Summary
هذه المادة تقارير طريقة بسيطة لعزل الطبقات الفرعية perivitelline الخارجي والداخلي من بيض الدجاج مع التقليل من التغيير الهيكلي وتحسين سولوبيليه البروتين من كل طبقة فرعية لتحليلات البروتيوم.
Abstract
تلعب طبقة مارفيتيلين المحيطة بحفار البويضة دورًا أساسيًا في الإخصاب ، في دفاع البويضة ، وفي تطوير جنين الطيور. وهي تتكون من اثنين من الطبقات الفرعية البروتينية التي ترتبط بإحكام وتشكلت من قبل الأجهزة التناسلية الأنثوية متميزة. ويفترض أن لكل من الهيكلين خصوصياتهما الوظيفية الخاصة، التي لا يزال يتعين تحديدها. لتوصيف وظيفة البروتينات التي تؤلف كل طبقة فرعية، التحدي الأول هو وضع الظروف التي من شأنها أن تسمح للفصل الميكانيكية من هاتين الطبقتين معقدة، مع الحد من أي ضرر هيكلي. الخطوة الثانية هي تحسين الظروف التجريبية لتسهيل تحلل البروتين من هذين الطبقة الفرعية ، لتحليلات البيوكيميائية اللاحقة. يتم تقييم كفاءة هذا النهج من خلال تحليل ملف البروتين لكل طبقة فرعية بواسطة دوديسيل كبريتات الصوديوم بولي-أكريلاميد جل إلكتروفيرسيس (SDS-PAGE)، والذي من المتوقع أن يكون متميزاً بين الهيكلين. ويظل هذا الإجراء الذي من خطوتين بسيطا؛ فإنه يتطلب المعدات الكيمياوية الحيوية الكلاسيكية والكواشف؛ وهو متوافق مع مزيد من البروتيوميات المتعمقة. ويمكن أيضاً نقلها إلى بيض الطيور الآخر من أجل البيولوجيا المقارنة، مع العلم أن هيكل وتكوين الطبقة شبه الفيئية قد تبين أن لهما سمات خاصة بالأنواع. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الظروف غير التحللية التي تم تطويرها لفصل الطبقات الفرعية (الخطوة 1) تسمح بتحليلاتها الهيكلية عن طريق المسح الضوئي والمجهر الإلكتروني للإرسال. كما قد يشكل الخطوة الأولية لتنقية البروتين اللاحقة لتحليل الأنشطة البيولوجية الخاصة بكل منها وهيكلها ثلاثي الأبعاد، أو لإجراء المزيد من التحليلات الكيميائية المناعية أو الوظيفية. ومن شأن هذه الدراسات أن تساعد على فك الوظيفة الفسيولوجية لهاذين الطبقة الفرعية، وهما من المقومات الهيكلية والوظيفية التي تشكل معايير محددة للنجاح الإنجابي.
Introduction
والغرض من هذه الطريقة هو توفير بروتوكول يسمح بالتوصيف الكيميائي الحيوي اللاحق للطبقة شبه الحيوية (PL)، وهي طبقة بروتينية رقيقة تحيط وصف البيض وتلعب دورا أساسيا في تكاثر أنواع الطيور. و PL، واسمه أيضا "vitelline غشاء" في الأدب، هي شبكة ثلاثية الأبعاد من الألياف السميكة تتكون من عدة أنواع من بروتينات الجليكوبروتين. وهي تتكون من طبقة بيريفيتلين داخلية (IPL) (على اتصال مع صفار) يتم تجميعها في المبيض، ومن طبقة محيطية خارجية (OPL، على اتصال مع الأبيض)، مستلقية على IPL(الشكل 1)وتنتجها infundibulum. هذا النسيج الأخير هو الجزء العلوي مثل القمع من oviduct تلقي بصيلات صفار ناضجة بعد الإباضة، والموقع حيث يحدث الإخصاب. إفراز OPL يحدث بعد هذين الحدثين ويتبعها الودائع المتعاقبة من بياض البيض وقشر البيض في أجزاء محددة أخرى من oviduct. لا ترتبط الوظائف الفسيولوجية لـ PL بالتخصيب والمراحل المبكرة من تكوين الجنين فحسب ، بل ترتبط أيضًا بالحماية المادية والجزيئية للجنين. تحليل البروتيوم من البيض الدجاج التي أجريت على PL كله كشف عن وجود 137 بروتينات مختلفة1, ولكن توزيع معظم هذه البروتينات بين IPL و OPL لا يزال يتعين توضيحها. الحد الأدنى من البيانات المتاحة في التقرير الأدبي أن IPL و OPL عرض ملامح البروتين متميزة جدا2,3,4, مما يوحي خصائص هيكلية وظيفية مختلفة. ومن المرجح أن تكون الندرة النسبية للبيانات المتعلقة بتوزيع البروتينات بين الـ OPL و IPL راجعة إلى صعوبة فصل كلا الطبقات الفرعية الرقيقة والمضمروسة.
توضح الطريقة المعروضة هنا الشروط التي يجب استخدامها لفصل الطبقات الفرعية مع تأثير محدود على بنية كل منها في النسيج مع الحفاظ على محتواها من البروتين ، وتوفير البروتوكول الذي يسمح بالتحلل الكامل للبروتينات لتحليله لاحقًا من قبل البروتيوميكس. ويشمل خطوتين رئيسيتين: 1) 1) رر أخذ العينات وPL/IPL الفصل و 2) PL, OPL, والعلاج IPL للانقلاب البروتين وكهربية لتحليل الطيف الشامل. يتم عرض سير العمل في الشكل 2. ومن الجدير بالذكر أنه على الرغم من أن هذا البروتوكول قد تم تحسينه لتحليلات البروتيوم (الخطوة 2.2)، يمكن إيقافه عند بعض الخطوات للالكتروسكوب النسيجي (مثل المجهر الإلكتروني)، والتحليلات البيوكيميائية المناعية، والدراسات الوظيفية (الخطوة 1)، ولتطهير البروتينات القابلة للذوبان في الملح من أجل توصيف هيكلها والنشاط البيولوجي (الخطوة 2.1)(الشكل 2).
الخطوة الأولى هي إزالة إجمالي PL من صفار البيض (الشكل 2، الخطوة 1.1). جميع الأساليب المنشورة تبدأ بفصل بياض البيض عن صفار البيض يدويًا أو باستخدام فاصل بيض. ويتبع ذلك إزالة بياض البيض المتبقية وchalazae سميكة باستخدام ملقط أو بواسطة الامتزاز على ورقة مرشح5 (الشكل 2A). بعد ذلك ، فإن التقنيات المختارة لعينة PL متغيرة اعتمادًا على المقالات المنشورة. بعض الأوراق تشمل عدة يغسل من صفار، في المياه deionized أو المقطر1،5،6،في 0.85 إلى 1٪ محلول ملحي2،7،8، في حلول التخزين المؤقت مثل 0.15 M NaCl / N -N تريس (هيدروكسي ميثيل)ميثيل]-2-aminoethanesulfonic حمض، ح ح 7.44، أو في 0.01N HCl (pH 2)3. وقد طبقت هذه الإجراءات على الدجاج، بطة، حلقة العنق الدراج، الحجل الرمادي، الببغاء كوكاتيل، حمامة محلية، أو بيض الجرات2،6،9. إزالة PL بينما يتم الحفاظ على صفار البيض في طبق بيتري دون حلول مائي قد تكون شاقة للغاية كما PL هش وصفار البيض يميل إلى التمسك PL1،5 وبالتالي لا يزال من الصعب القضاء على بعد ذلك. استخدام العازلة الحمضية أو حل لمدة ساعة في 37 ° C3 أيضا غير مفضل مثل هذه الظروف قد تغير هيكل PL وقد يؤدي إلى فقدان البروتين. من المهم أيضا إزالة المنطقة التي تحتوي على قرص الجرثومي لأن هذه المنطقة من المرجح أن يكون لها نمط هيكلي وجزئي متميز ، والذي لا يعكس كل PL4،6،10 ( الشكل2B). هذه الطريقة تستفيد من الأفكار التي أبرزتها بعض المقالات المنشورة وتقترح بعض التحسينات لتسهيل أخذ العينات PL مع الحفاظ على سلامتها (الشكل 2C).
وتتألف الخطوة الثانية من فصل الطبقات الفرعية اثنين(الشكل 2، الخطوة 1.2). هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية كما OPL و IPL ترتبط بإحكام إلى بعضها البعض. وينبغي إجراء هذه الخطوة بعناية مع ملقط تحت منظار تشريح المجهر. المنشورات التي تبلغ عن الفصل OPL/IPL محدودة للغاية2و3و7و11 وبعضها يستخدم شروطًا محددة (عازلة حمضية عند 37 درجة مئوية مقابل 1 ساعة2،3)من المرجح أن تؤثر على البنية النسيجية للطبقات الفرعية و / أو تساهم في فقدان البروتين أو صفار أو تلوثات بيضاء. لتمييز أفضل OPL من IPL، أفاد بعض المؤلفين استخدام الأزرق التولويني لتلوين طفيف OPL (الطبقة الداخلية لا تزال بلا لون)11. في الطريقة المتقدمة، ونحن الأمثل الظروف بحيث يتحقق بسهولة الفصل ولا يتطلب استخدام أي صبغة(الشكل 2D).
الخطوة الرئيسية الثانية هي solubilization من البروتينات التي تؤلف كل طبقة فرعية. كلاسيكيا، ويتحقق ذلك عن طريق خلط1lyophilized نظيفة، المجففة2،6،أو أعدت حديثا3،4،11 PL / sublayers مباشرة مع عازلة Laemmli المستخدمة لكهربية. يفضل مؤلفون آخرين solubilization الأولية من طبقات في 1٪ NaCl, في 1٪ SDS التخزين المؤقت حل2,3,11 أو في حل يحتوي على مثبطات البروتياز و SDS6 في درجة حرارة الغرفة أو تريتون تليها حضانة في 45 °C12, تحت تحريك قوي مستمر. كما وصف بعض المؤلفين بروتوكول حيث تم احتضان PL في الفوسفات العازلة المالحة أو اليوريا وتعرض ل sonication13. وقد أعقب هذه العلاجات كل من الطرد المركزي والتخفيف في عازلة Laemmli وجميع حصة العيب من سولوبيليشن البروتين غير مكتملة من طبقات كما يتم التخلص من هذه المسألة غير قابلة للذوبان (بيليه التي تم الحصول عليها بعد الطرد المركزي) من العينة ليتم تحليلها.
بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام ظروف الدس (اليوريا ، المنظفات ، ارتفاع درجة الحرارة ، إلخ) من قبل بعض المؤلفين لتجميل البروتين لا يتوافق مع تنقية البروتين اللاحقة للتوصيف لأنها من المرجح أن تعطل البروتينات بشكل لا رجعة فيه ، وتتداخل مع أنشطتها البيولوجية وتضعف أيضًا بنيتها ثلاثية الأبعاد. لهذه الخطوة 2 محددة ، ويتضمن البروتوكول أول substep السماح لل solubilization من البروتينات الأكثر وفرة في ظل ظروف غير denaturing بعد PL / OPL / IPL الميكانيكية إزالة structuration ، والتي لن تتداخل مع مزيد من الدراسات البروتينية، إذا لزم الأمر(الشكل 2،الخطوة 2.1)، وخطوة فرعية ثانية تسمح بال solubilization كاملة من البروتينات للكهربية والبروتيوميات المتعمقة(الشكل 2،الخطوة 2.2). وهو يجمع بين الاقتراحات المأخوذة من مختلف الأوراق المنشورة والتعديلات الناتجة عن أفكار جديدة التحقق من صحتها من خلال الدراسات التجريبية.
Protocol
1.PL، IPL، وأخذ العينات OPL
- 10- أخذ العينات من
- كسر البيض وضعت حديثا غير مخصب يدويا واستخدام فاصل البيض ملقاة على كوب زجاجي لفصل صفار من الأبيض. إزالة chalazae مع مقص صغير ولفة صفار على ورقة مرشح لإزالة الزميلون التي تظهر شفافة ومرئية (الشكل 2A).
تنبيه: يجب الحرص على عدم ثقب PL مع مقص. استخدام ملاقط بدلا من مقص لإزالة chalazas قد تثير الكسر PL والتسرب صفار لاحقة. الخطوة المتداول على ورقة التصفية أمر بالغ الأهمية وينبغي أن يتم تنفيذها بسرعة كبيرة بسبب خصائص ماصة من مرشح ورقة التي قد تؤدي إلى كسر PL. كما أنه من المهم جدا استخدام البيضة غير المخصب من يوم وضع، لتحسين نجاح هذه الخطوة الأولى وجميع الخطوات اللاحقة. بدلا من ذلك، يمكن استخدام البيض التي تم تخزينها أقل من 10 أيام في بيئة تبريد ولكن يجب على المجربين النظر في المخاطر المحتملة من تعديلات PL. - غمر صفار في بلورة تحتوي على 10 mM تريس HCl درجة ح HH 8 التي تم تبريدها سابقا وصولا الى 4 درجة مئوية وإزالة منطقة PL على القرص germinal داخل منطقة 1 سم باستخدام مقص حاد (الشكل 2B).
ملاحظة: في البداية، كان PL مغمورة في المياه الأيونية، ولكن هذا النهج له بعض العيوب، مثل عدم وجود درجة PH التحكم والصعوبات لفصل الطبقات الفرعية بعد ذلك (الخطوة 1.2). ولذلك، تم اختبار عدة شروط بما في ذلك تركيز تريس(الشكل 3A)وH(الشكل 3B). استخدام العازلة في درجة الني هيدروني، بدلا من المياه deionized أو demineralized، وفقا لعلم وظائف الأعضاء البيض (درجة الH من البيض الأبيض حوالي 7.8 في يوم وضع)14 ويقلل من فقدان البروتين. في المقابل، حمضية أو قلوية جداً هو يشتبه في أن تؤدي PL de-structuration والتبكير البروتين solubilization(الشكل 3B). المخزن المؤقت يتكون من 10 mM تريس-HCl درجة ح H 8 تم العثور على أن يكون الأمثل, كما أنه يحترم علم وظائف الأعضاء البيض ولا يسبب solubilization البروتين كبيرة (تركيز البروتين في المخزن المؤقت العمل لا يزال الحد الأدنى, الشكل 3A,B). - تمزق PL مع مقص صغير في المخزن المؤقت. عقد حواف اثنين من PL تمزق مع ملقط وقشر PL قبالة صفار.
- الحفاظ على PL مع ملقط وشطف PL عدة مرات في عدة حمامات من 10 mM تريس-HCl، 8 pH حتى لا أثر صفار مرئيا. في هذه المرحلة، تأكد من أن PL نظيفة، والأبيض، والعائمة في المخزن المؤقت. ويمكن معالجتها في الخطوة 1-2 لفصل الطبقة الفرعية أو مباشرة إلى الخطوة 2-1 بالنسبة للتحليلات الكيميائية الحيوية.
- كسر البيض وضعت حديثا غير مخصب يدويا واستخدام فاصل البيض ملقاة على كوب زجاجي لفصل صفار من الأبيض. إزالة chalazae مع مقص صغير ولفة صفار على ورقة مرشح لإزالة الزميلون التي تظهر شفافة ومرئية (الشكل 2A).
- أخذ العينات OPL و IPL
- تنتشر عينة PL كاملة عن طريق وضع OPL صعودا في طبق بيتري البلاستيك والحفاظ عليه شقة مع أقل التجاعيد ممكن. تغطية العينة مع 10 M تريس HCl pH 8، 50 mM NaCl. استخدام طبق بيتري البلاستيكية (وليس الزجاج) للحد من حركات PL، لأن PL العصي أفضل للبلاستيك.
- لتحديد موقع الجانب OPL، انظر إلى موقع chalazae المتبقية التي يتم إرفاقها OPL وليس IPL. تتطلب هذه الخطوة تركيزًا صغيرًا من الـ NaCl (50 mM) لتسهيل فصل الطبقة الفرعية.
ملاحظة: استناداً إلى الرسم البياني المعروض في الشكل 3C والأدب11، لا ينبغي أن يؤدي هذا التركيز إلى فقدان البروتين الرئيسي. في البداية، تم استخدام المياه غير المؤين لفصل الطبقات الفرعية، كما هو موضح سابقا1،5،6، ولكن تم العثور على هذه التقنية لتكون شاقة للغاية ، وأسفرت عن تغيير في سلامة PL الهيكلية. ولذلك، تم اختبار تركيزات مختلفة من الـ NaCl(الشكل 3C)حيث سهل الملح فصل الطبقات الفرعية. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن استخدام تركيز NaCl >100 mM يزيد من البروتين solubilization / الافراج عن PL، وهو ليس الهدف هنا (وهذا سيكون الهدف في الخطوة 2) (الشكل 3C). إضافة 50 mM NaCl إلى 10 mM تريس HCl درجة ح H 8 العازلة يسهل فصل من اثنين من الطبقة الفرعية ويقلل من فقدان البروتين.
- لتحديد موقع الجانب OPL، انظر إلى موقع chalazae المتبقية التي يتم إرفاقها OPL وليس IPL. تتطلب هذه الخطوة تركيزًا صغيرًا من الـ NaCl (50 mM) لتسهيل فصل الطبقة الفرعية.
- قطع PL مجموع إلى قطع من حوالي 2 سم × 3 سم مع مقص صغير. ميكانيكيا فصل طبقتين من كل قطعة PL مع ملقط تلميح فائقة الدقة تحت مجهر تشريح منظار (الشكل 4). تخزين العينات IPL و OPL الناتجة بشكل فردي في microTubes في -80 درجة مئوية، حتى مزيد من الاستخدام.
ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. تجدر الإشارة إلى أن الكفاءة ومرفق الفصل بين الطبقتين يعتمد إلى حد كبير على نضارة البيض. في الواقع ، تظهر البيض المخزنة تعديلات داخلية جذرية بسبب الزيادة السريعة في الرقم الـ PH الأبيض والتغيير اللاحق لمؤشر صفار اللون بسبب تخفيف PL (وضعف). IPL هو أكثر هشاشة بالمقارنة مع OPL. ولذلك، فمن الأفضل أن تضع وجه OPL أعلاه وفصل الطبقات الفرعية اثنين عن طريق سحب على OPL مع ملقط. وينبغي التعامل مع كل من الطبقة الفرعية بعناية ثمينة.
- تنتشر عينة PL كاملة عن طريق وضع OPL صعودا في طبق بيتري البلاستيك والحفاظ عليه شقة مع أقل التجاعيد ممكن. تغطية العينة مع 10 M تريس HCl pH 8، 50 mM NaCl. استخدام طبق بيتري البلاستيكية (وليس الزجاج) للحد من حركات PL، لأن PL العصي أفضل للبلاستيك.
2. عينة العلاج للتحلل البروتين وتحليلات SDS-PAGE
-
البروتين الأولي solubilization
- تجميد الجافة IPL وعينات OPL بشكل فردي. مرة واحدة يتم الانتهاء من تجميد التجفيف، وقطع تقريبيا 1 ملغ من كل عينة في الأنابيب الدقيقة النظيفة التي تمتلك غطاء المسمار دليل تسرب. إبقاء العينات المتبقية في أنابيب مغلقة بإحكام للتخزين لفترات طويلة في -80 درجة مئوية.
ملاحظة: استخدام الأنابيب الدقيقة مع غطاء المسمار إثبات تسرب يضمن إغلاق فرميتية وتسرب واقية لمنع إعادة الإماهة العينة، وأنه من شأنها تأمين العينات. - مزيج 1 ملغ من كل طبقة مسيلح مع 400 ميكرولتر من 50 mM تريس pH 7, 500 mM NaCl. استخدام خلاط طاحونة لمدة 2 مرة لمدة 5 دقائق في 30 هرتز لتفكك OPL و OPL الهياكل في الجسيمات الدقيقة وتسهيل solubilization البروتين. جمع 400 ميكرولتر من العينات التي تحتوي على OPL و IPL في اثنين من الأنابيب الدقيقة النظيفة.
ملاحظة: المخزن المؤقت المستخدم هنا تم اختياره لزيادة solubilization البروتين (بعكس الخطوة 1). وقد استند هذا المخزن المؤقت على النتائج المقدمة في الشكل 3، والتي تظهر زيادة في البروتين solubilization في 7 الرقم الH (الشكل 3B) واستخدام 0.5 M NaCl (الشكل 3C). يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتًا هنا. في هذه المرحلة، يمكن استخدام العينات لتنقية البروتينات PL الرئيسية أو معالجتها إلى الخطوة 2.2.
- تجميد الجافة IPL وعينات OPL بشكل فردي. مرة واحدة يتم الانتهاء من تجميد التجفيف، وقطع تقريبيا 1 ملغ من كل عينة في الأنابيب الدقيقة النظيفة التي تمتلك غطاء المسمار دليل تسرب. إبقاء العينات المتبقية في أنابيب مغلقة بإحكام للتخزين لفترات طويلة في -80 درجة مئوية.
-
سولوبيلييلات البروتين للكهربية
- إضافة 5x SDS-PAGE عينة العازلة (100 ميكرولتر، 0.25 م تريس-HCl، 0.05٪ بروموفينول الأزرق، 50٪ الجلسرين، 5٪ SDS، 5٪ بيتا ميركابتوتينول، 6.8 pH) إلى كل 400 ميكرولتر من العينة والحرارة في 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتًا هنا، ويمكن تخزين العينات عند -80 درجة مئوية. في هذه المرحلة من البروتوكول، يتم حل OPL و IPL تماما. ويمكن تقييم كفاءة solubilization عينة من قبل عينات الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 10000 س ز. وتتميز السولوبيلي الكامل من خلال غياب بيليه مرئية بعد الطرد المركزي. وهكذا، بعد solubilization كاملة، يعتبر هنا أن 1 ملغ من الطبقات دون المزيل للlyophilized يتوافق مع 1 ملغ من البروتينات (تركيز البروتين في عينة 500 ميكرولتر هو 2 ملغم / مل). في الواقع، وتتألف PL من أكثر من 80٪ بروتين2،15. استخدام 5x عينة العازلة حدود العينة التخفيف ولكن يمكن أيضا 1x أو 2x عينة المخزن المؤقت يمكن استخدامها. - قم بتحميل 20 ميكروغرام كحد أقصى من البروتينات/حارة على هلام بولي أكريلاميد SDS (4٪ -20٪ جل متدرج) و قم بإجراء الكهرباء الكهربية عند 120 فولت باستخدام نظام كهرباء رأسي.
ملاحظة: استخدام 4٪ -20٪ هلام التدرج ليس إلزاميا ولكن يفضل هنا كما OPL و IPL تظهر البروتينات مع الأوزان الجزيئية تتراوح بين < 10 كيلو Da إلى > 250 كيلو. قد يكون من المفيد أيضا للحفاظ على هلام التراص (التي عادة ما تتم إزالتها)، كما وجود البروتينات غير القابلة للذوبان أو مجاميع البروتين في الجزء السفلي من الآبار تشير إلى سوء solubilization وخطوة مفقودة محتملة أثناء إعداد العينة. - بعد الكهرباء، وإزالة المواد الهلامية من لوحات الزجاج وصمة عار مع محلول Coomassie الأزرق الرائعة (50٪ H2O، 40٪ EtOH، 10٪ حمض الخليك، وR250 Coomassie الأزرق الرائع) لمدة 30 دقيقة.
- De-stain مع محلول يتكون من 50٪ H2O، 40٪ EtOH، 10٪ محلول حمض الخليك حتى خلفية هلام يظهر الضوء الأزرق.
- وأخيرا نقل هلام في أطباق بيتري التي تحتوي على المياه ديونيد، لتحقيق دي تلطيخ وتهوية من هلام البوليأكريلاميد. يجب أن تظهر البروتينات كشرائط زرقاء من خلفية شفافة.
- إضافة 5x SDS-PAGE عينة العازلة (100 ميكرولتر، 0.25 م تريس-HCl، 0.05٪ بروموفينول الأزرق، 50٪ الجلسرين، 5٪ SDS، 5٪ بيتا ميركابتوتينول، 6.8 pH) إلى كل 400 ميكرولتر من العينة والحرارة في 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
Representative Results
تم فصل OPL و IPL من PL من بيضة غير مخصبة وضعت حديثًا لتحليل ملفات تعريف البروتين الخاصة بها من قبل SDS-PAGE. ويتضح سير العمل التجريبي للبروتوكول بأكمله في الشكل 2. ويبين الشكل 3 إطلاق البروتين في تركيزات تريس مختلفة (الشكل 3A)، الرقم الH مختلفة (الشكل 3B) ومختلف تركيزات NaCl (الشكل 3C). وقد لوحظت الطبقات الفرعية الناتجة تحت ضوء المنظار تشريح المجهر وتظهر في الشكل 4 حيث IPL شفافة في حين OPL كثيفة، غائم، وwhyish. ويمكن لهذه الميزات أن تشهد جزئيا على كفاءة فصل الطبقة الفرعية.
بعد الانفصال ، تم تحلل OPL و IPL بشكل مستقل ، وتم حل محتواها من البروتين بالكامل بفضل مزيج من الطحن الميكانيكي ، واستخدام المنظفات أنيونية (SDS) ، وكيل تقليل (beta-mercaptoethanol) ، يليه الغليان. بعد الهجرة في هلام polyacrylamide (SDS-PAGE electrophoresis)، تظهر عينات OPL و IPL ملفات تعريف كهروفلوريتي متميز (الشكل 5) ، كما هو متوقع.
الشكل 1: هيكل PL بيضة غير مخصبة وضعت حديثا. التمثيل التخطيطي والإرسال المجهري الإلكتروني من كل PL في المقطع المقطع (البيانات الشخصية، ©محطة IBiSA de Microscopie Electronique، جامعة و CHRU من تورز، فرنسا، S. Georgeault). لاحظ أنه تم الحصول على هذه الصورة من PL إعداد كما هو معروض في هذا البروتوكول. OPL، الطبقة الخارجية البيرفيتيلية؛ IPL، طبقة بيريفيتيلين الداخلية. يشير رأس السهم الأسود إلى الغشاء المستمر الذي يفصل بين الطبقات الفرعية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: سير العمل الذي يلخص الخطوتين الرئيسيتين للبروتوكول وأمثلة على التطبيقات. تم تحسين البروتوكول لتحليل البروتيوم لطبقات PL ، ولكن يمكن إيقافه في بعض الخطوات للتطبيقات الأخرى. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحسين تكوين العازلة لأخذ العينات PL. باختصار، تم احتضان PL نظيفة (ن = 4) في نفس الحجم من مختلف حلول التخزين المؤقت ل 2 h.PL تمت إزالتها، وتم تقدير تركيز البروتين عن طريق قياس امتصاص في 280 نانومتر في المخزن المؤقت المتبقي. (A) تأثير تركيز تريس-HCl في 8 درجة ح (ب) تأثير من pH (7 إلى 9). (C) تأثير تركيز NaCl. من هذه النتائج، خلصنا إلى أن العازلة تتألف من 10 mM تريس-HCl، 8، 50 mM NaCl هو الأكثر ملاءمة لأنه يحد من فقدان البروتين. ويعبر عن النتائج على أنها انحراف معياري ± لأربعة عينات مختلفة من الرر. وأجريت التحليلات الإحصائية باستخدام ANOVA في اتجاه واحد تليها اختبار مقارنات متعددة من توكي. P-value < 0.05 اعتبرت كبيرة (ns, غير هامة; * p<0.05, *** p<0.001, **** p<0.0001). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: يتميز OPL و IPL تحت مجهر تشريح منظار. بعد الانفصال، ظهر IPL (على اليمين) شفافة و OPL (على اليسار) كان مبهمًا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تحليل SDS-PAGE لفصل OPL و IPL من البيض غير المخصبة الطازجة. 4٪ -20٪ هلام أكريلاميد تليها Coomassie تلطيخ الأزرق الرائعة. يشار إلى كتلة النطاقات القياسية الوزن الجزيئي في كيلوDa. يتكون ملف تعريف OPL بشكل رئيسي من بروتينات ذات كتلة جزيئية > 30 كيلو Da في حين أن النطاقات الرئيسية المكتشفة على ملف IPL تحتوي على كتل جزيئية < 30 كيلو Da. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
يعتمد نجاح هذا البروتوكول على خطوتين حاسمتين تم تحسينهما بشكل مستقل: الفصل الميكانيكي لـ OPL و IPL اللذين يجب أن يكونا أقل قدرًا ممكنًا من الهيكلة ، يليه سولوبيليسيلون البروتين الكامل لكل طبقة فرعية ، والذي هو ، على العكس من ذلك ، de-structuring و denaturing. كما يسلط الضوء على بعض النقاط المحددة التي ينبغي أخذها في الاعتبار لضمان النجاح في إنجاز كل خطوة.
البروتوكول لا يعتمد على لون قشر البيض، وزن البيض، نوع الإنتاج، أو سلالة وراثية من hen. ومع ذلك، فإنه يعتمد على نضارة البيض. في الواقع، البيض يخضع تعديلات عميقة الفيزيائية الداخلية بسرعة بعد وضعها، على الرغم من أن هذه التغييرات يمكن أن تتأخر عندما يتم تنفيذ التخزين في ظروف مبردة14،15. فقدان ثاني أكسيد الكربون من خلال مسام قشر البيض أثناء التخزين يؤدي إلى زيادة درجة PH بياض البيض (من 7.8 إلى 9.5) في حين أن بعض تبادل المياه تحدث بين صفار والأبيض، عبر PL. كلا التعديلات تؤثر سلبا على التركيب الجزيئي والهزلولوجي لل PL التي تصبح ضعيفة وأقل توترا14,15, من المرجح بسبب التعديلات الفيزيائية الكيميائية من محتواها البروتين16,17,18. ومن المفترض أن فصل الطبقات الفرعية سوف تصبح صعبة للغاية مع البيض المخزنة خاصة إذا تم تخزين لفترة طويلة في درجة حرارة الغرفة. حتى الآن، تم تنفيذ البروتوكول باستخدام البيض المخزنة لمدة تقل عن 4 أيام في 4 درجة مئوية والمدة القصوى للتخزين لبيضة لعينة بكفاءة PL sublayers غير معروف حتى الآن. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كان الهدف هو تحليل كل طبقة فرعية ، فمن الأهمية بمكان استخدام البيض غير المخصب. في يوم الاستلقاء ، يكون جنين البويضة المخصبة 23 ساعة من العمر وتطوره سريعًا جدًا بعد ذلك ، إذا تم احتضان البويضة. في الواقع ، والتنمية الجنينية ونمو بعض الهياكل خارج استخدام PL باعتبارها substratum ، والتي هي بالتالي المتدهورة بسرعة ، ويحل محلها خارج19sac الصفار خارج مmbryonic.
بعد فصل يدوي من صفار البيض والأبيض، صفار يحتاج إلى تنظيفها من آثار بياض البيض ومن chalazae التي ظلت تعلق بإحكام على PL. الطرف هو لفة صفار بعناية على ورقة مرشح وتنفيذ يغسل واسعة من صفار في حلول المخزنة (10 mM تريس-HCl 8 pH). درجة حُكّة الاضاءة المستخدمة في المخزن المؤقت تتسق مع درجة الهزّة الفيزيولوجية لبيضة بياض14 وقد ثبت أنها تقلل من فقدان البروتين(الشكل 3). استخدام عازلة المبردة ثم يساعد على إزالة PL من صفار لأنه في 4 درجة مئوية، فإن العازلة تسهيل إزالة PL كما صفار الدهون يتراجع ويصبح أقل السوائل في هذه الدرجة. وسوف يغسل إضافية تسمح لإزالة بقايا صفار من PL. ومن المهم أيضاً أن تُقطع المنطقة المقابلة للقرص الجرثومي لأن هذا الهيكل الذي يحتوي على البروتوكلات الأنثوية قد لا يكون ممثلاً للـ PL. وهو موقع الإخصاب وتكاثر الخلايا الجنينية عندما يتم تخصيب البويضة. ومن المفترض أن يكون لها تكوين معين التي قد لا تكون ممثلة لPL كله، وهذا هو السبب في إزالته. ويسهل هذه الخطوة المحددة بقوة عندما يتم مغمورة صفار في عازلة الباردة. على الرغم من أن هذا هيكل القرص الجرثومي يتم التخلص منه في هذا البروتوكول (من الأهداف)، فإن التحليلات المحددة لهذه المنطقة في البويضات المخصبة يمكن أن تكون مفيدة جدا للعلماء المهتمين بدراسة تطور محتوى PL (البروتيوميات والنشاط) والهيكل (المجهر الإلكتروني)، خلال المراحل المبكرة من تكوين الجنين19،20،21. في هذه المرحلة، PL كله هو سليم هيكليا ويمكن معالجتها لمزيد من التحليل الهيكلي عن طريق المجهر الإلكتروني(الشكل 2)،إلى الخطوة 1.2 أو إلى الخطوة 2.1 (إذا كان الهدف هو تحليل PL كله).
الخطوة 1.2 يجب أن يتم تحت منظار تشريح المجهر، كما PL رقيقة جدا وهشة (حوالي 10 ميكرومتر سميكة). فصل الطبقات الفرعية يكاد يكون من المستحيل في المياه أو في العازلة تفتقر إلى الحد الأدنى من الملح، والمحاولات الأولية باستخدام هذه الخيارات قد أسفرت عن أضرار PL خطيرة. وبالتالي، فإن العازلة المختارة لهذه الخطوة لا تزال في السّكّر الفيزيولوجي (pH 8) وتحتوي على 50 mM NaCl. هذه الخطوة شاقة ويجب أن يتم تنفيذها بعناية وبلطف لمنع تمزق PL. وبمجرد فصلهما، يمكن التعرف بسهولة على الطبقات الفرعية لأنهما تظهران سمات مادية غريبة (معتمة مقابل شفافة). وينبغي أن يعكس عدم تجانس الألغام المضادة للأفراد تحت ضوء المجهر فصلاً ناقصاً وبالتالي وجود البقع المتبقية من الـ OPL الموجودة على IPL. بالإضافة إلى ذلك ، من الصعب جداً علاج الغشاء بأكمله ، كما أن استخدام قطع 2 سم × 3 سم يعزز إلى حد كبير فرص النجاح. الطبقة الفرعية الناتجة التي تم الحصول عليها مناسبة للدراسة النسيجية عن طريق المجهر الإلكتروني (الشكل 1). ومن الجدير بالذكر أن بنية خطية محددة (0.05 إلى 1 ميكرومتر سميكة) تسمى الغشاء المستمر (CM) مرئية على micrograph(الشكل 1)وتبقى عادة تعلق على طبقة فرعية واحدة أو أخرى أثناء عملية الفصل. وقد سبق أن نشرت أنه عند استخدام المولى الملح عالية نسبيا لفصل (500 mM)، ظلت اللجنة تعلق على OPL7 في حين أن استخدام المياه5 سوف تفضل مرفق CM إلى IPL. في هذا البروتوكول، يتم استخدام مُلَلَمٍ منخفض للملح لتحقيق أهداف محددة (الطبقة الفرعية PL سليمة هيكلياً والحد الأدنى من فقدان البروتينات)، مما يعني أن هذا CM من المرجح أن يرتبط بـ IPL. ومع ذلك، فإن تحليل إضافي لـ IPL و OPL عن طريق المجهر الإلكتروني للإرسال سيوضح بوضوح على هذه الفرضية. PL، OPL، أو طبقات IPL التي تم الحصول عليها في نهاية الخطوة 1 قد تستخدم أيضا لم مقايسات في المختبر للبويضة الحيوانات المنوية ملزمة التحليلات22 أو لتحليل الخطوات المبكرة للتنمية الجنينية23,24.
تشير الخطوة 2 إلى اضمح جزء من محتوى البروتين (الخطوة 2.1) أو كلياً (الخطوة 2.2). PL و / أو OPL هي أول مزيل لإزالة جزيئات الماء والسماح لقياسات الوزن دقيقة. في الواقع، وPL تتكون أساسا من الماء (88٪)7، في حين أن المادة الجافة تحتوي على البروتينات أساسا (80٪ إلى 90٪ اعتمادا على الدراسات)، والكربوهيدرات والدهون والمعادن2،7،25. وبالنظر إلى أن المياه الواردة في PL تتم إزالتها عن طريق تجميد التجفيف، أن يتم استرداد الكربوهيدرات أساسا في البروتينات الجليكوبروتين PL، وأن الدهون والمعادن تنشأ من صفار يتم التخلص منها أساسا من قبل يغسل واسعة النطاق، ومن المفترض أن PL الناتجة تتكون حصرا تقريبا من البروتينات. وهكذا، ينبغي أن قيمة الوزن التي تم الحصول عليها بعد التجميل الكامل تتوافق أساسا مع البروتينات. ثم يتم تخفيف كمية متساوية من PL و/أو OPL و/أو IPL في المخزن المؤقت الذي يحتوي على 0.5 M NaCl. ارتفاع الملح الضرس جنبا إلى جنب مع التدمير الميكانيكية للشبكة الليفية عن طريق طحن يسهل إلى حد كبير solubilization البروتين في ظل ظروف غير denaturing. ويتبع هذه الخطوة من قبل solubilization كاملة باستخدام الغليان، المنظفات SDS وكيل الحد بيتا mercaptoethanol (الخطوة 2.2). في الواقع، بعض البروتينات IPL هي SDS قابل للذوبان glycoproteins25،26،27 والمكونات الرئيسية لل OPL هي NaCl للذوبان1،11. باستخدام هذا البروتوكول، لم نر أي بيليه المتبقية من البروتينات غير قابلة للذوبان بعد الطرد المركزي، مما يشير إلى أن solubilization كان من المرجح أن تكون كاملة. ثم تم تحليل البروتينات من PL و OPL و / أو IPL من قبل SDS-PAGE. ملامح البروتين الناتجة تتفق مع الأدب المنشور2,4,11,16, ولكن دقة وكثافة الإشارة تحسنت بشكل كبير وأكثر من ذلك بكثير متجانسة بين مختلف IPL و OPL عينات مستقلة.
وبالإضافة إلى ذلك، يتم إجراء المقارنة الكمية بين OPL و IPL ممكن بفضل دقة الوزن الذي نحن يستنتج للطبقات الفرعية المعنية2،7. وعلاوة على ذلك، كل من OPL و IPL ملامح متميزة جدا وباستثناء الفرقة خافت في 14 كيلو ندى و 75 كيلو ادا، كلا PL الطبقات الفرعية لا تشارك بشكل واضح العصابات عرض نفس الوزن الجزيئي. وهذه الملاحظة تؤكد كفاءة فصل الطبقات الفرعية دون وجود تلوث متقاطع كبير. وفقا لتحليل PL البروتيومي الوحيد المنشور1، فإن أكثر النطاقات كثافة في OPL (< 30 كيلو) يجب أن تتوافق مع lysozyme (14 kDa) ، وغشاء ال vitelline بروتين الطبقة الخارجية 1 (17 كيلوبايت) ، ويانورت بيتا ديفنسين 0 11 (الوزن الجزيئي الظاهر من 12 كيلو Da), في حين أن عصابات مكثفة من IPL (> 30 كيلو Da) هي على الأرجح زونا-Pellucida البروتين 1 (102 كيلو داد) وزونا-Pellucida البروتين 3 (47 كيلوDa). توزيع البروتينات PL وفيرة جدا ovotransferrin (78 كيلوDa), البيضويومين البروتين X (45 كيلوتم), ovalbumin (43 كيلو ادا)1 بين الطبقات الفرعية لا يزال يتعين توضيحه. في الواقع، فإن الوزن الجزيئي العالي لهذه البروتينات (>30 كيلو Da) يشير إلى أنها بروتينات IPL على أساس ملف SDS-PAGE، ولكن خصوصيتها في الأنسجة (البروتينات التي تعبر عنها oviduct) تفضل ربط هذه البروتينات بـ OPL28،29. وعلاوة على ذلك، اقترح البعض تلوث محتمل لعينات PL عن طريق البيض البيض والبروتينات صفار البيض بسبب عدم كفاية الغسيل1. وهذا النقص في المعلومات هو الأساس لوضع هذا البروتوكول، الذي سيُستخدم كذلك في البروتيومات الكمي المتعمق للبروتيوميات PL و OPL و IPL.
بدلاً من ذلك، من الخطوة 2.1 وبعد الطرد المركزي لإزالة المادة غير القابلة للذوبان، من الممكن استخراج بعض البروتينات المحددة لمزيد من التوصيف البيولوجي الكيميائي الحيوي. وقد تم مؤخرا تطبيق هذا النهج لتوصيف الأنشطة البيولوجية و / أو هيكل 3D من العنصرين الرئيسيين من OPL، وغشاء vitelline غشاء الخارجي بروتين الطبقة 1 (VMO1) وطيران بيتا defensin 11 (AvBD11)30،31. قد يساعد توفر هذه البروتينات كجزيئات منقّعة أيضًا على إنتاج أجسام مضادة محددة لإجراء تجارب إضافية مثل الكيمياء المناعية أو لتطوير التشخيضات الكمية، بما في ذلك التشخيض المناعي المرتبط بالإنزيمات.
القيدان الرئيسيان لهذا البروتوكول هما (1) التحدي مع فصل الطبقات الفرعية خاصة إذا تم تخزين البيض أكثر من 4 أيام في 4 درجات مئوية و (2) حقيقة أن ال solubilization البروتين الكامل يتطلب تقليل و denaturing المخازن المؤقتة ، والتي تضعف النشاط البيولوجي الجوهري للعينات الناتجة. وفيما يتعلق بالحد الأول، يتطلب الفصل الميكانيكي مهارات تقنية ولكن من السهل تحقيقه بعد 2 أو 3 دورات تدريبية تجريبية. قد تبقى بعض القطع الصغيرة IPL تعلق على OPL والعكس بالعكس حيث ترتبط كل من الطبقات الفرعية بإحكام. ومع ذلك، ينبغي أن يكون تلوث طبقة فرعية واحدة من قبل الآخر الحد الأدنى إذا تم تنفيذ الفصل الميكانيكي بحذر. نموذجي IPL و OPL SDS-PAGE ملفات تعريف بعد الفصل الأمثل sublayer موضحة في الشكل 5. فيما يتعلق بالتقييد الثاني، تم تحسين الخطوات التجريبية المعروضة في هذه المقالة لتحليلات البروتيوم، من أجل تقديم قائمة شاملة من البروتينات التي تؤلف كل طبقة فرعية. لمزيد من توصيف الأنشطة البيولوجية لكل بروتين، من الضروري التوقف عند الخطوة 2-1-2، قبل استخدام شروط الوَسْل (الخطوة 2-2-1، استخدام العازلة مع SDS وبيتا-ميركابتولينول متبوعاً بالغليان). ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن البروتينات الناتجة عن الخطوة 2.1.2 هي فقط البروتينات القابلة للذوبان في الملح في حين أن البروتينات غير القابلة للذوبان تشكل مجاميع. قد يكون أحد الخيارات لمواصلة تقييم نشاط كل منها هو إنتاج بروتينات غير قابلة للذوبان كملح البروتينات المؤتلفة باستخدام أنظمة غير مغايرة(E. القولونية، عصيولفيروس، الخميرة، الخ).
ويمكن تكييف هذا البروتوكول مع بيض الطيور الأخرى لإجراء دراسات مقارنة لتقدير أصالة كل نوع على نطاق أفضل. في الواقع، PL يعرض بعض خصائص الطيور سواء هيكليا ومن حيث تكوين البروتين، من المرجح أن بسبب التكيف مع بيئات جديدة ولكن أيضا إلى الخصوصيات التنموية2،6،9،32. تطوير هذا البروتوكول الذي يتطلب تقنية معتدلة والمعدات / المواد الكلاسيكية يفتح آفاقا بحثية جديدة في مجال تكاثر الطيور ودراسات تحديد المواصفات.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نحن ممتنون لفيليب ديدييه وكارين إنجر (إنراي، PEAT، 37380، نوزيلي، فرنسا، https://doi.org/10.15454/1.5572326250887292E12) لتوفير البيض البني عيسى غير المخصب. كما نشكر جامعة تورز، فرنسا على تمويلها درجة الدكتوراه في جامعة م. بريجون. وقد تلقى هذا العمل دعماً مالياً من الوكالة الوطنية الفرنسية للبحوث (EQLIPSE, ANR-19-CE21-0006).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binocular dissecting microscope | Vision Engineering, France | Model Mantis Elite | |
| Lyophilizer | Cryotec, France | Model Cosmos 80 | |
| Mini-Protean II electrophoresis cell | Biorad, Hercules, USA | 1652960 | Any apparatus adapted for protein electrophoresis |
| Mixer Mill MM400 | Retsch, Hann, Germany | 20.745.0001 | Mixer mill adapted for for dry, wet, and cryogenic grinding of small amounts of sample |
| Ultra fine dissection scissors in stainless steel length 12 cm | Dutscher, Brumath | 5066 | |
| Ultra precise tip forceps anti-magnetic stainless steel 9.5x 109.3 mm | Dutscher, Brumath | 327005 |
References
- Mann, K. Proteomic analysis of the chicken egg vitelline membrane. Proteomics. 8 (11), 2322-2332 (2008).
- Chung, W. H., Lai, K. M., Hsu, K. -C. Comparative study on histological structures of the vitelline membrane of hen and duck egg observed by cryo-scanning electron microscopy. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 58 (3), 1794-1799 (2010).
- Kido, S., Doi, Y. Separation and Properties of the Inner and Outer Layers of the Vitelline Membrane of Hen's Eggs. Poultry Science. 67 (3), 476-486 (1988).
- Steele, M. G., Meldrum, W., Brillard, J. P., Wishart, G. J. The interaction of avian spermatozoa with the perivitelline layer in-vitro and in-vivo. Journal of Reproduction and Fertility. 101 (3), 599-603 (1994).
- Bain, J. M., Hall, J. M. Observations on the development and structure of the vitelline membrane of the hen's egg: an electron microscope study. Australian Journal of Biological Sciences. 22 (3), 653-665 (1969).
- Damaziak, K., Kieliszek, M., Buclaw, M. Characterization of structure and protein of vitelline membranes of precocial (ring-necked pheasant, gray partridge) and superaltricial (cockatiel parrot, domestic pigeon) birds. PLoS One. 15 (1), 0228310 (2020).
- Bellairs, R., Harkness, M., Harkness, R. D. The vitelline membrane of the hen's egg: a chemical and electron microscopical study. Journal of Ultrastructure Research. 8 (3-4), 339-359 (1963).
- Kido, S., et al. Characterization of vitelline membrane outer layer protein I, VMO-I: amino acid sequence and structural stability. Journal of Biochemistry. 117 (6), 1183-1191 (1995).
- Damaziak, K., et al. Comparative analysis of structure and strength of vitelline membrane and physical parameters of yolk of ostrich, emu, and greater rhea eggs. Poultry Science. 97 (3), 1032-1040 (2018).
- Kirunda, D. F., McKee, S. R. Relating quality characteristics of aged eggs and fresh eggs to vitelline membrane strength as determined by a texture analyzer. Poultry Science. 79 (8), 1189-1193 (2000).
- Back, J. F., Bain, J. M., Vadehra, D. V., Burley, R. W. Proteins of the outer layer of the vitelline membrane of hen's eggs. Biochimica Et Biophysica Acta. 705 (1), 12-19 (1982).
- Waclawek, M., Foisner, R., Nimpf, J., Schneider, W. J. The chicken homologue of zona pellucida protein-3 is synthesized by granulosa cells. Biology of Reproduction. 59 (5), 1230-1239 (1998).
- Okumura, H., et al. A newly identified zona pellucida glycoprotein, ZPD, and dimeric ZP1 of chicken egg envelope are involved in sperm activation on sperm-egg interaction. Biochemical Journal. 384, Pt 1 191-199 (2004).
- Guyot, N., Rehault-Godbert, S., Nys, Y., Baron, F. Understanding the natural antibacterial defences of egg white and their regulation. Achieving Sustainable Production of Eggs Volume 1. Roberts, J. 1, Burleigh Dodds Science Publishing Limited. Cambridge, UK. 161-193 (2016).
- Trziszka, T., Smolinska, T. Chemical Characterization of the Vitelline Membrane of Hens Eggs. Food Chemistry. 8 (1), 61-70 (1982).
- Berardinelli, A., Ragni, L., Giunchi, A., Gradari, P., Guarnieri, A. Physical-mechanical modifications of eggs for food-processing during storage. Poultry Science. 87 (10), 2117-2125 (2008).
- Kelley, A. J. The effects of storage time on vitelline membrane protein banding patterns and interior egg quality of eggs from nonmolted and molted hens. Texas A&M University. , Master of Science Thesis (2003).
- Schafer, A., Drewes, W., Schwagele, F. Analysis of vitelline membrane proteins of fresh and stored eggs via HPLC. Zeitschrift Für LebensmittelUntersuchung Und-Forschung A. Food Research and Technology. 206 (5), 329-332 (1998).
- Romanoff, A. L. The avian embryo: Structural and functional development. , The Macmillan Company. New York, NY. (1960).
- Haas, H. J., Spratt, N. T. Contributions to an analysis of the avian vitelline membrane's potential to promote outgrowth of the yolk sac-serosal membrane. The Anatomical Record. 184 (2), 227-231 (1976).
- Jensen, C. Ultrastructural changes in the avian vitelline membrane during embryonic development. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 21 (3), 467-484 (1969).
- Barbato, G. F., Cramer, P. G., Hammerstedt, R. H. A practical in vitro sperm-egg binding assay that detects subfertile males. Biology of Reproduction. 58 (3), 686-699 (1998).
- New, D. A. T. The Adhesive Properties and Expansion of the Chick Blastoderm. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 7 (2), 146-164 (1959).
- New, D. A. T. A New Technique for the Cultivation of the Chick Embryo. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3 (4), 326-331 (1955).
- Kido, S., Janado, M., Nunoura, H. Macromolecular components of the vitelline membrane of hen's egg. I. Membrane structure and its deterioration with age. Journal of Biochemistry. 78 (2), 261-268 (1975).
- Kido, S., Janado, M., Nunoura, H. Macromolecular components of the vitelline membrane of hen's egg. II. Physicochemical properties of glycoprotein I. Journal of Biochemistry. 79 (6), 1351-1356 (1976).
- Kido, S., Janado, M., Nunoura, H. Macromolecular components of the vitelline membrane of hen's egg. III. Physicochemical properties of glycoprotein II. Journal of Biochemistry. 81 (5), 1543-1548 (1977).
- Réhault-Godbert, S., et al. Ovalbumin-related protein X is a heparin-binding ov-serpin exhibiting antimicrobial activities. Journal of Biological Chemistry. 288 (24), 17285-17295 (2013).
- Gautron, J., et al. Ovotransferrin is a matrix protein of the hen eggshell membranes and basal calcified layer. Connective Tissue Research. 42 (4), 255-267 (2001).
- Guyot, N., et al. Proteomic analysis of egg white heparin-binding proteins: towards the identification of natural antibacterial molecules. Scientific Reports. 6, 27974 (2016).
- Guyot, N., et al. function, and evolution of Gga-AvBD11, the archetype of the structural avian-double-beta-defensin family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 337-345 (2020).
- Mori, M., Masuda, N. Proteins of the vitelline membrane of quail (Coturnix coturnix japonica) eggs. Poultry Science. 72 (8), 1566-1572 (1993).
