鶏卵からの外側および内側のペリビテリンサブ層の機械的分離とタンパク質可溶化

Summary

この記事では、鶏卵の外側と内側の膜下層を分離しながら、構造変化を最小限に抑え、プロテオミクス分析のために各サブ層のタンパク質可溶化を最適化する簡単な方法を報告します。

Abstract

卵黄を取り囲むペリビテリン層は、受精、卵の防御、および鳥類胚の発達において基本的な役割を果たす。これは、密接に関連付けられており、明確な女性の生殖器官によって形成される2つのタンパク質サブ層によって形成される。両方の構造は、独自の機能特異性を持っていると想定され、定義されたままです。各サブ層を構成するタンパク質の機能を特徴付けるには、構造上の損傷を制限しながら、これら2つの複雑な層の機械的分離を可能にする条件を確立することが最初の課題です。第2のステップは、これら2つのサブ層からのタンパク質可溶化を促進するために、実験条件を最適化し、その後の生化学的分析を行う。このアプローチの効率は、2つの構造間で明確であると予想される、ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって各サブ層のタンパク質プロファイルを分析することによって評価される。この 2 段階の手順は、単純なままです。それは古典的な生化学的装置および試薬を必要とする;さらに詳細なプロテオミクスと互換性があります。また、比較生物学のために他の鳥卵に転置してもよいし、ペリビテリン層の構造および組成が種特異的特徴を有することが示されていることを知っている。さらに、サブ層分離(ステップ1)のために開発された非変性条件は、走査および透過電子顕微鏡による構造解析を可能にする。また、その後のタンパク質精製の初期ステップを構成して、それぞれの生物学的活性および3D構造を分析したり、さらに免疫組織化学的または機能的な分析を行ったりすることができる。このような研究は、構造的および機能的な積層が生殖成功の決定基準であるこれら2つのサブ層の生理学的機能を解読するのに役立つだろう。

Introduction

この方法の目的は、卵黄を囲み、鳥類の繁殖に基本的な役割を果たす薄タンパク質層であるペリビテリン層(PL)のその後の生化学的特徴付けを可能にするプロトコルを提供することにある。PLは、文献の中でも「ビテリン膜」と名付けられ、いくつかのタイプの糖タンパク質で構成される太い繊維の3次元ネットワークである。それは、卵巣に組み立てられる内側のペリビテリン層(IPL)(黄身と接触する)と外側のペリビテリン層(OPL、白と接触)で構成され、IPL(図1)に横たわり、インファンディブラムによって生成される。この後者の組織は、排卵後に成熟したヨルキ卵胞を受け取る卵管の漏斗状の上層部であり、受精が行われる部位である。OPLの分泌はこれら2つの事象の後に起こり、卵白と卵殻の連続的な沈着が卵管の他の特定のセグメントで続く。PLの生理機能は、受精や初期段階の胚発生だけでなく、胚の物理的および分子的保護にも関連しています。PL全体で行われた鶏卵のプロテオミクス分析は、137種類のタンパク質¹の存在を明らかにしたが、IPLとOPLの間のこれらのタンパク質の大部分の分布は解明されていない。文献で利用可能なデータの最小量は、IPLとOPLが非常に異なるタンパク質プロファイル^2、3、4を示し、異なる構造的および機能的特性を示唆していると報告している。OPL と IPL 間のタンパク質の分布に関するデータの相対的な希少性は、薄く埋め込まれた両方のサブレイヤーを分離するのが困難なためである可能性があります。

ここで示す方法は、タンパク質含有量を維持しながら、それぞれの組織学的構造への影響が限られた2つのサブ層を分離するために使用される条件を説明し、プロテオミクスによるその後の分析のためにタンパク質の完全な可溶化を可能にするプロトコルを提供する。1) PL サンプリングと OPL/IPL 分離、2) 質量分析のためのタンパク質の可溶化と電気泳動のための PL、OPL、および IPL 処理の 2 つの主要な手順が含まれます。このワークフローは図 2に示されています。顕著に、本プロトコルはプロテオミクス分析のために最適化されている(ステップ2.2)が、組織学的(例えば、電子顕微鏡検査)、免疫組織化学的分析、機能研究(ステップ1)、およびそれらの構造および生物学的活性を特徴付けるために塩溶性タンパク質の精製のためにいくつかのステップで停止することができる(ステップ2.1)。

最初のステップは卵黄から総PLを除去することです(図2、ステップ1.1)。すべての公開された方法は、卵白を手動で、または卵のセパレータを使用して卵白を分離することから始まります。その後、残りの卵白と厚いカラザエを鉗子を用いて、または濾紙⁵上への吸着によって除去する(図2A)。次に、サンプルPLに選択された技術は、公開された記事に応じて可変です。いくつかの論文は、卵黄のいくつかの打ち付けを含みます, 脱イオンまたは蒸留水^{で 1,5,6,}0.85〜1%生理食塩水^2,7,8,0.15 M NaCl/N-[トリス(ヒドロキシメチル))]メチル-2-アミノエタンスルホン酸、pH 7.4、または0.0H(0.01)の中で.これらの手順は、鶏、アヒル、リングネックキジ、灰色のパートリッジ、コッカティエルオウム、国内の鳩、またはラタイト卵^2、6、9に適用されました。卵黄が水溶液なしでペトリ皿に維持されている間のPLの除去はPLが壊れやすく、卵黄がPL^1、5に固執する傾向があり、したがって、その後排除することは困難なままであるため、非常に面倒かもしれません。酸性緩衝液または37°C3での1時間の溶液の使用も、PL構造を変化させ、タンパク質損失を生じさせる可能性があるため好ましくない。また、このゾーンは、PL4、6、10全体を反映しない明確な構造および分子パターンを有する可能性が高いので、胚盤を含む領域を除去することも重要である(図2B)。この方法は、いくつかの出版された記事で強調されたアイデアを利用し、その完全性を維持しながらPLサンプリングを容易にするためにいくつかの改善を提案しています(図2C)。

2 番目のステップは、2 つのサブレイヤーを分離することです (図 2、ステップ 1.2)。OPL と IPL は互いに密接にバインドされるため、このステップは重要です。このステップは、双眼解剖顕微鏡の下で鉗子で慎重に行われるべきである。OPL/IPL分離を報告する出版物は^{2、3、7、11に非常に}限られており^、それらのいくつかは、サブ層の組織学的構造に影響を与える可能性が高い特定の条件(37°Cの酸性緩衝液^{1時間2、3)}を使用し、タンパク質の損失または黄身または白色汚染に寄与する可能性がある。OPLとIPLをよりよく区別するために、一部の著者は、OPLをわずかに着色するためにトルイジンブルーの使用を報告しました(内側の層は無色のままです)¹¹。開発した方法では、分離が容易に達成され、染料の使用を必要としないように条件を最適化しました(図2D)。

第2の主なステップは、各サブ層を構成するタンパク質の可溶化である。古典的には、クリーンな凍結乾燥^1、乾燥^2、6、または新鮮な調製^3、4、11PL/サブ層を電気泳動に使用されるLaemmliバッファーと直接混合することによって達成される。他の著者は、1%NaClの層の予備的な可溶化を好み、1%SDS緩衝液^{2、3、11、}またはプロテアーゼ阻害剤およびSDS6を室温で含む溶液またはトリトンで45°C12でインキュベートし、続いて一定の激しい攪拌の下で好ましい。いくつかの著者はまた、PLがリン酸緩衝液生理食塩水または尿素中にインキュベートされ、超音波処理¹³を受けたプロトコルを記述した。これらの処理はすべてレムリバッファーで遠心分離および希釈を行い、不溶性物質(遠心分離後に得られるペレット)が分析対象の試料から廃棄されるため、全て層からの不完全なタンパク質可溶化の欠点を共有する。

また、タンパク質可溶化のための特定の著者による変性条件(尿素、洗剤、高温など)の使用は、タンパク質を不可逆的に不活性化し、その生物学的活性を妨げ、また、その3D構造を損なう可能性があるため、特性評価のためのその後のタンパク質精製と互換性がありません。この特定のステップ2では、このプロトコルには、PL/OPL/IPL機械的脱構造化後の非変性条件下で最も豊富なタンパク質の可溶化を可能にする第1のサブステップが含まれており、必要に応じてさらなるタンパク質研究を妨げない(図2、ステップ2.1)、および電気泳動および深部プロテクトにおけるタンパク質の完全な可溶化を可能にする第2のサブステップが含まれる。これは、実験的研究によって検証された新しいアイデアから生じる様々な出版された論文と調整から取られた提案を組み合わせたものである。

Protocol

1.PL、IPL、および OPL サンプリング

1. PL サンプリング
   1. 生きたての未受精卵を手動で割り、ガラスビーカーの上に横たわっている卵のセパレーターを使用して黄身を白から分離します。小さいはさみでチャラザエを取り出し、フィルターペーパーの上に黄身を転がして、透明で目に見える構造として現れる付着性の卵白を取り除く(図2A)。
      注意:はさみでPLを穿刺しないように注意してください。ハサミを取り除くためにはさみの代わりにピンセットを使用すると、PL破損とその後の黄身漏れを引き起こす可能性があります。フィルターペーパーのローリングステップは重要であり、PL破損を引き起こす可能性のある紙フィルターの吸収特性のために非常に迅速に実行する必要があります。また、この最初のステップとその後のすべてのステップの成功を最適化するために、産卵日から未受精卵を使用することも非常に重要です。あるいは、冷却された環境で10日未満保存された卵を使用することもできますが、実験者はPL変更の潜在的なリスクを考慮する必要があります。
   2. 以前に4°Cまで冷却した10 mM Tris-HCl pH 8を含む結晶化器に黄身を浸し、鈍いはさみを使用して1cmゾーン内の胚葉ディスク上のPL領域を取り除きます(図2B)。
      注:当初、PLは脱イオン水に浸っていましたが、このアプローチにはpH制御の欠如と後でサブレイヤを分離するのが難しいなど、いくつかの欠点があります(ステップ1.2)。したがって、トリス濃度(図3A)およびpH(図3B)を含むいくつかの条件を試験した。pH 8での緩衝液の使用は、脱イオンまたは脱塩水の代わりに、卵の生理学(卵白のpHは産卵日に約7.8)14に従い、タンパク質の損失を最小限に抑える。対照的に、酸性または非常にアルカリ性のpHはPL脱構造化および早期タンパク質可溶化を引き起こすと疑われる(図3B)。10 mM Tris-HCl pH 8からなる緩衝液は、卵の生理学を尊重し、有意なタンパク質可溶化を引き起こさないため最適であることが判明した(働く緩衝液中のタンパク質濃度は最小限のまま、図3A、B)。
   3. 緩衝液の小さいはさみでPLを破裂する。破裂したPLの2つの縁を鉗子で保持し、卵黄からPLを剥がします。
   4. 鉗子でPLを維持し、10 mM Tris-HClの複数の浴場でPLを数回リンスし、黄身の痕跡が見えなくなるまでpH 8。この段階で、PL がクリーンで白色で、バッファー内にフローティングされていることを確認します。これは、副層分離のためにステップ1.2で処理することも、生化学的分析のためにステップ2.1に直接処理することができます。
2. OPL および IPL サンプリング
   1. プラスチックペトリ皿にOPLを上向きに入れ、できるだけ少ないしわで平らに保ち、PLサンプル全体を広げます。サンプルを10 mMトリス-HCl pH 8、50 mM NaClで覆います。PLはプラスチックにうまくくっきりするので、PLの動きを制限するためにプラスチックペトリ皿(そしてガラスではない)を使用してください。
      1. OPL 側を見つけるには、IPL ではなく OPL に接続されている残りのチャラザの位置を調べてください。このステップは、サブ層分離を容易にするために、小さなNaCl濃度(50 mM)を必要とします。
         注:図 3Cおよび文献¹¹に示すグラフに基づいて、この濃度は、大きなタンパク質損失を招くものではありません。最初は、前述の^1、5、6のように、脱イオン水を使用してサブ層を分離したが^、この技術は非常に骨の折れるものであり、構造PLの完全性の変化をもたらした。従って、異なるNaCl濃度(図3C)を塩として試験し、2つのサブ層の分離を促進した。しかし、NaCl濃度>100 mMを使用すると、PLからのタンパク質可溶化/放出が増加することが注目に値するが、これはここでの目的ではない(これはステップ2の目的である)(図3C)。50 mM NaCl を 10 mM Tris-HCl pH 8 バッファーに加えることは、2 つのサブレイヤーの分離を促進し、タンパク質損失を最小限に抑えます。
   2. 小さいはさみで約2cm x 3cmの部分に総PLを切ります。両眼解剖顕微鏡下で超精密な先端鉗子を用いて各PL片の2つの層を機械的に分離する(図4)。得られたIPLおよびOPLサンプルを-80°Cのマイクロチューブに個別に保管し、さらに使用するまで保管してください。
      注: プロトコルはここで一時停止することができます。なお、2層の分離の効率や機能は、卵の鮮度に大きく依存する。実際に、保存された卵は、卵白pHの急激な増加とPL緩み(および弱体化)による黄身指数のその後の変化による抜本的な内部改変を示す。IPL は OPL と比較して、より脆弱です。したがって、上記のOPLの面を配置し、鉗子でOPLを引っ張って2つのサブ層を分離することが好ましい。両方のサブレイヤーは、貴重な注意を払って処理する必要があります。

2. タンパク質可溶化およびSDS-PAGE分析のサンプル処理

1. 一次タンパク質可溶化
   1. フリーズドライIPLおよびOPLサンプルを個別に使用。凍結乾燥が完了したら、漏れ防止スクリューキャップを持つクリーンマイクロチューブで各サンプルから約1mgをカットします。残りのサンプルを密閉チューブに入れて、-80°Cで長期保管してください。
      注:漏れ防止スクリューキャップ付きマイクロチューブを使用することで、サンプルの水分補給を防ぐために、密閉および漏れ防止クロージャが保証され、サンプルが固定されます。
   2. 50 mM トリス pH 7、500 mM NaCl の 400 μL と各凍結乾燥したサブ層の 1 mg を混合します。ミクロ粒子でOPLとOPL構造を崩壊させ、タンパク質の可溶化を促進するために、30 Hzで5分間ミキサーミルを使用してください。OPLとIPLを含むサンプルの400 μLを2つのクリーンマイクロチューブに集めます。
      注:ここで使用されるバッファーは、タンパク質の可溶化を増加させるために選択されています(ステップ1とは異なります)。このバッファーは 、図 3に示した結果に基づいて、pH 7 (図 3B)におけるタンパク質可溶化の増加を示し、0.5 M NaCl を使用した (図 3C) 。プロトコルはここで一時停止することができます。この段階では、サンプルは、主なPLタンパク質のタンパク質精製に使用したり、ステップ2.2に加工することができます。
2. 電気泳動のためのタンパク質可溶化
   1. サンプルの400 μLに5x SDS-PAGEサンプルバッファー(100 μL、0.25 M Tris-HCl、0.05%ブロモフェノールブルー、50%グリセロール、5%SDS、5%β-メルカプトエタノール、pH 6.8)を加え、100°Cで5分間加熱します。
      注: プロトコルはここで一時停止することができ、サンプルは-80 °Cで保存することができます。 プロトコルのこの段階では、OPL と IPL は完全に解消されます。サンプルの可溶化の効率は、10,000 x gで 5 分間の遠心サンプルで評価できます。完全な可溶化は、遠心分離後に可視ペレットの不在を特徴とする。したがって、完全な可溶化の後、凍結乾燥されたサブ層の1mgが1mgのタンパク質に相当すると考えられる(500μL試料中のタンパク質濃度は2mg/mLである)。実際、PLは80%以上のタンパク質^2,15から構成されています。5x サンプルバッファーの使用はサンプル希釈を制限しますが、1x または 2x サンプルバッファーも使用できます。
   2. SDSポリアクリルアミドゲル(4%~20%の勾配ゲル)に最大20μgのタンパク質/レーンをロードし、垂直電気泳動システムを使用して120Vで電気泳動を行います。
      注: 4%~20% の勾配ゲルの使用は必須ではありませんが、OPL と IPL は、<10 kDa から >250 kDa までの分子量のタンパク質を示すため、ここでは好ましいです。また、ウェルの底部に不溶性タンパク質またはタンパク質凝集体が存在すると、溶解不良とサンプル調製中のステップの欠落の可能性を示すため、積層ゲル(通常は除去される)を維持するのにも有用である可能性があります。
   3. 電気泳動後、ガラス板からゲルを取り出し、クーマシーブリリアントブルー溶液(50%H2O、40%EtOH、10%酢酸、R250クーマシーブリリアントブルー)で30分間染色します。
   4. 50%H2O、40%EtOH、10%酢酸溶液からなる溶液を用いた脱染色は、ゲルの背景が水色に見えるまでである。
   5. 最後に、脱イオン水を含むペトリ皿にゲルを移し、ポリアクリルアミドゲルの脱染色および水分補給を達成する。タンパク質は、透明な背景の青いバンドとして表示される必要があります。

Representative Results

OPLとIPLは、SDS-PAGEによってタンパク質プロファイルを分析するために、新たに産まれた未受精卵のPLから分離された。プロトコル全体の実験ワークフローを 図 2に示します。 図3 は、異なるトリス濃度(図3A)、各種pH(図3B)および異なるNaCl濃度(図3C)でのタンパク質放出を示す。得られた2つのサブレイヤーを両眼解剖顕微鏡の光の下で観察し、OPLが緻密で白濁している間にIPLが半透明である 図4 に示されている。これらの特徴は部分的にサブ層分離の効率のために証言することができる。

分離後、OPLとIPLは独立して凍結乾燥し、機械的粉砕、アニオン洗剤(SDS)の使用、還元剤(β-メルカプトエタノール)の組み合わせによりタンパク質含有量が完全に溶解し、沸騰した。ポリアクリルアミドゲル(SDS-PAGE電気泳動)でマイグレーションした後、OPLおよびIPLサンプルは、期待どおりに異なる電気泳動プロファイル(図5)を示します。

図1:未受精卵のPLの構造断面におけるPL全体の模式的表現および透過電子顕微鏡(個人データ、©Plateforme IBiSA de Microscopie Electronique、フランス、S.ジョージオーの大学とCHRU)。この画像は、このプロトコルで提示されたPLから得られたことに注意してください。OPL, 外側のペリビテルリン層;IPL、内側のペリビテルリン層。黒い矢印は、2つのサブレイヤを分離する連続膜を示します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 2: プロトコルの 2 つの主要な手順とアプリケーション例を要約したワークフロー。このプロトコルはPL層のプロテオーム解析用に最適化されていますが、他のアプリケーションではいくつかのステップで停止することができます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:PLサンプリングのためのバッファ構成の最適化簡単に言えば、クリーンPL(n=4)を2hの様々な緩衝液の同じ体積でインキュベートし.PL除去し、残りの緩衝液中の280nmで吸光度を測定することによってタンパク質濃度を推定した。(a) pH 8におけるトリス-HCl濃度の影響(B)pHの効果(7〜9)。(C) NaCl濃度の影響これらの結果から、我々は、10 mM Tris-HCl、pH 8、50 mM NaClからなるバッファーがタンパク質損失を制限するため最も適切であると結論付けた。結果は、4つの異なるPLサンプルの平均±標準偏差として表されます。統計分析は、一方向のANOVAを使用して行われ、続いてTukeyの多重比較検定を行った。P値 <0.05 は有意であると考えられていました (ns、 有意ではありません; * p<0.05, *** p<0.001, **** p<0.0001).この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:双眼解剖顕微鏡下でのOPLおよびIPLの特徴。分離後、IPL(右側)は半透明に見え、OPL(左側)は不透明であった。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図5:産卵したばかりの未受精卵からOPLとIPLを分離したSDS-PAGE分析。4%~20%アクリルアミドゲルに続いて、クマシーブリリアントブルー染色。分子量標準バンドの質量はkDaで示される。OPLプロファイルは主に分子質量を持つタンパク質>30 kDaで構成され、IPLプロファイルで検出された主要バンドは分子質量<30 kDaを有する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

本プロトコルの成功は、独立して最適化された2つの重要なステップに依存しています:OPLとIPLの機械的分離は、可能な限り脱構造化する必要があり、その後、各サブ層の完全なタンパク質可溶化が続き、逆に脱構造化と変性が行われます。また、各ステップの成功を確実にするために考慮する必要があるいくつかの特定の点も強調しています。

プロトコルは、卵殻の色、卵の重量、生産の種類、または鶏の遺伝的株に依存しません。しかし、卵の鮮度によって異なります。実際、卵は産卵後すぐに深い内部物理化学的修飾を受けるが、冷蔵条件下で保存を行うとこれらの変化は遅れる可能性がある^14,15。貯蔵中に卵殻の毛穴を通して二酸化炭素が失われると、卵白pH(7.8から9.5)が増加し、PL全体で黄身と白の間でいくつかの水の交換が行われます。いずれの改変も、そのタンパク質含有量^16、17、18の物理化学的修飾に起因する可能性が低い^14、15と弱まるPLの分子および組織構造に悪影響を及ぼす。特に保存された卵の貯蔵が室温で長期間行われる場合、サブ層の分離は非常に困難なものと考えられます。最新の状態では、プロトコルは4°Cで4日未満保存された卵を用いて行われ、PLサブレイヤーを効率的にサンプリングするための卵の貯蔵期間の最大持続時間はまだ分かっていない。また、各サブ層の解析が目的である場合、未受精卵を使用することが重要です。産卵の日には、受精卵の胚は23時間古く、卵子がインキュベートされた場合、その後、その発達は非常に迅速である。実際、胚発生およびいくつかの胚外構造の成長は、PLを皮下として使用して拡大し、このように急速に分解され、胚外黄身嚢¹⁹に置き換えられる。

卵黄と卵白を手動で分離した後、卵白の痕跡とPLにしっかりと付着したままのチャラザから黄身を洗浄する必要があります。チップは、フィルター紙の上に慎重に黄身を転がし、緩衝溶液(10 mM Tris-HCl pH 8)で黄身の広範な打ち解きを行うことである。バッファーに使用されるpHは、卵白¹⁴の生理学的pHと一致しており、タンパク質の損失を最小限に抑えることが示されている(図3)。4°Cでは、リピシック黄身が後退し、この温度で液体が少なくなるので、冷蔵緩衝液を使用すると、卵黄からPLを除去するのに役立ちます。追加の打ち込みにより、PLから黄身残渣を除去することができます。また、雌の前核を含むこの構造はPLの代表ではない可能性があるため、胚盤に対応するゾーンを切り取ることも重要である。卵子が受精したときの胚細胞の受精と増殖の部位である。PL全体を代表しない特定の組成物を有することになっているが、これが除去された理由である。この特定のステップは、黄身がコールドバッファーに浸漬される際に強く促進される。この胚ディスク構造は、現在のプロトコル(目的外)では廃棄されるが、受精卵中のこの領域の特定の分析は、胚発生^19、20、21の初期段階において、PL内容(プロテオミクスおよび活性)および構造(電子顕微鏡)の進化を研究する科学者にとって非常に有用であり得る。この段階では、PL全体が構造的に無傷であり、電子顕微鏡法(図2)によって更なる構造解析のために処理され、ステップ1.2またはステップ2.1(目的はPL全体を分析すること)に至る。

PLは非常に薄く、壊れやすい(厚さ約10μm)であるため、ステップ1.2は双眼解剖顕微鏡の下で行う必要があります。サブレイヤーの分離は、水や最小限の塩を欠く緩衝液ではほとんど不可能であり、これらのオプションを使用した最初の試みは深刻なPL損傷をもたらしました。したがって、この工程のために選択された緩衝液は生理学的pH(pH8)に留まり、50 mM NaClを含有する。このステップは困難であり、PLの引き裂きを防ぐために慎重かつ穏やかに行わなければなりません。分離されると、2つのサブレイヤーは、特異な物理的特徴(不透明と半透明)を示すため容易に識別できます。顕微鏡の光の下でのIPLの均質性の欠如は不完全な分離を反映し、したがってIPLに存在するOPLの残りのスポットの存在を反映すべきである。さらに、膜全体を治療することは非常に困難であり、2cm x 3 cmの部分の使用は大きく成功の可能性を高める。得られたサブ層は電子顕微鏡による組織学的研究に適している(図1)。連続膜(CM)という特定の線形構造(0.05~1 μm厚)が顕微鏡写真(図1)に見え、分離の過程で通常一方または他方のサブレイヤに付着したままであることに注目してください。分離のために比較的高い塩分モルリティ(500mM)を使用する場合、CMはOPL⁷に取り付けられたままであり、水⁵の使用はIPLへのCMの取り付けを好むと以前に公表されている。このプロトコルでは、低塩モルリティが特定の目的(PLサブレイヤーは構造的に無傷で、タンパク質の損失を最小限に抑える)を達成するために使用され、これは、このCMがIPLに関連している可能性が高いことを意味します。しかし、透過電子顕微鏡によるIPLとOPLの追加分析は、この仮説に明確に述べられるであろう。ステップ1の終わりに得られたPL、OPL、またはIPL層は、精子・卵子結合解析²²のためのインビトロアッセイに用いてもよいし、胚発生^23、24の初期段階を分析するためにも用いることができる。

ステップ2は、タンパク質含量の可溶化をいい、部分的に(ステップ2.1)または完全に(ステップ2.2)。PLおよび/またはOPLは水分子を除去し、精密な重量測定を可能にするために最初に凍結乾燥される。実際、PLは主に水(88%)7で構成され、乾燥物質は本質的にタンパク質(研究に応じて80%〜90%)、炭水化物、脂肪、およびミネラル^2、7、25を含む。PLに含まれる水が凍結乾燥によって除去され、糖質が基本的にPL糖タンパク質で回収され、卵黄から生じる脂肪やミネラルが本質的に広範な清水によって廃棄されることを考慮すると、得られたPLはタンパク質からほぼ独占的に構成されていると仮定されます。したがって、完全凍結乾燥後に得られる重量値は、主にタンパク質に対応すべきである。PL、OPL、および/または IPL の量は、0.5 M NaCl を含むバッファー内で希釈されます。高塩モルリティを粉砕することにより繊維網の機械的破壊に組み合わせることで、非変性条件下でのタンパク質可溶化を大いに促進する。このステップは、沸騰を用いた完全な可溶化、SDS洗剤および還元剤β-メルカプトエタノール(ステップ2.2)に続く。実際、いくつかのIPLタンパク質は、SDS溶性糖タンパク質^{25、26、27であり、OPL}の主要な構成要素はNaCl溶性^1、11である。このプロトコルを使用すると、遠心分離後に不溶性タンパク質の残りのペレットは見られず、可溶化が完了した可能性が高いことを示しています。PL、OPL、および/またはIPLからのタンパク質をSDS-PAGEによって分析した。結果として得られるタンパク質プロファイルは、公開された文献^{2、4、11、16}と一致するが^、シグナルの分解能と強度は高度に改善され、様々なIPLとOPL独立サンプリングの間ではるかに均質である。

また、OPLとIPLの定量的比較は、それぞれのサブレイヤ^2,7について推測した重量の精度のおかげで可能になります。さらに、OPLとIPLの両方のプロファイルは非常に明確であり、14 kDaおよび75 kDaのかすかなバンドを除いて、両方のPLサブレイヤーが同じ分子量を示すバンドを目に見えて共有しません。この観察は、重大な交差汚染のないサブ層分離の効率を裏付ける。^1のPLプロテオミクス分析で発表された唯一のPLプロテオミクス分析によると、OPL(<30 kDa)で最も強烈なバンドは、リゾザイム(14 kDa)、ビテリン膜外層タンパク質1(17kDa)、鳥類β-デフェンシン1に対応する必要があります 1(12 kDaの明らかな分子量)、IPL(>30 kDa)の強烈なバンドは、おそらくゾナ・ペルクダタンパク質1(102 kDa)およびゾナ・ペルクダタンパク質3(47 kDa)である。非常に豊富なPLタンパク質のオボトランスフェリン(78kDa)、オボアルブミン関連タンパクX(45kDa)、オボアルブミン(43kDa)1のサブ層間の分布は解明されたままである。実際、これらのタンパク質の高分子量(>30 kDa)は、それらがSDS-PAGEプロファイルに基づくIPLタンパク質であることを示唆しているが、それらの組織特異性(卵性発現タンパク質)はむしろこれらのタンパク質をOPL^28,29に関連付ける。さらに、一部の人々は、不十分な洗浄による卵白および卵黄タンパク質によるPLサンプルの潜在的な汚染を示唆している^1.この情報不足は、本プロトコルの開発の基礎であり、PL、OPL、およびIPLの詳細な定量プロテオミクスに対してさらに使用される。

あるいは、ステップ2.1および遠心分離後から不溶性物質を除去し、さらに生化学的および生物学的特徴付けのためにいくつかの特異的なタンパク質を抽出することができる。このようなアプローチは、OPLの2つの主要成分の生物学的活性および/または3D構造を特徴付けるために最近適用されている、ビテリン膜外層タンパク質1(VMO1)および鳥類β-ディフェンシン11(AvBD11)30、31。これらのタンパク質を精製分子として利用できることは、免疫組織化学などの追加実験や、酵素結合免疫吸着アッセイを含む定量アッセイの開発のための特定の抗体の産生にも役立つ可能性がある。

このプロトコルの2つの大きな制限は、(1)卵が4°Cで4日以上保存されている場合は特にサブレイヤ分離の課題であり、(2)完全なタンパク質可溶化は、得られたサンプルの本質的な生物学的活性を損なう緩衝液の減少と変性を必要とする事実である。最初の制限では、機械的分離は技術的なスキルを必要としますが、2つまたは3つの実験的な訓練の後に簡単に達成されます。IPL の小片の中には、OPL にアタッチされたままの部分と、両方のサブレイヤが密接に関連付けられているものがあります。しかし、機械的分離が慎重に行われる場合、一方のサブレイヤの汚染は、もう一方の部分層による汚染を最小限に抑える必要があります。最適なサブレイヤー分離後の典型的な IPL および OPL SDS-PAGE プロファイルを 図 5に示します。2番目の制限に関しては、この記事で提示された実験的なステップは、各サブレイヤを構成するタンパク質の包括的なリストを提供するために、プロテオミクス分析のために最適化されています。各タンパク質の生物学的活性のさらなる特徴付けのためには、変性条件を使用する前にステップ2.1.2で停止する必要があります(ステップ2.2.1、SDSおよびβ-メルカプトエタノールを用いたバッファーの使用後に沸騰)。しかし、ステップ2.1.2から生じるタンパク質は塩溶性タンパク質のみであり、塩不溶性タンパク質は凝集体を形成する。それぞれの活性をさらに評価する選択肢の1つは、異種系(大腸菌、バキュロウイルス、酵母など)を用いて組換えタンパク質として塩不溶性タンパク質を産生することである。

このプロトコルは、各種の独創性をよりよく理解するために、比較研究のために他の鳥卵に適応することができる。実際、PLは、構造的にもタンパク質組成の観点からも、新しい環境への適応だけでなく、発達特異性^{2、6、9、32}にも起因するいくつかの鳥特異性を表示する。適度な技術性と古典的な機器/材料を必要とするこのプロトコルの開発は、鳥の再生と種分化研究の分野で新しい研究の道を開きます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Binocular dissecting microscope	Vision Engineering, France		Model Mantis Elite
Lyophilizer	Cryotec, France		Model Cosmos 80
Mini-Protean II electrophoresis cell	Biorad, Hercules, USA	1652960	Any apparatus adapted for protein electrophoresis
Mixer Mill MM400	Retsch, Hann, Germany	20.745.0001	Mixer mill adapted for for dry, wet, and cryogenic grinding of small amounts of sample
Ultra fine dissection scissors in stainless steel length 12 cm	Dutscher, Brumath	5066
Ultra precise tip forceps anti-magnetic stainless steel 9.5x 109.3 mm	Dutscher, Brumath	327005