Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

चूहों में मोटर टिक अभिव्यक्ति के तीव्र और पुरानी प्रयोगात्मक मॉडल पैदा करना

Published: May 27, 2021 doi: 10.3791/61743
Automatic Translation
*1, *1, 1
1The Leslie & Susan Goldschmied (Gonda) Multidisciplinary Brain Research Center, Bar-Ilan University
* These authors contributed equally

Summary

हम स्वतंत्र रूप से चूहों के व्यवहार में टिक अभिव्यक्ति के तीव्र और पुरानी प्रयोगात्मक मॉडल पैदा करने के लिए प्रोटोकॉल पेश करते हैं। मॉडल स्ट्राटाल कैनुला प्रत्यारोपण और बाद में गाबाएक विरोधी आवेदन पर आधारित हैं । तीव्र मॉडल क्षणिक इंजेक्शन का उपयोग करता है जबकि पुरानी मॉडल एक चमड़े के नीचे प्रत्यारोपित मिनी-ओस्मोटिक पंप के माध्यम से लंबे समय तक सुई का उपयोग करता है ।

Abstract

मोटर टिक्स अचानक, तेजी से, आवर्ती आंदोलन हैं जो टूरेट सिंड्रोम और अन्य टिक विकारों के प्रमुख लक्षण हैं। टिक पीढ़ी का रोगविज्ञान बेसल गैंगलिया, विशेष रूप से इसकी प्राथमिक इनपुट संरचना, स्ट्राटम के असामान्य अवरोध से जुड़ा हुआ है। कृंतक और गैर-मानव वानरों दोनों के पशु मॉडलों में, गाबा के स्थानीय अनुप्रयोगएक विरोधी, जैसे कि बाइक्यूलिन और पिरोटॉक्सिन, स्ट्राटम के मोटर भागों में स्थानीय विघटन को प्रेरित करता है जिसके परिणामस्वरूप मोटर टिक्स की अभिव्यक्ति होती है।

यहां, हम चूहों में मोटर टिक्स के तीव्र और पुराने मॉडल पेश करते हैं। तीव्र मॉडल में, पृष्ठीय स्ट्राटम में प्रत्यारोपित कैनुला के माध्यम से बाइक्यूक्लिन माइक्रोइंजेक्शन एक घंटे तक की कम समय अवधि के लिए स्थायी टिक्स की अभिव्यक्ति को प्रकाश में डालते हैं। क्रोनिक मॉडल एक विकल्प है जो कई दिनों या हफ्तों की अवधि के लिए टिक अभिव्यक्ति के विस्तार को सक्षम करता है, जो एक उप-क्यूटनीस मिनी-ऑस्मोटिक पंप के माध्यम से बाइक्यूलीलाइन के निरंतर अर्क का उपयोग करता है।

मॉडल कोर्टिको-बेसल गंगलिया मार्ग में टिक पीढ़ी के व्यवहार और तंत्रिका तंत्र के अध्ययन को सक्षम करते हैं। मॉडल इंजेक्शन कैनुलास के अलावा अतिरिक्त रिकॉर्डिंग और उत्तेजना उपकरणों के प्रत्यारोपण का समर्थन करते हैं, इस प्रकार विद्युत और ऑप्टिकल उत्तेजना और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग जैसे विभिन्न प्रकार के उपयोगों के लिए अनुमति देते हैं। प्रत्येक विधि के अलग-अलग फायदे और कमियां हैं: तीव्र मॉडल आंदोलन के काइनेटिक गुणों और इसी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल परिवर्तनों की तुलना करने से पहले, दौरान और बाद में टिक अभिव्यक्ति और टिक अभिव्यक्ति पर अल्पकालिक मॉड्यूलर के प्रभावों को सक्षम बनाता है। यह तीव्र मॉडल स्थापित करने के लिए सरल है; हालांकि, यह थोड़े समय तक सीमित है। पुरानी मॉडल, जबकि अधिक जटिल, लंबे समय तक टिक अभिव्यक्ति पर टिक गतिशीलता और व्यवहार प्रभावों का अध्ययन संभव बनाता है। इस प्रकार, अनुभवजन्य क्वेरी का प्रकार टिक अभिव्यक्ति के इन दो पूरक मॉडलों के बीच विकल्प को चलाता है।

Introduction

टिक्स टूरेट सिंड्रोम (टीएस) और अन्य टिक विकारों के निर्णायक लक्षण हैं। टिक्स को अचानक, तेजी से, आवर्ती आंदोलनों (मोटर टिक्स), या वोकलाइजेशन (वोकल टिक्स)1के रूप में वर्णित किया गया है। टिक अभिव्यक्ति आम तौर पर अपने लौकिक (आवृत्ति)2 और स्थानिक (तीव्रता, शरीर स्थान) में कई समय तराजू (घंटे, दिन, महीने और साल) पर3 गुणों में उतार चढ़ाव । ये परिवर्तन विभिन्न कारकों से प्रभावित होते हैं, जैसे पर्यावरणीय विशेषताएं4,5,व्यवहार राज्य6,7,और स्वैच्छिक और अस्थायी दमन8।

यद्यपि मोटर टिक्स को नियंत्रित करने वाला न्यूरोनल तंत्र अभी भी पूरी तरह से समझ में नहीं आता है, सैद्धांतिक और प्रयोगात्मक अध्ययनों की बढ़ती संख्या ने इसकी प्रकृति9के रूप में नए सबूत प्रदान किए हैं। वर्तमान में, टिक पीढ़ी के रोगविज्ञान में कोर्टिको-बेसल गैंगलिया (सीबीजी) लूप शामिल करने के लिए सोचा जाता है, और विशेष रूप से स्ट्राटम के असामान्य अवरोध, प्राथमिक बेसल गंगलिया इनपुट न्यूक्लियस10,11,12से जुड़ा हुआ है। कृंतक और वानरों में पिछले अध्ययनों से यह पता चला है कि स्ट्राटम को विभिन्न गाबाए विरोधी के स्थानीय अनुप्रयोग द्वारा डिजिबिट किया जा सकता है, जैसे कि बाइक्यूलिन और पिक्रोटॉक्सिन13,14,15,16, 17,18। यह औषधीय हस्तक्षेप इंजेक्शन के लिए कॉन्ट्रालेट्रल साइड में क्षणिक मोटर टिक अभिव्यक्ति की ओर जाता है, इस प्रकार चेहरे के साथ टिक विकारों का एक मजबूत तीव्र मॉडल स्थापित करता है और वैधता का निर्माण करता है। तीव्र मॉडल को प्रेरित करना सरल है औरटिक अभिव्यक्ति के दौरान और बाद में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और काइनेटिक रिकॉर्डिंग के साथ विद्युत और ऑप्टिकल उत्तेजना समवर्ती जैसे अल्पकालिक मॉड्यूलेशन के प्रभावों का अध्ययन करना संभव बनाता है। हालांकि, तीव्र मॉडल इंजेक्शन के बाद कम समय अवधि तक सीमित है। तीव्र मॉडल के आधार पर, हमने हाल ही में चूहों में टिक पीढ़ी के एक पुराने मॉडल का प्रस्ताव किया है जो एक चमड़े के नीचे प्रत्यारोपित मिनी-ऑस्मोटिक पंप19के माध्यम से स्ट्रेटम के लिए बाइक्यूुलिन के लंबे समय तक, निश्चित दर वाले जलसेक का उपयोग करता है। यह मॉडल टिक अभिव्यक्ति की अवधि को कई दिनों/सप्ताह तक बढ़ाता है । एक लंबी अवधि में बाइक्यूलिन की निरंतर रिहाई इस तरह के औषधीय उपचार और टिक अभिव्यक्ति पर व्यवहार राज्यों के रूप में कारकों की एक किस्म के प्रभाव की परीक्षा के लिए अनुमति देता है ।

यहां, हम चूहों में टिक अभिव्यक्ति के तीव्र और पुराने मॉडल पैदा करने के लिए प्रोटोकॉल पेश करते हैं। विशिष्ट शोध प्रश्न के एक समारोह के रूप में, प्रोटोकॉल एकतरफा बनाम द्विपक्षीय प्रत्यारोपण, टिक्स की साइट (स्ट्राटम के सोमाटोटोपिक संगठन के अनुसार)18 और प्रत्यारोपण-कैनुला (अतिरिक्त प्रत्यारोपित उपकरणों के स्थान के आधार पर) के कोण सहित मापदंडों की ठीक ट्यूनिंग को सक्षम करते हैं। पुरानी मॉडल में उपयोग की जाने वाली विधि आंशिक रूप से वाणिज्यिक उत्पादों पर आधारित है, लेकिन टिक मॉडल को फिट करने के लिए महत्वपूर्ण समायोजन के साथ। यह लेख इन टिक मॉडलों को कस्टम करने के लिए आवश्यक समायोजन का विवरण देता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी प्रक्रियाओं को संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित और पर्यवेक्षण किया गया था और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थानों और अनुसंधान में प्रयोगशाला जानवरों के उपयोग और देखभाल के लिए बार-Ilan विश्वविद्यालय के दिशा-निर्देशों का पालन किया गया था । इस प्रोटोकॉल को स्वास्थ्य मंत्रालय में प्रयोगशाला पशुओं में प्रयोगों के लिए राष्ट्रीय समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

नोट: यह प्रोटोकॉल महिला लांग-इवांस चूहों (तीव्र और पुराने मॉडल) और मादा स्प्राग डावले चूहों (तीव्र मॉडल) 3-10 महीने, 280-350 ग्राम आयु वर्ग का उपयोग करता है। अन्य उपभेदों, वजन या उम्र में इन मॉडलों के कार्यान्वयन को विभिन्न प्रतिक्रिया के लिए ध्यान से परीक्षण किया जाना चाहिए।

1. तीव्र मॉडल

  1. प्री-सर्जरी की तैयारी
    1. इंप्लांट-कैनुला तैयारी
      नोट: प्रत्यारोपण-cannula striatum में स्थानीय bicuculline इंजेक्शन सक्षम बनाता है ।
      1. एक स्टेनलेस स्टील, 25 जी (OD 0.02',, ID 0.015')) हाइपो-ट्यूब को एक प्रत्यारोपण-कैनुला(चित्रा 1,डिवाइस #1) प्राप्त करने के लिए काटें। सीधे किनारों को प्राप्त करने के लिए एक रोटरी उपकरण का उपयोग करें। कैनुला की लंबाई प्रत्यारोपण लक्ष्य गहराई, कैनुला प्रत्यारोपण के कोण, और अंतिम सीमेंटेड कैप ऊंचाई पर निर्भर करती है। ऊतक क्षति को रोकने के लिए अंतिम इंजेक्शन लक्ष्य से 2 मिमी (0.079') अधिक प्रत्यारोपण लक्ष्य गहराई की आवश्यकता होती है।
        नोट: प्रत्यारोपित उच्चतम वस्तु टोपी ऊंचाई निर्धारित करता है ।
      2. रेत और प्रत्यारोपण-cannula किनारों चिकनी, मस्तिष्क के लिए अतिरिक्त मैकेनिक घर्षण को रोकने । किसी भी आंतरिक अवरोधों को दूर करने के लिए इसके माध्यम से 30 ग्राम (0.01') सुई डालें।
    2. डमी तैयारी
      नोट: डमी प्रत्यारोपित कैनुला के अंदर रखा एक हटाने योग्य आंतरिक तार है। डमी प्रत्यारोपित कैनुला को सील करता है, इस प्रकार इसकी बाधा को रोकता है।
      1. एक रोटरी उपकरण के साथ एक 0.013'तार काटकर एक डमी बनाओ। डमी 3 मिमी (0.118') प्रत्यारोपण-कैनुला लंबाई(चित्रा 1,डिवाइस #2) से अधिक होनी चाहिए।
      2. डमी को इंप्लांट-कैनुला में तब तक डालें जब तक कि वह अंत तक न पहुंच जाए। अतिरिक्त तार को कैनुला के खिलाफ चुटकी बजाकर मोड़ें। डमी को प्रत्यारोपित कैनुला से बाहर गिरने से रोकने के लिए और चूहे को हटाने से रोकने के लिए डमी को प्रत्यारोपित-कैनुला के साथ फ्लश किया जाना चाहिए।
    3. इंजेक्टर तैयारी
      नोट: इंजेक्टर, एक लचीली ट्यूब और एक इंजेक्शन-कैनुला(चित्रा 1,डिवाइस #3) से बना है, जो स्ट्रेटम में प्रत्यक्ष बाइक्यूललाइन इंजेक्शन को सक्षम बनाता है।
      1. एक 70 सेमी (27.559')) लचीला बहुलक माइक्रोबोर ट्यूब (ओडी 0.06', आईडी 0.02')(चित्रा 1,डिवाइस #3.1)।
        नोट: लचीला ट्यूब की लंबाई प्रयोगात्मक पिंजरे और जलसेक पंप मशीन स्थान के बीच की दूरी से परिभाषित किया गया है । इंजेक्शन अवधि के दौरान चूहे की मुक्त आवाजाही को सक्षम करने के लिए यह काफी लंबा होना चाहिए, लेकिन बहुत लंबा नहीं, चूहे से बचने के लिए इसमें उलझ रहा है (चित्रा 3Aदेखें)।
      2. इंजेक्शन-कैनुला(चित्रा1, डिवाइस #3.2) प्राप्त करने के लिए एक स्टेनलेस स्टील, 30 ग्राम (ओडी 0.012', आईडी 0.007') हाइपो-ट्यूब काटें। सीधे किनारों को प्राप्त करने के लिए एक रोटरी उपकरण का उपयोग करें। यह 5 मिमी (0.197') प्रत्यारोपण-कैनुला से अधिक लंबा उपाय करना चाहिए: 2 मिमी (0.079') मस्तिष्क के भीतर प्रत्यारोपित कैनुला से अधिक समय तक अंतिम इंजेक्शन लक्ष्य तक पहुंचने के लिए, और 3 मिमी (0.118') इसे लचीला ट्यूब में डालने के लिए।
      3. रेत और इंजेक्शन-कैनुला की नोक चिकनी, मस्तिष्क के लिए अतिरिक्त मैकेनिक घर्षण को रोकने। यह सत्यापित करने के लिए 0.005'व्यास को मापने वाला तार डालें कि यह अबाधित है।
      4. एक इंजेक्टर प्राप्त करने के लिए, लचीली ट्यूब में इंजेक्शन-कैनुला के 3 मिमी (0.118') डालें और उनके बीच संयुक्त गोंद करें। साइनोएक्रिलेट (सीए) गोंद और सीए एक्सीलेटर का प्रयोग करें।
      5. इंजेक्टर को बाँझ पानी से भरा 25 जी सुई (0.018') के साथ एक सिरिंज संलग्न करें और इसे धो लें। यह सुनिश्चित करता है कि इंजेक्शन-कैनुला से बाहर आने वाला प्रवाह अभिविन्यास सीधे और सरल है। महत्वपूर्ण रूप से, यदि प्रवाह सीधा नहीं है, तो किसी भी अवरोध को दूर करने और इंजेक्शन-कैनुला छेद को बढ़ाने और प्रवाह को फिर से सत्यापित करने के लिए 30 जी (ओडी 0.01') सुई की नोक का उपयोग करें।
    4. कैनुला धारक तैयारी
      नोट: कैनुला धारक स्टीरियोटैक्सिक आर्म से जुड़ा हुआ है और प्रत्यारोपण के दौरान प्रत्यारोपण कैनुला रखता है। कैनुला-धारक में कैनुला-होल्डर बेस और कैनुला-होल्डर लीड होते हैं, जो एक साथ चिपके होते हैं(चित्रा 1,डिवाइस #4)। प्रत्यारोपण के दौरान, कैनुला-धारक आधार स्टीरियोटैक्सिक आर्म से जुड़ा होता है, और कैनुला-धारक लीड प्रत्यारोपण-कैनुला से जुड़ा होता है।
      1. कैनुला-धारक आधार: स्टेनलेस स्टील के 10 सेमी (3.947'), 22 जी (ओडी 0.028', आईडी 0.017') हाइपो-ट्यूब(चित्रा 1,डिवाइस #4.1)।
      2. कैनुला-धारक लीड: वांछित प्रत्यारोपण-कैनुला(चित्रा1, डिवाइस #4.2) की तुलना में 3 मिमी (0.118') की लंबाई तक 0.013'तार काटें।) ।
      3. कैनुला-होल्डर लीड को कैनुला-होल्डर बेस में डालें और सीए गोंद और सीए एक्सीलेटर का उपयोग करके उनके बीच संयुक्त गोंद करें। प्रत्यारोपण के दौरान ऊतक क्षति से बचने के लिए, प्रत्यारोपण-कैनुला की तुलना में सीसा 1 मिमी (0.039') छोटा होना चाहिए।
    5. बिक्यूकुलिन तैयारी: शारीरिक नमकीन या कृत्रिम सेरेब्रोस्पाइनल द्रव (एसीएसएफ) में 1 माइक्रोग्राम/माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता के लिए बाइक्यूकुलिन मेथिओडाइड को भंग करें। भंग बाइक्यूलीलाइन को 1 मिली सीरिंज में विभाजित करें, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करें, और जरूरत पड़ने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें। जब आवश्यक हो, तो उपयोग से पहले सिरिंज को गल जाएं।
  2. शल्यचिकित्सा
    1. चूहे को एक डिजाइन किए गए कक्ष में रखकर प्रारंभिक संज्ञाहरण को प्रेरित करें और 0.5-1 एल/मिनट की दर से ऑक्सीजन के साथ मिश्रित 4-5% आइसोफ्लुनाणे वितरित करें। फिर, केटामाइन और जाइलाज़ीन (क्रमशः 100 और 10 मिलीग्राम/किलो) मिश्रण के साथ चूहे इंट्रामस्क्युलर (आईएम या आईपी) इंजेक्ट करें।
    2. एक इलेक्ट्रिक क्लिपर का उपयोग करके चूहे के सिर को शेव करें।
    3. चूहे के कानों में लिडोकेन जेल डालें। कॉर्नियल सुखाने और आघात को रोकने के लिए चूहे की आंखों पर पेट्रोलियम जेली रखो।
    4. कान की सलाखों और टूथबार का उपयोग करके स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम में चूहे को सुरक्षित करें।
    5. पोविडोन आयोडीन के साथ चूहे की खोपड़ी को झाड़ू और फिर शराब के साथ क्षेत्र को निष्फल करने के लिए पोंछें। 0.5 - 1% लिडोकेन समाधान के साथ वांछित चीरा रेखा के साथ घुसपैठ करें(एससी)। एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करना, खोपड़ी के साथ एक चीरा बनाएं।
    6. सर्जिकल क्षेत्र को खोलने के लिए किनारों की ओर प्रावरणी खींचें।
    7. कपास झाड़ू का उपयोग करके, बाँझ नमकीन के साथ खोपड़ी को साफ करें। रक्तस्राव के मामले में, रक्त केशिका को कोटराइज करने के लिए कॉटराइजर का उपयोग करें। यह कदम समय के साथ कैप स्थिरता के लिए महत्वपूर्ण है ।
    8. सर्जिकल साइट को बड़ा करने के लिए चार घुमावदार हीमोस्टैट्स (दो पूर्वकाल, दो पीछे) के साथ प्रावरणी को क्लैंप करें।
    9. ब्रेग्मा और लैम्ब्डा निर्देशांक को मापें। दो बिंदुओं के डॉर्सोवेंट्रल (डीवी) को स्तर दें, ताकि वे 100 माइक्रोन की सीमा के भीतर हों।
    10. स्टीरियोटैक्सिक उपकरण का उपयोग करके, ब्याज के क्षेत्रों के निर्देशांक को मापने और चिह्नित करें और लंगर शिकंजा प्रत्यारोपित किया जाना है। अग्रभाग क्षेत्र में टिक इंडक्शन के लिए सीधे प्रत्यारोपण कैनुला निर्देशांक हैं: एपी: +1 से +1.5, एमएल: ±2.5, डीवी: 3; हिंडलिम्ब क्षेत्र: एपी: -0.4 से -0.5, एमएल: ±3.5, डीवी:318,20।
      नोट: कई उपकरणों के प्रत्यारोपण के मामले में जो कैनुला को सीधे प्रत्यारोपित करने से रोकते हैं, कैनुला प्रत्यारोपण के कोण को बदलते हैं और इसके निर्देशांक तदनुसार (अग्रेलि निर्देशांक: एपी: +2.7, एमएल: ±2.5, डीवी: 3, पूर्वकाल से पीछे तक 15 डिग्री) ।
    11. माइक्रोस्कोप के नीचे खोपड़ी में छेद ड्रिल करें। 1/4-1/2 बिट साइज कार्बाइड राउंड बर्स के साथ डेंटल ड्रिल मशीन का इस्तेमाल करें । मस्तिष्क की चोट के जोखिम को कम करने के लिए, ड्रिलिंग कौशल के अनुसार ड्रिल गति को समायोजित करें और किसी भी मैकेनिक दबाव से बचें। लगभग 1 मिमी के लिए, मस्तिष्क दिखाई देने तक ड्रिल करें। किसी भी रक्त को सूती झाड़ू के साथ अवशोषित करें और बाँझ नमकीन से धोएं।
      नोट: लंगर शिकंजा टोपी को स्थिर करने के लिए सेवा करते हैं । सुनिश्चित करें कि शिकंजा दोनों गोलार्द्धों में और पूर्वकाल-पीछे धुरी के साथ स्थित हैं।
    12. कैनुला प्रत्यारोपण
      1. छेद में लंगर शिकंजा पेंच। स्टेनलेस स्टील #0 x 1/8 आकार शिकंजा का प्रयोग करें।
        नोट: लंगर शिकंजा की संख्या प्रत्यारोपित उपकरणों की कुल संख्या पर निर्भर करता है । जमीन शिकंजा (जैसे बिजली की रिकॉर्डिंग या विद्युत उत्तेजना के लिए) मस्तिष्क की सतह तक पहुंचना चाहिए।
      2. कैनुला धारक को स्टीरियोटैक्सिक आर्म में अटैच करें।
      3. प्रत्यारोपण-कैनुला-कैनुला-धारक पर स्लाइड करें। धीरे-धीरे प्रत्यारोपण-कैनुला को छेद के ऊपर तब तक रखें जब तक कि यह मस्तिष्क तक न पहुंच जाए।
      4. मस्तिष्क की सतह से शुरू डीवी निर्देशांक को मापें। प्रत्यारोपण लक्ष्य तक प्रत्यारोपण-कैनुला कम करें। छेद से बाहर आने वाले किसी भी रक्त को सूती झाड़ू के साथ अवशोषित करें, बाँझ नमकीन से धोएं और फिर अच्छी तरह से सूख जाएं।
      5. जेल गोंद का उपयोग कर खोपड़ी के लिए प्रत्यारोपित कैनुला गोंद। सूखने तक इंतजार करें।
      6. इसे खोपड़ी से संलग्न करने के लिए प्रत्यारोपित कैनुला के साथ दंत सीमेंट लागू करें। डमी प्रविष्टि को सक्षम करने के लिए 2 मिमी (0.079') अपने ऊपरी छोर से विस्तार करें। सूखने तक इंतजार करें।
        नोट: कैनुला धारक पर सीमेंट न डालें।
      7. कैनुला धारक को उठाएं, जिससे प्रत्यारोपित कैनुला को जगह में छोड़ दिया जाए।
      8. प्रत्यारोपित कैनुला में डमी डालें।
      9. अन्य सभी उपकरणों जैसे रिकॉर्डिंग सरणी, ऑप्टिक फाइबर, उत्तेजना इलेक्ट्रोड आदि को प्रत्यारोपित करें। खोपड़ी के बाकी हिस्सों पर दंत सीमेंट लागू करें, सभी प्रत्यारोपण को कवर।
      10. कमरे के तापमान रिंगर के समाधान और कारप्रोफेन 5 मिलीग्राम/किलो अनुसूचित जाति21के 3 एमएल इंजेक्ट ।
      11. चूहे की निगरानी तब तक करें जब तक कि यह चेतना को फिर से न आ जाए (जानवर सीधा है, इसके वायुमार्ग पर नियंत्रण है और आकांक्षा के खतरे में नहीं है)। पूरी वसूली के लिए चूहे को अपने घर पिंजरे में लौटा दें।
  3. माइक्रोइंजेक्शन
    नोट: इंजेक्शन के दौरान, यह सत्यापित करना महत्वपूर्ण है कि बाइक्यूलिन का प्रवाह बरकरार है। यह इंजेक्टर में एक छोटे से हवा बुलबुला फार्म दे और उसके आंदोलन की निगरानी के द्वारा किया जा सकता है। इंजेक्टर की शेष मात्रा नमकीन से भरी जा सकती है, ताकि कोई बाइक्यूलिन बर्बाद न हो।
    1. इंजेक्टर को 25 जी सुई (ओडी 0.018') के साथ एक बाइक्यूलीलाइन सिरिंज से अटैच करें। इंजेक्टर के ~ 1/3-1/2 भरें और सिरिंज को हटा दें, जिससे एक छोटे से हवा के बुलबुले के गठन की अनुमति मिल जाए।
    2. इंजेक्टर को 25 जी सुई (ओडी 0.018') के साथ बाँझ नमकीन से भरी सिरिंज से अटैच करें। इंजेक्टर को तब तक भरें जब तक कि बाइकक्यूलाइन अंत तक न पहुंच जाए और उसमें से एक छोटी सी बूंद निकल जाए।
    3. एक 10 μL सटीक ग्लास माइक्रोसिंरिंग के प्लंजर निकालें।
    4. सटीक ग्लास माइक्रोसिरिंग के लिए एक छोटी-लचीली बहुलक ट्यूब (~ 3 सेमी, 1.181') को काटें और संलग्न करें।
    5. छोटी-लचीली ट्यूब के दूसरे छोर को 1 एमएल सिरिंज, 25 जी सुई (ओडी 0.018') बाँझ पानी से भरा करने के लिए कनेक्ट करें।
    6. लघु-लचीली ट्यूब के माध्यम से पानी को सटीक ग्लास माइक्रोसिरिंग में इंजेक्ट करें जब तक कि पानी इससे बाहर न आ जाए। छोटी-लचीली ट्यूब को डिस्कनेक्ट करें।
    7. प्लंजर को तब तक फिर से लागू करें जब तक कि यह सटीक ग्लास माइक्रोसिरिंग पर ~ 7 माइक्रोल मार्क तक न पहुंच जाए।
    8. जलसेक पंप मशीन में किस्मत वाले स्लॉट में सटीक ग्लास माइक्रोसिरिंग डालें।
    9. सटीक ग्लास माइक्रोसिरिंग के लिए इंजेक्टर संलग्न करें और 0.35 μL/मिनट की दर और 0.35 माइक्रोन की कुल मात्रा के लिए सेटिंग्स कॉन्फ़िगर करें।
    10. इंजेक्टर टिप के नीचे एक पेपर वाइप रखो। इंजेक्टर पर हवा बुलबुला स्थान चिह्नित करें, जलसेक पंप मशीन शुरू करें और सत्यापित करें कि एक बाइक्यूलाइन ड्रॉप दिखाई देता है। इंजेक्शन के बाद, हवा बुलबुला स्थान फिर से चिह्नित करें।
      नोट: दोनों अंकों के बीच का अंतर प्रायोगिक इंजेक्शन के दौरान वांछित अंतर से मेल खाता है।
    11. प्रयोगात्मक पिंजरे में चूहा रखो और डमी को हटा दें।
    12. अंत के माध्यम से प्रत्यारोपित कैनुला में इंजेक्टर डालें (चित्रा 3Aदेखें)।
    13. जलसेक पंप मशीन शुरू करें। सत्यापित करें कि हवा का बुलबुला बढ़ रहा है। टिक दीक्षा और समाप्ति के समय का ट्रैक रखने के लिए स्टॉपवॉच शुरू करें।
    14. इंजेक्शन के बाद एक मिनट, इंजेक्टर को हटा दें और धीरे-धीरे डमी को फिर से लागू करें।
      नोट: इंजेक्शन के बाद डमी डालने इंजेक्शन लक्ष्य में bicuculline धक्का ।
  4. पोस्ट इंजेक्शन
    1. इंजेक्शन को सटीक ग्लास माइक्रोसिरिंग से डिस्कनेक्ट करें।
    2. हवा से भरी सिरिंज का उपयोग करके, इंजेक्टर से शेष समाधान धोएं। इंजेक्टर को बाँझ पानी से साफ करें और फिर इंजेक्टर के माध्यम से हवा का इंजेक्शन लगाकर इसे छान लें।
    3. इन्फ्यूजन पंप मशीन से सटीक ग्लास माइक्रोसिरिंग को डिस्कनेक्ट करें और इसे बाँझ पानी से साफ करें।

2. क्रोनिक मॉडल

  1. प्री-सर्जरी की तैयारी
    1. कैनुला-गाइड तैयारी
      नोट: कैनुला-गाइड जलसेक-ट्यूब का हिस्सा है और प्रत्यारोपण के दौरान कैनुला-धारक को जलसेक-कैनुला संलग्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
      1. स्टेनलेस स्टील के 12 मिमी (0.472'), 25 जी (ओडी 0.02', आईडी 0.015') हाइपो-ट्यूब को कैनुला-गाइड(चित्रा 2,डिवाइस #1) प्राप्त करने के लिए काटें। सीधे किनारों को प्राप्त करने के लिए एक रोटरी उपकरण का उपयोग करें।
      2. चरण 1.1.4 में वर्णित कैनुला-धारक तैयार करें। कैनुला-धारक को कैनुला-गाइड में डालें ताकि यह सत्यापित किया जा सके कि यह ठीक से जुड़ा हुआ है और इसे हटा दें।
    2. जलसेक-कैनुला तैयारी
      नोट: जलसेक-कैनुला भी जलसेक ट्यूब का एक हिस्सा है। यह स्ट्राटम के अंतिम लक्ष्य में प्रत्यारोपित किया जाता है और बाइक्यूलिन के फोकल जलसेक की अनुमति देता है।
      1. एक जलसेक-कैनुला प्राप्त करने के लिए स्टेनलेस स्टील, 30 ग्राम (ओडी 0.012', आईडी 0.007') हाइपो-ट्यूब को काटें। सीधे किनारों को प्राप्त करने के लिए एक रोटरी उपकरण का उपयोग करें। कुल जलसेक-कैनुला लंबाई वांछित प्रत्यारोपण गहराई के साथ-साथ एक सुरक्षा कारक (~ 1-2 मिमी, का योग है 0.039'-0.079'), जलसेक-कैनुला तुला हिस्सा (2 मिमी, 0.079'),कैनुला-गाइड (3 मिमी, 0.118''), और क्षैतिज भाग (4 मिमी, 0.157'))(चित्रा 2,डिवाइस#2)।
        नोट: तीव्र मॉडल के विपरीत, प्रत्यारोपण गहराई अंतिम जलसेक लक्ष्य के बराबर है ।
      2. जलसेक-कैनुला में 0.005'व्यास तार डालें और उन्हें इच्छित स्थान में एल आकार में मोड़ें। ऊर्ध्वाधर भाग वांछित प्रत्यारोपण गहराई से अधिक 4-5 मिमी (0.157'-0.197')) से मेल खाता है, और क्षैतिज हिस्सा 4 मिमी (0.157') लंबा है।
        नोट: आंतरिक तार का सम्मिलन झुकने के दौरान कैनुला की बाधा को रोकता है।
    3. लचीला कैथेटर-ट्यूबिंग तैयारी
      नोट: यह जलसेक-ट्यूब का एक घटक भी है। यह एक टयूबिंग-एडाप्टर के माध्यम से मिनी-ऑस्मोटिक पंप के लिए जलसेक-कैनुला को जोड़ता है।
      1. पॉलीथीन (पीई) के 8 सेमी (3.149') कट (10 ट्यूबिंग (आईडी 0.011', OD 0.025')(चित्रा 2,डिवाइस #3)।
        नोट: कैथेटर की लंबाई प्रत्यारोपण लक्ष्य और पंप स्थान के बीच की दूरी से निर्धारित होती है, जिससे चूहे के सिर और गर्दन की मुक्त आवाजाही की अनुमति होती है (चित्रा 3 बीदेखें)।
    4. जलसेक-ट्यूब की विधानसभा
      नोट: जलसेक-ट्यूब मस्तिष्क के लिए मिनी ऑस्मोटिक पंप से bicuculline आयोजित करता है । इसमें कैनुला-गाइड, इन्फ्यूजन-कैनुला, फ्लेक्सिबल कैथेटर-टयूबिंग, ट्यूबिंग-एडाप्टर और फ्लो-मॉडरेटर(चित्रा 2)शामिल हैं।
      1. जलसेक-कैनुला से भीतरी तार निकालें। माइक्रोस्कोप के नीचे कैनुला का निरीक्षण करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि इसके किनारे दोनों तरफ खुले और साफ हैं; यदि नहीं, तो इसे खोलने के लिए 30 जी (ओडी 0.01') सुई का उपयोग करें।
      2. सीए गोंद और सीए एक्सीलेटर का उपयोग करके, 3 मिमी (0.118') ओवरलैप पर, तुला भाग के पास, जलसेक-कैनुला के ऊर्ध्वाधर खंड में कैनुला-गाइड गोंद करें।
      3. लचीला कैथेटर-टयूबिंग में जलसेक-कैनुला के क्षैतिज भाग डालें। ओवरलैप कम से कम 2 मिमी (0.079')।
      4. पंप प्रवाह-मॉडरेटर की पारदर्शी टोपी को बाहर निकालें। इससे शॉर्ट स्टेनलेस स्टील कैनुला ट्यूब(चित्रा 2,डिवाइस #5.1) का पता चल जाएगा।
        नोट: प्रवाह मॉडरेटर मिनी ऑस्मोटिक पंप किट का एक हिस्सा है । यह एक पारदर्शी टोपी, एक छोटा कैनुला-भाग, एक सफेद फ्लैंज और एक लंबा कैनुला-भाग से बना है। लंबे कैनुला-भाग को मिनी-ऑस्मोटिक पंप में डाला जाता है और छोटा कैनुला-भाग टयूबिंग-एडाप्टर के माध्यम से कैथेटर-ट्यूबिंग से जुड़ा होता है।
      5. 70% अल्कोहल में ट्यूबिंग-एडाप्टर(चित्रा 2,डिवाइस #4) विसर्जित करें। सामग्री को प्रफुल्लित करने की अनुमति देने के लिए कई मिनट प्रतीक्षा करें।
      6. प्रवाह-मॉडरेटर के छोटे कैनुला-भाग के लिए ट्यूबिंग-एडाप्टर संलग्न करें, जब तक कि यह सफेद फ्लैंज(चित्रा 2,डिवाइस #5.2) को छू न जाए। ट्यूबिंग-एडाप्टर एक तंग सील कनेक्शन बनाने के लिए हवा में सिकुड़ जाएगा।
      7. टयूबिंग-एडाप्टर के खुले छोर में लचीला कैथेटर-टयूबिंग डालें, जब तक कि यह प्रवाह-मॉडरेटर के छोटे कैनुला-भाग को छू न जाए।
      8. एक क्लिप स्टैंड का उपयोग करके और सभी कनेक्शनों को गोंद करते हुए लंबे कैनुला-भाग(चित्रा 2,डिवाइस #5.3) को पकड़ें। कनेक्शन टयूबिंग-एडाप्टर और सफेद फ्लैंज, ट्यूबिंग-एडाप्टर और फ्लेक्सिबल कैथेटर-ट्यूबिंग के बीच हैं, और अंत में लचीला कैथेटर-ट्यूबिंग और जलसेक-कैनुला के क्षैतिज हिस्से के बीच हैं। गोंद पूरी तरह से सूखी है जब तक कई घंटे रुको (गोंद प्रकार के आधार पर) ।
        नोट: कनेक्शन को ढीला आने से रोकने के लिए पीई संगत चिपकने वाला का उपयोग करें।
      9. जलसेक ट्यूब के लंबे कैनुला-भाग के माध्यम से बाँझ पानी इंजेक्ट करें, 27 जी (0.014') कुंद सुई के साथ एक सिरिंज का उपयोग करके। सत्यापित करें कि जलसेक-कैनुला के माध्यम से पानी सुचारू रूप से बहता है। पानी को छानने के लिए जलसेक-ट्यूब के माध्यम से हवा इंजेक्ट करें।
    5. मिनी ऑस्मोटिक पंप का भड़काना
      नोट: भड़काना एक स्टार्ट-अप प्रक्रिया है जो पंप को प्रत्यारोपण के तुरंत बाद जलसेक शुरू करने में सक्षम बनाती है।
      1. शरीर के तापमान (~ 37 डिग्री सेल्सियस) पर पानी के साथ एक हीटिंग बाथ भरें। बाँझ खारा के साथ एक छोटी सी बीकर भरें और इसे हीटिंग बाथ में रखें।
      2. एक कागज पोंछ के साथ मिनी ओस्मोटिक पंप लपेटें, और यह ऊपर की ओर का सामना करना पड़ खोलने के साथ खड़ी ठीक, एक क्लिप धारक खड़े का उपयोग कर ।
      3. एक 27 जी (0.014') कुंद सुई के साथ एक सिरिंज का उपयोग कर ACSF के साथ पंप भरें । सिरिंज निकालते समय, हवा को प्रवेश करने से रोकने के लिए एसीएसएफ इंजेक्ट करते रहें। पंप के एपर्चर में एक ACSF बुलबुला दिखाई देगा।
        नोट: प्रारंभिक ACSF जलसेक चूहे को सर्जरी से पूरी तरह से उबरने से पहले tics प्रेरित कर रहे है सक्षम बनाता है । वैकल्पिक रूप से, निम्नलिखित पंप प्रतिस्थापन से बचने के लिए प्राथमिक सर्जरी के दौरान बाइक्यूलिन से भरे पंप को प्रत्यारोपित किया जा सकता है, लेकिन यह इष्टतम19नहीं है।
      4. एक सिरिंज, 27 जी (0.014') जलसेक-ट्यूब के लंबे कैनुला-भाग के लिए कुंद सुई देते हैं और इसके माध्यम से ACSF इंजेक्ट करते हैं। सिरिंज को हटाते समय, हवा को प्रवेश करने से रोकने के लिए, ACSF इंजेक्ट करते रहें। एक ACSF बुलबुला लंबे कैनुला-भाग में दिखाई देगा।
      5. पंप में लंबे कैनुला-भाग डालें, बुलबुला बुलबुला करने के लिए। एक ACSF बुलबुला जलसेक-कैनुला की नोक पर दिखाई देना चाहिए।
      6. पंप को बीकर में रखें। पंप प्रत्यारोपण से पहले कम से कम 4-6 घंटे (~ 37 डिग्री सेल्सियस पर) के लिए, जलसेक-ट्यूब से जुड़े पंप को प्राइम करें। सुनिश्चित करें कि केवल पंप नमकीन संपर्क करता है।
    6. पंप प्रत्यारोपण सर्जरी
      1. एनेस्थीसिया प्रोटोकॉल के अनुसार चूहे को एनेस्थेटाइज करें। चरण 1.2.1 देखें।
      2. एक इलेक्ट्रिक क्लिपर का उपयोग करके, चूहे के सिर और पीठ को शेव करें, स्कैपुले के थोड़ा पीछे।
      3. सर्जरी में बुनियादी चरणों का प्रदर्शन करें, जैसा कि चरण 1.2.3-1.2.11 में वर्णित है। चीरा खोपड़ी के साथ ऑक्सीपिटल हड्डी तक होना चाहिए।
      4. ऑटोक्लेव में एक बड़े हीमोस्टेट (~ 14 सेमी लंबा, 5.512') को स्टरलाइज करें। चीरा के माध्यम से हीमोस्टेट डालें और बारी-बारी से खोलने और मिडस्केपर लाइन के माध्यम से त्वचा के नीचे बंद करके चूहे की पीठ में एक चमड़े के नीचे की जेब बनाएं।
        नोट: जेब काफी बड़ी पंप को नियंत्रित करने के लिए और यह थोड़ा स्थानांतरित करने के लिए अनुमति होनी चाहिए ।
    7. मिनी ऑस्मोटिक पंप और जलसेक ट्यूब प्रत्यारोपण
      1. कैनुला धारक को स्टीरियोटैक्सिक आर्म में संलग्न करें और इसे प्रत्यारोपण के लिए वांछित स्थिति में रखें।
      2. हीटिंग बाथ से पंप निकालें और इसे पेपर वाइप से ढके चूहे की पीठ पर रखें।
      3. कैनुला-धारक पर जलसेक-ट्यूब के कैनुला-गाइड स्लाइड करें।
      4. पंप को एक हीमोस्टेट के साथ पकड़ें और धीरे-धीरे इसे चमड़े के नीचे की जेब में डालें।
      5. लंगर शिकंजा प्रत्यारोपण।
        नोट: पंप डालने के बाद लंगर शिकंजा प्रत्यारोपण, जेब खोलने की रुकावट से बचने के लिए, और कैनुला प्रत्यारोपण से पहले cannula विस्थापन से बचने के लिए ।
      6. लक्ष्य में जलसेक-कैनुला को प्रत्यारोपित करें और इसे जेल गोंद का उपयोग करके खोपड़ी में गोंद करें। सूखने तक इंतजार करें। अग्रभाग टिक प्रेरण के लिए निर्देशांक हैं: एपी: +1 से +1.5, एमएल: ±2.5, डीवी: 5।
      7. खोपड़ी को ठीक करने के लिए जलसेक-कैनुला के साथ दंत सीमेंट लागू करें। सूखने तक इंतजार करें।
      8. कैनुला धारक जगह में प्रत्यारोपित कैनुला छोड़ लिफ्ट ।
      9. अन्य सभी उपकरणों को प्रत्यारोपित करें। खोपड़ी के बाकी हिस्सों पर दंत सीमेंट लागू करें, सभी प्रत्यारोपण को कवर। चूहे की मुक्त आवाजाही को सक्षम करने के लिए चमड़े के नीचे की जेब में पर्याप्त लचीला कैथेटर-टयूबिंग छोड़ दें।
        नोट: सुनिश्चित करें कि खोपड़ी और जेब खोलने के बीच कोई उजागर क्षेत्र नहीं हैं, और कैथेटर तुला नहीं है।
      10. चरण 1.2.12.10-1.2.12.11 में विस्तृत सर्जरी को अंतिम रूप दें।
  2. पंप रिप्लेसमेंट सर्जरी
    नोट: प्रत्येक मिनी ऑस्मोटिक पंप प्रकार की अपनी पूर्व निर्धारित डिलीवरी जलसेक अवधि होती है। इसलिए, पंप प्रतिस्थापन सर्जरी समाप्ति की तारीख से पहले किया जाना चाहिए।
    1. प्री-सर्जरी की तैयारी
      1. कदम दोहराएं 2.1.5.1-2.1.5.2.
      2. एक 27 जी (0.014') कुंद सुई के साथ एक सिरिंज का उपयोग कर bicuculline के साथ पंप भरें । सिरिंज को हटाते समय, हवा को प्रवेश करने से रोकने के लिए, बाइकक्यूलाइन इंजेक्ट करते रहें।
      3. पंप के अंदर प्रवाह-मॉडरेटर (इसकी पारदर्शी टोपी से जुड़ा) डालें।
      4. पंप को बीकर में रखें। पंप प्रतिस्थापन से पहले कम से कम 4-6 घंटे (~ 37 डिग्री सेल्सियस पर) के लिए पंप को प्राइम करें।
    2. शल्यचिकित्सा
      1. चूहे को एनेस्थेटाइज करें (चरण 1.2.1.1 देखें) और एक इलेक्ट्रिक क्लिपर का उपयोग करके अपनी पीठ शेव करें।
      2. पोविडोन आयोडीन के साथ चूहे की पीठ झाड़ू और फिर एक शराब पोंछ के साथ क्षेत्र बंध्याकरण करने के लिए। 0.5-1% लिडोकेन समाधान (एससी) के साथ वांछित चीरा रेखा के साथ घुसपैठ करें।
      3. प्रत्यारोपित पंप के ऊपर त्वचा पर एक चीरा बनाओ। कमरे के तापमान ACSF के साथ जेब धोएं और धुंध पैड के साथ सूखी। चीरा के पास के क्षेत्र को कवर करने के लिए ऑटोक्लेव डिस्पोजेबल पर्दे का उपयोग करें।
      4. एक हीमोस्टेट का उपयोग कर प्रवाह-मॉडरेटर से ACSF से भरे पंप को अलग करें और त्यागें।
      5. हीटिंग बाथ से बाइक्यूलाइन से भरे पंप को हटा दें। अलग और प्रवाह-मॉडरेटर को बाइक्यूललाइन से भरे पंप से त्यागें।
      6. धीरे-धीरे प्रत्यारोपित प्रवाह-मॉडरेटर के लिए bicuculline से भरे पंप देते हैं। आसपास की त्वचा को छूने से बचें।
        नोट: हवा के बुलबुले को रोकने के लिए चरण 2.2.2.4-2.2.2.6 जल्दी से किया जाना चाहिए। हालांकि, पंप को धीरे-धीरे डाला जाना चाहिए ताकि मस्तिष्क में बाइक्यूलिन के तेजी से प्रवेश को रोका जा सके।
      7. चीरा के दो मार्जिन को एक साथ बारीकी से दबाएं, संदंश का उपयोग करें। एक ऊतक चिपकने वाला के साथ चीरा रेखा गोंद। एक विकल्प के रूप में, टांके का उपयोग कर चीरा बंद करो।
      8. पोविडोन आयोडीन के साथ क्षेत्र झाड़ू और कदम 1.2.12.10-1.2.12.11 में विस्तृत के रूप में सर्जरी को अंतिम रूप दें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

चूहों में टिक इंडक्शन के लिए तीव्र और पुरानी मॉडल पैदा करने के लिए प्रोटोकॉल ऊपर प्रस्तुत किए गए थे। प्रोटोकॉल सर्जरी और प्रयोगों के लिए पूरी तैयारी को कवर करते हैं (तीव्र मॉडल के लिएचित्र 1, पुरानी मॉडल के लिए चित्रा 2)। स्ट्राटम के मोटर क्षेत्रों में बाइक्यूललाइन के आवेदन के परिणामस्वरूप चल रहे मोटर टिक्स की अभिव्यक्ति होती है। टिक्स आवेदन के लिए कॉन्ट्रालेटरल साइड पर दिखाई देते हैं और संक्षिप्त और दोहराव वाले मांसपेशियों के संकुचन की विशेषता होती है। स्ट्राटम के पूर्ववर्ती भागों में बाइक्यूक्लिन आवेदन के बाद, टिक्स आमतौर पर चूहे के अग्रभाग, सिर और/या जबड़े में व्यक्त किए जाते हैं, जबकि पीछे के इंजेक्शन के बाद, टिक्स हिंडलिब18में व्यक्त किए जाते हैं। तीव्र मॉडल(चित्रा 3 ए)में, टिक्स बाइक्यूललाइन माइक्रोइंजेक्शन के कई मिनट बाद दिखाई देने लगते हैं, जो दर्जनों मिनट तक रहते हैं और अंततः क्षय और18बंद हो जाते हैं। क्रोनिक मॉडल(चित्रा 3 बी)में, टिक्स आमतौर पर पहले दिन बाइक्यूललाइन से भरे पंप प्रत्यारोपण19के बाद दिखाई देना शुरू कर देते हैं। दिन के दौरान टिक्स में उतार-चढ़ाव होता है और शांत जागने वाले राज्य19के दौरान सबसे स्पष्ट रूप से नमूदार होते हैं । टिक अभिव्यक्ति मिनी-ऑस्मोटिक पंप के प्रकार के आधार पर कई दिनों की अवधि में और कुछ हफ्तों तक चल रही है।

टिक अभिव्यक्ति की निगरानी और मात्रा निर्धारित की जा सकती है वीडियो, काइनेटिक सेंसर और तंत्रिका गतिविधि15,19,22की एक साथ रिकॉर्डिंग द्वारा । मोटर टिक्स में एक टकसाली काइनेटिक हस्ताक्षर होता है जिसे एक्सेलेरोमीटर और जायरोस्कोप संकेतों(चित्रा 4)में पाया जा सकता है, जिससे उनकी आवृत्ति और तीव्रता की माप को सक्षम किया जा सकता है। बड़े आयाम एलएफपी क्षणिक स्पाइक्स15 (चित्रा 4)की उपस्थिति के कारण, पूरे सीबीजी मार्ग में स्थानीय क्षेत्र क्षमता (एलएफपी) सिग्नल का उपयोग करके टिक टाइमिंग का भी मूल्यांकन किया जा सकता है। यहां प्रस्तुत परिणाम और तीव्र और पुराने मॉडलों के अतिरिक्त कार्यान्वयन का विस्तार से वर्णन किया गया है15,18,19,22,23. कृंतक और गैर-मानव वानरों दोनों में स्ट्राइटल डिसिनिबिशन मॉडल ने टूरेट सिंड्रोम और मोटर15, 18 और मुखर24 टिक्स दोनों से संबंधित अन्य टिक विकारों में टिक अभिव्यक्ति के प्रमुख गुणों को दोहराया और एक अलग व्यवहार, पर्यावरण और औषधीय हस्तक्षेप22,25, 26केबाद उनकी अभिव्यक्ति । हालांकि, मौजूदा निष्कर्ष केवल टिक विकारों की जटिल अभिव्यक्ति के हिमशैल की नोक बनाते हैं।  हमें विश्वास है कि मॉडल इस तरह के कारकों की एक विस्तृत श्रृंखला के अध्ययन में सक्षम हो जाएगा, ऐसे संवेदी इनपुट के रूप में पर्यावरणीय प्रभाव से लेकर, समवर्ती कार्रवाई प्रदर्शन और इस तरह के विभिन्न उपचार के लिए प्रतिक्रिया के रूप में नैदानिक प्रभाव के रूप में व्यवहार प्रभाव ।

Figure 1
चित्रा 1: तीव्र मॉडल में उपयोग किए जाने वाले कस्टम-निर्मित उपकरणों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (1) इंप्लांट-कैनुला जो लंबे समय से स्ट्राटम में प्रत्यारोपित किया जाता है। (2) डमी, एक हटाने योग्य आंतरिक तार, प्रत्यारोपित कैनुला को सील करने के लिए प्रयोग किया जाता है। (3) इंजेक्टर, (3.1) लचीला ट्यूब और (3.2) इंजेक्शन-कैनुला से बना, स्ट्राटम में बाइक्यूलिन के तीव्र वितरण के लिए उपयोग किया जाता है। (4) कैनुला-धारक, (4.1) आधार और (4.2) सीसा से बना, प्रत्यारोपण के दौरान प्रत्यारोपण-कैनुला को पकड़ने के लिए उपयोग किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: कस्टम निर्मित उपकरणों और पुराने मॉडल में इस्तेमाल मिनी ऑस्मोटिक पंप का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (1) कैनुला-गाइड का उपयोग प्रत्यारोपण के दौरान जलसेक-कैनुला को पकड़ने के लिए किया जाता है। (2) जलसेक-कैनुला को लंबे समय से स्ट्राटम में प्रत्यारोपित किया जाता है। (3) लचीला कैथेटर-ट्यूबिंग जलसेक-कैनुला को मिनी-ऑस्मोटिक पंप से जोड़ता है। (4) ट्यूबिंग-एडाप्टर फ्लेक्सिबल कैथेटर-ट्यूबिंग को फ्लो मॉडरेटर से जोड़ता है । (5) फ्लो-मॉडरेटर (5.1) छोटे कैनुला-भाग, (5.2) सफेद फ्लैंज और (5.3) लंबे कैनुला-भाग से बना है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: प्रायोगिक सेटअप का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। तीव्र मॉडल में, टिक्स को पंप-इन्फ्यूजन मशीन(ए)का उपयोग करके एक बाइक्यूलीलाइन इंजेक्शन के बाद प्रेरित किया जाता है। पुराने मॉडल में, चल रहे टिक्स मिनी-ऑस्मोटिक पंप प्रत्यारोपण(बी)के माध्यम से बाइक्यूलिन के लंबे समय तक जलसेक द्वारा प्राप्त किए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: काइनेमेटिक और न्यूरोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग से सिंक्रोनाइज्ड संकेतों का एक उदाहरण। एक्सेलेरोमीटर, जायरोस्कोप और इसी एलएफपी से प्राथमिक मोटर कॉर्टेक्स से तीक्ष्ण अभिव्यक्ति के दौरान। धराशायी ग्रे लाइन: एलएफपी सिग्नल द्वारा पता लगाया गया टिक शुरुआत का समय। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस पांडुलिपि में, हमने स्वतंत्र रूप से व्यवहार करने वाले चूहे में टिक इंडक्शन के लिए तीव्र और पुरानी मॉडलों के प्रोटोकॉल को विस्तृत किया। ये प्रोटोकॉल सभी घटकों, सर्जरी और प्रयोगात्मक प्रक्रिया की तैयारी का वर्णन करते हैं जिन्हें विशिष्ट शोध आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए अनुकूलन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इन मॉडलों में अंतर्निहित प्राथमिक सिद्धांत स्ट्राटम के मोटर क्षेत्रों के लिए बाइक्यूलीलाइन का प्रत्यक्ष स्थानीय अनुप्रयोग है, जो टिक विकारों10, 11, 12के रोगविज्ञान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जानाजाताहै। दोनों मॉडलों में, बाइक्यूलिन को कस्टम-निर्मित प्रत्यारोपित कैनुलास के माध्यम से लक्ष्य तक पहुंचाया जाता है। विशिष्ट कैनुला प्रत्यारोपण लक्ष्य टिक अभिव्यक्ति के वांछित शरीर के स्थान पर निर्भर करता है। स्ट्रिकम27 , 28,29,30का आयोजन कियाजाताहै । अपने पूर्वकाल के हिस्सों में बाइक्यूललाइन के आवेदन से अग्रभाग, जबड़े और सिर में टिक अभिव्यक्ति होती है, जबकि पीछे के हिस्सों में इसके आवेदन के परिणामस्वरूप हिंडलिब टिक्स18होता है। इसके अलावा, वेंट्रल स्ट्राटम (न्यूक्लियस एक्यूबेन्स - एनएसी) में आवेदन करने से अतिसक्रियता31हो जाती है। मॉडल दोनों गोलार्द्धों में कैनुलास के प्रत्यारोपण और द्विपक्षीय लक्षणों का उत्पादन करने के लिए एक साथ इंजेक्शन के लिए दोनों स्ट्रीटल लक्ष्यों में सक्षम हैं । यह विधि न केवल टिक अभिव्यक्ति मॉडल पर लागू होती है, बल्कि अन्य तंत्रिका विज्ञान मॉडलों में भी मान्य होती है जिसके लिए न्यूरोएक्टिव यौगिकों के इंजेक्शन की आवश्यकता होती है।

तीव्र मॉडल में, हम लक्ष्य क्षेत्र को ऊतक क्षति को रोकने के लिए इंजेक्शन लक्ष्य से ऊपर कैनुला 2 मिमी (0.079') प्रत्यारोपित करने का सुझाव देते हैं। इंजेक्शन-कैनुला द्वारा बाद में होने वाले नुकसान को कम करने के लिए, हम अंतिम लक्ष्य तक पहुंचने के लिए एक पतली 30 ग्राम ट्यूब का उपयोग करते हैं। ध्यान दें कि एक ही लक्ष्य के लिए कई इंजेक्शन अंततः यांत्रिक तनाव से ऊतक परिगलन के लिए नेतृत्व करेंगे, जो कम टिक अभिव्यक्ति का कारण होगा । एक संभव समाधान के बाद इंजेक्शन के दौरान गहरे लक्ष्यों को इंजेक्टर डालने के लिए है, जब तक वे striatum के मोटर क्षेत्रों में स्थानीयकृत रहते हैं । यह ऊतक परिगलन पुरानी मॉडल में नहीं होता है, क्योंकि बाइक्यूलिन जलसेक एक स्थिर सीधे प्रत्यारोपित जलसेक-कैनुला के माध्यम से स्ट्राटाल लक्ष्य में चल रहा है। क्रोनिक जलसेक-कैनुला प्रत्यारोपण से संभावित ऊतक क्षति को कम करने के लिए, हमने 30 जी ट्यूब का भी उपयोग किया। हालांकि, लचीला कैथेटर ट्यूबिंग के माध्यम से प्रवाह-मध्यस्थ के लिए जलसेक-कैनुला को जोड़ने के लिए, हमें एक ट्यूबिंग-एडाप्टर का उपयोग करने की आवश्यकता थी, जिससे इस प्रक्रिया में एक संभावित असफल बिंदु बन सके। मोटा लचीला कैथेटर ट्यूबिंग प्रवाह-मध्यस्थ फिट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, बड़ा जलसेक-cannula से एक बड़ा ऊतक क्षति की एक उचित लागत के लिए अग्रणी ।

पिछले 10 वर्षों में चल रहे शोध ने हमें15, 18,22,23की विशिष्ट सांद्रता और वितरण दरों को परिभाषित करने में सक्षम बनाया है, जिसके परिणामस्वरूप अवलोकन योग्य टिक अभिव्यक्ति की प्रजनन योग्य व्यवहार घटना हुई है। उच्च मात्रा, सांद्रता या इंजेक्शन दरों की ओर इन मूल्यों से विचलन, चूहों के प्रासंगिक दौरे15,18,32 और एकतरफा घूर्णन का कारण बन सकता है। कम सांद्रता के परिणामस्वरूप अधिक सूक्ष्म, कम पता लगाने योग्य टिक्स होते हैं, जो कम समय पर व्यक्त होते हैं। पुरानी मॉडल में, पूरी अवधि में कोई दौरे नहीं देखे गए; हालांकि, द्विकुलिन से भरे पंप प्रत्यारोपण के बाद पहले दिन व्यापक टिक अभिव्यक्ति और एकतरफा घूर्णन की प्रवृत्ति देखी गई, जो दूसरे दिन के दौरान स्थिर हो गई। यह, पोस्ट ब्रेन सर्जरी वसूली के साथ संयुक्त, जानवर के आराम के स्तर और भलाई के साथ हस्तक्षेप करता है। टिक अभिव्यक्ति से वसूली की अवधि को अलग करने के लिए, हम एक ACSF से भरे पंप पहले19प्रत्यारोपित करने का सुझाव देते हैं । ACSF जलसेक की इस अवधि का उपयोग टिक प्रेरण से पहले नियंत्रण प्रयोगों का संचालन करने के लिए भी किया जा सकता है। नियंत्रण प्रायोगिक सत्र भी तीव्र मॉडल में किया जा सकता है, ACSF इंजेक्शन का उपयोग18,३३।

तीव्र और पुराने मॉडल दोनों का उपयोग काइनेटिक विशेषताओं और तंत्रिका संबंधों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। टिक्स को फ्रेम-बाय-फ्रेम ऑफ़लाइन वीडियो विश्लेषण द्वारा पहचाना जा सकता है, जो हालांकि समय लेने वाली और कम सटीक है। अधिक संवेदनशील मूल्यांकन विधियों में इलेक्ट्रोमैयोग्राफी (ईएमजी) और काइनेमेटिक सेंसर (एक्सेलेरोमीटर और जायरोस्कोप)(चित्रा 4)शामिल हैं। इस उद्देश्य के लिए, सटीक आंदोलन मूल्यांकन के लिए शरीर पर टिक-एक्सप्रेसिंग साइट के पास काइनेमेटिक उपकरणों को स्थित करने की आवश्यकता होती है। टिक अभिव्यक्ति के तंत्रिका सहसंबंध सीबीजी मार्ग(चित्रा 4)भर में न्यूरोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग द्वारा कब्जा कर लिया जा सकता है । अतिरिक्त रिकॉर्डिंग उपकरणों के प्रत्यारोपण पर विचार करते समय, इंजेक्शन के साथ हस्तक्षेप को रोकने के लिए मस्तिष्क के अंदर और बाहर उनके स्थानों को सावधानीपूर्वक योजना बनाने की आवश्यकता होती है।

प्रायोगिक क्वेरी की प्रकृति को टिक अभिव्यक्ति के मॉडल का चुनाव तय करना चाहिए। तीव्र मॉडल सरल और लागू करने में आसान है। कई क्षणिक इंजेक्शन समय की एक अपेक्षाकृत लंबी अवधि में आयोजित किया जा सकता है, कई मस्तिष्क क्षेत्रों में एक साथ चलाया जा सकता है और नियंत्रण और प्रयोगात्मक सत्रों के संयोजन सक्षम । पुरानी मॉडल अधिक जटिल है और चूहे की भलाई की दैनिक निगरानी की आवश्यकता है। फिर भी, निरंतर और लंबे समय तक बाइक्यूलाइन एप्लिकेशन समय के साथ टिक अभिव्यक्ति की गतिशीलता और इसके मॉड्यूलेशन को संबोधित करने का अवसर प्रदान करता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन के हिस्से में एक इसराइल विज्ञान फाउंडेशन (आईएसएफ) अनुदान (297/18) द्वारा समर्थित किया गया था । लेखक ों ने एम ब्रोनफेल्ड को तीव्र कृंतक मॉडल और एम इस्राएलश्विली को उनकी टिप्पणियों के लिए स्थापित करने के लिए धन्यवाद दिया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anchor screws Micro Fasteners SMPPS0002 #0 x 1/8 - Pan Head Sheet Metal Screws
Bicuculline methiodide Sigma Aldrich 14343
Cyanoacrylate (CA) accelerator Zap PT29
Cyanoacrylate (CA) glue BSI IC-2000 This glue was found to be stronger than others
Dental cement Coltene H00322 Hygenic Perm Repair Material Reline Resin Self Cure
Glue gel Loctite Ultra Gel Control
Hemostat WPI 501242 Any hemostat sized approximately 14 cm would be sufficient
Hypo-tube, extra-thin wall 25G Component supply company HTX-25X
Hypo-tube, regular wall 22G Component supply company HTX-22R
Hypo-tube, regular wall 30G Component supply company HTX-30R
Infusion pump machine New Era Pump Systems NE-1000
Mini-osmotic pump ALZET 2001 1.0µl per hour, 7 days
PE compatible adhesive CEYS Special difficult plastics (suitable for PE)
PE-10 Catheter Tubing ALZET PE-10 ID = 0.28mm, OD = 0.61mm
Precision glass microsyringe, 10µl Hamilton 80065 1701 RNR 10µl syr (22s/51/3)
Tissue adhesive 3M 1469Sb Vetbond
Tubing-adapter CMA 3409500
Tygon micro bore tubing, 0.02 inch ID * 0.06 OD Component supply company TND80-020
Wire 0.005-inch Component supply company GWX-0050
Wire 0.013-inch Component supply company GWX-0130

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. American Psychiatric Association. DSM-5. American Psychiatric Association. , (2013).
  2. Peterson, B. S., Leckman, J. F. The temporal dynamics of tics in Gilles de la Tourette syndrome. Biol.Psychiatry. 44, 1337-1348 (1998).
  3. Ganos, C., et al. The somatotopy of tic inhibition: where and how much. Movement Disorders. , (2015).
  4. Barnea, M., et al. Subjective versus objective measures of tic severity in Tourette syndrome - The influence of environment. Psychiatry Research. 242, 204-209 (2016).
  5. Silva, R. R., Munoz, D. M., Barickman, J., Friedhoff, A. J. Environmental Factors and Related Fluctuation of Symptoms in Children and Adolescents with Tourette's Disorder. Journal of Child Psychology and Psychiatry. 36 (2), 305-312 (1995).
  6. Rothenberger, A., et al. Sleep and Tourette syndrome. Advances in Neurology. 85, 245-259 (2001).
  7. Conelea, C. a, Woods, D. W., Brandt, B. C. The impact of a stress induction task on tic frequencies in youth with Tourette Syndrome. Behaviour Research and Therapy. 49 (8), 492-497 (2011).
  8. Ganos, C., Rothwell, J., Haggard, P. Voluntary inhibitory motor control over involuntary tic movements. Movement Disorders. 33 (6), 937-946 (2018).
  9. Yael, D., Vinner, E., Bar-Gad, I. Pathophysiology of tic disorders. Movement Disorders. 30 (9), 1171-1178 (2015).
  10. Kurvits, L., Martino, D., Ganos, C., Eddy, C. M. Clinical Features That Evoke the Concept of Disinhibition in Tourette Syndrome. Frontiers in Psychiatry. 11, 1-10 (2020).
  11. Mink, J. W. Basal ganglia dysfunction in Tourette's syndrome: a new hypothesis. Pediatric Neurology. 25, 190-198 (2001).
  12. Bronfeld, M., Bar-Gad, I. Tic disorders: what happens in the basal ganglia. The Neuroscientist. 19 (1), 101-108 (2013).
  13. Tarsy, D., Pycock, C. J., Meldrum, B. S., Marsden, C. D. Focal contralateral myoclonus produced by inhibition of GABA action in the caudate nucleus of rats. Brain. 101 (1), 143-162 (1978).
  14. Crossman, A. R., Mitchell, I. J., Sambrook, M. A., Jackson, A. Chorea and Myoclonus in the Monkey Induced By Gamma-Aminobutyric Acid Antagonism in the Lentiform Complex. Brain. 111 (5), 1211-1233 (1988).
  15. McCairn, K. W., Bronfeld, M., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. The neurophysiological correlates of motor tics following focal striatal disinhibition. Brain. 132 (8), 2125-2138 (2009).
  16. Worbe, Y., et al. Behavioral and movement disorders induced by local inhibitory dysfunction in primate striatum. Cerebral Cortex. 19 (8), 1844-1856 (2009).
  17. Pogorelov, V., Xu, M., Smith, H. R., Buchanan, G. F., Pittenger, C. Corticostriatal interactions in the generation of tic-like behaviors after local striatal disinhibition. Experimental Neurology. 265, 122-128 (2015).
  18. Bronfeld, M., Yael, D., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. Motor tics evoked by striatal disinhibition in the rat. Frontiers in Systems Neuroscience. 7, 50 (2013).
  19. Vinner, E., Israelashvili, M., Bar-Gad, I. Prolonged striatal disinhibition as a chronic animal model of tic disorders. Journal of Neuroscience Methods. 292, 20-29 (2017).
  20. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 6, (2007).
  21. Flecknell, P. Analgesia and Post-Operative Care. Laboratory Animal Anaesthesia. , (2016).
  22. Israelashvili, M., Bar-Gad, I. Corticostriatal divergent function in determining the temporal and spatial properties of motor tics. Journal of Neuroscience. 35 (50), 16340-16351 (2015).
  23. Bronfeld, M., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. Spatial and temporal properties of tic-related neuronal activity in the cortico-basal ganglia loop. Journal of Neuroscience. 31 (24), 8713-8721 (2011).
  24. McCairn, K. W., et al. A Primary Role for Nucleus Accumbens and Related Limbic Network in Vocal Tics. Neuron. 89 (2), 300-307 (2016).
  25. Rizzo, F., et al. Aripiprazole Selectively Reduces Motor Tics in a Young Animal Model for Tourette's Syndrome and Comorbid Attention Deficit and Hyperactivity Disorder. Frontiers in Neurology. 9, 1-11 (2018).
  26. Vinner, E., Matzner, A., Belelovsky, K., Bar-gad, I. Dissociation of tic expression from its neuronal encoding in the striatum during sleep. bioRxiv. , (2020).
  27. Webster, K. E. Cortico-striate interrelations in the albino rat. Journal of Anatomy. 95, Pt 4 532-544 (1961).
  28. Ebrahimi, A., Pochet, R., Roger, M. Topographical organization of the projections from physiologically identified areas of the motor cortex to the striatum in the rat. Neuroscience Research. 14, 39-60 (1992).
  29. Brown, L. L., Sharp, F. R. Metabolic mapping of rat striatum: somatotopic organization of sensorimotor activity. Brain Research. 686, 207-222 (1995).
  30. Brown, L. L., Smith, D. M., Goldbloom, L. M. Organizing principles of cortical integration in the rat neostriatum: Corticostriate map of the body surface is an ordered lattice of curved laminae and radial points. Journal of Comparative Neurology. 392 (4), 468-488 (1998).
  31. Yael, D., Tahary, O., Gurovich, B., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. Disinhibition of the nucleus accumbens leads to macro-scale hyperactivity consisting of micro-scale behavioral segments encoded by striatal activity. The Journal of Neuroscience. , 3120 (2019).
  32. Obeso, J. A., Rothwell, J. C., Marsden, C. D. The spectrum of cortical myoclonus. From focal reflex jerks to spontaneous motor epilepsy. Brain. 108, 124-193 (1985).
  33. Bronfeld, M., et al. Bicuculline-induced chorea manifests in focal rather than globalized abnormalities in the activation of the external and internal globus pallidus. Journal of Neurophysiology. 104 (6), 3261-3275 (2010).

Tags

व्यवहार अंक 171 टिक इंडक्शन मोटर टिक्स पशु मॉडल ओस्मोटिक पंप बेसल गैंगलिया स्ट्राटम बाइक्यूकुलिन गाबा विरोधी क्रोनिक मॉडल एक्यूट मॉडल टूरेट सिंड्रोम
चूहों में मोटर टिक अभिव्यक्ति के तीव्र और पुरानी प्रयोगात्मक मॉडल पैदा करना
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vinner, E., Belelovsky, K., Bar-Gad, … More

Vinner, E., Belelovsky, K., Bar-Gad, I. Generating Acute and Chronic Experimental Models of Motor Tic Expression in Rats. J. Vis. Exp. (171), e61743, doi:10.3791/61743 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter