Summary
מאמר זה מדווח על שיטה פשוטה לבודד את שכבות המשנה החיצוניות והפנימיות של ביצי עוף תוך מזעור השינוי המבני ולייעל את סולביליזציה של חלבונים של כל שכבת משנה לניתוחים פרוטאומיים.
Abstract
שכבת הפריוויטליין המקיפה את חלמון הביצה ממלאת תפקיד בסיסי בהפריה, בהגנה על הביציות ובהתפתחות עובר העופות. היא נוצרת על ידי שתי שכבות חלבון הקשורות קשר הדוק ונוצרות על ידי איברי רבייה נשיים מובהקים. ההנחה היא שלשני המבנים יש ספציפיות תפקודית משלהם, שנותרה מוגדרת. כדי לאפיין את תפקידם של חלבונים המרכיבים כל שכבת משנה, האתגר הראשון הוא לקבוע את התנאים שיאפשרו הפרדה מכנית של שתי שכבות מורכבות אלה, תוך הגבלת כל נזק מבני. השלב השני הוא לייעל את התנאים הניסיוניים כדי להקל על סולובליזציה של חלבונים משתי שכבות משנה אלה, לניתוחים ביוכימיים עוקבים. היעילות של גישה זו מוערכת על ידי ניתוח פרופיל החלבון של כל שכבת משנה על ידי נתרן דודציל סולפט-פולי-אקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE), אשר צפוי להיות נבדל בין שני המבנים. הליך דו-שלבי זה נשאר פשוט; זה דורש ציוד ביוכימי קלאסי ריאגנטים; ותואם לפרוטאומיות מעמיקות נוספות. זה יכול להיות גם טרנספוזיציה ביצי עופות אחרים לביולוגיה השוואתית, בידיעה כי המבנה ואת ההרכב של שכבת perivitelline הוכח יש תכונות ספציפיות למינים. בנוסף, התנאים שאינם מנומרים שפותחו עבור הפרדת שכבות משנה (שלב 1) מאפשרים ניתוחים מבניים שלהם על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה והעברה. זה עשוי גם להוות את הצעד הראשוני עבור טיהור החלבון הבאים לנתח את הפעילות הביולוגית שלהם בהתאמה מבנה 3D, או לבצע ניתוחים אימונוהיסטוכימיים או פונקציונליים נוספים. מחקרים כאלה יסייעו לפענח את הפונקציה הפיזיולוגית של שתי שכבות משנה אלה, אשר integrities מבניים ותפקודיים הם קריטריונים מכריעים של הצלחת הרבייה.
Introduction
מטרת שיטה זו היא לספק פרוטוקול המאפשר אפיון ביוכימי עוקב של שכבת perivitelline (PL), שכבה חלבונית דקה המקיפה את חלמון הביצה וממלאת תפקיד בסיסי ברפרודוקציה של מיני העופות. PL, המכונה גם "קרום ויטלין" בספרות, היא רשת תלת מימדית של סיבים עבים המורכבת ממספר סוגים של גליקופרוטאינים. הוא מורכב משכבת פריוויטליין פנימית (IPL) (במגע עם החלמון) המורכבת בשחלה, ומשכבת פריוויטליין חיצונית (OPL, במגע עם הלבן), שוכבת על ה- IPL (איור 1) ומיוצרת על ידי הפונפוניבלום. רקמה אחרונה זו היא החלק העליון דמוי המשפך של ה- oviduct המקבל את זקיק החלמון הבוגר לאחר הביוץ, ואת האתר בו מתרחשת ההפריה. הפרשת OPL מתרחשת לאחר שני אירועים אלה ואחריו הפקדה רצופה של לבן ביצה קליפת ביצה בקטעים ספציפיים אחרים של oviduct. הפונקציות הפיזיולוגיות של PL קשורות לא רק להפריה ולשלבים המוקדמים של העובר, אלא גם להגנה הפיזית והמולקולרית של העובר. הניתוח הפרוטאומי של ביצת העוף שבוצע על כל PL גילה את נוכחותם של 137 חלבונים שונים1, אבל ההפצה של רוב החלבונים האלה בין IPL ו OPL נשאר להיות ברור. הכמות המינימלית של נתונים הזמינים בדו"ח הספרות כי IPL ו OPL להפגין פרופילי חלבון ברורים מאוד2,3,4, אשר מציע תכונות מבניות ותפקודיות שונות. המחסור היחסי בנתונים על התפלגות החלבונים בין OPL ל-IPL נובע ככל הנראה מהקושי להפריד בין שתי שכבות המשנה הדקות והמוטמעות.
השיטה המוצגת כאן מתארת את התנאים שישמשו להפרדת שתי שכבות המשנה בעלות השפעה מוגבלת על המבנה ההיסטולוגי שלהן תוך שמירה על תכולת החלבון שלהן, ולספק את הפרוטוקול המאפשר את ההסתבכות המלאה של חלבונים לניתוח הבא על ידי פרוטאומיקה. הוא כולל שני שלבים עיקריים: 1) דגימת PL והפרדת OPL/IPL ו-2) טיפול PL, OPL ו- IPL לסלוביליזציה של חלבונים ואלקטרופורזה לניתוח ספקטרומטריית מסה. זרימת העבודה מוצגת באיור 2. באופן בולט, למרות שהפרוטוקול הנוכחי עבר אופטימיזציה לניתוחים פרוטאומיים (שלב 2.2), ניתן לעצור אותו בשלבים מסוימים עבור היסטולוגית (למשל, מיקרוסקופ אלקטרונים), ניתוחים אימונוהיסטוכימיים, מחקרים תפקודיים (שלב 1), ולטיהור חלבונים מסיסים במלח כדי לאפיין את המבנה שלהם ואת הפעילות הביולוגית (שלב 2.1) (איור 2).
הצעד הראשון הוא הסרת PL הכולל מחלמון הביצה(איור 2, שלב 1.1). כל השיטות שפורסמו מתחילות בהפרדת הביצה הלבנה מהחלמון באופן ידני או באמצעות מפריד ביצים. לאחר מכן מסירים את הביצה הלבנה הנותרת ואת הצ'לאזה העבה באמצעות מלקחיים או על ידי ספיחה על ניירמסנן 5 (איור 2A). לאחר מכן, הטכניקות שנבחרו לדגום PL משתנות בהתאם למאמרים שפורסמו. ניירות מסוימים כוללים מספר שטיפות של החלמון, במים deionized או מזוקק1,5,6, ב 0.85 כדי 1% תמיסת מלח2,7,8, בפתרונות אגירה כגון 0.15 M NaCl / N-[Tris(hydroxymethyl)מתיל]-2-אמינואתנסולפונית, pH 7.44, או ב- 0.01N HCl (עמ' 2)3. הליכים אלה יושמו על עוף, ברווז, פסיון צוואר טבעת, פרטרידג 'אפור, תוכי קוקטיאל, יונה ביתית, או ביצי ratites2,6,9. הסרת PL בעוד חלמון הביצה נשמר בצלחת פטרי ללא פתרונות מימית עשוי להיות מייגע מאוד כמו PL הוא שביר חלמון ביצה נוטה להידבק PL1,5 ולכן נשארקשה לחסל לאחר מכן. השימוש של חיץ חומצי או פתרון במשך שעה ב 37 °C3 הוא גם לא מועדף כמו תנאים כאלה עשוי לשנות את מבנה PL ועלול לגרום לאובדן חלבון. כמו כן, חשוב להסיר את האזור המכיל את הדיסק הנביט, שכן אזור זה עשוי להיות בעל תבנית מבנית ומולקולרית מובהקת, שאינה משקפת את כל PL4,6,10 ( איור2B). שיטה זו מנצלת רעיונות המודגשים על ידי כמה מאמרים שפורסמו ומציעה כמה שיפורים כדי להקל על דגימת PL תוך שמירה על שלמותה (איור 2C).
השלב השני מורכב מהפרדת שתי שכבות המשנה(איור 2, שלב 1.2). שלב זה הוא קריטי כמו OPL ו- IPL קשורים בחוזקה זה לזה. שלב זה צריך להתבצע בזהירות עם מלקחיים תחת מיקרוסקופ ניתוח משקפת. פרסומים המדווחים על הפרדת OPL/IPL מוגבלים למדי2,3,7,11 וחלקם משתמשים בתנאים ספציפיים (חיץ חומצי ב 37 מעלות צלזיוס למשך שעה2,3 ) שעשויים להשפיע על המבנה ההיסטולוגי של שכבות המשנה ו / או לתרום לאובדן חלבון או חלמון אוזיהומיםלבנים. כדי להבחין טוב יותר OPL מן IPL, כמה מחברים דיווחו על השימוש בכחול טולואידין כדי לצבוע מעט את OPL (השכבה הפנימית נשארת חסרת צבע)11. בשיטה שפותחה, אופטימיזציה של התנאים כך שההפרדה מושגת בקלות ואינה דורשת שימוש בצבע כלשהו (איור 2D).
הצעד העיקרי השני הוא solubilization של חלבונים להרכיב כל שכבת משנה. באופן קלאסי, הוא מושגת על ידי ערבוב נקי lyophilized1, מיובש2,6, או מוכן טרי3,4,11 PL / sublayers ישירות עם מאגר Laemmli המשמש אלקטרופורזה. מחברים אחרים העדיפו solubilization ראשוני של שכבות ב 1% NaCl, בתמיסת אגירה 1% SDS2,3,11 או בתמיסה המכילה מעכבי פרוטאז ו SDS6 בטמפרטורת החדר או טריטון ואחריו דגירה ב 45 °C(70°F 12 ), תחת ערבוב נמרץ מתמיד. כמה מחברים תיארו גם פרוטוקול שבו PL היה דגירה מלוחים מאגר פוספט או אוריאה נתון sonication13. טיפולים אלה היו כל ואחריו צנטריפוגה ודילול במאגר Laemmli וכולם חולקים את החיסרון של solubilization חלבון שלם משכבות כמו החומר מסיס (גלולה המתקבל לאחר צנטריפוגה) מושלך מן המדגם כדי להיות מנותח.
בנוסף, השימוש בתנאים דנאטוריים (אוריאה, חומר ניקוי, טמפרטורה גבוהה וכו ') על ידי מחברים מסוימים עבור solubilization חלבון אינו תואם את טיהור החלבון הבאים לאפיון כפי שהם עשויים להשבית חלבונים באופן בלתי הפיך, להפריע לפעילות הביולוגית שלהם וגם לפגוע במבנה 3D שלהם. עבור שלב ספציפי זה 2, הפרוטוקול כולל תת-צעד ראשון המאפשר זלזול בחלבונים הנפוצים ביותר בתנאים שאינם מנומקים לאחר פירוק מכני של PL/OPL/IPL, אשר לא יפריע למחקרי חלבון נוספים, במידת הצורך (איור 2, שלב 2.1), ותת-צעד שני המאפשר פירוק מלא של חלבונים לאלקטרופורזה ופרוטאומיקה מעמיקה (איור 2, שלב 2). הוא משלב הצעות שנלקחו ממאמרים שונים שפורסמו והתאמות הנובעות מרעיונות חדשים המאומתים על ידי מחקרים ניסיוניים.
Protocol
1.PL, דגימות IPL ו-OPL
- דגימת PL
- שוברים את הביצה הטרייה שלא הופרה ידנית ומשתמשים במפריד ביצים שוכב על זכוכית כדי להפריד את החלמון מהלבן. הסירו את הצ'לאז עם מספריים קטנות וגלגלו את החלמון על נייר סינון כדי להסיר אלבומן דבק שמופיע כמבנה שקוף וגלוי (איור 2A).
התראה: היזהר לא לנקב את PL עם מספריים. השימוש בפינצטה במקום במספריים להסרת צ'לאזות עלול לעורר שבירה של PL ודליפת חלמון לאחר מכן. השלב המתגלגל על נייר המסנן הוא קריטי ויש לבצעו מהר מאוד בשל המאפיינים הספיגה של מסנן הנייר שעלולים לגרום לשבירה PL. כמו כן חשוב מאוד להשתמש ביצה לא מופרית מיום השכבה, כדי לייעל את ההצלחה של הצעד הראשון הזה ואת כל השלבים הבאים. לחלופין, ביצים שאוחסנו פחות מ 10 ימים בסביבה מקוררת עשוי לשמש אבל ניסויים חייבים לשקול סיכונים פוטנציאליים של שינויים PL. - לטבול את החלמון גבישי המכיל 10 מ"מ Tris-HCl pH 8 כי כבר מקורר בעבר עד 4 °C (69 °F) ולהסיר את אזור PL מעל הדיסק הנביטה בתוך אזור 1 ס"מ באמצעות מספריים קהה (איור 2B).
הערה: בתחילה, PL היה שקוע במים deionized, אבל גישה זו יש כמה חסרונות, כגון חוסר שליטה pH ואת הקשיים להפריד שכבות משנה לאחר מכן (שלב 1.2). לכן נבדקו מספר תנאים, ביניהם ריכוז טריס(איור 3A)ו-pH (איור 3B). השימוש במאגר ב pH 8, במקום מים deionized או demineralized, הוא בהתאם לפיזיולוגיה ביצה (ה- pH של לבן ביצה הוא כ 7.8 ביום השכבה)14 ומצמצם את אובדן החלבון. לעומת זאת, חשד לפגיעה חומצית או אלקליין מאוד ב-pH הוא גורם לדה-בנייה של PL ולזלת חלבון מוקדמת(איור 3B). החיץ המורכב מ- 10 mM Tris-HCl pH 8 נמצא אופטימלי, שכן הוא מכבד את פיזיולוגיית הביצים ואינו גורם לסלוביליזציה משמעותית של חלבונים (ריכוז החלבון במאגר העבודה נותר מינימלי, איור 3A,B). - קרע את PL עם מספריים קטנים במאגר. החזק את שני הקצוות של PL קרוע עם מלקחיים לקלף את PL את החלמון.
- לשמור על PL עם מלקחיים ולשטוף את PL מספר פעמים בכמה אמבטיות של 10 mM Tris-HCl, pH 8 עד שום עקבות של חלמון גלוי. בשלב זה, ודא שה- PL נקי, לבן וצף במאגר. זה יכול להיות מעובד בשלב 1.2 עבור הפרדת שכבת משנה או ישירות לשלב 2.1 לניתוחים ביוכימיים.
- שוברים את הביצה הטרייה שלא הופרה ידנית ומשתמשים במפריד ביצים שוכב על זכוכית כדי להפריד את החלמון מהלבן. הסירו את הצ'לאז עם מספריים קטנות וגלגלו את החלמון על נייר סינון כדי להסיר אלבומן דבק שמופיע כמבנה שקוף וגלוי (איור 2A).
- דגימת OPL ו- IPL
- מורחים את כל דגימת PL על ידי הצבת OPL כלפי מעלה לתוך צלחת פטרי פלסטיק ושמירה על שטוח עם פחות קמטים ככל האפשר. לכסות את המדגם עם 10 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM NaCl. השתמש צלחת פטרי פלסטיק (ולא זכוכית) כדי להגביל את תנועות PL, כי PL מקלות טוב יותר פלסטיק.
- כדי לאתר את הצד OPL, להסתכל איפה המיקום של chalazae הנותרים המחוברים OPL ולא IPL. שלב זה דורש ריכוז NaCl קטן (50 mM) כדי להקל על הפרדת שכבת משנה.
הערה: בהתבסס על הגרף המוצג באיור 3C ובספרות11, ריכוז זה לא אמור להוביל לאובדן חלבון גדול. בתחילה, מים deionized שימש כדי להפריד את שכבות המשנה, כפי שתואר קודם לכן1,5,6, אבל טכניקה זו נמצאה מייגעת מאוד והביא לשינוי של שלמות PL מבנית. לכן, ריכוזי NaCl שונים (איור 3C) נבדקו כמלח הקל על ההפרדה בין שתי שכבות המשנה. עם זאת, ראוי לציין כי השימוש בריכוז NaCl >100 mM מגביר את סולובליזציה/שחרור החלבון מה-PL, וזו אינה המטרה כאן (זו תהיה המטרה בשלב 2) (איור 3C). הוספת 50 mM NaCl למאגר 10 mM Tris-HCl pH 8 מאפשרת הפרדה בין שתי שכבות המשנה ומצמצמת את אובדן החלבון.
- כדי לאתר את הצד OPL, להסתכל איפה המיקום של chalazae הנותרים המחוברים OPL ולא IPL. שלב זה דורש ריכוז NaCl קטן (50 mM) כדי להקל על הפרדת שכבת משנה.
- חותכים את PL הכולל לחתיכות של כ 2 ס"מ x 3 ס"מ עם מספריים קטנים. מפרידים מכנית בין שתי השכבות של כל פיסת PL בעזרת מלקחיים מדויקים במיוחד מתחת למיקרוסקופ מנתח משקפת(איור 4). לאחסן את דגימות IPL ו OPL וכתוצאה מכך בנפרד microtubes ב -80 מעלות צלזיוס, עד לשימוש נוסף.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. יש לציין כי היעילות ומתקן ההפרדה של שתי השכבות תלויים מאוד ברעננות הביצה. ואכן, ביצים מאוחסנות מראות שינויים פנימיים דרסטיים בשל העלייה המהירה ב- pH לבן ביצה ושינוי הבא של מדד החלמון עקב התרופפות PL (והיחלשות). IPL הוא שביר יותר בהשוואה OPL. זה, אם כן, עדיף למקם את הפנים של OPL מעל ולהפריד את שתי שכבות המשנה על ידי משיכת OPL עם מלקחיים. שתי שכבות המשנה צריכות להיות מטופלות בזהירות יקרה.
- מורחים את כל דגימת PL על ידי הצבת OPL כלפי מעלה לתוך צלחת פטרי פלסטיק ושמירה על שטוח עם פחות קמטים ככל האפשר. לכסות את המדגם עם 10 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM NaCl. השתמש צלחת פטרי פלסטיק (ולא זכוכית) כדי להגביל את תנועות PL, כי PL מקלות טוב יותר פלסטיק.
2. טיפול לדוגמה לסלוביליזציה של חלבונים וניתוחי SDS-PAGE
-
סולובליזציה ראשונית של חלבונים
- דגימות IPL ו- OPL יבשות בהקפאה בנפרד. לאחר השלמת ייבוש ההקפאה, חותכים בקירוב 1 מ"ג מכל דגימה במיקרו-צינורות נקיים בעלי מכסה בורג הוכחה לדליפה. שמור את הדגימות הנותרות בצינורות סגורים היטב לאחסון ממושך ב -80 מעלות צלזיוס.
הערה: השימוש במיקרו-צינורות עם מכסה בורג חסין דליפה מבטיח סגירה הרמטית ועיינת דליפה כדי למנוע התייבשות דגימה וזה יאבטח את הדגימות. - יש לערבב 1 מ"ג של כל שכבת משנה ליאופילית עם 400 μL של 50 מ"מ טריס pH 7, 500 מ"מ NaCl. השתמש טחנת מערבל במשך 2 פעמים במשך 5 דקות ב 30 הרץ כדי לפורר OPL ו OPL מבנים במיקרו-חלקיקים להקל על solubilization חלבון. לאסוף 400 μL של הדגימות המכילות OPL ו- IPL בשתי microtubes נקי.
הערה: המאגר המשמש כאן נבחר כדי להגדיל את סולובליזציה של חלבון (בניגוד לשלב 1). מאגר זה התבסס על התוצאות שהוצגו באיור 3, המראות עלייה בסולוביליזציה של חלבונים ב-pH 7 (איור 3B)ושימוש ב-0.5 M NaCl (איור 3C). ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. בשלב זה, ניתן להשתמש בדגימות לטיהור חלבונים של חלבוני PL עיקריים או לעבד לשלב 2.2.
- דגימות IPL ו- OPL יבשות בהקפאה בנפרד. לאחר השלמת ייבוש ההקפאה, חותכים בקירוב 1 מ"ג מכל דגימה במיקרו-צינורות נקיים בעלי מכסה בורג הוכחה לדליפה. שמור את הדגימות הנותרות בצינורות סגורים היטב לאחסון ממושך ב -80 מעלות צלזיוס.
-
סולובליזציה של חלבונים לאלקטרופורזה
- הוסף 5x SDS-PAGE מאגר מדגם (100 μL, 0.25 M Tris-HCl, 0.05% כחול ברומופנול, 50% גליצרול, 5% SDS, 5% בטא-mercaptoethanol, pH 6.8) לכל 400 μL של המדגם וחום ב 100 מעלות צלזיוס עבור 5 min.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן, וניתן לאחסן דגימות ב- -80 °C (69 °F). בשלב זה של הפרוטוקול, OPL ו- IPL מומסים לחלוטין. היעילות של solubilization מדגם ניתן להעריך על ידי דגימות צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 10,000 x g. solubilization מלא מאופיין על ידי היעדר גלולה גלוי לאחר צנטריפוגה. לכן, לאחר solubilization מלא, זה נחשב כאן כי 1 מ"ג של שכבת משנה lyophilized מתאים 1 מ"ג של חלבונים (ריכוז החלבון במדגם 500 μL הוא 2 מ"ג / מ"ל). אכן, PL מורכב יותר מ 80% חלבון2,15. השימוש במאגר מדגם 5x מגביל את הדילול לדוגמה, אך ניתן להשתמש גם במאגר מדגם 1x או 2x. - לטעון מקסימום של 20 מיקרוגרם של חלבונים / נתיב על ג'ל פוליאקרילאמיד SDS (4%-20% ג'ל שיפוע) ולבצע אלקטרופורזה ב 120 V באמצעות מערכת אלקטרופורזה אנכית.
הערה: השימוש בג'ל שיפוע של 4%-20% אינו חובה, אך עדיף כאן כמו OPL ו- IPL להציג חלבונים עם משקולות מולקולריות החל <10 kDa כדי >250 kDa. זה עשוי להיות גם שימושי כדי לשמור על ג'ל הערימה (כי הוא הוסר בדרך כלל), כמו נוכחות של חלבונים מסיסים או אגרגטים חלבון בתחתית בארות יצביע על solubilization עניים צעד חסר אפשרי במהלך הכנת המדגם. - לאחר אלקטרופורזה, להסיר ג'לים מצלחות הזכוכית וכתם עם פתרון כחול מבריק קומאסי (50% H2O, 40% EtOH, 10% חומצה אצטית, ו R250 קומאסי כחול מבריק) במשך 30 דקות.
- דה-כתם עם פתרון המורכב 50% H2O, 40% EtOH, 10% תמיסת חומצה אצטית עד רקע הג'ל מופיע כחול בהיר.
- לבסוף להעביר את הג'ל בצלחות פטרי המכילות מים deionized, כדי להשיג דה כתמים והתייבשות של ג'לים polyacrylamide. חלבונים צריכים להופיע כמו רצועות כחולות של רקע שקוף.
- הוסף 5x SDS-PAGE מאגר מדגם (100 μL, 0.25 M Tris-HCl, 0.05% כחול ברומופנול, 50% גליצרול, 5% SDS, 5% בטא-mercaptoethanol, pH 6.8) לכל 400 μL של המדגם וחום ב 100 מעלות צלזיוס עבור 5 min.
Representative Results
OPL ו- IPL הופרדו מ- PL של ביצה לא מופרית שהוטלה זה עתה כדי לנתח את פרופילי החלבון שלהם על ידי SDS-PAGE. זרימת העבודה הניסיונית של הפרוטוקול כולו מאוירת באיור 2. איור 3 מציג שחרור חלבונים בריכוזי טריס שונים (איור 3A), pH שונים (איור 3B)וריכוזי NaCl שונים (איור 3C). שתי שכבות המשנה שהתקבלו נצפו תחת אור המיקרוסקופ המיקרוסקופ המשקפת ומוצגות באיור 4 שבו IPL שקוף ואילו OPL צפוף, מעונן ולבן. תכונות אלה יכולות להעיד בחלקן על יעילות ההפרדה בין שכבות המשנה.
לאחר הפרידה, OPL ו- IPL היו lyophilized באופן עצמאי, ותכולת החלבון שלהם היה מומס לחלוטין הודות לשילוב של שחיקה מכנית, השימוש בחומר ניקוי אניוני (SDS), וסוכן צמצום (בטא-mercaptoethanol), ואחריו רותחים. לאחר נדידה בג'ל פוליאקרילמיד (אלקטרופורזה SDS-PAGE), דגימות OPL ו- IPL מציגות פרופילים אלקטרופורטיים מובהקים (איור 5), כצפוי.
איור 1: מבנה ה-PL של ביצה לא מופרית שהוטלה זה עתה. ייצוג סכמטי מיקרוגרף אלקטרונים שידור של PL כולו חתך (נתונים אישיים, ©Plateforme IBiSA דה מיקרוסקופי אלקטרוניק, אוניברסיטת CHRU של טורס, צרפת, S. Georgeault). שים לב שתמונה זו התקבלה מ- PL שהוכנה כפי שהוצגה בפרוטוקול זה. OPL, שכבת פריוויטליין החיצונית; IPL, שכבת פריוויטליין פנימית. ראש חץ שחור מציין את הממברנה הרציפה המפרידה בין שתי שכבות המשנה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: זרימת עבודה המסכמת את שני השלבים העיקריים של הפרוטוקול ודוגמאות ליישומים. הפרוטוקול עבר אופטימיזציה לניתוח פרוטאומי של שכבות PL, אך ניתן לעצור אותו בשלבים מסוימים עבור יישומים אחרים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: מיטוב קומפוזיציית המאגר לדגימה של PL. בקצרה, PL נקי (n = 4) היה דגירה באותו נפח של פתרונות אגירה שונים עבור 2 שעות.PL הוסר, ואת ריכוז החלבון הוערך על ידי מדידת ספיגה ב 280 ננומטר במאגר הנותר. (A)השפעת ריכוז Tris-HCl ב- pH 8. (B)השפעת ה-pH (7 עד 9). (ג)השפעת ריכוז NaCl. מתוצאות אלה, הגענו למסקנה כי החיץ מורכב 10 mM Tris-HCl, pH 8, 50 mM NaCl הוא המתאים ביותר כפי שהוא מגביל אובדן חלבון. התוצאות מבוטאות כסטיית תקן ממוצעת ± של ארבע דגימות PL שונות. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות ANOVA חד-כיווני ואחריו מבחן השוואות מרובות של Tukey. ערך P <0.05 נחשב משמעותי (ns, לא משמעותי; * p<0.05, *** p<0.001, **** p<0.0001). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תכונות OPL ו- IPL תחת מיקרוסקופ ניתוח משקפת. לאחר ההפרדה, IPL (מימין) הופיע שקוף OPL (בצד שמאל) היה אטום. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ניתוח SDS-PAGE של OPL מופרד ו- IPL מהביצה הלא מופרית שהוטלה זה עתה. 4%-20% ג'ל אקרילאמיד ואחריו כתמים כחולים מבריקים של קומאסי. המסה של רצועות סטנדרטיות משקל מולקולרי מצוין kDa. פרופיל OPL מורכב בעיקר מחלבונים עם מסה מולקולרית >30 kDa בעוד הלהקות הגדולות שזוהו בפרופיל IPL יש מסות מולקולריות <30 kDa. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
ההצלחה של הפרוטוקול הנוכחי מסתמכת על שני צעדים קריטיים אשר היו אופטימיזציה עצמאית: ההפרדה המכנית של OPL ו- IPL כי צריך להיות פחות de-structuring ככל האפשר, ואחריו solubilization החלבון המלא של כל שכבת משנה, שהוא, לעומת זאת, de-structuring ו denaturing. זה גם מדגיש כמה נקודות ספציפיות שיש לקחת בחשבון כדי להבטיח את ההישג המוצלח של כל צעד.
הפרוטוקול אינו תלוי בצבע קליפת הביצה, במשקל הביצה, בסוג הייצור או בזן הגנטי של התרנגולת. עם זאת, זה תלוי טריות הביצה. אכן, הביצה עוברת שינויים פיזיוכימיים פנימיים עמוקים במהירות לאחר שהוטל, אם כי שינויים אלה יכולים להתעכב כאשר האחסון מבוצע בתנאים בקירור14,15. אובדן פחמן דו חמצני דרך נקבוביות קליפת הביצה במהלך האחסון גורם לעלייה של pH לבן ביצה (מ 7.8 ל 9.5) בעוד כמה חילופי מים מתרחשים בין החלמון ללבן, על פני PL. שני השינויים משפיעים לרעה על המבנה המולקולרי וההיסטולוגי של ה- PL שהופך חלש ומתוח פחות14,15, ככל הנראה עקב שינויים פיזיוכימיים של תכולת החלבון שלו16,17,18. ההנחה היא כי ההפרדה של שכבות משנה יהיה קשה מאוד עם ביצים מאוחסנות במיוחד אם האחסון מתנהל במשך תקופה ארוכה בטמפרטורת החדר. עד כה, הפרוטוקול בוצע באמצעות ביצים המאוחסנות פחות מ 4 ימים ב 4 מעלות צלזיוס ואת משך הזמן המקסימלי של אחסון עבור ביצה לדגום ביעילות שכבות משנה PL עדיין לא ידוע. בנוסף, אם המטרה היא ניתוח של כל שכבת משנה, חיוני להשתמש בביצים לא מופרות. ביום ההטילה, העובר של ביצית מופרית הוא בן 23 שעות והתפתחותו מהירה מאוד לאחר מכן, אם הביצית דגירה. אכן, התפתחות עוברית וצמיחה של כמה מבנים extraembryonic להרחיב באמצעות PL כמו substratum, אשר ולכן מושפל במהירות, והוחלף על ידי שק חלמון extraembryonic19.
לאחר הפרדה ידנית של החלמון והלבן ביצה, החלמון צריך להיות ניקה מן העקבות לבן ביצה מ chalazae שנשאר מחובר היטב PL. הקצה הוא לגלגל את החלמון בזהירות על נייר סינון ולבצע שטיפות נרחבות של החלמון בפתרונות אגירה (10 mM Tris-HCl pH 8). רמת ה- pH המשמשת עבור החיץ עולה בקנה אחד עם ה- pH הפיזיולוגי של הביצה הלבנה14 והוכח כמצמצמת את אובדן החלבון (איור 3). השימוש במאגר בקירור יעזור להסיר את ה- PL מהחלמון מכיוון ש- 4 מעלות צלזיוס, המאגר יקל על הסרת PL כאשר החלמון השומני נסוג והופך לפחות נוזלי בטמפרטורה זו. שטיפות נוספות יאפשרו הסרת שאריות חלמון מן PL. חשוב גם לגזור את האזור המתאים דיסק נביטה כי מבנה זה המכיל pronucleus נקבה לא יכול להיות נציג של PL. זהו האתר של הפריה וכפל של התאים העובריים כאשר הביצית מופרית. זה אמור להיות הרכב מסוים שעשוי להיות לא מייצג של PL כולו, וזו הסיבה מדוע הוא הוסר. צעד ספציפי זה הוא הקל מאוד כאשר החלמון הוא שקוע חיץ קר. למרות מבנה דיסק נביטה זה מושלך בפרוטוקול הנוכחי (מתוך המטרות), ניתוחים ספציפיים של אזור זה בביצים מופרות יכול להיות מאוד שימושי עבור מדענים המעוניינים לחקור את האבולוציה של תוכן PL (פרוטאומיקה ופעילות) ומבנה (מיקרוסקופ אלקטרונים), בשלבים המוקדמים של embryogenesis19,20,21. בשלב זה, ה-PL כולו שלם מבחינה מבנית וניתן לעבד אותו לניתוח מבני נוסף באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים (איור 2), לשלב 1.2 או לשלב 2.1 (אם המטרה היא לנתח את כל ה-PL).
שלב 1.2 צריך להתבצע תחת מיקרוסקופ ניתוח משקפת, כמו PL הוא דק מאוד שביר (על 10 מיקרומטר עובי). ההפרדה של שכבות משנה היא כמעט בלתי אפשרית במים או באגירה חסר מלח מינימלי, וניסיונות ראשוניים באמצעות אפשרויות אלה גרמו נזק PL חמור. לכן, המאגר שנבחר עבור שלב זה נשאר ב- pH פיזיולוגי (pH 8) ומכילים 50 mM NaCl. שלב זה הוא מפרך ויש לבצעו בזהירות ובעדינות כדי למנוע קריעת PL. לאחר ההפרדה, ניתן לזהות בקלות את שתי שכבות המשנה מכיוון שהן מציגות מאפיינים פיזיים מוזרים (אטומים לעומת שקופים). חוסר הומוגניות של IPL תחת אור המיקרוסקופ צריך לשקף הפרדה חלקית ובכך את נוכחותם של כתמים הנותרים של OPL נוכח על IPL. בנוסף, קשה מאוד לטפל בקרום כולו ואת השימוש 2 ס"מ x 3 חתיכות ס"מ מאוד לשפר את סיכויי ההצלחה. שכבת המשנה המתקבלת מתאימה למחקר היסטולוגי של מיקרוסקופ אלקטרונים (איור 1). ראוי לציין כי מבנה ליניארי ספציפי (בעובי 0.05 עד 1 מיקרומטר) הנקרא הקרום הרציף (CM) גלוי במיקרוגרף (איור 1) ונשאר מחובר בדרך כלל לקוטלת משנה זו או אחרת במהלך תהליך ההפרדה. זה פורסם בעבר כי בעת שימוש טוחנות מלח גבוהה יחסית להפרדה (500 מ"מ), CM נשאר מחובר OPL7 בעוד השימוש במים5 יעדיף את ההחזקה של CM ל- IPL. בפרוטוקול זה, טוחנת מלח נמוכה משמשת להשגת המטרות הספציפיות (שכבת משנה של PL ללא פגע ואובדן מינימלי של חלבונים), כלומר CM זה קשור ככל הנראה ל- IPL. עם זאת, ניתוח נוסף של IPL ו- OPL על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים שידור היה בבירור המדינה על השערה זו. שכבות PL, OPL או IPL שהושגו בסוף שלב 1 עשויות לשמש גם למטעני במבחנה לניתוחי כריכת ביציות זרע22 או לנתח את השלבים המוקדמים של התפתחות עוברית23,24.
שלב 2 מתייחס לסלוביליזציה של תכולת החלבון, באופן חלקי (שלב 2.1) או לחלוטין (שלב 2.2). PL ו/או OPL הם תחילה lyophilized כדי להסיר מולקולות מים ולאפשר מדידות משקל מדויקות. ואכן, PL מורכב בעיקר ממים (88%)7, בעוד החומר היבש מכיל בעיקר חלבונים (80% עד 90% בהתאם למחקרים), פחמימות, שומנים, ומינרלים2,7,25. בהתחשב בכך המים הכלולים PL מוסר על ידי הקפאת ייבוש, כי פחמימות הם התאוששו למעשה גליקופרוטאינים PL, וכי שומן ומינרלים שמקורם חלמון מושלכים למעשה על ידי שטיפות נרחבות, ההנחה היא כי PL וכתוצאה מכך מורכב כמעט אך ורק של חלבונים. לכן, ערך המשקל המתקבל לאחר ליאופיליזציה מלאה צריך להתאים בעיקר חלבונים. כמות שווה של PL, OPL ו/או IPL מדוללים לאחר מכן במאגר המכיל 0.5 M NaCl. טוחנת המלח הגבוהה המשולבת להרס המכני של הרשת הסיבית על ידי שחיקה מקלה מאוד על סלוביליזציה של חלבונים בתנאים שאינם מכבידים. שלב זה מלווה את solubilization מלא באמצעות רותחים, חומר ניקוי SDS ואת סוכן צמצום בטא-mercaptoethanol (שלב 2.2). ואכן, כמה חלבונים IPL הם גליקופרוטאינים מסיסים SDS25,26,27 ואת המרכיבים העיקריים של OPL הם NaCl-מסיסים1,11. באמצעות פרוטוקול זה, לא ראינו שום גלולה שנותרה של חלבונים בלתי מסיסים לאחר צנטריפוגה, אשר מציין כי solubilization היה ככל הנראה הושלם. חלבונים מ- PL, OPL ו/ או IPL נותחו לאחר מכן על-ידי SDS-PAGE. פרופילי החלבון המתקבלים עולים בקנה אחד עם ספרות שפורסמה2,4,11,16, אבל הרזולוציה והעוצמה של האות משופרת מאוד והומוגנית הרבה יותר בין דגימות עצמאיות שונות של IPL ו- OPL.
בנוסף, השוואה כמותית בין OPL ו- IPL מתאפשרת הודות לדיוק המשקל שהסקנו עבור שכבות המשנה המתאימות2,7. יתר על כן, הן פרופילי OPL והן פרופיל IPL הם מאוד ברורים למעט רצועה חלשה ב 14 kDa ו 75 kDa, שתי שכבות המשנה PL אינם חולקים בעליל להקות המציגות את אותו משקל מולקולרי. תצפית זו מאמתת את היעילות של הפרדת שכבות משנה ללא זיהום צולב משמעותי. על פי הניתוח הפרוטאומי היחיד של PL שפורסם1, הרצועות האינטנסיביות ביותר ב- OPL (<30 kDa) צריכות להתאים לליזוזים (14 kDa), חלבון שכבה עליונה של קרום ויטלין 1 (17 kDa), בטא-דפא העופותensin 11 (משקל מולקולרי לכאורה של 12 kDa), בעוד להקות אינטנסיבי של IPL (>30 kDa) הם כנראה חלבון Zona-Pellucida 1 (102 kDa) ו Zona-Pellucida חלבון 3 (47 kDa). ההתפלגות של החלבונים PL בשפע מאוד ovotransferrin (78 kDa), חלבון הקשורות ovalbumin X (45 kDa), ovalbumin (43 kDa)1 בין שכבות משנה נשאר להיות מואר. אכן, המשקל המולקולרי הגבוה של חלבונים אלה (>30 kDa) מרמז כי הם חלבוני IPL המבוססים על פרופיל SDS-PAGE, אבל הספציפיות שלהם לרקמות (חלבונים המובעים על ידי oviduct) מעדיפה לקשר חלבונים אלה ל- OPL28,29. יתר על כן, כמה הציעו זיהום פוטנציאלי של דגימות PL על ידי חלבונים חלבון לבן ביצה עקב שטיפה לא מספקת1. מידע חסר זה הוא הבסיס לפיתוח הפרוטוקול הנוכחי, אשר ישמש עוד יותר פרוטאומיקה כמותית מעמיקה של PL, OPL, ו- IPL.
לחלופין, משלב 2.1 ולאחר צנטריפוגה כדי להסיר את החומר מסיס, ניתן לחלץ כמה חלבונים ספציפיים עבור אפיון ביוכימי וביולוגי נוסף. גישה כזו יושמה לאחרונה כדי לאפיין את הפעילויות הביולוגיות ו / או את המבנה 3D של שני המרכיבים העיקריים של OPL, חלבון השכבה החיצונית קרום ויטלין 1 (VMO1) ו בטא-דפנסין עופות 11 (AvBD11)30,31. הזמינות של חלבונים אלה כמולקולות מטוהרות עשויה גם לסייע לייצר נוגדנים ספציפיים לניסויים נוספים כגון אימונוהיסטוכימיה או לפיתוח מבחנים כמותיים, כולל מבחנים אימונוסורבנטיים המקושרים לאנזימים.
שתי המגבלות העיקריות של פרוטוקול זה הן (1) האתגר עם הפרדת שכבות משנה במיוחד אם ביצים אוחסנו יותר מ 4 ימים ב 4 מעלות צלזיוס ו (2) העובדה כי solubilization החלבון המלא דורש צמצום ו denaturing מאגרים, אשר פוגעים בפעילות הביולוגית המהותית של הדגימות וכתוצאה מכך. לגבי המגבלה הראשונה, הפרדה מכנית דורשת מיומנויות טכניות אך מושגת בקלות לאחר 2 או 3 אימונים ניסיוניים. חלקים קטנים של IPL עשויים להישאר מחוברים ל- OPL ולהיפך מכיוון ששתי שכבות המשנה משויכות היטב. עם זאת, זיהום של שכבת משנה אחת על ידי השני צריך להיות מינימלי אם ההפרדה המכנית מבוצעת בזהירות. פרופילי IPL ו- OPL SDS-PAGE אופייניים לאחר הפרדת שכבת משנה מיטבית מודגמים באיור 5. לגבי המגבלה השנייה, צעדים ניסיוניים שהוצגו במאמר זה מוטבו לניתוחים פרוטאומיים, על מנת לספק רשימה ממצה של חלבונים המרכיבים כל שכבת משנה. לאפיון נוסף של הפעילות הביולוגית של כל חלבון, יש צורך לעצור בשלב 2.1.2, לפני השימוש בתנאים denaturing (שלב 2.2.1, שימוש חוצץ עם SDS ובטא-mercaptoethanol ואחריו רותחים). עם זאת, ראוי לציין כי חלבונים הנובעים משלב 2.1.2 הם רק חלבונים מסיסים במלח בעוד חלבונים מסיסים במלח יוצרים אגרגטים. אפשרות אחת להעריך עוד יותר את פעילותם בהתאמה עשויה להיות לייצר חלבונים מסיסים במלח כחלבונים רקומביננטיים באמצעות מערכות הטרולוגיות (E. coli, baculovirus, שמרים וכו ').
פרוטוקול זה עשוי להיות מותאם ביצי עופות אחרים למחקרים השוואתיים כדי להעריך טוב יותר את המקוריות של כל מין. אכן, PL מציג כמה ספציפי ציפור הן מבחינה מבנית והן מבחינת הרכב החלבון, ככל הנראה בשל הסתגלות לסביבות חדשות, אלא גם ספציפיות התפתחותית2,6,9,32. פיתוח פרוטוקול זה הדורש טכנאיות מתונה וציוד/חומרים קלאסיים פותח אפיקי מחקר חדשים בתחום מחקרי רביית ציפורים ודגימות.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לפיליפ דידייה וקארין אנגר (INRAE, PEAT, 37380, Nouzilly, צרפת, https://doi.org/10.15454/1.5572326250887292E12) על אספקת ביצים חומות איסה לא מופרות. אנו מודים גם לאוניברסיטת טורס, צרפת על מימון הדוקטורט של מ. ברג'ון. עבודה זו קיבלה תמיכה כספית מסוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (EQLIPSE, ANR-19-CE21-0006).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binocular dissecting microscope | Vision Engineering, France | Model Mantis Elite | |
| Lyophilizer | Cryotec, France | Model Cosmos 80 | |
| Mini-Protean II electrophoresis cell | Biorad, Hercules, USA | 1652960 | Any apparatus adapted for protein electrophoresis |
| Mixer Mill MM400 | Retsch, Hann, Germany | 20.745.0001 | Mixer mill adapted for for dry, wet, and cryogenic grinding of small amounts of sample |
| Ultra fine dissection scissors in stainless steel length 12 cm | Dutscher, Brumath | 5066 | |
| Ultra precise tip forceps anti-magnetic stainless steel 9.5x 109.3 mm | Dutscher, Brumath | 327005 |
References
- Mann, K. Proteomic analysis of the chicken egg vitelline membrane. Proteomics. 8 (11), 2322-2332 (2008).
- Chung, W. H., Lai, K. M., Hsu, K. -C. Comparative study on histological structures of the vitelline membrane of hen and duck egg observed by cryo-scanning electron microscopy. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 58 (3), 1794-1799 (2010).
- Kido, S., Doi, Y. Separation and Properties of the Inner and Outer Layers of the Vitelline Membrane of Hen's Eggs. Poultry Science. 67 (3), 476-486 (1988).
- Steele, M. G., Meldrum, W., Brillard, J. P., Wishart, G. J. The interaction of avian spermatozoa with the perivitelline layer in-vitro and in-vivo. Journal of Reproduction and Fertility. 101 (3), 599-603 (1994).
- Bain, J. M., Hall, J. M. Observations on the development and structure of the vitelline membrane of the hen's egg: an electron microscope study. Australian Journal of Biological Sciences. 22 (3), 653-665 (1969).
- Damaziak, K., Kieliszek, M., Buclaw, M. Characterization of structure and protein of vitelline membranes of precocial (ring-necked pheasant, gray partridge) and superaltricial (cockatiel parrot, domestic pigeon) birds. PLoS One. 15 (1), 0228310 (2020).
- Bellairs, R., Harkness, M., Harkness, R. D. The vitelline membrane of the hen's egg: a chemical and electron microscopical study. Journal of Ultrastructure Research. 8 (3-4), 339-359 (1963).
- Kido, S., et al. Characterization of vitelline membrane outer layer protein I, VMO-I: amino acid sequence and structural stability. Journal of Biochemistry. 117 (6), 1183-1191 (1995).
- Damaziak, K., et al. Comparative analysis of structure and strength of vitelline membrane and physical parameters of yolk of ostrich, emu, and greater rhea eggs. Poultry Science. 97 (3), 1032-1040 (2018).
- Kirunda, D. F., McKee, S. R. Relating quality characteristics of aged eggs and fresh eggs to vitelline membrane strength as determined by a texture analyzer. Poultry Science. 79 (8), 1189-1193 (2000).
- Back, J. F., Bain, J. M., Vadehra, D. V., Burley, R. W. Proteins of the outer layer of the vitelline membrane of hen's eggs. Biochimica Et Biophysica Acta. 705 (1), 12-19 (1982).
- Waclawek, M., Foisner, R., Nimpf, J., Schneider, W. J. The chicken homologue of zona pellucida protein-3 is synthesized by granulosa cells. Biology of Reproduction. 59 (5), 1230-1239 (1998).
- Okumura, H., et al. A newly identified zona pellucida glycoprotein, ZPD, and dimeric ZP1 of chicken egg envelope are involved in sperm activation on sperm-egg interaction. Biochemical Journal. 384, Pt 1 191-199 (2004).
- Guyot, N., Rehault-Godbert, S., Nys, Y., Baron, F. Understanding the natural antibacterial defences of egg white and their regulation. Achieving Sustainable Production of Eggs Volume 1. Roberts, J. 1, Burleigh Dodds Science Publishing Limited. Cambridge, UK. 161-193 (2016).
- Trziszka, T., Smolinska, T. Chemical Characterization of the Vitelline Membrane of Hens Eggs. Food Chemistry. 8 (1), 61-70 (1982).
- Berardinelli, A., Ragni, L., Giunchi, A., Gradari, P., Guarnieri, A. Physical-mechanical modifications of eggs for food-processing during storage. Poultry Science. 87 (10), 2117-2125 (2008).
- Kelley, A. J. The effects of storage time on vitelline membrane protein banding patterns and interior egg quality of eggs from nonmolted and molted hens. Texas A&M University. , Master of Science Thesis (2003).
- Schafer, A., Drewes, W., Schwagele, F. Analysis of vitelline membrane proteins of fresh and stored eggs via HPLC. Zeitschrift Für LebensmittelUntersuchung Und-Forschung A. Food Research and Technology. 206 (5), 329-332 (1998).
- Romanoff, A. L. The avian embryo: Structural and functional development. , The Macmillan Company. New York, NY. (1960).
- Haas, H. J., Spratt, N. T. Contributions to an analysis of the avian vitelline membrane's potential to promote outgrowth of the yolk sac-serosal membrane. The Anatomical Record. 184 (2), 227-231 (1976).
- Jensen, C. Ultrastructural changes in the avian vitelline membrane during embryonic development. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 21 (3), 467-484 (1969).
- Barbato, G. F., Cramer, P. G., Hammerstedt, R. H. A practical in vitro sperm-egg binding assay that detects subfertile males. Biology of Reproduction. 58 (3), 686-699 (1998).
- New, D. A. T. The Adhesive Properties and Expansion of the Chick Blastoderm. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 7 (2), 146-164 (1959).
- New, D. A. T. A New Technique for the Cultivation of the Chick Embryo. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3 (4), 326-331 (1955).
- Kido, S., Janado, M., Nunoura, H. Macromolecular components of the vitelline membrane of hen's egg. I. Membrane structure and its deterioration with age. Journal of Biochemistry. 78 (2), 261-268 (1975).
- Kido, S., Janado, M., Nunoura, H. Macromolecular components of the vitelline membrane of hen's egg. II. Physicochemical properties of glycoprotein I. Journal of Biochemistry. 79 (6), 1351-1356 (1976).
- Kido, S., Janado, M., Nunoura, H. Macromolecular components of the vitelline membrane of hen's egg. III. Physicochemical properties of glycoprotein II. Journal of Biochemistry. 81 (5), 1543-1548 (1977).
- Réhault-Godbert, S., et al. Ovalbumin-related protein X is a heparin-binding ov-serpin exhibiting antimicrobial activities. Journal of Biological Chemistry. 288 (24), 17285-17295 (2013).
- Gautron, J., et al. Ovotransferrin is a matrix protein of the hen eggshell membranes and basal calcified layer. Connective Tissue Research. 42 (4), 255-267 (2001).
- Guyot, N., et al. Proteomic analysis of egg white heparin-binding proteins: towards the identification of natural antibacterial molecules. Scientific Reports. 6, 27974 (2016).
- Guyot, N., et al. function, and evolution of Gga-AvBD11, the archetype of the structural avian-double-beta-defensin family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 337-345 (2020).
- Mori, M., Masuda, N. Proteins of the vitelline membrane of quail (Coturnix coturnix japonica) eggs. Poultry Science. 72 (8), 1566-1572 (1993).
