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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Geração de Condições Ambientais Dinâmicas usando um dispositivo microfluido de alto rendimento

Published: April 17, 2021 doi: 10.3791/61735
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1State Key Laboratory of Cultivation Base for Photoelectric Technology and Functional Materials, State Key Laboratory of Photon-Technology in Western China Energy, Institute of Photonics and Photon-Technology, Northwest University
* These authors contributed equally

Summary

Apresentamos um sistema microfluido para estudos de alto rendimento em máquinas de vida complexas, que consiste em 1500 unidades culturais, uma matriz de bombas peristálticas aprimoradas e um módulo de mistura no local. O chip microfluido permite a análise das condições microambientais altamente complexas e dinâmicas in vivo.

Abstract

Imitar condições ambientais in vivo é crucial para estudos in vitro sobre máquinas de vida complexas. No entanto, as técnicas atuais voltadas para células e órgãos vivos são altamente caras, como a robótica, ou não têm volume de nanoliter e precisão de tempo de milissegundos na manipulação líquida. Nós apresentamos aqui o design e a fabricação de um sistema microfluido, que consiste em 1.500 unidades culturais, uma matriz de bombas peristálticas aprimoradas e um módulo de mistura no local. Para demonstrar as capacidades do dispositivo microfluido, as esferas de células-tronco neurais (NSC) são mantidas no sistema proposto. Observamos que quando a esfera NSC é exposta à CXCL no primeiro dia e eGF no dia 2, a conformação em forma redonda é bem mantida. A variação na ordem de entrada de 6 medicamentos causa alterações morfológicas na esfera NSC e no marcador representativo do nível de expressão para a hasteza NSC (ou seja, Hes5 e Dcx). Esses resultados indicam que as condições ambientais dinâmicas e complexas têm grandes efeitos na diferenciação e autoconexão do NSC, e o dispositivo microfluido proposto é uma plataforma adequada para estudos de alto rendimento sobre as máquinas de vida complexa.

Introduction

Técnicas de alto rendimento são cruciais para estudos biomédicos e clínicos. Ao conduzir paralelamente milhões de testes químicos, genéticos ou de células vivas e organoides, os pesquisadores podem identificar rapidamente genes que modulam uma via bio molecular e personalizar a entrada de drogas sequenciais às necessidades específicas. Os chips robóticos1 e microfluidic em combinação com um programa de controle de dispositivos permitem que procedimentos experimentais complexos sejam automatizados, abrangendo manipulação celular/tecido, manuseio líquido, imagem e processamento/controle de dados2,3. Portanto, centenas e milhares de condições experimentais podem ser mantidas em um único chip, de acordo com o rendimento desejado4,5.

Neste protocolo, descrevemos o procedimento de design e fabricação de um dispositivo microfluido, que consiste em 1500 unidades culturais, uma matriz de bombas peristálticas aprimoradas e módulos de mistura no local. A câmara de cultura celular de 2 níveis previne uma tesoura desnecessária durante a troca média, o que garante um ambiente cultural não perturbado para imagens de células vivas de longo prazo. Os estudos demonstram que o dispositivo microfluido proposto é uma plataforma adequada para estudos de alto rendimento sobre as complexas máquinas de vida. Além disso, as características avançadas do chip microfluido permitem a reconstituição automatizada de condições microambientais altamente complexas e dinâmicas in vivo, como as composições de citocinas e ligantes em troca6,7,a conclusão das quais leva meses para plataformas convencionais como placa de 96 poços.

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Protocol

1. Design de chips microfluidos

  1. Projete o multiplexer microfluido composto por 18 entradas, cada uma controlada por uma válvula individual e uma bomba peristáltica. Para aumentar o volume líquido impulsionado por um ciclo de bombeamento, faça com que a bomba peristáltica seja composta por 3 canais de controle, que foram propositalmente ampliados para 200 μm, e 10 linhas de fluxo conectadas.
  2. Projete a câmara de cultura sem tesouras. A replicação da unidade de cultura de 2 níveis é composta por uma câmara de cultura celular inferior (400 μm x 400 μm x 150 μm) e uma camada tampão mais alta (400 μm x 400 μm x 75 μm), que previne o estresse indesejado das células durante a troca média(Figura 1).
  3. Projete recursos de alto rendimento. Duplicar a unidade de cultura para formar um layout de matriz 30 x 50, ocupando uma área de aproximadamente 7 cm por 5 cm de tamanho.

2. Fabricação e operação de chips

  1. Fabricação da moldagem de réplica usando litografia UV
    NOTA: A moldagem da réplica foi fabricada em wafer de silício de acordo com o protocolo de fotolitografia padrão8.
    1. Fabricação das estruturas do canal
      1. Fotoresist giratório: Spin coat 5 mL do fotoresist negativo SU-8 3025 em um wafer de silício a 500 rpm para 10 s e 3000 rpm para 30 s.
      2. Cozimento macio: Coloque o wafer em uma placa quente a 65 °C por 2 min e depois 95 °C por 10 min, esfrie-o até a temperatura ambiente.
      3. Alinhamento e cura: Fixar o wafer e a máscara no suporte do alinhador e ligar a fonte de luz para 18 s para curar o fotoresist exposto.
      4. Pré-exposição pós-exposição bake: Aumente o wafer para 95°C a 110°C/h a partir da temperatura ambiente e mantenha-o pelo menos 40 min até a remoção.
      5. Desenvolva: Mergulhe o wafer na solução em desenvolvimento (desenvolvedor SU-8) e agitar-o por 2,5 min para lavar fotoresist redundante e obter a estrutura do canal de 25 μm de altura.
      6. Cozimento duro: Cubra o wafer com placa de petri de vidro e asse a 65 °C por 2 minutos, depois aumente até 160°C a 120 °C/h e mantenha-o por 3 horas.
    2. Fabricação da câmara de cultura celular com a camada tampão
      1. Use os parâmetros da etapa 2.1.1.1 para girar o revestimento de 7 mL do fotoresist negativo SU-8 3075 no wafer acima.
      2. Asse macio (descrito na etapa 2.1.1.2) o wafer e mude a máscara para se alinhar bem com marcadores no wafer. Em seguida, ligue a fonte de luz para 24 s para curar o fotoresist exposto.
      3. Mergulhe o wafer na solução em desenvolvimento (desenvolvedor SU-8) e agitar-o por 4 minutos e 40 segundos para lavar o fotoresist redundante e obter uma estrutura de camada de 75 μm de altura que em torno da estrutura de canal de 25 μm de altura fabricada antes. Cozimento duro (descrito na etapa 2.1.1.6) o wafer para tornar a estrutura complexa mais forte.
      4. Repita as etapas 2.1.2.1-2.1.2.3 para fabricar uma estrutura de câmara de 75 μm de altura que empilhe na estrutura da camada.
    3. Fabricação das estruturas das válvulas
      1. Usando o parâmetro da etapa 2.1.1.1 para girar o casaco de 5 mL do fotoresista positivo AZ 50x no wafer acima.
      2. Asse macio (descrito na etapa 2.1.1.2) o wafer e faça a máscara alinhada bem com marcadores no wafer, em seguida, mantenha a fonte de luz acesa por 20 s e desligada imediatamente por 30 s. Repita o procedimento de luz acesa/desligada em 5 círculos para curar o fotoresist exposto.
      3. Mergulhe o wafer para o desenvolvedor compatível e agitar-o por cerca de 8 minutos para lavar fotoresist redundante e obter as válvulas em forma redonda que se sobrepõem com os canais de controle para garantir uma boa conexão. Cozimento duro (descrito na etapa 2.1.1.6) o wafer padronizado para tornar todo o modelo mais forte.
  2. Produção de chips microfluidos usando litografia macia
    1. Trate os wafers de silício estampados e em branco com rimetilcloosilano por 15 minutos.
    2. Prepare 3 porções de gel PDMS (10:1 de razão monômero/catalisador) correspondentes a 50 g de camada de fluxo, 20 g de controle camada 2 e 20 g de membrana, respectivamente.
    3. Funde 50 g de gel PDMS no wafer de silício padronizado e desaparaso-os por 1-2 horas na câmara de vácuo a -0,85 MPa para copiar a camada de fluxo.
    4. Degas as 2 porções de 20 g de PDMS e gire-a no wafer padronizado e um wafer de silício em branco a 2000-2800 rpm por 30 s, como preparar uma camada de controle e camada de membrana.
    5. Coloque os wafers cobertos de PDMS no forno de ventilação por 60 min a 80 °C para incubação.
    6. Alinhe e conecte as diferentes camadas através de dispositivo óptico personalizado (zoom em 100x) e máquina de gravura de plasma. Em seguida, mantenha-o em um forno de ventilação por 2 horas a 80 °C para melhorar a ligação do chip.
    7. Faça os furos de entrada no chip e, em seguida, conecte-o a um deslizamento revestido de PDMS e curado por pelo menos 12 horas a 80 °C antes de usar.
  3. Operação de chips
    1. Conecte válvulas solenoides pneumáticas em miniatura à camada de controle do chip e abra a interface de usuário gráfica MATLABpersonalizada 8 para vincular e controlar o interruptor.
    2. Ajuste as pressões de fechamento das válvulas de membrana PDMS push-up para 25 psi.
    3. Ofereça entradas combinatórias/sequenciais de mudança dinâmica para câmaras designadas(Figura 2d) por tempo de desconto das válvulas.

3. Geração de insumos dinâmicos em microambientes celulares

  1. Tratamento de chips e carregamento celular
    1. Mantenha as condições de cultura padrão (37 °C, 5% CO2) no microscópio por pelo menos 5 horas.
    2. Encha o chip com meio de revestimento (ou seja, mencionado na NOTA) e incuba-o nas condições de cultura padrão (descrito na etapa 3.1.1) por pelo menos uma hora.
    3. Lave o chip por soro fisiológico tamponado (PBS) ou meio de cultura celular (o meio de DMEM da Águia Modificada de Dulbecco) para construir um ambiente de cultura saudável.
    4. Colher células com 80% de confluência e resuspensar as células usando mídia cultural (DMEM) a uma densidade de ~ 106/mL. Em seguida, carregue as células no chip pressurizando a solução contendo células.
      NOTA: A colheita de diferentes linhas celulares no chip requer meio de revestimento correspondente para tratar a câmara de cultura celular. Normalmente, para experimentos em fibroblasto 3T3 e cultura aderente de galinha todas as válvulas que controlam as câmaras culturais estão abertas, as células fluem para todas as câmaras de cultura dentro da mesma coluna.
  2. Configuração para imagens de células vivas de alto rendimento
    NOTA: Para aquisição de imagem, foi utilizado um microscópio invertido com estágio translacional automatizado e uma câmera digital complementar de semicondutor de óxido de metal (CMOS). O estágio e a aquisição de imagens foram controlados através do software personalizado.
    1. Visualize a matriz das câmaras culturais utilizando lente objetiva de 10x em campo brilhante para afirmar e definir as coordenadas de localização de cada câmara da matriz de 30 por 50 câmaras.
    2. Transforme a lente objetiva para o 20x ou 40x, selecione as coordenadas de localização da câmara desejada e o estágio translacional se move para a posição atribuída após a confirmação. Ajuste bem o plano focal x,y, z para obter uma imagem ideal.
    3. O ideal é que a intensidade da luz, o tempo de exposição e outros parâmetros de imagem foram determinados individualmente para cada canal (ou seja, imagens de campo brilhante e fluorescência).
    4. Defina o intervalo e a duração do ciclo de imagem, salve o caminho e, em seguida, inicie a imagem.

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Representative Results

A bomba peristáltica convencional foi descrita pela primeira vez por Stephen Quake em 2000, usando a qual a peristalse foi acionada pelo padrão 101, 100, 110, 010, 011, 001 8,10. Os números 0 e 1 indicam "abrir" e "fechar" as 3 linhas de controle horizontal. Estudos com mais de 3 válvulas (por exemplo, cinco) também foram relatados11. Embora a bomba peristáltica composta por 3 linhas de controle e 3 linhas de fluxo forneça precisão de nanoliter, a taxa de transporte é muito lenta para alimentar 1.500 câmaras de cultura. Para resolver o problema, incluímos mais linhas de fluxo (ou seja, os 10 canais conectados) para aumentar o volume líquido impulsionado por um ciclo de bombeamento (ou seja, 101, 100, 110, 010, 011, 001). Assim, os nutrientes e medicamentos podem ser efetivamente entregues em câmaras designadas. A bomba peristáltica transportada volume líquido pode aumentar em 16x para ~ 50 nanoliters por ciclo de bombeamento. Como a matriz de bombas peristálticas é controlada por 3 canais de controle conectados(Figura 1b),as soluções de cada entrada são entregues simultaneamente ao chip e permitem a mistura instantânea. As entradas combinatórias e sequenciais podem, portanto, ser geradas por tempo hávezes on-off das entradas conectadas a diferentes soluções. Utilizando a mesma metodologia, citocinas dinâmicas e concentrações de ligantes também podem ser geradas. Por exemplo, combinações selecionadas de 1, 0.9, 0.2, 0,05, 0,01 g/L e 4 mídias de cultura em branco podem gerar uma flutuação de onda seno (entre 0 a 0,5 g/L) em concentração com tamanhos de passo que variam de 0,0005 a 0,01 g/L.

Para a cultura das células primárias, é crucial manter um microambiente estável. O estresse da tesoura e a exaustão do meio condicionado durante a troca média afetarão o comportamento celular e o destino celular12. Para superar esses problemas, projetamos uma camada tampão para evitar o estresse indesejado das tesouras nas células durante a troca média(Figura 1c). Ao contrário das unidades de cultura convencionais, as principais vantagens do dispositivo (ou seja, controlado por válvulas) são suas capacidades de mixagem, entrega e manutenção no local de condições independentes. Na Figura 2d,demonstramos que uma palavra chinesa complexa pode ser criada em chip através da entrega precisa de líquidos para posições designadas e manutenção de uma condição não afetada em câmaras de cultura individuais. As capacidades do dispositivo fluido ativo na mixagem no local são ilustradas com um videoclipe, mostrando as concentrações FITC que mudam dinamicamente em uma câmara de cultura (Figura 3c e Vídeo 7:47-7:50), que é realizada controlando a taxa de bombeamento de 2 bombas peristáticas independentes conectadas a 2 inletas12. A simulação numérica sugere que quando o meio é direcionado de cima para baixo através das câmaras de cultura, o fluxo de cisalhamento rapidamente chega ao fundo da cultura bem (Vídeo 4:07-4:25). As forças de tesoura podem ser efetivamente evitadas quando a solução é direcionada da esquerda para a direita. Mesmo a uma taxa de fluxo de entrada de 10 mm/s, o tecido de tamanho celular ou micrométrico permanece intacto na parte inferior da unidade de cultura.

Como é mostrado na Figura 3b(1), cada entrada é controlada por uma válvula diferente da bomba peristáltica inferior. Quando uma droga é selecionada para ser entregue em câmaras designadas, a entrada ligada à droga está aberta e o funcionamento do conjunto da bomba peristáltica transporta apenas esta droga. Para 2 ou várias drogas, simplesmente abrimos as entradas conectadas para gerar uma mistura de drogas em volume igual. Também integramos uma bomba peristática independente da matriz (Figura 2g),que poderia operar a uma taxa de bombeamento diferente da matriz e, portanto, gerar diferentes diluições. Para imitar as condições ambientais dinâmicas in vivo NSC, foram geradas condições sequenciais e combinatórias de 6 ligantes (ou seja, Irregulares, DLL, EGF, PACAP, CXCL, PDGF),que consiste em 720 e 56 condições diferentes, utilizando-se a matriz de bombas peristálticas e entregues às câmaras designadas. Em detalhes, as condições sequenciais podem ser representadas como Sij = {ligand i é adicionado no dia j} e uma condição combinatória como Ci = {ligante i está presente}, onde ligante i = Irregular, DLL, EGF, PACAP, CXCL, PDGF e j=1,2,3,4,5,6. Respostas das células e esferas do NSC foram registradas a cada 2 horas durante a cultura e estimulação.

As esferas NSC são mantidas na câmara de cultura celular de 400 μm(Figura 2e e Figura 4). A diferenciação e a haste (ou seja, a auto-renovação) das células-tronco são representadas pelo nível de expressão de Dcx e Hes5, respectivamente. Observamos que quando a esfera NSC é exposta à CXCL no dia 1 e EGF no dia 2, a conformação em forma redonda é bem mantida e há um aumento óbvio no tamanho da esfera. NSCs com alto nível de expressãode Dcx morrem no 3º dia quando o EGF é substituído pelo PACAP, sugerindo efeitos nas células diferenciadas13,14,15,16. As células começam a se conectar à superfície PDMS não tratada após a estimulação por DLL no4º dia, e se dissociam em células individuais com a adição de PDGF no5º dia e irregular no dia6. Alterações na ordem de entrada desses 6 ligantes trazem status NSC distinto(Figura 5). Por exemplo, a evolução dos NSCs varia drasticamente quando o CXCL muda de posição com PDGF ao longo da sequência(Figura 5a e 5b). Esses resultados demonstram que as dinâmicas condições ambientais variadas têm grandes efeitos na diferenciação e autoconseção dos NSCs, o que abre caminho para o desenvolvimento de plataformas cerebrais-on-chip para estudos biomédicos, bem como aplicações clínicas.

Figure 1
Figura 1: Projeto do chip microfluido de alta produtividade. A bomba peristáltica aprimorada consiste em múltiplos canais de fluxo e canais de controle ampliados, o que leva ao aumento do volume líquido transferido por ciclo de bombeamento. b. A matriz de bombas peristálticas é controlada por 3 linhas de controle conectadas. Portanto, a inclusão de diferentes entradas em pontos de tempo programados pode gerar sinais de entrada combinatórios, sequenciais e dinâmicos. c. Para evitar o fluxo indesejado de cisalhamento, projetamos uma unidade de cultura de dois níveis. As células são mantidas na parte inferior do nível inferior, que é de 150 μm de profundidade. d. Cada câmara de cultura está conectada a 4 canais, permitindo que a solução seja direcionada através de direções de cima para baixo e esquerda-direita. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Fabricação do chip microfluido de alta produtividade. As microestruturas das camadas de controle e fluxo foram primeiro padronizadas em wafer de silício, no qual o PDMS é lançado para replicação. b. As camadas de controle, membrana e fluxo são alinhadas e unidas usando gravura plasmática e ligação térmica. c-f. As características avançadas do chip são demonstradas usando corantes de alimentos verdes, azuis e amarelos. Mostramos que, oportunamente on-off das válvulas, soluções de precisão nanoliter podem ser entregues às câmaras designadas. g. O conjunto de bombas peristálticas é controlado por 3 linhas de controle conectadas (ou seja, Control-1) e uma bomba peristáltica independente controlada por outras 3 linhas de controle (ou seja, Controle-2). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Um esquema mostrando o dispositivo fluido ativo. Um esquema mostrando que(a)as células fluem através do canal de desvio; bAs válvulas controlam a entrada e a bomba peristáltica; e (c)as células fluem para as câmaras de cultura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Imagens representativas da esfera NSC ao serem estimuladas por entradas de drogas sequenciais. Imagens de campo brilhante (linha superior), Hes5-GFP (segunda fileira), Dcx-Desred (terceira fileira) mostram que, após a estimulação sequencial, a morte celular substancial ocorre entre as células de alta dcxe hes5-alta. O surgimento da área escura sugere a morte de células-tronco, que se localizam principalmente na região central. Barra de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Variações na conformação da esfera NSC, nível de expressão de Dcx e Hes5, ao serem estimuladas por diferentes insumos sequenciais. Demonstra-se que a variação na ordem de entrada de 6 medicamentos causa alterações no nível de tecido, morfológico e de expressão das moléculas de sinalização, indicando as sensibilidades da esfera de NSC às condições ambientais dinâmicas. As sequências de entrada: (a) DLL>> PACAP>> EGF>> CXCL>> PDGF>> Jagged, (b) DLL>> PACAP >> EGF >> PDGF >> CXCL > Jagged, (c)DLL >> PACAP >> PDGF >> CXCL >> EGF >> Jagged, (d) PDGF >> CXCL >> PACAP >> EGF >> DLL >> Jagged. Barra de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Vários dispositivos microfluidos foram desenvolvidos para realizar experimentos multiplexados e complexos17,18,19,20. Por exemplo, microwells feitas de uma matriz de recessos topológicos podem prender células individuais sem o uso de força externa, mostrando caracteres vantajosos, incluindo pequeno tamanho amostral, paraleloização, menor custo de material, resposta mais rápida, alta sensibilidade21,22,23,24. Gotícula e tensão superficial A gotícula confinada elimina a necessidade de hardware auxiliar, como uma microbomba, tornando o transporte de gotículas mais de baixo custo e eco-amigável25,26. Gotas de líquidos podem ser prontamente depositados na superfície por micropipettos ou bocais de pulverizador, e após os experimentos, os sistemas podem ser facilmente atualizados e reutilizáveis27,28. A técnica de slipchip permite reações multiplexadas sem o envolvimento de bombas ou válvulas integradas e, portanto, amigáveis ao usuário e produtor29,30. No entanto, esses sistemas enfrentam uma série de obstáculos técnicos, como armazenar soluções de nanoliter em micro poços, controlar a umidade e limitações de tecnologias paralelas de distribuição de líquidos de baixo volume.

Neste artigo, descrevemos um protocolo para experimentos biomédicos de alto rendimento usando sistema de imagem de células vivas e um dispositivo microfluido personalizado. Os procedimentos de fabricação de chips, incluindo UV e litografia macia, e parâmetros de configuração para imagens fluorescentes automáticas são demonstrados em detalhes. Os resultados mostram que os recursos funcionais avançados (ou seja, a câmara de cultura de 2 níveis e a bomba peristáltica aprimorada) do chip microfluido proposto superam os dispositivos relatados anteriormente e atendem às necessidades de realizar milhares de experimentos paralelos. Também descrevemos os parâmetros cruciais (por exemplo, a manutenção do meio condicionado) que se deve controlar cuidadosamente para manter ambientes saudáveis para a cultura das células primárias e tronco.

Experimentos biomédicos baseados em células, que incluem protocolos complexos e adição programada de produtos químicos, são muitas vezes considerados demorados e trabalhosos. Por exemplo, além dos procedimentos de manipulação celular, insumos combinatórios de 6 drogas com recarga horária requer pelo menos 250 passos de pipetação por hora, e repetição até o final do experimento. Além disso, modelar condições ambientais dinâmicas in vivo requer adição oportuna de uma ou múltiplas citocinas, ligantes e drogas na precisão de segundos, o que é impossível para operações manuais. Demonstramos que conectando as entradas do chip a múltiplas drogas, ou diferentes concentrações de uma única droga, sinais de entrada combinatórios, sequenciais e dinâmicos podem ser gerados e mantidos nos ambientes celulares livres de tesouras. As respostas morfológicas e químicas das células e tecidos, que são mantidas nas câmaras culturais paralelamente em execução, podem então ser monitoradas em tempo real usando o software de microscópio comercial.

Com o aumento do rendimento de dispositivos microfluidos e a coleta automatizada de dados durante a bioimagem, o sistema de imagem de células vivas pode gerar milhares de imagens a cada hora. Por exemplo, o funcionamento contínuo do chip de 1500 unidades durante uma semana gera 252.000 imagens. Pode levar meses para acompanhar manualmente a evolução dos tecidos e populações celulares (por exemplo, o nível de expressão das biomoléculas fluorescentes) no nível único celular. Usando um programa MATLAB personalizado, os dados maciços podem ser automaticamente classificados, formatados e analisados. Traços que mostram a mobilidade, características morfológicas e o nível de expressão das moléculas de sinalização podem ser recuperados (mostrados no vídeo), o que evita erros humanos e economiza uma quantidade considerável de tempo.

Portanto, a metodologia que demonstramos aqui mostra protocolos adequados para a realização de experimentos biomédicos de alto rendimento com manipulação automatizada de células e tecidos, imagem fluorescente e análise de dados. O desligamento on-off das válvulas de membrana fornece volume líquido, tempo e resolução espacial ideais para reconstruir as condições ambientais em constante mudança e complexas para in vitro como um órgão-on-chip. Embora o protocolo seja consideravelmente mais complexo em comparação com as abordagens biomédicas transitórias (por exemplo, procedimentos manuais usando placas de 96 poços), o protocolo e a plataforma apresentados não se restringem a estudos sobre funções celulares e teciduais. A triagem da entrada combinada e sequencial de medicamentos pode nos permitir desenvolver terapias para aplicações clínicas.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os autores reconhecem o apoio técnico de Zhifeng Cheng da Chansn Instrument (China) LTD. Este trabalho foi apoiado por bolsas (Fundação Nacional de Ciência Natural da China,51927804).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2713 Loker Avenue West Torrey pines scientific
AZ-50X AZ Electronic Materials, Luxembourg
Chlorotrimethylsilane(TMCS) 92360-25mL Sigma
CO2 Incubator HP151 Heal Force
Desktop Hole Puncher for PDMS chips WH-CF-14 Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.
DMEM(L-glutamine, High Glucose, henol Red) Invitrogen
Electronic Balance UTP-313 Max:600g, e:0.1g, d:0.01g Shanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co.,LTD.
FBS Sigma
Fibronection 0.25 mg/mL Millipore, Austria
Glutamax 100x Gibco
Heating Incubator BGG-9240A Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd.
Nikon Model Eclipse Ti2-E Nikon
Pen/Strep 10 Units/mL Penicillin 10 ug/mL Streptomycin Invitrogen
Plasma cleaner PDC-002 Harrick Plasma
polydimethylsiloxane(PDMS) Momentive
polylysine 0.01% Sigma
Spin coater ARE-310 Awatori Rentaro
Spin coater TDZ5-WS Cence
Spin coater WH-SC-01 Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.
SU-8 3025 MicroChem, Westborough, MA, USA
SU-8 3075 MicroChem, Westborough, MA, USA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Michael, S., et al. A robotic platform for quantitative high-throughput screening. Assay and Drug Development Technologies. 6 (5), 637-657 (2008).
  2. Kim, S. J., Lai, D., Park, J. Y., Yokokawa, R., Takayama, S. Microfluidic automation using elastomeric valves and droplets: reducing reliance on external controllers. Small. 8 (19), 2925-2934 (2012).
  3. Melin, J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration: the evolution of design rules for biological automation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 213-231 (2007).
  4. Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. H. Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1575-1588 (2013).
  5. Junkin, M., et al. High-content quantification of single-cell immune dynamics. Cell Reports. 15 (2), 411-422 (2016).
  6. Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain. Development. 146 (4), (2019).
  7. Kageyama, R., Shimojo, H., Ohtsuka, T. Dynamic control of neural stem cells by bHLH factors. Neuroscience Research. 138, 12-18 (2019).
  8. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
  9. Zhang, C., et al. Ultra-multiplexed analysis of single-cell dynamics reveals logic rules in differentiation. Science Advances. 5 (4), (2019).
  10. Quake, S. R., Scherer, A. From micro-to nanofabrication with soft materials. Science. 290 (5496), 1536-1540 (2000).
  11. Okandan, M., Galambos, P., Mani, S. S., Jakubczak, J. F. Development of surface micromachining technologies for microfluidics and BioMEMS. Microfluidics and BioMEMS. 4560, International Society for Optics and Photonics. 133-139 (2001).
  12. Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, Sixth Edition. , (1983).
  13. Niu, W., et al. SOX2 reprograms resident astrocytes into neural progenitors in the adult brain. Stem Cell Reports. 4 (5), 780-794 (2015).
  14. Sarkar, D. K., et al. Cyclic adenosine monophosphate differentiated β-endorphin neurons promote immune function and prevent prostate cancer growth. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (26), 9105-9110 (2008).
  15. Watanabe, J., et al. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-induced differentiation of embryonic neural stem cells into astrocytes is mediated via the β isoform of protein kinase. C. Journal of Neuroscience Research. 84 (8), 1645-1655 (2006).
  16. Watanabe, J., et al. Involvement of protein kinase C in the PACAP-induced differentiation of neural stem cells into astrocytes. Annals of the New York Academy of Sciences. 1070 (1), 597-601 (2006).
  17. Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298 (5593), 580-584 (2002).
  18. Khademhosseini, A., et al. Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays. Lab on a Chip. 5 (12), 1380-1386 (2005).
  19. Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. Three-dimensional microfluidic devices fabricated in layered paper and tape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (50), 19606-19611 (2008).
  20. Zhang, Y., et al. DNA methylation analysis on a droplet-in-oil PCR array. Lab on a Chip. 9 (8), 1059-1064 (2009).
  21. Huang, N. T., Hwong, Y. J., Lai, R. L. A microfluidic microwell device for immunomagnetic single-cell trapping. Microfluidics and Nanofluidics. 22 (2), 16 (2018).
  22. Galler, K., Bräutigam, K., Große, C., Popp, J., Neugebauer, U. Making a big thing of a small cell-recent advances in single cell analysis. Analyst. 139 (6), 1237-1273 (2014).
  23. Grünberger, A., Wiechert, W., Kohlheyer, D. Single-cell microfluidics: opportunity for bioprocess development. Current Opinion in Biotechnology. 29, 15-23 (2014).
  24. Lin, H., Mei, N., Manjanatha, M. G. In vitro comet assay for testing genotoxicity of chemicals. Optimization in Drug Discovery. , Humana Press. Totowa, NJ. 517-536 (2014).
  25. Bai, H., et al. Efficient water collection on integrative bioinspired surfaces with star-shaped wettability patterns. Advanced Materials. 26 (29), 5025-5030 (2014).
  26. Zhao, J., Chen, S. Following or against topographic wettability gradient: movements of droplets on a micropatterned surface. Langmuir. 33 (21), 5328-5335 (2017).
  27. Theberge, A. B., et al. Microfluidic platform for combinatorial synthesis in picolitre droplets. Lab on a Chip. 12 (7), 1320-1326 (2012).
  28. Zhang, L., et al. Fabrication of ceramic microspheres by diffusion-induced sol-gel reaction in double emulsions. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (22), 11489-11493 (2013).
  29. Moerman, R., et al. Quantitative analysis in nanoliter wells by prefilling of wells using electrospray deposition followed by sample introduction with a coverslip method. Analytical Chemistry. 77 (1), 225-231 (2005).
  30. Zhou, X., Lau, L., Lam, W. W. L., Au, S. W. N., Zheng, B. Nanoliter dispensing method by degassed poly (dimethylsiloxane) microchannels and its application in protein crystallization. Analytical Chemistry. 79 (13), 4924-4930 (2007).

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Bioengenharia Edição 170 Microfluidic alto rendimento imagem de células vivas
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Che, B., Zhu, J., Sun, D., Feng, X., Zhang, C. Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (170), e61735, doi:10.3791/61735 (2021).

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