører til muligheden for in-cell strukturel biologi på kryopreserverede celler til makromolekyler på deres endogene niveauer i deres oprindelige miljøer. De frysehastigheder, der kræves for cellulær kryopræservering, overskrides dog under typisk prøvehåndtering for DNP MAS NMR, og dette resulterer i tab af cellulær integritet og levedygtighed. I denne artikel beskrives en detaljeret protokol for tilberedning og kryogen overførsel af en frossen prøve af pattedyrceller til et MAS NMR-spektrometer.
Indførelsen af dynamisk nuklear polarisering for magiske vinkel spinning nukleare magnetiske resonans spektroskopi kan øge følsomheden af MAS NMR med flere størrelsesordener. Dette har gjort det muligt at påvise biomolekyler ved eller i nærheden af deres fysiologiske koncentrationer. DNP kan og giver den følsomhed, der kræves for at påvise et isotopisk mærket protein ved endogene (~1 μM) koncentrationer i komplekst biologisk miljø1. Da der findes veletablerede protokoller om at indføre isotopisk mærkede molekyler i umærkede pattedyrsceller uden at påvirke deres levedygtighed, åbner dette mulighed for at studere istopisk berigede biomolekyler på deres endogene niveauer i deres oprindelige miljø. Da DNP-forbedringer desuden er mere effektive ved lavere temperaturer2,3,4, flugter de eksperimentelle temperaturer for DNP MAS NMR pænt med dem, der kræves til langtidsopbevaring af levedygtige pattedyrceller5. Den konventionelle metode til overførsel af en prøve til et DNP MAS NMR-spektrometer udsætter den imidlertid for temperaturudsvingshastigheder, der brister pattedyrsceller.
MAS NMR-eksperimenter kræver, at prøven roteres om den magiske vinkel ved frekvenser, der er lig med eller større end størrelsen af den anisotropiske interaktion, for at den kan beregnes til nul, typisk mindst 4 kHz og ofte meget højere6,7,8,9. Prøver pakkes derfor ind i rotorer, der har en finned spids, der bruges til at drive rotorens rotation med en strøm af gas og har et mærke i den anden ende, så rotationsfrekvensen kan overvåges af et omdrejningstæller. Prøveoverførsel for de fleste MAS NMR-instrumenter opnås ved at injicere rotoren fra instrumentets yderside ind i statoren i slutningen af NMR-sonden med en strøm af tør luft eller nitrogengas. Når rotoren når statoren, som holder rotoren i den magiske vinkel, drives prøverotationen af en luftturbinemekanisme. Separate strømme af gasstøtte, fremdrive og styre temperaturen på rotoren. Indsættelse af en rotor i NMR-spektrometeret og opnåelse af stabil MAS-spinding kræver fint bearbejdede drevspidser og stram kontrol af temperaturen og trykket i de separate gasstrømme. På trods af disse tekniske krav er indsættelse og opnåelse af stabil MAS stort set automatiseret til kommercielle MAS NMR-sonder til rumtemperaturapplikationer.
Situationen er dog mere kompliceret for applikationer med lav temperatur. Prøver til lavtemperaturapplikationer indsættes typisk i spektrometeret ved stuetemperatur og nedfryses i statoren. I det første minut falder prøvetemperaturen hurtigt (> −100 °C/min),og systemtemperaturen kræver flere minutter at ekvilibrere. På grund af samspillet mellem temperatur og tryk håndteres indsættelse og nærmer sig den ønskede MAS ofte manuelt til lavtemperaturapplikationer. På trods af kravet om manuel indgriben er frysning af rotoren inde i instrumentet gavnlig, fordi den minimerer indførelsen af vand og kondens i sonden, hvilket er afgørende for vellykket spinding. Ikke alene kan kondens og isophobning fra omgivende fugt blokere gasledninger, kondens, eller frost på rotoren selv kan mekanisk forhindre MAS. Prøver til lavtemperatur MAS NMR fryses således typisk inde i instrumentet med hastigheder, der overstiger -100 °C/min.
Pattedyrceller kan bevare deres integritet gennem en fryse-optøningscyklus, hvis afkølingen er langsom5,10,11,12, med en hastighed, der er lig med eller langsommere end 1 °C/min. Alternativt bevarer cellerne også deres integritet, hvis kølehastigheden er ultrahurtig13,14,15, med en hastighed, der er hurtigere end 104 °C/min. Satser mellemliggende til disse to ekstremer brud og dræbe pattedyr celler på grund af is krystal dannelse både i og uden for cellerne, selv i nærværelse af kryobeskyttende midler16. Prøvekølingshastighederne for en rumtemperaturrotor inde i en forkølet sonde falder mellem disse to yderpunkter, således at man studerer kryogent bevarede intakte levedygtige pattedyrceller, prøverne skal fryses, før de overføres til instrumentet og overføres til instrumentet uden temperaturudsving, der kan beskadige prøven eller ophobningen af frost på rotoren, der kan forhindre rotoren i at rotere. Protokollen beskriver en metode til frostfri, forkølet rotorindsættelse i et kryogen MAS NMR-system til undersøgelse af kryogent bevarede intakte levedygtige pattedyrscelleprøver. Den kryogene prøveoverførsel, der er beskrevet her, blev udviklet til NMR-karakterisering af levedygtige intakte celler. Det gælder dog for ethvert system, hvor temperaturudsving kan kompromittere prøvens integritet. Dette omfatter enhver række komplekse systemer, såsom fryse slukkede reaktioner for kemisk og strukturel karakterisering af fanget reaktion mellemprodukter17,18, enzymologi19,20 eller protein foldning21,22.
Den kryogene overførsel af frosne prøver til et NMR-spektrometer har held til at bevare levedygtigheden af frosne pattedyrceller gennem NMR-dataindsamlingen. Denne metodes succes fremgår af målinger af levedygtigheden før og efter MAS NMR. Denne fremgangsmåde er vellykket og generaliserbar for ethvert system, hvor temperaturudsving kan kompromittere prøveintegriteten. Den aktuelt præsenterede protokol udføres med HEK 293-cellelinjen. Da kryopræserveringsbetingelserne for mange pattedyrscellelinjer er meget ens, er det sandsynligt, at de her rapporterede tilstande kan oversættes til andre cellulære systemer; de kan dog kræve yderligere optimering af kryobeskyttere, prøvemængder og frysehastigheder for at opnå de samme resultater.
Denne metode kan forbedres ved at pakke rotoren hurtigere ud efter NMR-eksperimentet. Dette trin er i øjeblikket sub optimalt, og dets udførelse påvirker cellernes levedygtighed. Før cellerne kan genbruges i medier, skal drevspidsen og siliciumproppen fjernes fra rotoren. Prøven optøs ujævnt, når rotoren holdes under fjernelse af drevspidsen og siliciumproppen, så kortere rotorhåndteringstider resulterer i højere viabilities. Udviklingen af rotorholdere eller andre værktøjer til at lette ensartet optøning og hurtig fjernelse af drevspidsen og siliciumproppen vil hjælpe med at gøre vurderingen af levedygtigheden efter NMR mere nøjagtig.
Den tilgang til kryogen prøvebelastning, der er beskrevet i denne artikel, er begrænset til NMR-sonder, der understøtter indsættelse og udslyngning af prøver med sonden på plads i NMR-magnetens boring. Mens ekstern prøveindsætning og udslyngning er standard for kommercielle DNP-systemer, har brugerdefinerede sonder ikke altid denne mulighed. Denne tilgang til kryogen prøvebelastning kan også kræve en vis ændring for NMR-sonder, der er bygget til at være kompatible med rotorer i forskellige størrelser. Denne protokol er optimeret til 3,2 mm rotorer og kan kræve ændring, hvis prøvefangerens ydre diameter overstiger den indre diameter af et mikrocentrifugerør (f.eks. trin 3.4.2).
Med anvendelsen af DNP til MAS NMR er det nu muligt at detektere proteiner og andre biomolekyler ved endogene fysiologiskekoncentrationer 24,25,26. Dette åbner mulighed for at studere biomolekyler i deres oprindelige miljøer. Opretholdelse af cellulær integritet og levedygtighed under hele forsøget vil sandsynligvis være afgørende for at forbinde spektroskopiens eksperimentelle resultater med biologiske fænomener. Ukontrolleret frysning af prøver , der indeholder rensede proteiner eller cellulære lysater , kompromitterer typisk ikke prøvekvalitet7,27, selv om der er tegn på , at frysehastigheden kan være en vigtig variabel selv i rensede systemer28. Prøver af pattedyrceller skal dog nedfryses i kontrolleret hastighed, hvis det er vigtigt for fortolkningen at bevare cellulær intakthed og levedygtighed. Her præsenterer vi en protokol for frysning og overførsel af frosne prøver af pattedyrceller til et forkølet DNP MAS NMR-instrument, der undgår potentielt skadelige temperaturudsving og understøtter måling på levedygtige celler.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Cancer Research Prevention &Research Institute of Texas [RR150076], National Science Foundation [1751174]; National Institutes of Health [NS-111236], Welch Foundation [1-1923-20170325]; Lupe Murchison Foundation, Ted Nash Long Life Foundation og Kinship Foundation (Searle Scholars Program) til K.K.F.
0.4% Trypan blue stain | Invitrogen | T10282 | |
100 mm cell culture dish | Thomas Scientific | 430167 | |
150 mm cell culture dish | Nunc | 157150 | |
3.2 mm sapphire rotor | Bruker | ||
45 ° angled forceps | Hampton Research | HR4-859 | |
AMUPol | Cortecnet | C010P005 | |
Black and Silver marker | Sharpie | ||
Cap removing tool | Bruker ? | ||
Cell culture grade water | HyClone | SH30529.03 | |
Ceramic cap | Bruker | ||
CoolCell | Corning/ Biocision | UX-04392-00 (Corning) / BCS-405 (Bioscion) | |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10288 | |
Countess II automated cell counter | Invitrogen | AMQAF1000 | |
Cryogen tubes | Nalgene | 03-337-7Y | |
d8-glycerol | Aldrich | 447498 | |
Deuterium oxide, 99.8 % atom D | Aldrich | 756822-1 | |
DMEM | Gibco | 10569-010 | |
DNP NMR system with 1.7 T cryogen free gyrotron | Bruker | ||
Foam dewar | Spearlab | FD-800 | |
Kimwipes | Kimwipes | ||
Packaging tool | Bruker ? | ||
Pen-Strep | Gibco | 15140-122 | |
Powdered PBS | VWR | VWRRV0780 | |
Protonated PBS | Gibco | 10010-023 | |
Silicon plug | Bruker | ||
Standard Vessel forceps | |||
Tryp-L | Gibco | 12605010 |