Summary
We presenteren een microfluïdisch systeem voor studies met hoge doorvoer op complexe levensmachines, dat bestaat uit 1500 kweekeenheden, een reeks verbeterde peristaltische pompen en een on-site mengmodulus. De microfluïdische chip maakt de analyse van de zeer complexe en dynamische micromilieuomstandigheden in vivo mogelijk.
Abstract
Het nabootsen van in vivo omgevingsomstandigheden is cruciaal voor in vitro studies naar complexe levensmachines. De huidige technieken gericht op levende cellen en organen zijn echter ofwel zeer duur, zoals robotica, of missen nanolitervolume en millisecondetijdnauwkeurigheid bij vloeistofmanipulatie. Hierin presenteren we het ontwerp en de fabricage van een microfluïdisch systeem, dat bestaat uit 1.500 kweekeenheden, een reeks verbeterde peristaltische pompen en een on-site mengmodulus. Om de capaciteiten van het microfluïdische apparaat aan te tonen, worden neurale stamcelbollen (NSC) in het voorgestelde systeem gehandhaafd. We merkten op dat wanneer de NSC-bol wordt blootgesteld aan CXCL op dag 1 en EFG op dag 2, de ronde conformatie goed wordt gehandhaafd. Variatie in de invoervolgorde van 6 geneesmiddelen veroorzaakt morfologische veranderingen in de NSC-bol en de representatieve marker van het expressieniveau voor NSC-stemheid (d.w.z. Hes5 en Dcx). Deze resultaten geven aan dat dynamische en complexe omgevingsomstandigheden grote effecten hebben op NSC-differentiatie en zelfvernieuwing, en het voorgestelde microfluïdische apparaat is een geschikt platform voor studies met hoge doorvoer over de complexe levensmachines.
Introduction
Technieken met een hoge doorvoer zijn cruciaal voor biomedische en klinische studies. Door parallel miljoenen chemische, genetische of levende cel- en organoïdetests uit te voeren, kunnen onderzoekers snel genen identificeren die een biomoleculaire route moduleren en sequentiële medicijninvoer aanpassen aan iemands specifieke behoeften. Robotica1 en microfluïdische chips in combinatie met een apparaatbesturingsprogramma maken het mogelijk complexe experimentele procedures te automatiseren, waaronder cel-/weefselmanipulatie, vloeistofbehandeling, beeldvorming en gegevensverwerking/-controle2,3. Daarom kunnen honderden en duizenden experimentele omstandigheden op één chip worden gehandhaafd, volgens de gewenste doorvoer4,5.
In dit protocol beschreven we de ontwerp- en fabricageprocedure van een microfluïdisch apparaat, dat bestaat uit 1500 kweekeenheden, een reeks verbeterde peristaltische pompen en on-site mengmodulus. De celkweekkamer met 2 niveaus voorkomt onnodige afschuiving tijdens medium uitwisseling, wat zorgt voor een ongestoorde kweekomgeving voor langdurige live celbeeldvorming. De studies tonen aan dat het voorgestelde microfluïdische apparaat een geschikt platform is voor studies met hoge doorvoer over de complexe levensmachines. Bovendien maken de geavanceerde kenmerken van de microfluïdische chip geautomatiseerde reconstitutie van zeer complexe en dynamische micromilieuomstandigheden in vivo mogelijk, zoals de steeds veranderende cytokinen en ligandsamenstellingen6,7, waarvan de voltooiing maanden duurt voor conventionele platforms zoals 96-put plaat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Microfluïdisch chipsontwerp
- Ontwerp de microfluïdische multiplexer bestaande uit 18 inhammen, die elk worden aangestuurd door een individuele klep en een peristaltische pomp. Om het vloeistofvolume per pompcyclus te verhogen, moet de peristaltische pomp bestaan uit 3 regelkanalen, die doelbewust zijn verbreed tot 200 μm, en 10 aangesloten stroomleidingen.
- Ontwerp de afschuifvrije kweekkamer. Replicatie van de 2-niveau kweekeenheid bestaat uit een lagere celkweekkamer (400 μm x 400 μm x 150 μm) en een hogere bufferlaag (400 μm x 400 μm x 75 μm), die ongewenste schuifspanning op cellen tijdens medium uitwisseling voorkomt (figuur 1).
- Ontwerp functies met hoge doorvoer. Dupliceer de kweekeenheid om een matrixlay-out van 30 x 50 te vormen, met een oppervlakte van ongeveer 7 cm bij 5 cm groot.
2. Spaanderfabricage en verrichting
- Fabricage van de replicalijst met behulp van UV-lithografie
OPMERKING: De replicalijst is vervaardigd op siliciumwafel volgens het standaard fotolithografieprotocol8.- Fabricage van de kanaalstructuren
- Draaiende fotoresist: Spinlaag 5 ml van de SU-8 3025 negatieve fotoresist op een siliciumwafel bij 500 tpm voor 10 s en 3000 tpm voor 30 s.
- Zacht bakken: Leg het wafeltje 2 minuten op een kookplaat op 65 °C en vervolgens 95 °C gedurende 10 minuten, koel het af tot kamertemperatuur.
- Uitlijnen en uitharden: Bevestig de wafer en het masker op de houder van de aligner en schakel de lichtbron 18 s in om de blootgestelde fotoresist uit te harden.
- Pre-post blootstelling bakken: Verhoog de wafer tot 95°C bij 110°C/h van kamertemperatuur en bewaar deze minstens 40 min tot het verwijderen.
- Ontwikkelen: Dompel de wafer in de ontwikkeloplossing (SU-8 developer) en roer deze 2,5 min om redundante fotoresist af te wassen en de 25 μm hoge kanaalstructuur te krijgen.
- Hard bakken: Bedek de wafel met glazen Petrischaal en bak gedurende 2 minuten op 65 °C, verhoog vervolgens tot 160 °C bij 120 °C / h en bewaar deze gedurende 3 uur.
- Fabricage van de celkweekkamer met de bufferlaag
- Gebruik de parameters van stap 2.1.1.1 om 7 ml van de SU-8 3075 negatieve fotoresist op de bovenstaande wafer te draaien.
- Bak het wafeltje zacht (beschreven in stap 2.1.1.2) en verwissel het masker om goed af te stemmen op de markeringen op de wafer. Schakel vervolgens de lichtbron 24 s in om de blootgestelde fotoresist te genezen.
- Dompel de wafer naar de ontwikkelende oplossing (SU-8 developer) en roer deze gedurende 4 minuten en 40 seconden om redundante fotoresist af te wassen en een 75 μm hoge laagstructuur te krijgen die rond de 25 μm hoge kanaalstructuur die eerder is vervaardigd. Hard bakken (beschreven in stap 2.1.1.6) de wafel om de complexe structuur sterker te maken.
- Herhaal stap 2.1.2.1-2.1.2.3 om een 75 μm hoge kamerstructuur te fabriceren die op de laagstructuur stapelt.
- Fabricage van de klepstructuren
- Gebruik de parameter van stap 2.1.1.1 om 5 ml van de AZ 50x positieve fotoresist op de bovenstaande wafer te draaien.
- Bak het wafeltje zacht (beschreven in stap 2.1.1.2) en maak het masker goed uitgelijnd met markeringen op het wafeltje, houd vervolgens de lichtbron 20 s aan en onmiddellijk 30 s uit. Herhaal de licht aan/uit procedure in 5 cirkels om de blootgestelde fotoresist te genezen.
- Dompel de wafer naar de ontwikkelaar en roer hem ongeveer 8 minuten om redundante fotoresist af te wassen en de ronde kleppen te krijgen die overlappen met de besturingskanalen om een goede verbinding te garanderen. Hard bakken (beschreven in stap 2.1.1.6) de patroonwafel om het hele model sterker te maken.
- Fabricage van de kanaalstructuren
- Microfluïdische chipproductie met behulp van zachte lithografie
- Behandel de patroon- en blanco siliciumwafels gedurende 15 minuten met rimethylchlorosilane.
- Bereid 3 porties PDMS-gel (10:1 monomeer/katalysatorverhouding) die overeenkomen met respectievelijk 50 g debietlaag, 20 g regellaag 2 en 20 g membraan.
- Giet 50 g PDMS-gel op de siliconenwafel met patroon en de-gas ze gedurende 1-2 uur in de vacuümkamer bij -0,85 MPa om de stroomlaag te kopiëren.
- Ontgast de 2 porties van 20 g PDMS en draai deze op de wafer met patroon en een blanco siliciumwafel bij 2000-2800 tpm gedurende 30 s om een controlelaag en membraanlaag voor te bereiden.
- Zet de met PDMS bedekte wafels gedurende 60 minuten in de ventilatieoven bij 80 °C voor incubatie.
- Lijn de verschillende lagen uit en hecht ze aan elkaar via een aangepast optisch apparaat (zoom in 100x) en een plasma-etsmachine. Bewaar het vervolgens 2 uur in een ventilatieoven bij 80 °C om de hechting van de chip te verbeteren.
- Pons de inlaatgaten op de chip en bind deze vervolgens op een pdms-gecoate afdeklip en laat deze voor gebruik minstens 12 uur uitharden bij 80 °C.
- Spaanwerking
- Sluit miniatuur pneumatische magneetventielen aan op de regellaag van de chip en open de aangepaste MATLAB grafische gebruikersinterface8 om de schakelaar te koppelen en te bedienen.
- Stel de sluitdruk van push-up PDMS membraankleppen in op 25 psi.
- Lever dynamisch veranderende combinatorische/sequentiële ingangen aan aangewezen kamers (figuur 2d) door tijdige uitloop van de kleppen.
3. Generatie van dynamische inputs in cellulaire micromilieus
- Spaanbehandeling en celbelasting
- Houd de standaard kweekomstandigheden (37 °C, 5% CO2) gedurende ten minste 5 uur op de microscoop.
- Vul de chip met een coatingmedium (d.w.z. vermeld in de NOTE) en incubeer deze onder de standaard kweekomstandigheden (beschreven in stap 3.1.1) gedurende ten minste één uur.
- Spoel de chip door fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of celkweekmedium (Dulbecco's Modified Eagle's medium, DMEM) om een gezonde kweekomgeving op te bouwen.
- Oogst cellen bij 80% samenvloeiing en resuspendeer de cellen met behulp van kweekmedia (DMEM) met een dichtheid van ~ 106/ml. Laad vervolgens cellen in de chip door de celbevattende oplossing onder druk te zetten.
OPMERKING: Voor het cultiveren van verschillende cellijnen op de chip is een overeenkomstig coatingmedium nodig om de celkweekkamer te behandelen. Typisch, voor experimenten op 3T3 fibroblast en aanhangend cultuur van kip zijn alle kleppen die de kweekkamers regelen open, cellen stromen in alle kweekkamers binnen dezelfde kolom.
- Instellingen voor live-cell imaging met hoge doorvoer
OPMERKING: Voor beeldverwerving werd een omgekeerde microscoop met een geautomatiseerde translationele fase en een digitale complementaire CMOS-camera (Metal-Oxide Semiconductor) gebruikt. Het podium en de beeldverwerving werden aangestuurd via de maatwerksoftware.- Visualiseer de matrix van kweekkamers met behulp van 10x objectieve lens in helder veld om de locatiecoördinaten van elke kamer van de 30 bij 50 kamermatrix te bevestigen en te definiëren.
- Transformeer de objectieve lens naar de 20x of 40x en selecteer vervolgens de locatiecoördinaten van de gewenste kamer en de vertaalfase gaat na bevestiging naar de toegewezen positie. Verfijn het x-, y- en z-brandpuntsvlak om een optimaal beeld te krijgen.
- Optimale lichtintensiteit, belichtingstijd en andere afgebeelde parameters werden individueel bepaald voor elk kanaal (d.w.z. helderveld- en fluorescentiebeeldvorming).
- Stel het interval en de duur van de beeldvormingscyclus in, sla het pad op en begin met beeldvorming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De conventionele on-chip peristaltische pomp werd voor het eerst beschreven door Stephen Quake in 2000, waarbij de peristaltiek werd bediend door het patroon 101, 100, 110, 010, 011, 001 8,10. Het getal 0 en 1 geven "open" en "sluiten" van de 3 horizontale bedieningslijnen aan. Studies met meer dan 3 kleppen (bijv. vijf) zijn ook gerapporteerd11. Hoewel de peristaltische pomp bestaande uit 3 regellijnen en 3 stroomlijnen nanoliternauwkeurigheid biedt, is de transportsnelheid te traag om 1.500 kweekkamers te voeden. Om het probleem op te lossen, nemen we meer stroomleidingen op (d.w.z. de 10 aangesloten kanalen) om het vloeistofvolume per pompcyclus te verhogen (d.w.z. 101, 100, 110, 010, 011, 001). Zo kunnen de voedingsstoffen en medicijnen effectief worden geleverd aan aangewezen kamers. Het peristaltische gepomptransporteerde vloeistofvolume kan met 16x tot ~ 50 nanoliter per pompcyclus toenemen. Aangezien de array van peristaltische pompen wordt aangestuurd door 3 aangesloten besturingskanalen(figuur 1b),worden de oplossingen van elke inlaat tegelijkertijd aan de chip geleverd en kunnen ze onmiddellijk worden gemengd. Combinatorische en sequentiële ingangen kunnen daarom worden gegenereerd door tijdige on-off van de inlaten die zijn aangesloten op verschillende oplossingen. Met behulp van dezelfde methodologie kunnen ook dynamische variërende cytokine- en ligandconcentraties worden gegenereerd. Geselecteerde combinaties van 1, 0,9, 0,2, 0,05, 0,01 g/L en 4 blanco cultuurmedia kunnen bijvoorbeeld een sinusgolffluctuatie (tussen 0 en 0,5 g/L) in concentratie genereren met stapgroottes variërend van 0,0005 tot 0,01 g/L.
Voor de cultuur van primaire cellen is het cruciaal om een stabiel micromilieu te behouden. De spanning van de afschuiving en uitputting van geconditioneerd middel tijdens middelgrote uitwisseling zullen cellulair gedrag en cellot12beïnvloeden. Om deze problemen op te lossen, ontwerpen we een bufferlaag om ongewenste schuifspanning op cellen tijdens medium uitwisseling te voorkomen (figuur 1c). In tegenstelling tot de conventionele kweekeenheden zijn de belangrijkste voordelen van het apparaat (d.w.z. klepgestuurd) hun mogelijkheden van on-site mengen, leveren en onderhouden van onafhankelijke omstandigheden. In figuur 2dhebben we aangetoond dat een complex Chinees woord op chip kan worden gemaakt door nauwkeurige levering van vloeistoffen naar aangewezen posities en onderhoud van een onaangetast toestand in individuele kweekkamers. De mogelijkheden van het actieve vloeistofapparaat bij het mengen ter plaatse worden geïllustreerd met een videoclip, die de dynamisch veranderende FITC-concentraties in een kweekkamer laat zien(figuur 3c en video 7:47-7:50), die wordt bereikt door de pompsnelheid van 2 onafhankelijke peristaltische pompen aangesloten op 2 inhammen12te regelen. Numerieke simulatie suggereert dat wanneer het medium top-down door de kweekkamers wordt geleid, de afschuifstroom snel de bodem van de cultuur goed bereikt (Video 4:07-4:25). De afschuifkrachten kunnen effectief worden voorkomen wanneer de oplossing van links naar rechts wordt geleid. Zelfs bij een ingangsdebiet van 10 mm/s blijft weefsel ter grootte van een cel of micrometer ongestoord aan de onderkant van de kweekeenheid.
Zoals blijkt uit figuur 3b(1), wordt elke inlaat bestuurd door een andere klep dan de onderste peristaltische pomp. Wanneer één medicijn wordt geselecteerd om in aangewezen kamers te worden geleverd, is de inlaat die op het medicijn is aangesloten open en vervoert de werking van de array van de peristaltische pomp alleen dit medicijn. Voor 2 of meerdere medicijnen openen we gewoon de verbonden inhammen om een mengsel van medicijnen op hetzelfde volume te genereren. We integreren ook één onafhankelijke peristatische pomp onafhankelijk van de array(figuur 2g),die met een andere pompsnelheid van de array kan werken en daarom verschillende verdunningen kan genereren. Om de in vivo dynamische omgevingsomstandigheden van NSC na te bootsen, werden sequentiële en combinatorische toestand van 6 liganden (d.w.z. Jagged, DLL, EGF, PACAP, CXCL, PDGF), die bestaat uit 720 en 56 verschillende omstandigheden, gegenereerd met behulp van de array van peristaltische pompen en geleverd aan de aangewezen kamers. In detail kunnen sequentiële toestanden worden weergegeven als Sij = {ligand i wordt toegevoegd op dag j} en een combinatorische toestand als Ci = {ligand i is aanwezig}, waarbij ligand i = Gekarteld, DLL, EGF, PACAP, CXCL, PDGF en j= 1,2,3,4,5,6. Reacties van de NSC cellen en bollen werden elke 2 uur geregistreerd tijdens kweek en stimulatie.
NSC-bollen worden in de celkweekkamer van 400 μm bij 400 μm gehandhaafd (figuur 2e en figuur 4). Differentiatie en stamheid (d.w.z. zelfvernieuwing) van de stamcellen worden vertegenwoordigd door het expressieniveau van respectievelijk Dcx en Hes5. We merkten op dat wanneer de NSC-bol wordt blootgesteld aan CXCL op dag 1 en EFG op dag 2, de ronde conformatie goed wordt gehandhaafd en er een duidelijke toename van de bolgrootte is. NSC 's met een hoogDcx-expressieniveau sterven op de3e dag wanneer EFG wordt vervangen door PACAP, wat effecten suggereert op de gedifferentieerde cellen13,14,15,16. Cellen beginnen zich te hechten aan onbehandeld PDMS-oppervlak na stimulatie door DLL op de4e dag en distantiëren zich in individuele cellen met de toevoeging van PDGF op de5e dag en Jagged op de6e dag. Veranderingen in de invoervolgorde van deze 6 liganden brengen een onderscheidende NSC-status met zich mee (figuur 5). De ontwikkeling van NSC's varieert bijvoorbeeld sterk wanneer CXCL de positie met PDGF langs de reeks verandert (figuur 5a en 5b). Deze resultaten tonen aan dat de dynamische variërende omgevingsomstandigheden grote effecten hebben op differentiatie en zelfvernieuwing van de NSC's, wat de weg vrijmaakt voor de ontwikkeling van brain-on-chipplatforms voor biomedische studies en klinische toepassingen.
Figuur 1: Ontwerp van de microfluïdische chip met hoge doorvoer. a. De verbeterde peristaltische pomp bestaat uit meerdere stromingskanalen en verbrede regelkanalen, wat leidt tot een toename van het overgebrachte vloeistofvolume per pompcyclus. b. De array van peristaltische pompen wordt aangestuurd door 3 aangesloten besturingslijnen. Daarom kan de opname van verschillende inlaten op geprogrammeerde tijdspunten combinatorische, sequentiële en dynamische verschillende ingangssignalen genereren. c. Om ongewenste afschuifstroom te voorkomen, hebben we een kweekunit met 2 niveaus ontworpen. Cellen worden aan de onderkant van het lagere niveau gehouden, dat 150 μm diep is. d. Elke kweekkamer is verbonden met 4 kanalen, waardoor de oplossing door de top-down en links-rechts richtingen kan worden geleid. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Fabricage van de microfluïdische chip met hoge doorvoer. a. Microstructuren van besturings- en stroomlagen werden in de eerste plaats gemodelleerd op siliciumwafel, waarop PDMS wordt gegoten voor replicatie. b. De besturings-, membraan- en stromingslagen worden uitgelijnd en aan elkaar gebonden met behulp van plasmaets en thermische binding. c-f. De geavanceerde kenmerken van de chip worden gedemonstreerd met groene, blauwe en gele kleurstoffen. We laten zien dat door tijdige on-off van de kleppen, oplossingen van nanoliter nauwkeurigheid kunnen worden geleverd aan de aangewezen kamers. g. De array van peristaltische pompen wordt aangestuurd door 3 aangesloten besturingslijnen (d.w.z. Control-1) en één onafhankelijke peristaltische pomp die wordt aangestuurd door andere 3 regellijnen (d.w.z. Control-2). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Een schema met het actieve vloeistofapparaat. Een schema dat aangeeft dat (a) cellen door het bypass-kanaal stromen; b) kleppen regelen de inlaat en de peristaltische pomp; en (c) cellen stromen in de kweekkamers. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Representatieve beelden van de NSC-sfeer wanneer deze wordt gestimuleerd door sequentiële invoer van geneesmiddelen. Heldere veld (bovenste rij), Hes5-GFP (tweede rij), Dcx-Desred (derde rij) beelden laten zien dat bij sequentiële stimulatie, aanzienlijke celdood optreedt onder zowel Dcx-hoge als Hes5-hoge cellen. De opkomst van het donkere gebied suggereert de dood van stamcellen, die zich meestal in het kerngebied lokaliseren. Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Variaties in NSC-bolconformatie, Dcx- en Hes5-expressieniveau, wanneer ze worden gestimuleerd door verschillende sequentiële ingangen. Het is aangetoond dat variatie in de inputvolgorde van 6 geneesmiddelen veranderingen in weefsel, morfologische en expressieniveau van signaalmoleculen veroorzaakt, wat wijst op de gevoeligheden van NSC-sfeer voor de dynamische omgevingsomstandigheden. De invoerreeksen: (a) DLL>> PACAP>> EGF>> CXCL>> PDGF>> Gekarteld, (b) DLL>> PACAP >> EFG >> PDGF >> CXCL >> Gekarteld, (c) DLL >> PACAP >> PDGF >> CXCL >> EGF >> Gekarteld, (d) PDGF >> CXCL >> Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Verschillende microfluïdische apparaten zijn ontwikkeld om multiplexed en complexe experimenten uit te voeren17,18,19,20. Microwells gemaakt van een reeks topologische uitsparingen kunnen bijvoorbeeld individuele cellen vangen zonder het gebruik van externe kracht, met gunstige karakters, waaronder kleine steekproefgrootte, parallellisatie, lagere materiaalkosten, snellere respons, hoge gevoeligheid21,22,23,24. Druppel en oppervlaktespanning beperkte druppel elimineren de behoefte aan hulphardware zoals een micropomp, waardoor het vervoer van druppels goedkoper en milieuvriendelijkerwordt 25,26. Druppels vloeistoffen kunnen gemakkelijk op het oppervlak worden afgezet door micropipetten of sproeikoppen, en na de experimenten kunnen de systemen gemakkelijk worden vernieuwd en herbruikbaar27,28. De slipchiptechniek maakt multiplexed reacties mogelijk zonder tussenkomst van geïntegreerde pompen of kleppen, en dus gebruiks- en producentvriendelijk29,30. Deze systemen worden echter geconfronteerd met een aantal technische obstakels, zoals het opslaan van nanoliteroplossingen in microputten, het regelen van de vochtigheid en beperkingen van parallelle vloeistofdoseringstechnologieën met een laag volume.
In dit artikel beschreven we een protocol voor biomedische experimenten met hoge doorvoer met behulp van live cell imaging system en een aangepast microfluïdisch apparaat. De procedures voor chipfabricage, waaronder UV- en zachte lithografie, en installatieparameters voor automatische fluorescerende beeldvorming worden in detail gedemonstreerd. De resultaten tonen aan dat de geavanceerde functionele kenmerken (d.w.z. de kweekkamer met 2 niveaus en de verbeterde peristaltische pomp) van de voorgestelde microfluïdische chip beter presteren dan eerder gerapporteerde apparaten en voldoen aan de behoeften om duizenden parallelle experimenten uit te voeren. We hebben ook de cruciale parameters beschreven (bijvoorbeeld het onderhoud van geconditioneerd medium) die men zorgvuldig moet controleren om een gezonde omgeving te behouden voor de cultuur van primaire en stamcellen.
Celgebaseerde biomedische experimenten, waaronder complexe protocollen en geprogrammeerde toevoeging van chemicaliën, worden vaak als tijdrovend en arbeidsintensief beschouwd. Naast de celmanipulatieprocedures vereist combinatorische invoer van 6 geneesmiddelen met elk uur bijvullen bijvoorbeeld ten minste 250 pipetteerstappen per uur en herhaling tot het einde van het experiment. Bovendien vereist het modelleren van dynamische omgevingsomstandigheden in vivo tijdige toevoeging van een of meer cytokinen, liganden en geneesmiddelen met de nauwkeurigheid van seconden, wat onmogelijk is voor handmatige bewerkingen. We tonen hierin aan dat door de inhammen van de chip te verbinden met meerdere geneesmiddelen, of verschillende concentraties van één medicijn, combinatorische, sequentiële en dynamisch variërende ingangssignalen kunnen worden gegenereerd en onderhouden in de afschuifvrije cellulaire omgevingen. De morfologische en chemische reacties van cellen en weefsels, die in de parallel lopende kweekkamers worden gehandhaafd, kunnen vervolgens in realtime worden gecontroleerd met behulp van de commerciële microscoopsoftware.
Met een toenemende doorvoer van microfluïdische apparaten en geautomatiseerde gegevensverzameling tijdens bioimaging, kan het live cell imaging-systeem elk uur duizenden beelden genereren. Zo genereert het continu draaien van de 1500-eenheidschip gedurende een week 252.000 beelden. Het kan maanden duren om de evolutie van weefsels en celpopulaties (bijv. het expressieniveau van de fluorescerend gelabelde biomoleculen) op het niveau van één cel handmatig te volgen. Met behulp van een aangepast MATLAB-programma kunnen de enorme gegevens automatisch worden gesorteerd, geformatteerd en geanalyseerd. Sporen die de mobiliteit, morfologische kenmerken en het expressieniveau van signaalmoleculen laten zien, kunnen worden opgehaald (weergegeven in de video), wat menselijke fouten vermijdt en aanzienlijke tijd bespaart.
Daarom tonen de methodologie die we hier demonstreren geschikte protocollen voor het uitvoeren van biomedische experimenten met hoge doorvoer met geautomatiseerde cel- en weefselmanipulatie, fluorescerende beeldvorming en gegevensanalyse. De aan-uitschakeling van membraankleppen zorgt voor een optimaal vloeistofvolume, tijd en ruimtelijke resolutie om de steeds veranderende en complexe omgevingsomstandigheden voor in vitro zoals een organ-on-chip te reconstrueren. Hoewel het protocol aanzienlijk complexer is in vergelijking met de overgangsal biomedische benaderingen (bijv. handmatige procedures met 96-putplaten), zijn het gepresenteerde protocol en platform niet beperkt tot studies over cel- en weefselfuncties. De screening van combinatorische en sequentiële geneesmiddelinput kan ons in staat stellen therapieën te ontwikkelen voor klinische toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
Auteurs erkennen de technische ondersteuning van Zhifeng Cheng van Chansn Instrument (China) LTD. Dit werk werd ondersteund door subsidies (National Natural Science Foundation of China,51927804).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2713 Loker Avenue West | Torrey pines scientific | ||
| AZ-50X | AZ Electronic Materials, Luxembourg | ||
| Chlorotrimethylsilane(TMCS) 92360-25mL | Sigma | ||
| CO2 Incubator HP151 | Heal Force | ||
| Desktop Hole Puncher for PDMS chips WH-CF-14 | Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd. | ||
| DMEM(L-glutamine, High Glucose, henol Red) | Invitrogen | ||
| Electronic Balance UTP-313 Max:600g, e:0.1g, d:0.01g | Shanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co.,LTD. | ||
| FBS | Sigma | ||
| Fibronection 0.25 mg/mL | Millipore, Austria | ||
| Glutamax 100x | Gibco | ||
| Heating Incubator BGG-9240A | Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd. | ||
| Nikon Model Eclipse Ti2-E | Nikon | ||
| Pen/Strep 10 Units/mL Penicillin 10 ug/mL Streptomycin | Invitrogen | ||
| Plasma cleaner PDC-002 | Harrick Plasma | ||
| polydimethylsiloxane(PDMS) | Momentive | ||
| polylysine 0.01% | Sigma | ||
| Spin coater ARE-310 | Awatori Rentaro | ||
| Spin coater TDZ5-WS | Cence | ||
| Spin coater WH-SC-01 | Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd. | ||
| SU-8 3025 | MicroChem, Westborough, MA, USA | ||
| SU-8 3075 | MicroChem, Westborough, MA, USA |
References
- Michael, S., et al. A robotic platform for quantitative high-throughput screening. Assay and Drug Development Technologies. 6 (5), 637-657 (2008).
- Kim, S. J., Lai, D., Park, J. Y., Yokokawa, R., Takayama, S. Microfluidic automation using elastomeric valves and droplets: reducing reliance on external controllers. Small. 8 (19), 2925-2934 (2012).
- Melin, J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration: the evolution of design rules for biological automation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 213-231 (2007).
- Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. H. Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1575-1588 (2013).
- Junkin, M., et al. High-content quantification of single-cell immune dynamics. Cell Reports. 15 (2), 411-422 (2016).
- Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain. Development. 146 (4), (2019).
- Kageyama, R., Shimojo, H., Ohtsuka, T. Dynamic control of neural stem cells by bHLH factors. Neuroscience Research. 138, 12-18 (2019).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
- Zhang, C., et al. Ultra-multiplexed analysis of single-cell dynamics reveals logic rules in differentiation. Science Advances. 5 (4), (2019).
- Quake, S. R., Scherer, A. From micro-to nanofabrication with soft materials. Science. 290 (5496), 1536-1540 (2000).
- Okandan, M., Galambos, P., Mani, S. S., Jakubczak, J. F. Development of surface micromachining technologies for microfluidics and BioMEMS. Microfluidics and BioMEMS. 4560, International Society for Optics and Photonics. 133-139 (2001).
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, Sixth Edition. , (1983).
- Niu, W., et al. SOX2 reprograms resident astrocytes into neural progenitors in the adult brain. Stem Cell Reports. 4 (5), 780-794 (2015).
- Sarkar, D. K., et al. Cyclic adenosine monophosphate differentiated β-endorphin neurons promote immune function and prevent prostate cancer growth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (26), 9105-9110 (2008).
- Watanabe, J., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-induced differentiation of embryonic neural stem cells into astrocytes is mediated via the β isoform of protein kinase. C. Journal of Neuroscience Research. 84 (8), 1645-1655 (2006).
- Watanabe, J., et al. Involvement of protein kinase C in the PACAP-induced differentiation of neural stem cells into astrocytes. Annals of the New York Academy of Sciences. 1070 (1), 597-601 (2006).
- Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298 (5593), 580-584 (2002).
- Khademhosseini, A., et al. Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays. Lab on a Chip. 5 (12), 1380-1386 (2005).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. Three-dimensional microfluidic devices fabricated in layered paper and tape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (50), 19606-19611 (2008).
- Zhang, Y., et al. DNA methylation analysis on a droplet-in-oil PCR array. Lab on a Chip. 9 (8), 1059-1064 (2009).
- Huang, N. T., Hwong, Y. J., Lai, R. L. A microfluidic microwell device for immunomagnetic single-cell trapping. Microfluidics and Nanofluidics. 22 (2), 16 (2018).
- Galler, K., Bräutigam, K., Große, C., Popp, J., Neugebauer, U. Making a big thing of a small cell-recent advances in single cell analysis. Analyst. 139 (6), 1237-1273 (2014).
- Grünberger, A., Wiechert, W., Kohlheyer, D. Single-cell microfluidics: opportunity for bioprocess development. Current Opinion in Biotechnology. 29, 15-23 (2014).
- Lin, H., Mei, N., Manjanatha, M. G. In vitro comet assay for testing genotoxicity of chemicals. Optimization in Drug Discovery. , Humana Press. Totowa, NJ. 517-536 (2014).
- Bai, H., et al. Efficient water collection on integrative bioinspired surfaces with star-shaped wettability patterns. Advanced Materials. 26 (29), 5025-5030 (2014).
- Zhao, J., Chen, S. Following or against topographic wettability gradient: movements of droplets on a micropatterned surface. Langmuir. 33 (21), 5328-5335 (2017).
- Theberge, A. B., et al. Microfluidic platform for combinatorial synthesis in picolitre droplets. Lab on a Chip. 12 (7), 1320-1326 (2012).
- Zhang, L., et al. Fabrication of ceramic microspheres by diffusion-induced sol-gel reaction in double emulsions. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (22), 11489-11493 (2013).
- Moerman, R., et al. Quantitative analysis in nanoliter wells by prefilling of wells using electrospray deposition followed by sample introduction with a coverslip method. Analytical Chemistry. 77 (1), 225-231 (2005).
- Zhou, X., Lau, L., Lam, W. W. L., Au, S. W. N., Zheng, B. Nanoliter dispensing method by degassed poly (dimethylsiloxane) microchannels and its application in protein crystallization. Analytical Chemistry. 79 (13), 4924-4930 (2007).
