Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

توليد الظروف البيئية الديناميكية باستخدام جهاز Microfluidic عالي الإنتاجية

Published: April 17, 2021 doi: 10.3791/61735
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1State Key Laboratory of Cultivation Base for Photoelectric Technology and Functional Materials, State Key Laboratory of Photon-Technology in Western China Energy, Institute of Photonics and Photon-Technology, Northwest University
* These authors contributed equally

Summary

نحن نقدم نظام microfluidic لدراسات الإنتاجية العالية على آلات الحياة المعقدة ، والتي تتكون من 1500 وحدة ثقافة ، ومجموعة من المضخات التجهر المحسنة ومعامل خلط في الموقع. رقاقة microfluidic يسمح لتحليل الظروف البيئية الدقيقة معقدة للغاية وديناميكية في الجسم الحي.

Abstract

تقليد في الظروف البيئية في الجسم الحي أمر بالغ الأهمية للدراسات المختبرية على آلات الحياة المعقدة. ومع ذلك ، فإن التقنيات الحالية التي تستهدف الخلايا والأعضاء الحية إما مكلفة للغاية ، مثل الروبوتات ، أو تفتقر إلى حجم النانولتر ودقة الوقت مللي ثانية في التلاعب السائل. نقدم هنا تصميم وتصنيع نظام microfluidic ، والذي يتكون من 1500 وحدة ثقافية ، ومجموعة من المضخات التمعجية المحسنة ومعامل خلط في الموقع. لإثبات قدرات الجهاز microfluidic ، يتم الحفاظ على مجالات الخلايا الجذعية العصبية (NSC) في النظام المقترح. لاحظنا أنه عندما يتعرض مجال NSC لCXCL في اليوم 1 وEGF في اليوم 2 ، يتم الحفاظ على التوافق على شكل دائري بشكل جيد. الاختلاف في ترتيب الإدخال من 6 أدوية يسبب تغييرات مورفولوجية في مجال NSC وعلامة ممثل مستوى التعبير عن الجذعية NSC (أي Hes5 و Dcx). وتشير هذه النتائج إلى أن الظروف البيئية الديناميكية والمعقدة لها آثار كبيرة على تمايز مجلس الأمن القومي والتجديد الذاتي، وأن الجهاز المقترح للمركبات الدقيقة هو منصة مناسبة لدراسات الإنتاجية العالية على آلية الحياة المعقدة.

Introduction

تقنيات الإنتاجية العالية حاسمة بالنسبة للدراسات الطبية الحيوية والسريرية. ومن خلال إجراء الملايين من الاختبارات الكيميائية أو الوراثية أو الحية للخلايا والأعضاء، يمكن للباحثين تحديد الجينات التي تعدل المسار الجزيئي الحيوي بسرعة، وتخصيص مدخلات الأدوية المتسلسلة للاحتياجات المحددة للمرء. الروبوتات 1 ورقائق microfluidic في تركيبة مع برنامج التحكم في الجهاز تسمح الإجراءات التجريبية المعقدة لتكون الآلي، والتي تغطي التلاعب الخلية / الأنسجة، والمناولة السائلة، والتصوير، ومعالجة البيانات / التحكم2،3. لذلك ، يمكن الحفاظ على مئات وآلاف الحالات التجريبية على رقاقة واحدة ، وفقا للسرعة المطلوبة4،5.

في هذا البروتوكول ، وصفنا إجراء التصميم والتصنيع لجهاز microfluidic ، والذي يتكون من 1500 وحدة ثقافة ، ومجموعة من المضخات التثابر المحسنة ومعامل الخلط في الموقع. تمنع غرفة ثقافة الخلية ذات المستويين القص غير الضروري أثناء التبادل المتوسط ، مما يضمن بيئة ثقافية غير مضطربة لتصوير الخلايا الحية على المدى الطويل. وتبين الدراسات أن الجهاز microfluidic المقترحة هي منصة مناسبة لدراسات الإنتاجية العالية على آلات الحياة المعقدة. وعلاوة على ذلك، فإن الميزات المتقدمة للرقاقة microfluidic تسمح إعادة تشكيل الآلي للظروف البيئة الدقيقة معقدة للغاية وديناميكية في الجسم الحي، مثل السيتوكينات المتغيرة باستمرار والتراكيب ليغاندس6،7، والانتهاء منها يستغرق شهورا للمنصات التقليدية مثل لوحة 96 جيدا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تصميم رقائق ميكروفلويديك

  1. تصميم المضاعف microfluidic تتكون من 18 مداخل، يتم التحكم في كل منها عن طريق صمام الفردية ومضخة العاكسة. لزيادة حجم السائل مدفوعة لكل دورة ضخ، يكون مضخة التجسيم تتكون من 3 قنوات التحكم، والتي تم توسيعها عمدا إلى 200 ميكرومتر، و 10 خطوط تدفق متصلة.
  2. صمم غرفة الثقافة الخالية من القص. يتكون تكرار وحدة الثقافة من مستويين من قبل غرفة ثقافة الخلية السفلية (400 ميكرومتر × 400 ميكرومتر × 150 ميكرومتر) وطبقة عازلة أعلى (400 ميكرومتر × 400 ميكرومتر × 75 ميكرومتر) ، مما يمنع إجهاد القص غير المرغوب فيه على الخلايا أثناء التبادل المتوسط (الشكل 1).
  3. تصميم ميزات عالية الإنتاجية. تكرار وحدة الثقافة لتشكيل تخطيط مصفوفة 30 × 50 ، وتحتل مساحة حوالي 7 سم في 5 سم في الحجم.

2. تصنيع رقاقة وتشغيلها

  1. تصنيع صب النسخة المتماثلة باستخدام الطباعة الحجرية للأشعة فوق البنفسجية
    ملاحظة: تم تصنيع صب النسخة المتماثلة على رقاقة السيليكون وفقا لبروتوكول التصوير الضوئي القياسي8.
    1. تلفيق هياكل القناة
      1. غزل فوتوريست: تدور معطف 5 مل من SU-8 3025 الضوئية السلبية على رقاقة السيليكون في 500 دورة في الدقيقة لمدة 10 ق و 3000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.
      2. خبز ناعم: ضع الرقاقة على لوح ساخن عند 65 درجة مئوية لمدة دقيقتين ثم 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، قم بتهدئتها إلى درجة حرارة الغرفة.
      3. المحاذاة والمعالجة: إصلاح رقاقة وقناع على حامل المحاذاة وبدوره على مصدر الضوء لمدة 18 ق لعلاج الضوئي يتعرض.
      4. خبز ما قبل التعرض: قم بزيادة الرقاقة إلى 95 درجة مئوية عند 110 درجة مئوية / ساعة من درجة حرارة الغرفة وابقها على الأقل 40 دقيقة حتى إزالتها.
      5. تطوير: تراجع رقاقة في الحل النامية (SU-8 المطور) والتحريض عليه لمدة 2.5 دقيقة لغسل قبالة واستعداد الضوئي والحصول على هيكل قناة 25 ميكرومتر عالية.
      6. خبز من الصعب: تغطية رقاقة مع طبق بيتري الزجاج وخبز في 65 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، ثم منحدر تصل إلى 160 درجة مئوية في 120 درجة مئوية / ساعة والاحتفاظ بها لمدة 3 ساعات.
    2. تصنيع غرفة ثقافة الخلية مع طبقة العازلة
      1. استخدام المعلمات الخطوة 2.1.1.1 لتدور معطف 7 مل من SU-8 3075 الضوئية السلبية على رقاقة أعلاه.
      2. خبز ناعم (موضح في الخطوة 2.1.1.2) رقاقة وتغيير القناع لمحاذاة جيدا مع علامات على رقاقة. ثم قم بتشغيل مصدر الضوء لمدة 24 s لعلاج المكشط الضوئي المكشوف.
      3. تراجع رقاقة إلى الحل النامية (SU-8 المطور) والتحريض عليه لمدة 4 دقائق و 40 ثانية لغسل قبالة مضاد للكوادر زائدة عن الحاجة والحصول على هيكل طبقة 75 ميكرومتر عالية أن حول هيكل قناة 25 ميكرومتر عالية ملفقة من قبل. خبز الثابت (وصفها في الخطوة 2.1.1.6) رقاقة لجعل هيكل معقد أقوى.
      4. كرر الخطوات 2.1.2.1-2.1.2.3 لتصنيع هيكل غرفة 75 ميكرومتر عالية التي كومة على هيكل طبقة.
    3. تصنيع هياكل الصمام
      1. باستخدام المعلمة الخطوة 2.1.1.1 لتدور معطف 5 مل من 50x AZ الضوئية الإيجابية على رقاقة أعلاه.
      2. خبز لينة (وصفها في الخطوة 2.1.1.2) رقاقة وجعل قناع محاذاة جيدا مع علامات على رقاقة، ثم الحفاظ على مصدر الضوء على لمدة 20 ق وإيقاف فورا لمدة 30 ق. كرر ضوء على / إيقاف الإجراء في 5 دوائر لعلاج معرض للضوء.
      3. تراجع رقاقة لمطور مطابقة وإثارة لمدة 8 دقائق لغسل قبالة واستعدات ضوئية زائدة عن الحاجة والحصول على الصمامات على شكل دائري التي تتداخل مع قنوات التحكم لضمان اتصال جيد. خبز الثابت (وصفها في الخطوة 2.1.1.6) رقاقة منقوشة لجعل النموذج بأكمله أقوى.
  2. إنتاج رقاقة Microfluidic باستخدام الطباعة الحجرية الناعمة
    1. علاج رقائق السيليكون منقوشة وفارغة مع rimethylchlorosilane لمدة 15 دقيقة.
    2. إعداد 3 أجزاء من هلام PDMS (10:1 من نسبة مونومر / محفز) المقابلة ل 50 غرام من طبقة التدفق، 20 غرام من طبقة التحكم 2، و 20 غرام من الغشاء، على التوالي.
    3. يلقي 50 غرام من هلام PDMS على رقاقة السيليكون منقوشة، وإزالة الغاز لهم لمدة 1-2 ساعة في غرفة فراغ في -0.85 MPa لنسخ طبقة التدفق.
    4. ديغا 2 أجزاء من 20 غرام من PDMS وتدور على رقاقة منقوشة ورقائق السيليكون فارغة في 2000-2800 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية لإعداد طبقة التحكم وطبقة الغشاء.
    5. ضع الرقائق المغطاة ب PDMS في فرن التهوية لمدة 60 دقيقة عند 80 درجة مئوية للحضانة.
    6. محاذاة والسندات طبقات مختلفة معا من خلال جهاز بصري مخصص (التكبير في 100x) والبلازما آلة الحفر. ثم يبقيه في فرن التهوية لمدة 2 ساعة في 80 درجة مئوية لتعزيز الترابط من رقاقة.
    7. لكمة ثقوب مدخل على رقاقة، ومن ثم السندات على غطاء المغلفة PDMS والشفاء لمدة 12 ساعة على الأقل في 80 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  3. عملية رقاقة
    1. قم بتوصيل الصمامات السولينويد الهوائية المصغرة بطبقة التحكم في الشريحة، وافتح واجهة المستخدم الرسومية المخصصة MATLAB8 لربط المفتاح والتحكم فيه.
    2. تعيين الضغوط الختامية لدفع متابعة صمامات غشاء PDMS إلى 25 psi.
    3. تقديم المدخلات مجتمعة المتغيرة ديناميكيا / تسلسلي لغرف المعينة (الشكل 2D) في الوقت المناسب على الخروج من الصمامات.

3. توليد مدخلات ديناميكية في البيئات الدقيقة الخلوية

  1. معالجة الرقاقة وتحميل الخلايا
    1. الحفاظ على ظروف الثقافة القياسية (37 درجة مئوية، 5٪ CO2)على المجهر لمدة 5 ساعات على الأقل.
    2. املأ الشريحة بطبقة متوسطة (أي مذكورة في الملاحظة) واحتضنها في ظروف الثقافة القياسية (الموضحة في الخطوة 3.1.1) لمدة ساعة واحدة على الأقل.
    3. مسح رقاقة من قبل المالحة الفوسفات المخزنة (PBS) أو خلية ثقافة المتوسطة (دولبيكو النسر المعدلة المتوسطة، DMEM) لبناء بيئة ثقافية صحية.
    4. حصاد الخلايا في التقاء 80٪، وإعادة إنفاق الخلايا باستخدام وسائل الإعلام الثقافية (DMEM) في كثافة ~ 106/ مل. ثم قم بتحميل الخلايا في الشريحة عن طريق الضغط على الحل المحتوي على الخلية.
      ملاحظة: يتطلب زراعة خطوط خلايا مختلفة على رقاقة وسيط طلاء المقابلة لعلاج غرفة ثقافة الخلية. عادة، للتجارب على 3T3 الخلايا الليفية والثقافة الملتصقة من هن جميع الصمامات التي تسيطر على غرف الثقافة مفتوحة، والخلايا تتدفق إلى جميع غرف الثقافة داخل نفس العمود.
  2. إعداد لتصوير الخلايا الحية عالي الإنتاجية
    ملاحظة: للحصول على الصورة، تم استخدام مجهر مقلوب مع مرحلة تحويلية آلية وكاميرا رقمية تكميلية لأشباه الموصلات أكسيد المعدن (CMOS). تم التحكم في المرحلة والحصول على الصورة عن طريق البرنامج المخصص.
    1. تصور مصفوفة غرف الثقافة باستخدام عدسة الهدف 10x في مجال مشرق لتأكيد وتحديد إحداثيات الموقع من كل غرفة من 30 في 50 مصفوفة الغرفة.
    2. تحويل العدسة الموضوعية إلى 20x أو 40x ، ثم حدد إحداثيات الموقع للغرفة المطلوبة وينتقل المرحلة التحويلية إلى الموضع المعين بعد التأكيد. ضبط س، ص، ض الطائرة المحورية للحصول على صورة الأمثل.
    3. تم تحديد شدة الضوء وفضح الوقت والمعلمات الأخرى المصورة بشكل فردي لكل قناة (أي التصوير الساطع والمجال الفلوري).
    4. تعيين الفاصل الزمني ومدة دورة التصوير، وحفظ المسار ومن ثم بدء التصوير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم وصف المضخة التثامية التقليدية على رقاقة لأول مرة من قبل ستيفن كويك في عام 2000 ، والتي تم تشغيل التثابير من قبل نمط 101 ، 100 ، 110 ، 010 ، 011 ، 001 8،10. الرقم 0 و 1 يشيران إلى "فتح" و "إغلاق" خطوط التحكم الأفقية 3. كما تم الإبلاغ عن دراسات تستخدم أكثر من 3 صمامات (على سبيل المثال، خمسة)11. على الرغم من أن المضخة العواجيزية المكونة من 3 خطوط تحكم و 3 خطوط تدفق توفر دقة نانولتر ، إلا أن معدل النقل بطيء للغاية لإطعام 1500 غرفة ثقافة. لحل المشكلة، نقوم بتضمين المزيد من خطوط التدفق (أي القنوات العشر المتصلة) لزيادة الحجم السائل المدفوع لكل دورة ضخ (أي 101، 100، 110، 010، 011، 001). وبالتالي، يمكن تسليم المواد الغذائية والأدوية بشكل فعال إلى الغرف المعينة. المضخة العاكسة نقل حجم السائل يمكن أن تزيد بنسبة 16x إلى ~ 50 نانولتر لكل دورة ضخ. كما يتم التحكم في مجموعة من مضخات التجبير من قبل 3 قنوات التحكم المتصلة (الشكل 1ب)، يتم تسليم الحلول من كل مدخل في وقت واحد إلى رقاقة والسماح للخلط على الفور. ولذلك، يمكن توليد المدخلات المتتابعة والجمعية عن طريق الخروج في الوقت المناسب من المداخل المتصلة بحلول مختلفة. وباستخدام نفس المنهجية، يمكن أيضا توليد تركيزات السيتوكين والليجاند المتغيرة الديناميكية. فعلى سبيل المثال، يمكن لمزيج مختار من وسائط الثقافة الفارغة 1 و0.9 و0.2 و0.05 و0.01 غرام/لتر و4 وسائط ثقافة فارغة أن يولد تقلبا في موجة جيبية (يتراوح بين 0 و0.5 غرام/لتر) بتركيز يتراوح بين 0.0005 و0.01 غرام/لتر.

بالنسبة لثقافة الخلايا الأولية ، من الأهمية بمكان الحفاظ على بيئة دقيقة مستقرة. الإجهاد القص واستنفاد المتوسطة مشروطة خلال تبادل المتوسطة سوف تؤثر على السلوك الخلوي ومصير الخلية12. للتغلب على هذه المشاكل، ونحن تصميم طبقة عازلة لمنع الإجهاد القص غير المرغوب فيها على الخلايا خلال تبادل المتوسطة(الشكل 1c). على عكس وحدات الثقافة التقليدية ، فإن المزايا الرئيسية للجهاز (أي التحكم في الصمام) هي قدراتها على الاختلاط في الموقع والتسليم والصيانة للظروف المستقلة. في الشكل 2D، أظهرنا أنه يمكن إنشاء كلمة صينية معقدة على رقاقة عن طريق التسليم الدقيق للسوائل إلى المواقف المعينة والحفاظ على حالة غير متأثرة في غرف الثقافة الفردية. وتتجلى قدرات الجهاز السائل النشط في الاختلاط في الموقع مع مقطع فيديو ، مما يدل على تركيزات FITC المتغيرة ديناميكيا في غرفة الثقافة(الشكل 3c والفيديو 7:47-7:50) ، والتي يتم إنجازها من خلال التحكم في معدل ضخ مضختين عموديتين مستقلتين متصلتين بمداخل2 12. تشير المحاكاة العددية إلى أنه عندما يتم توجيه الوسط من أعلى إلى أسفل من خلال غرف الثقافة ، يصل تدفق القص بسرعة إلى أسفل بئر الثقافة (فيديو 4:07-4:25). يمكن منع قوى القص بشكل فعال عندما يتم توجيه الحل من اليسار إلى اليمين. وحتى عند معدل تدفق المدخلات البالغ 10 ملم/ثانية، تظل الأنسجة الخلوية أو بحجم ميكرومتر دون إزعاج في الجزء السفلي من وحدة الثقافة.

كما هو مبين في الشكل 3b(1) ، كل مدخل هو التحكم بواسطة صمام آخر غير المضخة الشرجية السفلية. عندما يتم اختيار دواء واحد ليتم تسليمها إلى غرف معينة ، يكون المدخل المتصل بالدواء مفتوحا وتشغيل مجموعة المضخة العقفة ينقل هذا الدواء فقط. ل2 أو أدوية متعددة، ونحن ببساطة فتح مداخل متصلة لتوليد خليط من المخدرات في حجم متساو. ونحن أيضا دمج مضخة واحدة المستقلة بيريستاتيكي مستقلة عن الصفيف(الشكل 2G)،والتي يمكن أن تعمل بمعدل ضخ مختلفة من الصفيف، وبالتالي توليد مخففات مختلفة. لمحاكاة الظروف البيئية الحيوية في vivo NSC ، تم إنشاء حالة تسلسلية وجنابية من 6 ليغند (أي خشنة، DLL، EGF، PACAP، CXCL، PDGF)، والتي تتكون من 720 و 56 حالة مختلفة ، باستخدام مجموعة من المضخات العاكسة وتسليمها إلى الغرف المعينة. بالتفصيل، يمكن تمثيل الظروف التسلسلية ك Sij = {ligand i يضاف في اليوم j} وحالة الجمع كما Ci = {ligand i موجود}، حيث ligand i = خشنة، DLL، EGF، PACAP، CXCL، PDGF و j= 1،2،3،4،5،6. تم تسجيل استجابات خلايا ومجالات NSC كل ساعتين أثناء الثقافة والتحفيز.

يتم الحفاظ على المجالات NSC في 400 ميكرومتر في 400 μm غرفة ثقافة الخلية (الشكل 2e والشكل 4). يتم تمثيل التمايز والنبع (أي التجديد الذاتي) للخلايا الجذعية من خلال مستوى التعبير Dcx و Hes5 على التوالي. لاحظنا أنه عندما يتعرض المجال NSC لCXCL في اليوم 1 وEGF في اليوم 2، يتم الحفاظ على تشكيل مستدير الشكل بشكل جيد وهناك زيادة واضحة في حجم الكرة. NSCs مع ارتفاعDcx مستوى التعبير يموت في 3rd اليوم عندما يتم استبدال EGF PACAP, مما يشير إلى آثار على الخلايا المتمايزة13,14,15,16. تبدأ الخلايا في التعلق بسطح PDMS غير المعالج عند التحفيز من قبل DLL في اليومالرابع ، وتتفكك إلى خلايا فردية مع إضافة PDGF في اليومالخامس وخشنة في اليومالسادس. التغييرات في ترتيب إدخال هذه ligands 6 جلب حالة NSC مميزة (الشكل 5). على سبيل المثال، يختلف تطور NSCs بشكل كبير عندما يقوم CXCL بتبديل الموضع مع PDGF على طول التسلسل(الشكل 5a و 5b). وتبين هذه النتائج أن الظروف البيئية المتغيرة الدينامية لها آثار كبيرة على التمايز والتجديد الذاتي للبلدان النامية، مما يمهد الطريق لتطوير منصات للدراسات الطبية الحيوية في الدماغ وكذلك التطبيقات السريرية.

Figure 1
الشكل 1: تصميم رقاقة microfluidic عالية الإنتاجية. تتكون المضخة التجهرية المحسنة من قنوات تدفق متعددة وقنوات تحكم موسعة ، مما يؤدي إلى زيادة حجم السائل المنقول لكل دورة ضخ. (ب) 2005 يتم التحكم في مجموعة من مضخات التجبير من قبل 3 خطوط التحكم المتصلة. ولذلك، فإن إدراج مداخل مختلفة في النقاط الزمنية المبرمجة يمكن أن يولد إشارات مدخلات متفاوتة متتابعة وديناميكية. ج. لمنع تدفق القص غير المرغوب فيه، قمنا بتصميم وحدة ثقافة من مستويين. يتم الحفاظ على الخلايا في الجزء السفلي من المستوى الأدنى، وهو 150 ميكرومتر في العمق. د- الزم ترتبط كل غرفة ثقافية ب 4 قنوات، مما يسمح بتوجيه الحل من خلال الاتجاهات من أعلى إلى أسفل ومن اليسار إلى اليمين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تصنيع رقاقة microfluidic عالية الإنتاجية. تم نقش الهياكل الدقيقة لطبقات التحكم والتدفق أولا على رقاقة السيليكون ، والتي يتم طرح PDMS لتكرارها. (ب) 2005 يتم محاذاة طبقات التحكم والغشاء والتدفق وترابطها معا باستخدام حفر البلازما والترابط الحراري. ج-و. يتم عرض الميزات المتقدمة للرقاقة باستخدام الأصباغ الغذائية الخضراء والزرقاء والصفراء. نحن نظهر أنه بحلول الوقت المناسب على الخروج من الصمامات، يمكن تسليم حلول دقة نانولتر إلى الغرف المعينة. ز.يتم التحكم في مجموعة من المضخات العصاهر بواسطة 3 خطوط تحكم متصلة (أي Control-1)، ومضخة عمودية مستقلة واحدة يتم التحكم فيها بواسطة خطوط تحكم 3 أخرى (أي Control-2). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3:تخطيطي يظهر الجهاز السائل النشط. تخطيطي يظهر أن (أ) الخلايا تتدفق عبر قناة الالتفافية؛ (ب) تتحكم الصمامات في المدخل والمضخة العقفية؛ و (ج) الخلايا تتدفق إلى غرف الثقافة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4:صور تمثيلية للمجال NSC عندما يتم تحفيزها بواسطة مدخلات المخدرات المتتابعة. حقل مشرق (الصف العلوي)، Hes5-GFP (الصف الثاني)، Dcx-Desred(الصف الثالث) تظهر الصور أنه عند التحفيز التسلسلي، يحدث موت خلية كبيرة بين كل من Dcx-highوHs5-high الخلايا. يشير ظهور المنطقة المظلمة إلى موت الخلايا الجذعية ، والتي يتم توطينها في الغالب في المنطقة الأساسية. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: الاختلافات في تشكيل مجال NSC ، Dcx و Hes5 مستوى التعبير ، عندما يتم تحفيزها من قبل مدخلات تسلسلية مختلفة. ومن الواضح أن الاختلاف في ترتيب مدخلات 6 أدوية يسبب تغييرات في الأنسجة، والمورفولوجية، ومستوى التعبير من جزيئات الإشارات، مما يدل على حساسيات مجال NSC للظروف البيئية الديناميكية. تسلسل الإدخال:(أ)DLL>> PACAP>> EGF>> CXCL>> PDGF>> خشنة, (ب) DLL>> PACAP >> منتدى إدارة الإنترنت >> PDGF >> CXCL >> خشنة،(ج)DLL >> PACAP >> PDGF >> CXCL >> EGF >> خشنة،(د)PDGF >> CXCL >> PACAP >> منتدى إدارة الإنترنت >> DLL >> Jagged. شريط المقياس: 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد تم تطوير مختلف الأجهزة microfluidic لأداء تجارب متعددة ومعقدة17،18،19،20. على سبيل المثال ، يمكن أن microwells مصنوعة من مجموعة من فترات الاستراحة الطوبولوجية فخ الخلايا الفردية دون استخدام القوة الخارجية ، والتي تظهر شخصيات مفيدة بما في ذلك حجم العينة الصغيرة ، التوازي ، وانخفاض تكلفة المواد ، استجابة أسرع ، حساسية عالية21،22،23،24. قطرة وسطح التوتر محصورة قطرة القضاء على الحاجة إلى الأجهزة المساعدة مثل micropump، مما يجعل نقل قطرات أكثر منخفضة التكلفة وصديقة للبيئة25،26. يمكن إيداع قطرات السوائل بسهولة على السطح عن طريق المايكروبايت أو فوهات البخاخ ، وبعد التجارب ، قد تكون الأنظمة منتعشة وسهلة الاستخدام27،28. تقنية slipchip يسمح ردود فعل متعددة دون مشاركة من مضخات متكاملة أو صمامات، وبالتالي المستخدم والمنتج ودية29،30. ومع ذلك، تواجه هذه الأنظمة عددا من العقبات التقنية، مثل تخزين المحاليل النانوية في الآبار الصغيرة، والتحكم في الرطوبة، والقيود المفروضة على تقنيات توزيع السائل ذات الحجم المنخفض الموازية.

في هذه الورقة ، وصفنا بروتوكولا للتجارب الطبية الحيوية عالية الإنتاجية باستخدام نظام تصوير الخلايا الحية وجهاز microfluidic مخصص. إجراءات تصنيع رقاقة بما في ذلك الأشعة فوق البنفسجية والليثوغرافيا الحجرية الناعمة، والمعلمات الإعداد للتصوير الفلورسنت التلقائي موضحة بالتفصيل. وتبين النتائج أن السمات الوظيفية المتقدمة (أي غرفة الثقافة من مستويين والمضخة التضمينية المعززة) لشريحة microfluidic المقترحة تتفوق على الأجهزة المبلغ عنها سابقا وتلبية الاحتياجات لإجراء الآلاف من التجارب الموازية. كما وصفنا المعايير الحاسمة (مثل الحفاظ على المتوسطة المكيفة) التي ينبغي للمرء أن يتحكم فيها بعناية للحفاظ على بيئات صحية لثقافة الخلايا الأولية والخلايا الجذعية.

وغالبا ما تعتبر التجارب الطبية الحيوية القائمة على الخلايا، والتي تشمل بروتوكولات معقدة وإضافة مبرمجة للمواد الكيميائية، تستغرق وقتا طويلا وشاقة. على سبيل المثال ، إلى جانب إجراءات التلاعب بالخلايا ، تتطلب المدخلات المشتركة من 6 أدوية مع إعادة التعبئة بالساعة ما لا يقل عن 250 خطوة أنبوبية في الساعة ، والتكرار حتى نهاية التجربة. وعلاوة على ذلك، تتطلب نمذجة الظروف البيئية الديناميكية في الجسم الحي إضافة واحدة أو عدة سيتوكينات وليغاند وعقاقير في الوقت المناسب بدقة ثوان، وهو أمر مستحيل للعمليات اليدوية. نحن هنا نثبت أنه من خلال ربط مداخل الشريحة بأدوية متعددة ، أو تركيزات مختلفة من دواء واحد ، يمكن توليد إشارات إدخال متتابعة ومتتابعة ومتفاوتة ديناميكيا وصيانتها في البيئات الخلوية الخالية من القص. ويمكن بعد ذلك رصد الاستجابات المورفولوجية والكيميائية للخلايا والأنسجة، التي يتم الحفاظ عليها في غرف الثقافة التي تعمل بالتوازي، في الوقت الحقيقي باستخدام برنامج المجهر التجاري.

مع زيادة الإنتاجية من أجهزة microfluidic وجمع البيانات الآلي أثناء التصوير الحيوي ، يمكن لنظام تصوير الخلايا الحية توليد الآلاف من الصور كل ساعة. على سبيل المثال، يؤدي التشغيل المستمر لشريحة 1500 وحدة لمدة أسبوع واحد إلى إنشاء 252,000 صورة. قد يستغرق الأمر شهورا لتتبع تطور الأنسجة وتجمعات الخلايا يدويا (على سبيل المثال، مستوى التعبير للجزيئات الحيوية الموسومة بالفلورسنت) على مستوى الخلية الواحدة. باستخدام برنامج MATLAB مخصص ، يمكن فرز البيانات الضخمة وتنسيقها وتحليلها تلقائيا. يمكن استرجاع الآثار التي تظهر الحركة والميزات المورفولوجية ومستوى التعبير لجزيئات الإشارات (كما هو موضح في الفيديو) ، مما يتجنب الخطأ البشري ويوفر قدرا كبيرا من الوقت.

لذلك ، فإن المنهجية التي نعرضها هنا تظهر بروتوكولات مناسبة لإجراء تجارب حيوية عالية الإنتاجية مع التلاعب الآلي بالخلايا والأنسجة والتصوير الفلوري وتحليل البيانات. يوفر إيقاف تشغيل صمامات الأغشية الحجم السائل المثالي والوقت والدقة المكانية لإعادة بناء الظروف البيئية المتغيرة والمعقدة باستمرار في المختبر مثل الجهاز على الشريحة. وعلى الرغم من أن البروتوكول أكثر تعقيدا بكثير مقارنة بالنهج الطبية الحيوية الانتقالية (مثل الإجراءات اليدوية باستخدام لوحات 96 بئرا)، فإن البروتوكول والمنصة المعروضين لا يقتصران على الدراسات المتعلقة بوظائف الخلايا والأنسجة. قد يسمح لنا فحص مدخلات الأدوية المدمجة والمتعاقبة بتطوير علاجات للتطبيقات السريرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

يقر المؤلفون بالدعم الفني المقدم من جيفنغ تشنغ من شركة تشانسن للصك (الصين) المحدودة. وقد تم دعم هذا العمل من خلال المنح (المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين، 51927804).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2713 Loker Avenue West Torrey pines scientific
AZ-50X AZ Electronic Materials, Luxembourg
Chlorotrimethylsilane(TMCS) 92360-25mL Sigma
CO2 Incubator HP151 Heal Force
Desktop Hole Puncher for PDMS chips WH-CF-14 Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.
DMEM(L-glutamine, High Glucose, henol Red) Invitrogen
Electronic Balance UTP-313 Max:600g, e:0.1g, d:0.01g Shanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co.,LTD.
FBS Sigma
Fibronection 0.25 mg/mL Millipore, Austria
Glutamax 100x Gibco
Heating Incubator BGG-9240A Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd.
Nikon Model Eclipse Ti2-E Nikon
Pen/Strep 10 Units/mL Penicillin 10 ug/mL Streptomycin Invitrogen
Plasma cleaner PDC-002 Harrick Plasma
polydimethylsiloxane(PDMS) Momentive
polylysine 0.01% Sigma
Spin coater ARE-310 Awatori Rentaro
Spin coater TDZ5-WS Cence
Spin coater WH-SC-01 Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.
SU-8 3025 MicroChem, Westborough, MA, USA
SU-8 3075 MicroChem, Westborough, MA, USA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Michael, S., et al. A robotic platform for quantitative high-throughput screening. Assay and Drug Development Technologies. 6 (5), 637-657 (2008).
  2. Kim, S. J., Lai, D., Park, J. Y., Yokokawa, R., Takayama, S. Microfluidic automation using elastomeric valves and droplets: reducing reliance on external controllers. Small. 8 (19), 2925-2934 (2012).
  3. Melin, J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration: the evolution of design rules for biological automation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 213-231 (2007).
  4. Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. H. Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1575-1588 (2013).
  5. Junkin, M., et al. High-content quantification of single-cell immune dynamics. Cell Reports. 15 (2), 411-422 (2016).
  6. Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain. Development. 146 (4), (2019).
  7. Kageyama, R., Shimojo, H., Ohtsuka, T. Dynamic control of neural stem cells by bHLH factors. Neuroscience Research. 138, 12-18 (2019).
  8. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
  9. Zhang, C., et al. Ultra-multiplexed analysis of single-cell dynamics reveals logic rules in differentiation. Science Advances. 5 (4), (2019).
  10. Quake, S. R., Scherer, A. From micro-to nanofabrication with soft materials. Science. 290 (5496), 1536-1540 (2000).
  11. Okandan, M., Galambos, P., Mani, S. S., Jakubczak, J. F. Development of surface micromachining technologies for microfluidics and BioMEMS. Microfluidics and BioMEMS. 4560, International Society for Optics and Photonics. 133-139 (2001).
  12. Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, Sixth Edition. , (1983).
  13. Niu, W., et al. SOX2 reprograms resident astrocytes into neural progenitors in the adult brain. Stem Cell Reports. 4 (5), 780-794 (2015).
  14. Sarkar, D. K., et al. Cyclic adenosine monophosphate differentiated β-endorphin neurons promote immune function and prevent prostate cancer growth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (26), 9105-9110 (2008).
  15. Watanabe, J., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-induced differentiation of embryonic neural stem cells into astrocytes is mediated via the β isoform of protein kinase. C. Journal of Neuroscience Research. 84 (8), 1645-1655 (2006).
  16. Watanabe, J., et al. Involvement of protein kinase C in the PACAP-induced differentiation of neural stem cells into astrocytes. Annals of the New York Academy of Sciences. 1070 (1), 597-601 (2006).
  17. Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298 (5593), 580-584 (2002).
  18. Khademhosseini, A., et al. Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays. Lab on a Chip. 5 (12), 1380-1386 (2005).
  19. Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. Three-dimensional microfluidic devices fabricated in layered paper and tape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (50), 19606-19611 (2008).
  20. Zhang, Y., et al. DNA methylation analysis on a droplet-in-oil PCR array. Lab on a Chip. 9 (8), 1059-1064 (2009).
  21. Huang, N. T., Hwong, Y. J., Lai, R. L. A microfluidic microwell device for immunomagnetic single-cell trapping. Microfluidics and Nanofluidics. 22 (2), 16 (2018).
  22. Galler, K., Bräutigam, K., Große, C., Popp, J., Neugebauer, U. Making a big thing of a small cell-recent advances in single cell analysis. Analyst. 139 (6), 1237-1273 (2014).
  23. Grünberger, A., Wiechert, W., Kohlheyer, D. Single-cell microfluidics: opportunity for bioprocess development. Current Opinion in Biotechnology. 29, 15-23 (2014).
  24. Lin, H., Mei, N., Manjanatha, M. G. In vitro comet assay for testing genotoxicity of chemicals. Optimization in Drug Discovery. , Humana Press. Totowa, NJ. 517-536 (2014).
  25. Bai, H., et al. Efficient water collection on integrative bioinspired surfaces with star-shaped wettability patterns. Advanced Materials. 26 (29), 5025-5030 (2014).
  26. Zhao, J., Chen, S. Following or against topographic wettability gradient: movements of droplets on a micropatterned surface. Langmuir. 33 (21), 5328-5335 (2017).
  27. Theberge, A. B., et al. Microfluidic platform for combinatorial synthesis in picolitre droplets. Lab on a Chip. 12 (7), 1320-1326 (2012).
  28. Zhang, L., et al. Fabrication of ceramic microspheres by diffusion-induced sol-gel reaction in double emulsions. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (22), 11489-11493 (2013).
  29. Moerman, R., et al. Quantitative analysis in nanoliter wells by prefilling of wells using electrospray deposition followed by sample introduction with a coverslip method. Analytical Chemistry. 77 (1), 225-231 (2005).
  30. Zhou, X., Lau, L., Lam, W. W. L., Au, S. W. N., Zheng, B. Nanoliter dispensing method by degassed poly (dimethylsiloxane) microchannels and its application in protein crystallization. Analytical Chemistry. 79 (13), 4924-4930 (2007).

Tags

الهندسة الحيوية ، العدد 170 ، Microfluidic ، الإنتاجية العالية ، تصوير الخلايا الحية
توليد الظروف البيئية الديناميكية باستخدام جهاز Microfluidic عالي الإنتاجية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Che, B., Zhu, J., Sun, D., Feng, X., … More

Che, B., Zhu, J., Sun, D., Feng, X., Zhang, C. Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (170), e61735, doi:10.3791/61735 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter